Article de méthode

Expression de transgènes dans l’urothélium vésical natif par transduction médiée par adénovirus

DOI :

10.3791/64584

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6 octobre 2022

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1Renal-Electrolyte Division, Department of Medicine, University of Pittsburgh School of Medicine

Dans cet article

Résumé

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Des méthodes sont décrites pour la génération de grandes quantités d’adénovirus recombinants, qui peuvent ensuite être utilisés pour transduire l’urothélium de rongeur natif permettant l’expression de transgènes ou la régulation négative de produits géniques endogènes.

Résumé

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En plus de former une barrière à haute résistance, l’urothélium qui tapisse le bassinet du rein, les uretères, la vessie et l’urètre proximal est supposé détecter et transmettre des informations sur son environnement aux tissus sous-jacents, favorisant ainsi la fonction et le comportement de miction. La perturbation de la barrière urothéliale, ou de sa fonction sensorielle/transductrice, peut entraîner une maladie. L’étude de ces événements complexes est entravée par le manque de stratégies simples pour modifier l’expression des gènes et des protéines dans l’urothélium. Les méthodes décrites ici permettent aux chercheurs de générer de grandes quantités d’adénovirus à titre élevé, qui peuvent ensuite être utilisés pour transduire l’urothélium des rongeurs avec une grande efficacité et d’une manière relativement simple. Les ADNc et les petits ARN interférents peuvent être exprimés par transduction adénovirale, et l’impact de l’expression transgénique sur la fonction urothéliale peut être évalué 12 h à plusieurs jours plus tard. Ces méthodes ont une large applicabilité aux études de biologie urothéliale normale et anormale utilisant des modèles animaux de souris ou de rats.

Introduction

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L’urothélium est l’épithélium spécialisé qui tapisse le bassinet du rein, les uretères, la vessie et l’urètre proximal1. Il comprend trois strates : une couche de cellules parapluies hautement différenciées et polarisées, souvent binucléées, dont les surfaces apicales baignent dans l’urine ; une couche cellulaire intermédiaire avec une population de cellules binucléées amplifiant le transit qui peut donner naissance à des cellules parapluies superficielles en réponse à leur perte aiguë; et une seule couche de cellules basales, dont un sous-ensemble fonctionne comme des cellules souches qui peuvent régénérer la totalité de l’urothélium en réponse à une lésion chronique. Les cellules parapluies sont principalement responsables de la formation de la barrière urothéliale à haute résistance, dont les composants comprennent une membrane apicale (riche en cholestérol et en cérébrosides) avec une faible perméabilité à l’eau et aux solutés, et un complexe jonctionnel apical à haute résistance (composé de jonctions serrées, de jonctions adhérentes, de desmosomes et d’un cycle actomyosine associé)1 . La surface apicale de la cellule parapluie et son anneau jonctionnel se dilatent pendant le remplissage de la vessie et reviennent rapidement à leur état pré-rempli après l’évacuation de 1,2,3,4,5. En plus de son rôle dans la fonction de barrière, on suppose également que l’urothélium a des fonctions sensorielles et transductrices qui lui permettent de détecter les changements dans le milieu extracellulaire (p. ex. étirement) et de transmettre cette information par la libération de médiateurs (y compris l’ATP, l’adénosine et l’acétylcholine) aux tissus sous-jacents, y compris les processus nerveux afférents sous-urothéliaux 6,7,8 . Des preuves récentes de ce rôle sont trouvées chez les souris dépourvues d’expression urothéliale de Piezo1 et Piezo2, ce qui entraîne une altération de la fonction de miction9. De plus, les rats surexprimant la protéine CLDN2 formant des pores à jonction serrée dans la couche cellulaire parapluie développent une inflammation et une douleur analogues à celles observées chez les patients atteints de cystite interstitielle10. On suppose que la perturbation de la fonction sensorielle/transductrice urothéliale ou de la barrière peut contribuer à plusieurs troubles de la vessie 6,11.

Une meilleure compréhension de la biologie de l’urothélium dans les états normaux et pathologiques dépend de la disponibilité d’outils qui permettront aux chercheurs de réguler facilement à la baisse l’expression des gènes endogènes ou de permettre l’expression des transgènes dans le tissu natif. Alors qu’une approche pour réguler à la baisse l’expression des gènes consiste à générer des souris knockout urothéliales conditionnelles, cette approche dépend de la disponibilité de souris avec des allèles floxés, nécessite beaucoup de travail et peut prendre des mois ou des années pour compléter12. Il n’est donc pas surprenant que les chercheurs aient mis au point des techniques pour transfecter ou transduire l’urothélium, ce qui peut conduire à des résultats sur une échelle de temps plus courte. Les méthodes publiées pour la transfection comprennent l’utilisation de lipides cationiques13, d’oligodésoxynucléotides phosphorothioés antisens14 ou d’acides nucléiques antisens attachés à la protéine TAT du VIH pénétrant le peptide11-mère 15. Cependant, ce protocole met l’accent sur l’utilisation de la transduction médiée par l’adénoviral, une méthodologie bien étudiée qui est efficace pour la livraison de gènes à un large éventail de cellules, qui a été testée dans de nombreux essais cliniques et, plus récemment, a été utilisée pour administrer l’ADNc codant pour la protéine de capside COVID-19 aux receveurs d’une variante du vaccin COVID-1916, 17. Pour une description plus complète du cycle de vie de l’adénovirus, des vecteurs adénoviraux et des applications cliniques des adénovirus, le lecteur est invité à consulter la référence17.

Une étape importante dans l’utilisation des adénovirus pour transduire l’urothélium a été un rapport de Ramesh et al. qui a montré de courts prétraitements avec des détergents, y compris le N-dodécyl-β-D-maltoside (DDM) considérablement amélioré la transduction de l’urothélium par un adénovirus codant β-galactosidase18. En utilisant cette étude de preuve de principe comme guide, la transduction médiée par adénoviral de l’urothélium a maintenant été utilisée pour exprimer une variété de protéines, y compris les GTPases de la famille Rab, les facteurs d’échange guanine-nucléotide, les fragments moteurs de myosine, les claudines associées à la jonction serrée formant des pores et ADAM17 10,19,20,21,22 . La même approche a été adaptée pour exprimer de petits ARN interférents (siRNA), dont les effets ont été sauvés par la co-expression de variantes résistantes au siRNA du transgène22. Le protocole décrit ici comprend des méthodes générales pour générer de grandes quantités d’adénovirus hautement concentrés, une exigence pour ces techniques, ainsi que des adaptations des méthodes de Ramesh et al.18 pour exprimer les transgènes dans l’urothélium avec une grande efficacité.

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Protocole

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Les expériences impliquant la génération d’adénovirus, qui nécessite une certification BSL2, ont été réalisées avec l’approbation des bureaux de santé et de sécurité environnementales de l’Université de Pittsburgh et du comité institutionnel de biosécurité. Toutes les expériences sur les animaux effectuées, y compris la transduction adénovirale (qui nécessite une certification ABSL2), ont été effectuées conformément aux directives / règlements pertinents de la politique du service de santé publique sur les soins et l’utilisation sans cruauté des animaux de laboratoire et de la loi sur le bien-être des animaux, et sous l’approbation du comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université de Pittsburgh. Des gants, une protection oculaire et une tenue appropriée sont portés pour toutes les procédures impliquant des virus recombinants. Tout déchet liquide ou solide doit être éliminé comme décrit ci-dessous. La litière des animaux après la transduction, et toute carcasse d’animaux qui en résulte, doivent être traitées comme des matières biologiques dangereuses et éliminées conformément aux politiques de l’établissement.

1. Préparation des stocks d’adénovirus à titre élevé

NOTE: La transduction efficace des vessies de rongeurs dépend de l’utilisation de souches virales purifiées et concentrées, généralement 1 x 107 à 1 x 108 particules virales infectieuses (IVP) par μL. Cette partie du protocole est axée sur la génération de stocks d’adénovirus à titre élevé à partir de préparations virales existantes. Toutes les étapes doivent être effectuées dans une hotte de culture cellulaire à l’aide de réactifs et d’outils stériles. Alors que les souches disponibles d’adénovirus utilisées aujourd’hui sont défectueuses de réplication, la plupart des institutions exigent une approbation pour utiliser des adénovirus et de l’ADN recombinant. Cela comprend souvent la désignation d’une salle de culture cellulaire en tant qu’installation approuvée par BSL2 pour produire et amplifier les adénovirus. Certaines considérations générales comprennent l’utilisation de masques, de protections oculaires, de gants et de vêtements appropriés à toutes les étapes de la production et de la purification du virus. Lors de la centrifugation, les capuchons de sécurité sont recommandés si les tubes de centrifugation manquent de bouchons étanches. Tous les matériaux non jetables, y compris les bouchons de sécurité des centrifugeuses, les bouteilles et les rotors potentiellement contaminés, sont traités avec une solution antivirale (voir le tableau des matériaux), puis rincés à l’eau ou à l’éthanol à 70 %. Les déchets liquides sont traités en ajoutant de l’eau de Javel à une concentration finale de 10 % (v/v). L’élimination de ces déchets liquides dépendra des politiques institutionnelles. Les déchets solides sont généralement éliminés dans des déchets biologiques dangereux.

  1. Culture de cellules HEK293T
    1. Décongeler un flacon congelé de cellules HEK293T dans un bain-marie à 37 °C et utiliser une pipette de 5 ml pour transférer les cellules dans une boîte de culture cellulaire de 15 cm de diamètre. À l’aide d’une pipette de 25 mL, ajouter lentement 20 mL de milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco contenant 10 % (v/v) de sérum fœtal bovin et d’antibiotique pénicilline/streptomycine (DMEM-FBS-PS) dans la boîte. Incuber les cellules dans un incubateur de culture cellulaire à 37 °C gazé avec 5% (v/v) de CO2 jusqu’à ce qu’elles atteignent 80%-90% de confluence (~2 x 107 cellules).
    2. À l’aide d’une pipette en verre fixée à une source sous vide, aspirer le milieu, puis rincer les cellules en transférant 20 mL de PBS stérile (2,7 mM KCl, 1,5 mM KH2PO 4, 136,9 mM NaCl et 8,9 mM Na2HPO4) dans la boîte à l’aide d’une pipette de 25 mL. Aspirer le PBS usé, puis utiliser une pipette de 5 mL pour transférer 3 mL de solution tiède (37 °C) de protéinase (voir le tableau des matières) dans la boîte, en incubant la capsule dans l’incubateur de culture cellulaire jusqu’à ce que les cellules se détachent (~3-4 min).
      REMARQUE: Une protéolyse efficace peut être mieux évaluée en inclinant lentement la boîte d’avant en arrière à la recherche de la libération des cellules de toutes les parties de la boîte dans le liquide en mouvement. Les cellules HEK293T sont sensibles au traitement prolongé par la protéinase et mourront si elles sont laissées plus de quelques minutes dans une solution de protéinase.
    3. Utilisez une pipette de 10 mL pour transférer 7 mL de DMEM-FBS-PS dans la boîte des cellules détachées, puis utilisez la même pipette pour aspirer les cellules et le milieu. Transférer les cellules en suspension dans un tube conique de 50 mL, puis granuler les cellules en centrifugeant la suspension dans une centrifugeuse clinique à basse vitesse à 200 x g pendant 5 min. Aspirer le surnageant à l’aide d’une pipette en verre fixée à une source de vide. Utilisez une pipette de 25 mL pour remettre en suspension la pastille de cellule dans 15 mL de DMEM-FBS-PS.
    4. Ajouter 1 mL de la suspension cellulaire à chacune des quinze boîtes de 15 cm contenant 19 mL de DMEM-FBS-PS.
    5. Cultiver les cellules dans un incubateur de culture tissulaire jusqu’à ce qu’elles atteignent 85% à 90% de confluence (~3-4 jours).
  2. Préparer une solution virale diluée
    1. Ajouter ~1,5 x 10 9 à 3 x 109 IVP d’un stock de virus existant (5-10 IVP/cellule) dans un tube conique de 50 mL rempli de 45 mL de DMEM sans FBS ou antibiotiques.
      REMARQUE: Il est possible d’utiliser une concentration plus faible du virus (1-5 IVP / cellule); Cependant, il faudra plus de temps pour que la production de virus s’ensuive.
  3. Infectez les cellules cultivées avec le virus.
    1. À l’aide d’une pipette en verre fixée à une source de vide, aspirer le milieu des cellules presque confluentes à l’étape 1.1.5.
    2. Utiliser une pipette de 25 mL pour transférer 3,0 mL de solution virale diluée (préparée à l’étape 1.2.1) dans chaque boîte de culture cellulaire. Ensuite, utilisez une pipette de 10 mL pour ajouter 7,0 mL de milieu DMEM (sans FBS ou antibiotiques) à chaque boîte. Incuber pendant 60 minutes dans un incubateur de culture cellulaire, puis ajouter 10 ml de DMEM contenant 20% (v/v) FBS et 2x PS à chaque boîte.
      REMARQUE: L’utilisation de l’une des 15 boîtes comme plaque de contrôle (dans laquelle le virus n’est pas ajouté) facilite l’identification de l’arrondi cellulaire induit par le virus et de la mort dans les cellules infectées à l’étape suivante.
    3. Incuber les cellules dans l’incubateur de culture cellulaire pendant 2 à 4 jours jusqu’à ce que la majorité d’entre elles commencent à s’arrondir et que >60% des cellules se soient détachées.
      REMARQUE: Si vous utilisez un titre inférieur du virus, la mort cellulaire peut prendre jusqu’à une semaine. Si la mort cellulaire ne se produit pas dans la semaine, il est probable que le processus devra être répété en utilisant un titre plus élevé du virus.
  4. Récupérer le virus des lysats cellulaires
    1. Utilisez un grattoir de cellules pour gratter le fond de chaque boîte, libérant les cellules attachées dans le milieu.
    2. À l’aide d’une pipette de 25 mL, recueillir et regrouper le milieu, les cellules et les débris cellulaires de chaque boîte de culture cellulaire dans un tube de culture cellulaire conique de 50 mL.
      REMARQUE: Pour économiser des ressources, le milieu de deux boîtes peut être combiné en un tube de 50 mL.
    3. Ensemencer le matériau cellulaire par centrifugation à l’aide d’une centrifugeuse de table à basse vitesse : 5 min à température ambiante à 3 000 x g. Utilisez une pipette en verre fixée à un dispositif à vide pour aspirer le surnageant.
    4. Utiliser une pipette de 10 mL, combinée à une trituration, pour regrouper toute la matière granulée obtenue dans un total de 7 mL de Tris-HCl 100 mM de pH 7,4 filtré stérile contenant 10 mM d’EDTA (solution de Tris-EDTA). Transférer le matériel mis en commun dans un tube conique de culture cellulaire stérile de 15 ml et le placer sur de la glace.
      REMARQUE: À ce stade, la préparation du virus peut être congelée à -80 ° C indéfiniment.
  5. Préparer des lysats cellulaires
    1. Effectuer trois cycles de gel-décongélation pour perturber les cellules restantes et ainsi libérer davantage les particules virales formées. Congeler le matériau mélangé à l’étape 1.4.4 en immergeant le tube dans de l’azote liquide (~30-60 s). Décongeler rapidement l’échantillon en plaçant le tube dans un incubateur à 37 °C. Tourbillonner l’échantillon pendant 15 s, puis répéter la procédure de congélation et de décongélation rapides 2x supplémentaires.
      REMARQUE: La solution virale peut être rapidement décongelée à 37 ° C dans un bain-marie, mais la prudence est de mise car les variations de température peuvent provoquer la fissuration du tube, libérant la solution virale dans le bain-marie. Pour éviter que cela ne se produise, placez le tube contenant le surnageant viral dans un tube plus grand, qui est ensuite placé dans le bain-marie.
    2. Utilisez une pipette de 10 ml pour transférer le matériau cellulaire congelé trois fois dans un tube centrifuge ultrarapide. Centrifuger le matériau dans le tube pendant 30 min à 4 °C à une centrifugeuse à 4 °C à ~18 500 x g.
    3. Récupérez le surnageant riche en virus ~7 mL à l’aide d’une pipette de 10 mL et transférez-le dans un tube conique de 15 mL. Conservez l’échantillon sur la glace jusqu’à l’étape suivante.
      REMARQUE : À ce stade, envisagez de conserver une partie aliquote du surnageant viral non purifié comme préambule pour commencer une nouvelle préparation virale (ou comme sauvegarde). Conserver cette partie aliquote à -80 °C.
  6. Isoler et purifier le virus par centrifugation à gradient de densité.
    1. Préparer un gradient discontinu de CsCl dans un tube à ultracentrifugation transparent à paroi mince PET de 12 ml (voir le tableau des matières) ou l’équivalent. Utilisez une seringue de 3 mL munie d’une aiguille de 18 G pour introduire délicatement 2,5 mL de solution de CsCl à 1,4 g/mL dans le fond du tube, puis utilisez une nouvelle seringue/aiguille pour la superposer avec 2,5 mL de solution de CsCl à 1,25 g/mL.
      REMARQUE: Laisser tomber des solutions directement sur une couche préexistante entraînera un mélange important et indésirable. Au lieu de cela, placez la partie biseautée de l’aiguille contre le bord du tube, puis appuyez très lentement sur le piston de la seringue, en augmentant la position de l’aiguille lorsque la solution remplit le tube.
    2. Chargez les ~7 mL de surnageant viral sur le dessus du gradient de la même manière à l’aide d’une seringue de 10 mL. S’il y a plus de 2-3 mm d’espace entre le surnageant viral et le haut du tube, ajouter une solution supplémentaire de Tris-EDTA pour remplir le tube jusqu’à ce qu’il ne reste que 2-3 mm d’espace.
    3. Faire un tube d’équilibre préparé de la même manière, contenant des couches de CsCl, mais remplaçant le surnageant viral par une solution de Tris-EDTA.
      NOTE: Les deux tubes doivent avoir des poids identiques (et des densités similaires) pour éviter une situation de charge déséquilibrée potentiellement dangereuse dans l’ultracentrifugeuse.
  7. Isoler le virus à l’aide de l’ultracentrifugation à débit.
    1. Chargez les gradients formés aux étapes 1.6.2-1.6.3 dans les godets d’un rotor SW41 ou équivalent. Vissez les bouchons de godet, placez le rotor dans une ultracentrifugeuse (prérefroidi à 4 °C) et centrifugez pendant 1 h à ~150 000 x g.
    2. Pendant la centrifugation, équilibrer la colonne décrite à l’étape 1.9.1 ci-dessous.
  8. Récupérer des particules virales isolées
    1. À la fin de l’étape de centrifugation, détachez soigneusement les godets du rotor et, dans une hotte de culture cellulaire, retirez les bouchons du godet, puis retirez les tubes et placez-les dans une grille.
    2. Recueillir le matériau à bandes, riche en particules virales, qui flotte à l’interface entre la solution de CsCl à 1,25 g/mL et 1,4 g/mL. En tenant le tube contenant le gradient sur la moitié inférieure d’une boîte de culture cellulaire (qui attrapera les matières renversées), utilisez une aiguille de 1 pouce de 18 G fixée à une seringue de 3 ml pour percer soigneusement le tube, juste en dessous du virus à bandes. Aspirez lentement le virus, qui est généralement récupéré dans ~ 1 mL.
    3. Retirez l’aiguille du tube, ce qui aura pour conséquence que le matériau restant dans le gradient s’écoulera du tube dans la moitié inférieure de la boîte de culture cellulaire (tout liquide doit être traité comme un déchet dangereux).
    4. Transférer la solution virale dans la seringue dans un tube microcentrifuge stérile sur de la glace.
      REMARQUE: Lors de la récupération du virus à cette étape, placez l’aiguille de manière à ce que la lumière de l’aiguille soit orientée vers le haut avec l’aiguille s’ouvrant quelques mm en dessous de la bande riche en virus. Éviter la contamination par la fine bande de virus mal assemblés qui est parfois observée à 2-3 mm au-dessus du virus à bandes (voir la fine flèche noire à la figure 1A).
  9. Retirer CsCl de l’échantillon par filtration sur gel.
    1. Équilibrer une colonne-10 (préemballée avec Sephadex G-25M), fixée à un support de support, avec 50 mL de PBS filtré stérile de 0,2 μm contenant 10% (v/v) de glycérol.
      NOTE: L’étape d’équilibrage initiale prend 2-3 heures et est nécessaire pour assurer le lavage complet des agents de conservation utilisés par le fabricant pour stabiliser la colonne.
    2. Laisser la solution de lavage reculer sous la fritte (un disque protecteur de matériau blanc au sommet du milieu de la colonne), puis transférer délicatement la solution virale purifiée recueillie à l’étape 1.8 vers le haut de la colonne. Laissez la solution riche en virus reculer sous la fritte, puis commencez à remplir la colonne de PBS-glycérol.
      REMARQUE: Une fonction de la fritte est d’empêcher la colonne de s’assécher. En conséquence, de courts délais sont tolérés avant que plus d’éluant ne soit ajouté à la colonne.
    3. Recueillir l’éluat dans 12 tubes microcentrifugés stériles, 0,5 mL par fraction.
  10. Déterminez le rendement viral.
    1. Déterminer les fractions virales maximales à l’aide de la spectrophotométrie. Préparer une dilution de 1:100 de chaque fraction dans du PBS et mesurer les DO260 dans un spectrophotomètre, en utilisant une dilution de 1:100 du tampon seul comme blanc. Les particules virales doivent éluer dans le volume vide, en commençant par la fraction 6. Regrouper les fractions contenant les lectures de DO260 les plus élevées.
    2. Effectuer une dilution de 1:100 des fractions virales regroupées et remesurer la DO260. Calculer la concentration finale de particules virales et le nombre de PIV dans les fractions regroupées à l’aide de la formule suivante: Particules virales par mL = DO260 × 100 (ceci corrige le facteur de dilution) × 1012. Une estimation générale est que 1% des particules virales sont IVP, en tant que telles: IVP/mL = DO 260 × 100 × 1010 ou IVP/μL = DO260 × 100 ×10 7.
  11. Aliquote les fractions virales regroupées (contenant 5 x 107 à 1 x 108 IVP) dans des tubes de microcentrifugation stériles ou des cryovials. Conserver les échantillons à -80 °C.

2. Transduction de la vessie de rongeur

NOTE: Si cette technique est nouvelle à la fois, il est recommandé de limiter le nombre d’animaux transduits en même temps à 2-4. Cela peut être accompli en échelonnant les heures de début pour chaque animal, en particulier pendant le traitement aux détergents à l’étape 2.2, puis l’incubation du virus à l’étape 2.3. Les enquêteurs expérimentés peuvent transduire jusqu’à six animaux à la fois.

  1. Cathétériser la vessie
    1. Anesthésiez les souris femelles C57Bl/6J (généralement âgées de 8 à 10 semaines, ~20 à 25 g) ou les rats Sprague Dawley femelles (généralement âgés de 2 à 3 mois, ~250 g) à l’aide d’un vaporisateur muni d’un cône nasal. Calibrer le vaporisateur pour produire 3,0 % (v/v) d’isoflurane, 97 % (v/v) O 2 pour les souris ou 4,0 % (v/v) d’isoflurane, 96 % (v/v) O2 pour les rats. Confirmez que les animaux sont anesthésiés en s’assurant qu’ils ne répondent pas au pincement des orteils (généralement après 1 à 2 minutes).
    2. Maintenez la température corporelle de l’animal en plaçant les animaux sur un coussin chauffant. Surveillez l’animal tout au long du protocole de transduction pour vous assurer qu’il est anesthésié et qu’il ne ressent aucune douleur pendant cette procédure.
    3. Réduire l’isoflurane à 1,5 % (v/v) pour les souris ou à 2,0 % (v/v) pour les rats et maintenir les animaux sous anesthésie pendant toute la durée du protocole.
    4. Pour éviter d’introduire de l’air dans la vessie, remplissez la partie du cathéter en plastique d’un cathéter IV (voir le tableau des matériaux) et le moyeu associé avec du PBS stérile à l’aide d’une pipette de transfert.
    5. Avec l’animal en décubitus dorsal, écouvillonner le méat externe avec de l’alcool à 70% et insérer le cathéter stérile dans le méat externe, puis dans l’urètre, puis dans la vessie.
      1. Pour effectuer cette tâche, utilisez une pince fine pour saisir doucement le tissu formant le méat externe et l’étendre verticalement, loin de l’animal. En utilisant l’autre main, insérez soigneusement le cathéter verticalement d’environ 3-4 mm dans le méat urétral (un monticule de chair juste au-dessus de l’ouverture du vagin). Ensuite, en raison d’une courbure de l’urètre, abaissez le cathéter, inséré dans le méat externe, vers la queue de l’animal, ce qui facilite son entrée dans la partie de l’urètre qui passe sous l’os pubien, et finalement dans la vessie.
        . REMARQUE: Surtout dans le cas de la souris, le cathéter peut être trop long et pas plus de 1,0 à 1,1 cm de celui-ci doit être inséré dans l’animal. Sinon, des dommages à la muqueuse de la vessie s’ensuivront. Pour éviter cela, marquez le cathéter ~1 cm sous son extrémité, puis n’insérez pas le cathéter au-delà de ce marquage.
    6. Laissez l’urine dans la vessie s’écouler. Enlevez toute urine résiduelle en effectuant la manœuvre de Credé: masser et appuyer doucement sur la bosse de la vessie dans la région abdominale inférieure.
  2. Rendre l’urothélium réceptif à la transduction en le traitant avec une solution détergente.
    1. Lavez la vessie de souris ou de rat en attachant une seringue stérile de 1 mL remplie de PBS au moyeu du cathéter. Injectez 100 μL de PBS stérile dans la vessie de souris (ou 450 μL dans le cas de la vessie de rat). Détachez la seringue de l’ajustement du cathéter et laissez le PBS s’égoutter. Si nécessaire, effectuez la manœuvre de Crede pour éliminer l’excès de liquide vésical.
    2. Instiller 100 μL de N-dodécyl-β-D-maltoside (DDM) à 0,1 % (p/v) (dissous dans du PBS et stérilisé par filtre à 0,2 μm) dans la vessie de souris à l’aide d’une seringue stérile de 1 mL. Retenir le DDM dans la vessie pendant 10 min en laissant la seringue en place. Chez le rat, le volume de DDM est augmenté à 450 μL.
    3. Retirez le DDM de la vessie en détachant la seringue et en la laissant s’écouler. Effectuez la manœuvre de Crede si nécessaire.
  3. Introduisez le virus dans la vessie.
    1. Fixer une seringue stérile de 1 mL au moyeu du cathéter et instiller 0,5 x 107 à 1 x 108 IVP d’adénovirus (préparé à l’étape 1), dilué dans 100 μL de PBS stérile pour les souris ou 450 μL pour les rats, dans la vessie. Laissez la seringue attachée au cathéter pour empêcher la solution virale de s’échapper.
    2. Après 30 min, détachez la seringue et laissez la solution virale évacuer la vessie sur une serviette jetable. Épongez toute solution virale résiduelle avec une lingette absorbante, jetez le tampon et essuyez les déchets biologiques dangereux.
      REMARQUE: Le glycérol est cytotoxique. En tant que tel, le volume maximal de solution virale instillée chez la souris est limité à 5 μL (qui, une fois dilué dans 100 μL de PBS, entraînerait une concentration finale de glycérol de ~0,5% [v / v]). De plus, il est possible d’améliorer l’efficacité de la transduction en augmentant le nombre de PIV instillées et en prolongeant l’incubation du virus à 45 min.
    3. Étape facultative : La vessie peut être rincée avec du PBS comme décrit à l’étape 2.2.1 ci-dessus; toutefois, cela n’est pas obligatoire.
  4. Laissez l’animal récupérer.
    1. Cesser l’écoulement de l’isoflurane et permettre à l’animal de récupérer et d’être complètement mobile avant de le remettre dans sa cage, en particulier si les animaux sont logés en groupe.
      REMARQUE: Comme la transduction virale en soi ne provoque pas de symptômes ou de douleurs observables des voies urinaires inférieures, il n’est généralement pas nécessaire de traiter après une intervention chirurgicale. Toutefois, si le transgène codé est toxique, une analgésie postopératoire ou des antibiotiques peuvent être nécessaires selon les exigences de l’établissement.
  5. Analyser les effets de l’expression transgénique 12-72 h après le traitement en utilisant des méthodes telles que l’hybridation in situ de l’ARNm, le transfert Western ou l’immunofluorescence 9,10,23 (voir les résultats représentatifs).

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Résultats

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Préparation du virus
Un exemple de purification virale par centrifugation à gradient de densité est présenté à la figure 1A. La bande rose clair, située à l’interface du matériel cellulaire chargé et de la couche de CsCl de 1,25 g/mL, est principalement composée de cellules perturbées et de leurs débris (voir la flèche magenta à la figure 1A). Il tire sa couleur rosâtre de la petite quantité de milieu de culture qui est reprise de l’étape 1.5...

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Discussion

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Alors que Ramesh et coll. se concentraient sur l’élaboration de stratégies pour utiliser la transduction adénovirale dans le traitement du cancer de la vessie 18, des rapports plus récents ont démontré l’utilité de ces techniques dans l’étude de la biologie, de la physiologie urothéliale normale et de la physiopathologie 10,18,19,20,21 ...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

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Ce travail a été soutenu par une subvention de projet pilote par l’intermédiaire de P30DK079307 (à M.G.D.), subvention NIH R01DK119183 (à G.A. et M.D.C.), NIH subvention R01DK129473 (à G.A.), un prix de développement de carrière de l’American Urology Association et une subvention de la Fondation Winters (à N.M.), par les noyaux d’imagerie rénale Cell Physiology and Model Organisms du Pittsburgh Center for Kidney Research (P30DK079307), et par S10OD028596 (à G.A.), qui a financé l’achat du système confocal utilisé pour capturer certaines des images présentées dans ce manuscrit.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Corning Costar (Millipore Sigma)de 10 mLCLS4488pipette sérologique stérile, emballée individuellement
Tube d’ultracentrifugation de 12 mLThermoFisher06-752Tube d’ultracentrifugation à paroi mince en PET
de 15 mL Tube à centrifuger coniqueFalcon (Corning)352097aiguille stérile
de 18 gBD  ;305196aiguille de 18 g x 1,5 po
20 mLCorning Costar (Millipore Sigma)CLS4489pipette sérologique stérile, emballée individuellement
Tube à centrifuger conique de 50 mLFalcon (Corning)352098
pipette stérile de 5 mLCorning Costar (Millipore Sigma)CLS4487pipette sérologique stérile, emballée individuellement
CavicideHenry Schein6400012Solution antivirale
Boîte de culture cellulaire - 15 cmFalcon (Corning)353025stérile, traité par culture tissulaire (Plat de 150 mm x 25 mm)
Grattoir cellulaireSarstedt893.1832longueur du manche 24 cm, longueur de la lame 1,7 cm
CsClMillipore SigmaC-4306Biologie moléculaire grade &ge ; 98 %
Milieu de culture DMEM (high glucose)Gibco (ThermoFisher)11965092avec 4,5 g/L de glucose + L-glutamine + rouge de phénol
EDTAMillipore SigmaEDSBioiultra grade &ge ; 99 %
Sérum fœtal bovin  ;Hyclone (Cytiva)SH30070.03sérum défini
Pipette en verreFisher Scientific13-678-20A5.75 en pipette en verre, autoclavée
GlycérolMillipore SigmaG-5516Biologie moléculaire grade &ge ; 99
 %HEK293 cellulesATCCCRL-3216Les cellules HEK293T sont une variante des cellules HEK293 qui expriment le grand antigène T SV40
IsofluraneCovetrus29405
Cathéter IV - sourisSmith Medical Jelco306324 G x 3/4 in Safety Cathéter IV  ;
cathéter IV radio-opaque - ratSmith Medical Jelco306022 G x 1 in Safety Catheter radio-opaque
KClMillipore SigmaP-9541Biologie moléculaire grade &ge ; 99 %
KH2PO4Millipore SigmaP5655Qualité de culture cellulaire  ; &ge ; 99 %
Na2HPO4&bull ; 7 H2OMillipore Sigma431478  ; &ge ; 99,99 %
NaClMillipore SigmaS3014grade de biologie moléculaire &ge ; 99 %
N-dodécyl-&bêta ;-D-maltoside  ;Millipore SigmaD4641  ; &ge ; 98 %
Cône de nez pour plusieurs animaux,conçuescomprennent une colonne-10 de Parkland Scientific (RES3200
).GE Healthcare17-085-01Colonnes préemballées remplies de Sephadex G-25M
Pénicilline/streptomycine antibiotique (100x)Gibco (ThermoFisher)15070063100x
solution concentrée SpectrophotomètreEppendorf  ;BioPhotomètre
Support et pinceFisher Scientific14-679Q et 05-769-8FQdisponibles auprès de nombreux fournisseurs
Unité de filtration stérileFisher Scientific (Nalgene)09-740-65B0.2 µ ; Unité de filtration à débit rapide m (150 mL)
Unité de filtration stérile 0,2 & micro ; m (seringue)Fisher Scientific  ;SLGV004SLMillipore Sigma Milex 0,22 & micro ; Unité de filtration m qui se fixe à la seringue
Centrifugeuse à super vitesseEppendorf  ;5810Ravec rotor à angle fixe Eppendorf F34-6-38 (12 000 tr/min)
Seringue (1 mL)BD  ;309628seringue de 1 mL embout Luer-lok -
seringue stérile (3 mL)BD  ;309656Embout coulissant pour seringue de 3 mL - stérile
Centrifugeuse de table (basse vitesse)Eppendorf  ;5702avec rotor à godets oscillants
Pipettes de transfertFisher Scientific13-711-9AMpolyéthylène 3,4 mL Pipette de transfert
Tris-baseMillipore Sigma648310-MBiologie moléculaire
TrypLE select protéasesolution Gibco (ThermoFisher)12604013TrypLE express enzyme (1x), sans rouge de phénol
UltracentrifugeuseBeckman CoulterOptima L-80 XPavec rotor Beckman SW41 (41 000 tr/min)
Vaporisateur  ;Services d’anesthésie générale, Inc.Tec 3Isoflurane vaporisateur
Vortex MixerVWR10153-838mélangeur vortex analogique
Pipette pipette à de les options commerciales sur mesure

Références

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  1. Dalghi, M. G., Montalbetti, N., Carattino, M. D., Apodaca, G. The Urothelium: Life in a liquid environment. Physiological Reviews. 100 (4), 1621-1705 (2020).
  2. Truschel, S. T., et al. Stretch-regulated exocytosis/endocytosis in bladder umbrella cells. Molecular Biology of the Cell. 13 (3), 830-846 (2002).
  3. Lewis, S. A., de Moura, J. L. C. Incorporation of cytoplasmic vesicles into apical membrane of mammalian urinary bladder epthelium. Nature (London). 297 (5868), 685-688 (1982).
  4. Eaton, A. F., et al. Expansion and contraction of the umbrella cell apical junctional ring in response to bladder filling and voiding. Molecular Biology of the Cell. 30 (16), 2037-2052 (2019).
  5. Yu, W., Khandelwal, P., Apodaca, G. Distinct apical and basolateral membrane requirements for stretch-induced membrane traffic at the apical surface of bladder umbrella cells. Molecular Biology of the Cell. 20 (1), 282-295 (2009).
  6. Birder, L., Andersson, K. E. Urothelial signaling. Physiological Reviews. 93 (2), 653-680 (2013).
  7. Birder, L. A. Urinary bladder, cystitis and nerve/urothelial interactions. Autonomic Neuroscience. 182, 89-94 (2014).
  8. Apodaca, G., Balestreire, E., Birder, L. A. The uroepithelial-associated sensory web. Kidney International. 72 (9), 1057-1064 (2007).
  9. Dalghi, M. G., et al. Functional roles for PIEZO1 and PIEZO2 in urothelial mechanotransduction and lower urinary tract interoception. Journal of Clinical Investigation Insight. 6 (19), 152984(2021).
  10. Montalbetti, N., et al. Increased urothelial paracellular transport promotes cystitis. American Journal of Physiology: Renal Physiology. 309 (12), 1070-1081 (2015).
  11. Keay, S. K., Birder, L. A., Chai, T. C. Evidence for bladder urothelial pathophysiology in functional bladder disorders. BioMed Research International. 2014, 865463(2014).
  12. Friedel, R. H., Wurst, W., Wefers, B., Kuhn, R. Generating conditional knockout mice. Methods in Molecular Biology. 693, 205-231 (2011).
  13. Kashyap, M., et al. Down-regulation of nerve growth factor expression in the bladder by antisense oligonucleotides as new treatment for overactive bladder. Journal of Urology. 190 (2), 757-764 (2013).
  14. Bolenz, C., et al. Cellular uptake and ex vivo urothelial penetration by oligodeoxynucleotides for optimizing treatment of transitional cell carcinoma. Analytical and Quantitative Cytology and Histology. 30 (5), 265-273 (2008).
  15. Tyagi, P., et al. Intravesical antisense therapy for cystitis using TAT-peptide nucleic acid conjugates. Molecular Pharmaceutics. 3 (4), 398-406 (2006).
  16. Sadoff, J., et al. Interim results of a phase 1-2a trial of Ad26.COV2.S Covid-19 vaccine. New England Journal of Medicine. 384 (19), 1824-1835 (2021).
  17. Lee, C. S., et al. Adenovirus-mediated gene delivery: Potential applications for gene and cell-Based therapies in the new era of personalized medicine. Genes & Diseases. 4 (2), 43-63 (2017).
  18. Ramesh, N., et al. Identification of pretreatment agents to enhance adenovirus infection of bladder epithelium. Molecular Therapy. 10 (4), 697-705 (2004).
  19. Khandelwal, P., et al. Rab11a-dependent exocytosis of discoidal/fusiform vesicles in bladder umbrella cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15773-15778 (2008).
  20. Khandelwal, P., Ruiz, W. G., Apodaca, G. Compensatory endocytosis in bladder umbrella cells occurs through an integrin-regulated and RhoA- and dynamin-dependent pathway. The European Molecular Biology Organization journal. 29 (12), 1961-1975 (2010).
  21. Khandelwal, P., et al. A Rab11a-Rab8a-Myo5B network promotes stretch-regulated exocytosis in bladder umbrella cells. Molecular Biology of the Cell. 24 (7), 1007-1019 (2013).
  22. Prakasam, H. S., et al. A1 adenosine receptor-stimulated exocytosis in bladder umbrella cells requires phosphorylation of ADAM17 Ser811 and EGF receptor transactivation. Molecular Biology of the Cell. 25 (24), 3798-3812 (2014).
  23. Gallo, L. I., et al. RAB27B requirement for stretch-induced exocytosis in bladder umbrella cells. American Journal of Physiology Cell Physiology. 314 (3), 349-365 (2018).
  24. Amasheh, S., et al. Claudin-2 expression induces cation-selective channels in tight junctions of epithelial cells. Journal of Cell Science. 115, 4969-4976 (2002).
  25. Yu, A. S., et al. Molecular basis for cation selectivity in claudin-2-based paracellular pores: identification of an electrostatic interaction site. The Journal of General Physiology. 133 (1), 111-127 (2009).
  26. Kasahara, H., Aoki, H. Gene silencing using adenoviral RNAi vector in vascular smooth muscle cells and cardiomyocytes. Methods in Molecular Medicine. 112, 155-172 (2005).
  27. Bolognesi, B., Lehner, B. Reaching the limit. eLife. 7, 39804(2018).
  28. Atasheva, S., Shayakhmetov, D. M. Cytokine responses to adenovirus and adenovirus vectors. Viruses. 14 (5), 888(2022).
  29. Sanchez Freire, V., et al. MicroRNAs may mediate the down-regulation of neurokinin-1 receptor in chronic bladder pain syndrome. American Journal of Pathology. 176 (1), 288-303 (2010).

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Transduction par ad novirusexpression de transg nestechnique de cath t rismebarri re uroth lialeWestern blotanalyse par immunofluorescencehybridation in situ de l ARNmexpression de la claudine 2cellules parapluies

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