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Article de méthode

Développement d’une technique chirurgicale pour les implants sous-rétiniens chez le rat

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DOI :

10.3791/64585

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2 décembre 2022

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1USC Roski Eye Institute, Keck School of Medicine of the University of Southern California, 2USC Dr. Allen and Charlotte Ginsburg Institute for Biomedical Therapeutics, University of Southern California, 3Department of Pathology, Keck School of Medicine of the University of Southern California, 4Regenerative Patch Technologies LLC, 5Eye center, Beijing Tsinghua Changgung Hospital, School of Clinical Medicine, Tsinghua University

Dans cet article

Résumé

Le présent protocole décrit l’approche sclérale pour l’implantation de dispositifs sous-rétiniens, une technique chirurgicale réalisable pour la mise en œuvre dans des modèles animaux de maladies rétiniennes dans la recherche.

Résumé

La dégénérescence rétinienne, telle que la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA), est l’une des principales causes de cécité dans le monde. Une myriade d’approches ont été entreprises pour développer des thérapies basées sur la médecine régénérative pour la DMLA, y compris des thérapies à base de cellules souches. Les rongeurs en tant que modèles animaux de la dégénérescence rétinienne constituent une base pour la recherche translationnelle, en raison du large éventail de souches qui développent des maladies de dégénérescence rétinienne à différents stades. Cependant, il est difficile d’imiter l’administration thérapeutique humaine d’implants sous-rétiniens chez les rongeurs, en raison de différences anatomiques telles que la taille du cristallin et le volume vitré. Ce protocole chirurgical vise à fournir une méthode guidée pour la transplantation d’implants dans l’espace sous-rétinien chez le rat. Une description complète et conviviale des étapes critiques a été incluse. Ce protocole a été développé comme une procédure chirurgicale rentable pour la reproductibilité dans différentes études précliniques chez le rat. Une miniaturisation appropriée d’un implant à taille humaine est nécessaire avant de mener l’expérience chirurgicale, ce qui comprend des ajustements aux dimensions de l’implant. Une approche externe est utilisée au lieu d’une procédure intravitréenne pour administrer l’implant dans l’espace sous-rétinien. À l’aide d’une petite aiguille pointue, une incision sclérale est pratiquée dans le quadrant temporal supérieur, suivie d’une paracentèse pour réduire la pression intraoculaire, minimisant ainsi la résistance lors de l’implantation chirurgicale. Ensuite, une injection de solution saline équilibrée (BSS) à travers l’incision est effectuée pour obtenir un décollement focal de la rétine (DR). Enfin, l’insertion et la visualisation de l’implant dans l’espace sous-rétinien sont effectuées. L’évaluation postopératoire de la mise en place sous-rétinienne de l’implant comprend l’imagerie par tomographie par cohérence optique dans le domaine spectral (SD-OCT). Les suivis d’imagerie permettent de déterminer la stabilité sous-rétinienne de l’implant, avant que les yeux ne soient prélevés et fixés pour une analyse histologique.

Introduction

La dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA) est l’une des principales causes de cécité dans le monde. Le nombre de personnes atteintes de DMLA en 2020 était estimé à 196 millions, et ce nombre devrait passer à environ 288 millions d’ici 20401. Au cours de la dernière décennie, plusieurs traitements ont été mis au point pour atténuer les changements visuels associés aux stades avancés de la DMLA, principalement pour traiter le développement et la progression de la néovascularisation choroïdienne observée dans la DMLA humide. À l’inverse, on estime que le traitement de la DMLA sèche, où le dysfonctionnement et la perte de cellules de l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) progressent vers l’EPR et l’atrophie rétinienne, représente 85 % à 90 % des DMLA, avec une prévalence de 0,44 % dans le monde 1,2. La DMLA a été décrite comme une maladie multifactorielle avec des facteurs liés à l’âge, à la génétique et à l’environnement contribuant à l’apparition et à la progression de la maladie. Plusieurs thérapies sont en cours de développement pour aborder les différentes voies physiopathologiques associées à cette maladie3.

La thérapie à base de cellules souches a été développée comme une nouvelle option thérapeutique pour remplacer l’EPR défaillant dans la DMLA4 sèche. Bien que l’utilisation des cellules souches pluripotentes en soit encore aux premiers essais cliniques, l’innocuité a été démontrée dans plusieurs essais cliniques 5,6,7. À ce jour, il existe deux voies principales pour déployer des cellules souches dans l’espace sous-rétinien : la suspension ou l’insertion d’un patch monocouche ensemencé sur un implant biocompatible 8,9,10,11,12. Les nouvelles stratégies utilisant des thérapies à base de cellules souches dans les études précliniques nécessitent des modèles animaux où les thérapies à base de cellules souches peuvent être administrées au même site ciblé que celui prévu chez l’homme. La différence d’anatomie peut nécessiter des modifications mineures des procédures, de l’équipement chirurgical et de l’approche par rapport à celles utilisées avec le produit humain final13,14. La modification des techniques de chirurgie oculaire est l’un des changements nécessaires qui a été largement décrit comme une approche réussie pour une utilisation dans différents modèles animaux 15,16,17.

Bien que des publications antérieures aient mentionné des techniques chirurgicales pour les implants sous-rétiniens chez le rat, il n’existe pas de descriptions complètes de ces techniques pour surmonter les difficultés techniques que les chercheurs peuvent rencontrer. Par conséquent, il est nécessaire de décrire correctement les techniques chirurgicales en détail, de fournir les meilleures pratiques et les leçons apprises à éviter et, si nécessaire, de résoudre les problèmes lors des étapes critiques de la procédure. Le but de ce manuscrit est de fournir une ligne directrice complète pour l’implantation chirurgicale de l’implant dans l’espace sous-rétinien chez le rat.

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Protocole

Toutes les expériences ont été approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Université de Californie du Sud et ont été réalisées conformément au Guide for the Care and Use of Laboratory Animals des National Institutes of Health (NIH) et à la déclaration de l’Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) pour l’utilisation des animaux dans la recherche ophtalmique et visuelle. Au total, 12 rats mâles du Royal College of Surgeon (RCS) ont été utilisés dans la présente étude. Les animaux ont été élevés dans l’animalerie et inclus dans l’étude une fois qu’ils ont atteint l’âge de 28 ans ± 1 jour après l’accouchement. Un examen complet de la vue a été effectué pour vérifier l’absence d’anomalies oculaires. Les implants sous-rétiniens, membranes ultraminces en parylène C et recouvertes de vitronectine, ont été conçus par une organisation commerciale spécifique (voir Tableau des matériaux). Ces membranes reproduisent des membranes à taille humaine en termes d’épaisseur et de perméabilité (cadre en maille de 6,0 m d’épaisseur avec pores circulaires de 20 m dans les zones ultraminces). La miniaturisation de la longueur et de la largeur (1,0 mm × 0,4 mm) des membranes de taille humaine a été réalisée pour accueillir les implants sous-rétiniens à l’intérieur des yeux de rongeurs18.

1. Soins aux animaux et préparation chirurgicale

  1. Pesez l’animal pour calculer la dose d’anesthésie et anesthésiez en suivant l’étape 1.2.
  2. Anesthésier l’animal par injection intrapéritonéale d’un mélange de kétamine et de xylazine (35-50 mg/kg et 5-10 mg/kg, respectivement ; voir le tableau des matériaux). Injecter avec une seringue de 1,0 mL et une aiguille de 30 G.
  3. Chargez une autre seringue de 1,0 ml avec la moitié de la quantité du mélange d’anesthésie (kétamine et xylazine) pour maintenir le niveau approprié d’anesthésie pendant la procédure.
  4. Confirmer une anesthésie adéquate par l’absence de réflexe de pédale (pincement ferme de l’orteil).
  5. Pour bien visualiser la cavité vitrée et la rétine, dilater la pupille par l’instillation de gouttes ophtalmiques de tropicamide à 1 % et de phényléphrine à 2,5 % (voir tableau des matériaux) dans l’œil traité.
    1. Appliquez une deuxième dose de gouttes ophtalmiques pour la dilatation après 5 min.
  6. Appliquez des larmes artificielles ou du gel lubrifiant oculaire dans l’œil non chirurgical toutes les 5 à 10 minutes pendant que l’animal est anesthésié pour hydrater la cornée.
  7. Placez un champ stérile sur le coussin chauffant (voir le tableau des matériaux). Placez un champ stérile recouvrant le plateau chirurgical.
  8. Préparez la zone chirurgicale stérile en plaçant les instruments stériles suivants sur le plateau chirurgical : gants chirurgicaux, implant sous-rétinien et outils chirurgicaux : pince à moustiques (3), ciseaux fins microchirurgicaux (1), porte-aiguille (1), pince fine avec dents (1), pince droite fine sans dents (2), seringue de microlitre (1), aiguille émoussée de 32 g (1), aiguille de 27 g ou 30 g (2), Suture en soie 4-0 (3), cotons-tiges, solution saline équilibrée (BSS) et une lamelle (voir le tableau des matériaux).
  9. Dans des conditions stériles et à l’aide de gants stériles, chargez la seringue d’un microlitre avec le BSS et fixez l’aiguille émoussée de 32 G.
  10. Insérez l’embout en coton dans l’embout de l’aiguille 27 G ou 30 G pour créer une poignée permettant une manipulation plus sensible de l’aiguille.
  11. Pour maintenir des conditions stériles tout au long de la procédure, changez les gants stériles si des instruments ou des zones non stériles sont manipulés, comme le microscope chirurgical.

2. Approche sclérale pour l’implantation sous-rétinienne : technique chirurgicale

  1. Exposez la zone chirurgicale en suivant les étapes ci-dessous.
    1. Une fois que l’animal est sous anesthésie et que la pupille est dilatée (étape 1.5), placez l’animal sur le ventre vers le bas, la tête vers le chercheur.
      REMARQUE : Gardez le rat sur le coussin chauffant recouvert d’un champ stérile pendant toute la chirurgie et jusqu’à ce que l’animal soit complètement rétabli.
    2. Appliquez des gouttes de povidone à 5 % (voir le tableau des matériaux) sur l’œil et nettoyez la surface de l’œil et les paupières avec des cotons-tiges.
    3. Placez et ajustez le microscope chirurgical (voir Tableau des matériaux) sur l’œil chirurgical.
      REMARQUE : Il est recommandé d’utiliser un microscope ophtalmique chirurgical tout au long de l’intervention chirurgicale pour obtenir une visualisation plus nette et plus grande des structures oculaires.
    4. Assurez-vous d’une bonne exposition de la zone chirurgicale en soulevant la paupière supérieure et en faisant saillir le globe oculaire à l’aide de sutures non résorbables 4-0.
      1. Élevez la paupière supérieure à l’aide d’une suture en soie 4-0. Placez la suture sur la face antérieure des paupières au niveau des glandes de Meibomius. Fixez la suture de traction en fixant la pince anti-moustiques à la surface chirurgicale.
        REMARQUE : Si la suture est placée plus haut que le niveau de la glande de Meibomius, l’éversion de la paupière se produira au lieu de l’élévation de la paupière.
      2. Effectuer une péritomie du quadrant temporal supérieur à l’aide de ciseaux fins microchirurgicaux.
      3. Placez deux sutures de traction pour permettre la saillie et le déplacement vers l’avant du globe oculaire. Effectuez l’isolation du muscle droit supérieur.
        1. En manipulant doucement l’œil à l’aide d’une pince à dents fines (pince de 0,12 mm) dans la partie supérieure du limbe, roulez l’œil vers le bas pour exposer la sclère.
        2. Placez une suture en soie 4-0 derrière le limbe supérieur jusqu’à 1 mm de distance, qui est l’emplacement du muscle extraoculaire supérieur. Clampez les deux queues de la suture à l’aide d’une pince à moustiques.
      4. Effectuer l’isolation du muscle droit temporal. Placez une deuxième suture (soie 4-0) jusqu’à 1 mm du limbe dans le quadrant temporal (au niveau de la zone correspondante du muscle extraoculaire temporal). Clampez les deux queues de la suture à l’aide d’une pince à moustiques.
      5. Une fois que les deux sutures du muscle extraoculaire sont correctement placées et serrées, tirez les sutures vers le bas et vers l’intérieur pour exposer le quadrant temporal supérieur de la sclère.
    5. Prolongez la péritomie vers l’arrière de l’œil à l’aide de ciseaux fins microchirurgicaux.
    6. Contrôlez les saignements conjonctivals à l’aide de cotons-tiges.
  2. Effectuez une incision sclérale, un décollement de la rétine (DR) et l’insertion d’un implant en suivant les étapes ci-dessous.
    1. Effectuez une incision sclérale à l’aide d’une aiguille de 27 G ou 30 G. Assurez-vous que la taille de l’incision est de ~1,2 mm et qu’elle est de 1,5 mm à l’arrière du limbe.
      REMARQUE : Le développement d’une configuration d’incision sclérale en forme de tunnel est recommandé pour stabiliser les structures intraoculaires tout en manipulant l’œil et en introduisant l’implant. Cette forme d’incision empêchera les fluctuations soudaines de la pression intraoculaire.
    2. Parfois, une bonne configuration nécessite de la pratique. Par conséquent, si la configuration correcte n’est pas obtenue, relâchez une certaine tension des sutures de traction du muscle extraoculaire pour faciliter le maintien des structures oculaires à l’intérieur de la cavité vitrée.
    3. En utilisant la même aiguille que celle utilisée pour l’incision sclérale (27 G ou 30 G), effectuez une paracentèse dans la cornée périphérique au même quadrant.
    4. Insérez l’aiguille émoussée de 32 G montée sur une seringue d’un microlitre à travers l’incision sclérale.
    5. Injecter 100 μL de BSS pour créer un DR focal.
    6. Relâchez les sutures de traction du muscle extraoculaire pour remettre l’œil en position normale.
    7. Pour une visualisation directe de la diététologie, posez et tenez la lamelle, chargée de gel lubrifiant ophtalmique, sur la cornée.
    8. Ajustez l’objectif du microscope pour qu’il fasse la mise au point sur la rétine.
    9. Si la DR n’est pas observée ou si elle est trop petite (plus petite que la taille d’un quadrant), effectuer une deuxième injection de BSS pour obtenir la taille de DR souhaitée en roulant l’œil vers le bas et vers l’intérieur et en répétant les étapes 2.2.4 à 2.2.8.
    10. Une fois le RD terminé, vérifiez la longueur sclérale (comme mentionné à l’étape 2.2.1) avec un pied à coulisse (voir le tableau des matériaux).
    11. Coupez le tissu choroïdien dans les deux sens avec de fins ciseaux microchirurgicaux.
    12. Passez l’aiguille émoussée sur le côté le long de l’incision sclérale pour vérifier que toutes les structures sclérales et choroïdiennes ont été disséquées.
    13. Insérez l’implant dans l’espace sous-rétinien.
    14. À l’aide de deux pinces chirurgicales fines, telles que des pinces à attacher (voir tableau des matériaux), saisissez l’implant par l’arrière afin de ne pas endommager la partie active de l’implant.
    15. Placez l’implant parallèlement au plan d’incision et glissez-le doucement.
    16. Une fois que l’implant est complètement introduit dans l’espace sous-rétinien, relâchez-le et enfoncez l’implant plus loin en introduisant les mâchoires de l’une des pinces de 1 à 1,5 mm dans l’incision.
    17. Relâchez les sutures de traction du muscle extraoculaire et vérifiez la position de l’implant à l’aide du microscope et de la lamelle comme décrit ci-dessus (étapes 2.2.7 et 2.2.8).
  3. Relâchez et retirez toutes les sutures.
    REMARQUE : Une fois l’intervention chirurgicale terminée, une TS-OCT est effectuée (étape 3) pour valider les signes cliniques. La séance d’imagerie SD-OCT est réalisée juste après l’opération. Si la visualisation correcte de l’emplacement de l’implant n’a pas été obtenue, effectuez à nouveau le SD-OCT 7 à 10 jours après l’opération.

3. Imagerie SD-OCT

  1. Cliquez sur l’icône Heidelberg Eye Explorer (un logiciel de gestion d’images ; voir Tableau des matériaux) sur l’écran du bureau.
  2. Cliquez sur l’icône Nouveau patient en haut de l’écran.
    1. Remplissez toutes les informations demandées pour générer l’identifiant de l’animal et cliquez sur Accepter.
    2. Sélectionnez le système d’imagerie OCT (HRA + OCT ; voir Tableau des matériaux) pour le type d’appareil.
    3. Sélectionnez l’opérateur et appuyez sur OK.
    4. Pour obtenir l’option de courbure de la cornée correcte, appuyez sur le bouton OK pour accepter les données oculaires par défaut.
  3. Assurez-vous que la fenêtre d’acquisition SD-OCT est lancée et prête pour SD-OCT.
  4. Allumez l’appareil photo SD-OCT en appuyant sur le bouton jaune Démarrer situé sur l’écran tactile à côté de l’appareil photo.
  5. Placez l’animal sur la scène d’animal SD-OCT qui a été adaptée sur le dessus de l’appui-tête SD-OCT.
    REMARQUE : L’adaptation au stade de l’animal comprend un morceau de mousse de polystyrène (voir le tableau des matériaux) pour s’adapter à l’étage de tête SD-OCT qui est suffisamment grand pour placer l’animal, y compris le coussin chauffant.
  6. Ajustez la hauteur de la table et la position de l’animal pour aligner la pupille avec le centre de l’objectif SD-OCT.
    REMARQUE : Une fois l’œil aligné, une image infrarouge en direct (IR) apparaîtra à l’écran.
  7. Appuyez sur le bouton IR + OCT de l’écran tactile ou sur le bouton OCT en bas à droite du moniteur pour démarrer l’acquisition d’images.
  8. Une fois le SD-OCT mis en service, sélectionnez un seul mode de numérisation avec le plus grand nombre (100) de trames ART. Le mode de balayage 100 ART est le mode par défaut.
  9. À l’aide du joystick de l’appareil photo, centrez le nerf optique sur l’image IR.
  10. Poussez l’appareil photo vers l’avant jusqu’à ce que l’image IR soit uniformément remplie avec l’image rétinienne.
    REMARQUE : Les coins sombres indiquent que l’appareil photo est trop loin ou trop près de l’œil.
  11. Déplacez la caméra sur le côté jusqu’à ce que l’implant soit visualisé dans l’aspect temporal de la rétine. Utilisez l’image IR pour guider les mouvements.
  12. Pour visualiser l’implant par le B-scan, appuyez simultanément sur CTRL + ALT + SHIFT + O pour afficher la fenêtre de réglage du SD-OCT B-scan.
  13. Ajustez le « bras de référence » (en bas de la fenêtre) jusqu’à ce que la rétine/l’implant soit visualisé dans l’image SD-OCT.
    REMARQUE : L’image SD-OCT doit être affichée dans les coins de référence bleus.
  14. Fermez la fenêtre.
  15. À l’aide du joystick et de la poignée de l’appareil photo, faites glisser et pivotez l’appareil photo dans toutes les directions jusqu’à ce que vous obteniez une image de qualité SD-OCT meilleure, plus plate et plus nette.
  16. Faites glisser la flèche bleue sur l’image IR jusqu’à ce qu’elle soit placée le long de l’implant.
  17. Une fois que la saturation et le placement du B-scan sont optimaux, activez le « Suivi automatique en temps réel (ART) » en appuyant sur le bouton noir Gain Control situé sous l’écran tactile.
  18. Une fois que l’ART atteint 100 images, appuyez sur Acquire sur l’écran tactile.
  19. Lorsque toutes les images ont été acquises, cliquez sur Enregistrer les images en haut de la fenêtre, puis cliquez sur Quitter.
  20. Gardez la cornée humide pendant toute la séance d’imagerie en appliquant fréquemment des gouttes oculaires lubrifiantes (toutes les 5 minutes).

4. Récupération des animaux

  1. À la fin de la séance d’imagerie, appliquez une pommade antibiotique sur la cornée pour prévenir l’infection oculaire et hydrater la cornée.
  2. Gardez l’animal couché sur le ventre sur le coussin chauffant jusqu’à ce qu’il soit complètement rétabli (~20-30 min) et ambulatoire.
  3. Administrer des analgésiques systémiques (1,0-1,2 mg/kg de buprénorphine SR une fois sous-cutanée ; voir le tableau des matériaux) à la fin de l’intervention chirurgicale.
  4. Ne laissez pas l’animal sans surveillance jusqu’à ce qu’il ait repris suffisamment conscience.
  5. Ne retournez pas l’animal en compagnie d’autres animaux avant qu’il ne soit complètement rétabli.
  6. Une fois complètement rétabli, remettez l’animal dans la zone d’hébergement avec accès à de la nourriture et de l’eau à volonté.

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Résultats

L’implantation d’un implant sous-rétinien chez des rats RCS (N = 12) a démontré la faisabilité et la reproductibilité de la technique chirurgicale pour l’administration sous-rétinienne chez le rat. Dans cette étude, l’œil droit était l’œil traité (N = 12) avec l’implant. Dans l’évaluation clinique réalisée à la fin de l’intervention à l’aide du microscope chirurgical, neuf des 12 yeux traités ont montré une localisation sous-rétinienne de l’implant (75,00 %), deux yeux (16,67 %) ont été ...

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Discussion

Bien que la procédure ait déjà été décrite avec de légères variations, l’objectif de ce manuscrit est de fournir une description complète d’une procédure chirurgicale pour les implants sous-rétiniens chez le rat à suivre lors de l’apprentissage de la technique et de surmonter les défis chirurgicaux et les complications potentielles que les chercheurs peuvent rencontrer. Le protocole chirurgical décrit ici comprend l’utilisation de la membrane de parylène ultramince qui a été largement ut...

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Déclarations de divulgation

M.S.H., D.R.H. et J.L. sont cofondateurs et consultants de Regenerative Patch Technologies (RPT). Les autres auteurs certifient qu’ils n’ont aucune affiliation ou implication dans une organisation ou une entité ayant un intérêt financier ou non financier dans le sujet ou les matériaux discutés dans ce manuscrit.

Remerciements

Cette étude a été financée par le CIRM DT3 (MSH) et la Recherche pour prévenir la cécité (USC Roski Eye Institute). Nous tenons à remercier Fernando Gallardo et le Dr Ying Liu pour leur assistance technique.

Le commanditaire n’a joué aucun rôle dans la conception ou la conduite de cette recherche.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
1 cc syringeVWRBD309659
27 G needle 1/2''VWRBD305109
30 G needle 1/2''VWRBD305106
32 G Blunt needle - Small hub RNHamilton7803-04
4-0 Perma Hand silk black 1X18" PC-5Ethicon1984G
6'' sterile cotton tipsVWR10805-154
Betadine 5% sterile ophthalmic prep solutionAlcon8007-1
BSS irrigating solution 15 mLAccutomeAx17362
Buprenorphine ERZooPharmN/A
Castroviejo CaliperStorzE2405
Castroviejo suturing forceps 0.12 mmStorzE1796
Clayman-Vannas scissors straightStorzE3383S
Cover glass, squareWVR48366-227
EPS Polystyrene blockSilverlake LLCCFB8x12x2
Gonak 15 mLAccutomeAx10968Eye lubricant
Halstead straight hemostatic mosquito forceps non-magneticStorzE6772
Hamilton syringe 700 series 100 µL Hamilton7638-01
HEYEX SoftwareHeidelberg N/Aan image management software
Kelman-McPherson tying forceps angledStorzE1815 AKUS
Ketamine (100 mg/mL)MWI501072
Needle holder 9mm curved fine lockingStorz3-302
Neomycin/Polymyxin B sulfactes/Bacitracin zinc ointment 3.5 gAccutomeAx0720
Ophthalmic surgical microscopeZeissSN: 233922
Phenylephrine 2.5% 15 mLAccutomeAx0310
Spectralis SD-OCTHeidelberg SPEC-CAM-011210s3600
Sterile DrapeVWR100229-300
Sterile surgical glovesVWR89233-804
T-Pump heating systemGaymarTP650
Tropicamide 1% 15 mLAccutomeAx0330
Ultrathin membranes made from Parylene C and coated with vitronectinMini Pumps LLC, CAspecifically designed for this studyused as subretinal implants 
Xylazine (100 mg/mL)MWI510650

Références

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