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Article de méthode

Évaluation des changements dans la plasticité synaptique à l’aide d’un modèle éveillé de traumatisme crânien traumatique léger

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DOI :

10.3791/64592

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20 janvier 2023

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1Division of Medical Sciences, University of Victoria, 2Island Medical Program, University of British Columbia

Dans cet article

Résumé

Ici, il est démontré comment un modèle de traumatisme crânien fermé éveillé peut être utilisé pour examiner les effets des lésions cérébrales traumatiques légères répétées (r-mTBI) sur la plasticité synaptique dans l’hippocampe. Le modèle reproduit des caractéristiques importantes du r-mTBI chez les patients et est utilisé conjointement avec l’électrophysiologie in vitro .

Résumé

Les traumatismes crâniens légers (TCC) sont un problème de santé répandu en Amérique du Nord. Il y a une pression croissante pour utiliser des modèles écologiquement valides de TCL à tête fermée dans le contexte préclinique afin d’accroître la translatabilité à la population clinique. Le modèle de lésion à tête fermée éveillée (ACHI) utilise un impacteur cortical contrôlé modifié pour administrer une blessure à tête fermée, induisant des déficits comportementaux cliniquement pertinents sans avoir besoin d’une craniotomie ou de l’utilisation d’un anesthésique.

Cette technique n’induit normalement pas de décès, de fractures du crâne ou de saignements cérébraux, et est plus compatible avec une blessure légère. En effet, la nature légère de la procédure ACHI la rend idéale pour les études portant sur les TCL répétitifs (r-mTBI). De plus en plus de preuves indiquent que le r-mTBI peut entraîner une blessure cumulative qui produit des symptômes comportementaux, des changements neuropathologiques et une neurodégénérescence. Le TCLm r est fréquent chez les jeunes qui pratiquent des sports, et ces blessures surviennent pendant une période de réorganisation synaptique robuste et de myélinisation, ce qui rend la population plus jeune particulièrement vulnérable aux influences à long terme du TCL-r.

En outre, le TCLm se produit dans les cas de violence entre partenaires intimes, une condition pour laquelle il existe peu de mesures de dépistage objectives. Dans ces expériences, la fonction synaptique a été évaluée dans l’hippocampe chez des rats juvéniles qui avaient subi un TCL-r à l’aide du modèle ACHI. Après les blessures, une trancheuse tissulaire a été utilisée pour fabriquer des tranches d’hippocampe afin d’évaluer la plasticité synaptique bidirectionnelle dans l’hippocampe 1 ou 7 jours après le r-mTBI. Dans l’ensemble, le modèle ACHI fournit aux chercheurs un modèle écologiquement valide pour étudier les changements dans la plasticité synaptique après un TCL et un TCLr.

Introduction

Les traumatismes crâniens (LCT) constituent un problème de santé important, avec ~2 millions de cas au Canada et aux États-Unis chaque année 1,2. Les traumatismes crâniens touchent tous les groupes d’âge et tous les sexes et ont un taux d’incidence supérieur à toute autre maladie, notamment le cancer du sein, le sida, la maladie de Parkinson et la sclérose en plaques3. Malgré la prévalence des traumatismes crâniens, leur physiopathologie reste mal comprise et les options de traitement sont limitées. Cela s’explique en partie par le fait que 85 % de tous les traumatismes crâniens sont classés comme légers (TCLm) et que l’on pensait auparavant que les TCL ne produisaient que des changements comportementaux limités et transitoires sans conséquences neuropsychiatriques à long terme 4,5. Il est maintenant reconnu que la récupération des TCL peut prendre des semainesà 5,6 ans, précipiter des affections neurologiques plus graves4, et que même des impacts répétés « sous-commotionnels » affectent le cerveau7. C’est alarmant, car les athlètes dans des sports tels que le hockey / football ont >10 impacts subcommotionnels à la tête par match / séance d’entraînement 7,8,9,10.

Les adolescents ont la plus forte incidence de traumatismes crâniens et, au Canada, environ un adolescent sur 10 consultera un médecin chaque année pour une commotion cérébrale liée au sport11,12. En réalité, tout impact sous-commotionnel à la tête ou TCL peut causer des dommages diffus au cerveau, ce qui pourrait également créer un état plus vulnérable pour des blessures ultérieures et / ou des affections neurologiques plus graves 13,14,15,16,17. Au Canada, il est reconnu légalement par la loi de Rowan que les blessures antérieures peuvent accroître la vulnérabilité du cerveau à d’autres lésions18, mais la compréhension mécaniste du TCLm en r-m demeure terriblement inadéquate. Il est clair, cependant, que le TCLm unique et le TCL-r peuvent avoir un impact sur la capacité d’apprentissage au cours des années scolaires19,20, avoir des résultats spécifiques au sexe 21,22,23,2 4 et nuire à la capacité cognitive plus tard dans la vie 16,25,26. En effet, les analyses de cohorte associent fortement le r-mTBI tôt dans la vie à la démence plus tard27,28. Le TCL-r est également potentiellement associé à l’encéphalopathie traumatique chronique (ETC), caractérisée par l’accumulation de protéine tau hyperphosphorylée et une atrophie corticale progressive et précipitée par une inflammation importante 27,29,30,31. Bien que les liens entre le TCLm et le CTE soient actuellement controversés32, ce modèle permettra de les explorer plus en détail dans un contexte préclinique.

Un TCL est souvent décrit comme une « blessure invisible », car il se produit dans un crâne fermé et est difficile à détecter, même avec des techniques d’imagerie modernes33,34. Un modèle expérimental précis de TBI doit adhérer à deux principes. Tout d’abord, il devrait récapituler les forces biomécaniques normalement observées dans la population clinique35. Deuxièmement, le modèle devrait induire des résultats comportementaux hétérogènes, ce qui est également très répandu dans les populations cliniques36,37,38. Actuellement, la majorité des modèles précliniques ont tendance à être plus sévères, impliquant une craniotomie, un appuie-tête stéréotaxique, une anesthésie et des impacts corticaux contrôlés (ICC) qui produisent des dommages structurels importants et des déficits comportementaux plus importants que ceux normalement observés cliniquement33. Une autre préoccupation avec de nombreux modèles précliniques de commotion cérébrale qui impliquent des craniotomies est que cette procédure elle-même crée une inflammation dans le cerveau, ce qui peut exacerber les symptômes du TCL et la neuropathologie de toute blessure ultérieure39,40. L’anesthésie introduit également plusieurs facteurs de confusion complexes, notamment la réduction de l’inflammation 41,42,43, la modulation de la fonction microgliale 44, la libération de glutamate45, l’entrée de Ca2+ par les récepteurs NMDA 46, la pression intracrânienne et le métabolisme cérébral 47. L’anesthésie introduit en outre des confusions en augmentant la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique (BHE), l’hyperphosphorylation tau et les niveaux de corticostéroïdes, tout en réduisant la fonction cognitive 48,49,50,51. De plus, les traumatismes crâniens diffus et fermés représentent la grande majorité des TCL cliniques52. Ils permettent également de mieux étudier la multitude de facteurs qui peuvent influencer les résultats comportementaux, y compris le sexe21, l’âge 53, l’intervalle inter-blessures15, la gravité54 et le nombre de blessures23.

La direction des forces accélératives / décélératives (verticales ou horizontales) est également une considération importante pour les résultats comportementaux et moléculaires. Les recherches de Mychasiuk et de ses collègues ont comparé deux modèles de TCL diffus à tête fermée : la perte de poids (forces verticales) et l’impact latéral (forces horizontales)55. Les analyses comportementales et moléculaires ont révélé des résultats hétérogènes dépendants du modèle et du sexe après un TCL. Ainsi, les modèles animaux qui aident à éviter les interventions chirurgicales, tout en incorporant des forces linéaires et rotationnelles, sont plus représentatifs des conditions physiologiques dans lesquelles ces blessures surviennent normalement33,56. Le modèle ACHI a été créé en réponse à ce besoin, permettant l’induction rapide et reproductible de TCL chez le rat tout en évitant les procédures (c.-à-d. l’anesthésie) connues pour biaiser les différences entre les sexes57.

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Protocole

L’approbation de toutes les procédures relatives aux animaux a été donnée par le Comité de protection des animaux de l’Université de Victoria, conformément aux normes du Conseil canadien de protection des animaux (CCPA). Tous les rats Long-Evans mâles ont été élevés à l’interne ou achetés (voir le tableau des matériaux).

1. Conditions de logement et d’élevage

  1. Laisser les animaux s’acclimater à leur environnement de logement pendant 1 semaine avant le sevrage au jour postnatal (JPN) 21.
  2. Maintenir les rats dans des cages standard à 22,5 °C ± 2,5 °C, avec un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau, sur un cycle lumière/obscurité de 12 h.
  3. Regroupez et hébergez les animaux avec deux ou trois compagnons de portée appariés et assignez-les au hasard à des conditions simulées ou r-TBI.
  4. Effectuez toutes les procédures entre 7h30 et 23h30.

2. Mise en place de la procédure de blessure à tête fermée éveillée

  1. Position a 2,75 po. Coussinet en mousse basse densité (100 cm x 15 cm x 7 cm) sous l’élément de frappe pour permettre le mouvement de rotation de la tête.
    REMARQUE : Le coussin de mousse avait une constante de ressort de ~2 500 N/m, mais peut varier entre 3 100 et 5 600 N/m58. Le niveau de fermeté (faible, moyen et élevé) ne s’est pas révélé prédictif de l’issue des blessures59. Le tampon en mousse est un matériau non consommable. Il est normalement remplacé chaque année ou s’il est souillé ou endommagé.
  2. Allumez le dispositif d’impact cortical modifié (Figure 1A) et réglez la vitesse sur 6 m/s.
    REMARQUE : Ces spécifications sont conçues pour provoquer une déficience neurologique aiguë chez les rats juvéniles et adolescents qui sont analogues aux caractéristiques d’un TCL, mais ces paramètres peuvent ne pas convenir aux animaux plus âgés ou à d’autres espèces (p. ex. souris ou furets). Pour un examen des paramètres ACHI courants, voir60.

3. Induction du TCL

  1. Lorsque les rats atteignent PND 24, déplacez-les dans la salle d’intervention où les procédures seront effectuées. Assurez-vous que cette pièce est séparée de leur environnement de logement normal.
  2. Placez doucement le rat dans un cône de contention, en vous assurant que le museau et les narines sont proches de la petite ouverture du cône pour permettre une ventilation adéquate. Utilisez une pince à cheveux en plastique pour maintenir le cône fermé à l’extrémité caudale afin d’empêcher tout mouvement une fois que le rat est placé dans le cône de retenue.
    1. Utilisez les scores de contention pour enregistrer la conformité ou la tolérance des animaux avec le cône de contention et la procédure ACHI.
      NOTE: Le score de contention peut être utilisé comme une évaluation du stress chez les animaux. Ainsi, des critères d’exclusion peuvent être élaborés à l’aide du score de contention pour réduire la variabilité entre les sujets qui survient en raison d’une réponse excessive au stress.
      1. Donnez un score de 0 à 4 en fonction de la volonté de l’animal d’entrer dans le cône, de ses mouvements et de ses vocalisations. Donnez un score de 0 s’il n’y a pas de résistance à la contention, tandis qu’un score de 1 correspond à l’animal tournant de 1 à 2x et peu ou pas de vocalisation ou de tortillement. Donnez un score de 2 si l’animal a tourné 2-3x et présente une vocalisation ou un tortillement. Donnez un score de retenue de 3 si l’animal a tourné de 5 à 10x et présente plus de vocalisations et de tortillements. Enfin, donnez un score de 4 si l’animal a tourné plus de 10x avec des vocalisations fréquentes et des tortillements.
        REMARQUE : Cette information figure également sur la feuille de notation elle-même (tableau supplémentaire S1 et tableau supplémentaire S2).
  3. Pendant que le rat est immobilisé, positionnez manuellement le casque (Figure 1B) sur la ligne médiane, avec le disque de ciblage sur le lobe pariétal gauche (Figure 1C,D).
  4. Placez le rat sur le coussin de mousse et réglez manuellement l’impacteur sur la position Étendre. Abaisser manuellement la pointe de l’impacteur afin qu’elle entre en contact avec le disque de ciblage du casque. Réglez manuellement l’élément de frappe sur la position Rétractable pour que l’élément de frappe se retire à 10 mm au-dessus du casque.
  5. Utilisez le cadran du bras stéréotaxique pour abaisser la pointe d’impact de 10 mm afin qu’elle touche à nouveau le disque de ciblage du casque. Appuyez sur l’interrupteur Impact de manière à accélérer rapidement la tête de l’animal sur 10 mm à 6 m/s.
  6. Une fois l’appareil activé, retirez immédiatement l’animal du cône de contention et procédez immédiatement à un protocole d’évaluation neurologique (NAP).
    NOTE: Pour les expériences actuelles, ce protocole a été répété huit fois au total à des intervalles de 2 heures.

4. Induction d’une blessure simulée

  1. Suivre toutes les procédures expérimentales décrites ci-dessus à la section 3, mais placer le rat à côté de la trajectoire du piston d’impact, de sorte qu’aucune blessure ne soit infligée.

5. Protocole d’évaluation neurologique

REMARQUE: Le NAP peut être utilisé pour mesurer le niveau de conscience, ainsi que le fonctionnement cognitif et sensorimoteur.

  1. Au départ et immédiatement après l’induction du TCL ou de la blessure simulée, évaluer les rats à l’aide du PNA tel que décrit dans56,61. Sur une table, placez la cage des rats et une cage de récupération espacées de 100 cm. Centrez uniformément la poutre d’équilibre au-dessus des deux cages. De plus, placez une serviette pliée ou un rembourrage supplémentaire sous la poutre d’équilibre.
  2. Si nécessaire, évaluez le niveau de conscience. Si les animaux ne réagissent pas après le TCL, évaluer l’apnée (arrêt de la respiration) et tout retard dans le réflexe de redressement en utilisant un chronomètre pour enregistrer le temps nécessaire à l’animal pour reprendre sa respiration et/ou se redresser d’une position couchée sur le ventre.
    NOTE: La perte du réflexe de redressement et l’apnée sont rares avec le modèle ACHI, mais elles peuvent parfois être observées chez les animaux juvéniles.
  3. Évaluez la fonction cognitive et sensorimotrice du rat à l’aide de la séquence de tests suivante. Administrer ces tests rapidement successivement après l’évaluation de la conscience.
    NOTE: La somme de ces quatre tests donne un score total sur 12, s’il n’y a pas de déficits comportementaux observés. Les déficits nuisent à ce score.
    1. Réponse de sursaut
      1. Placez le rat dans la cage de récupération vide et applaudissez bruyamment (50 cm) sur la cage. Enregistrez la réaction de l’animal au bruit à l’aide du système de notation suivant :
        3 = Réaction de sursaut rapide au son (p. ex., mouvement de l’oreille/contractions de l’oreille, saut, gel du corps entier).
        2 = Réaction lente ou légère réaction de gel au son.
        1 = Seuls les mouvements de l’oreille sont observés.
        0 = Aucune réaction au son.
    2. Extension de membre
      1. Avec la poutre (100 cm de long x 2 cm de large x 0,75 cm d’épaisseur) placée horizontalement à travers la maison et les cages de récupération du rat, ramassez le rat par la base de la queue et tenez-le près de la poutre. Assurez-vous que le rat est suffisamment proche pour pouvoir le saisir facilement. Évaluez la capacité du rat à étendre les deux membres jusqu’au faisceau à l’aide du système de notation suivant :
        3 = Extension complète des deux membres antérieurs et saisie du faisceau.
        2 = Un seul membre est étendu.
        1 = Extension ou rétraction intermittente des membres antérieurs.
        0 = Les membres antérieurs sont mous/pas d’extension.
    3. Marche en faisceau
      1. Placez l’animal au centre de la poutre horizontale à la marque de 50 cm face à sa cage d’origine. Assurez-vous que la poutre est espacée également entre la cage d’origine du rat et la cage de récupération (placée à ~80 cm l’une de l’autre). Laissez le rat traverser la poutre. Évaluez la capacité du rat à s’équilibrer et à marcher avec le système de notation suivant:
        3 = Marche avec succès sur la poutre avec moins de deux pieds glisse en 10 s.
        2 = Marche avec succès sur la poutre, mais plus de deux glissades de pied sont observées.
        1 = Mouvement hors locomotive, mouvement de « nage ».
        0 = Incapable de marcher le long de la poutre ou incapable de se déplacer dans les 10 s.
    4. Poutre rotative
      1. Repositionnez le rat au centre de la poutre, en vous assurant que le rat est équilibré. Soulevez la poutre de 80 cm au-dessus d’une serviette ou d’une surface rembourrée et commencez à faire tourner manuellement la poutre à raison d’une rotation par seconde pendant 4 s (un total de quatre rotations). Évaluez la capacité du rat à rester sur la poutre pendant sa rotation avec le système de notation suivant :
        3 = Rat reste sur le faisceau pour les quatre rotations.
        2 = Rat tombe sur la quatrième rotation.
        1 = Rat tombe lors de la deuxième ou troisième rotation.
        0 = Rat tombe lors de la première rotation.
  4. Une fois le PNA terminé, ramener les rats ayant subi un traumatisme crânien et les rats fictifs dans leurs cages domestiques. Répétez si nécessaire pour les procédures r-mTBI. Surveillez le bien-être des animaux à la suite de blessures à l’aide de la Liste de contrôle de surveillance en cage (dossier supplémentaire 1). S’il y a une indication d’anomalie (tout score qui n’est pas N) pendant la surveillance du côté de la cage, un score de douleur complet doit être pris avec l’échelle de douleur et la liste de contrôle de surveillance avancée après un impact à la tête (dossier supplémentaire 2).

6. Préparation des tranches

NOTE: Dans la présente étude, la plasticité synaptique a été évaluée chez les animaux après un TCLm 1 ou 7 jours après un TCL. Ces jours-là, les animaux étaient amenés individuellement dans le laboratoire dans des cages couvertes avant le sacrifice.

  1. Réfrigérer (-20 °C) pendant la nuit tous les outils chirurgicaux (figure 2A) nécessaires à la fabrication des tranches hippocampiques : ciseaux standard, ciseaux à dissection, forceps, rongeurs, spatules et bloc réfrigérant.
    REMARQUE: La colle à papier tissu et la chambre d’incubation ne doivent pas être réfrigérées.
  2. Préparer du liquide céphalorachidien artificiel (aLCR) contenant 125 mM de NaCl, 2,5 mM de KCl, 1,25 mM de NaHPO4, 25 mM de NaHCO3, 2 mM de CaCl 2, 1,3 mM de MgCl 2 et 10 mM de dextrose (300 ± 10 mOsm; pH 7,2-7,4).
    NOTE: La solution principale d’aCSF doit être continuellement barbotée avec du carbogène (95% O 2/5% CO2) pendant la durée du protocole.
  3. Avant d’euthanasier l’animal (étape 6.8), préparer 12,5 mL d’agarose. Dissoudre 0,25 g d’agarose dans 12,5 mL de solution saline tamponnée au phosphate (1x PBS) par micro-ondes dans un tube conique de 50 mL par incréments de 10 s.
  4. Gardez l’agarose au chaud (42 °C) et agitez-la dans une plaque chauffante pour l’empêcher de se solidifier.
  5. Installez une station de découpe sur de la glace, y compris une boîte de Pétri et un petit bécher (50 ml) rempli d’aCSF glacé (4 °C) et une boîte de Petri renversée avec un morceau de papier filtre mouillé sur le dessus (figure 2A). Faire continuellement bouillonner l’aCSF dans le petit bécher avec du carbogen.
  6. Réchauffer le bain-marie à 32 °C. Remplir la chambre de récupération avec du LCR et faire des bulles continues avec du carbogène (Figure 2B).
  7. Transportez l’animal dans la salle expérimentale.
  8. Anesthésier l’animal en inhalant de l’isoflurane à 5% (jusqu’à absence de réflexe de sevrage), puis le décapiter rapidement à l’aide d’une petite guillotine.
  9. Disséquer le cerveau du crâne dans la boîte de Petri remplie d’aLCR glacé (4 °C), en maintenant le crâne immergé dans le LCRa pour aider à refroidir rapidement le tissu.
    REMARQUE: Cette procédure nécessite normalement moins de 5 minutes, mais la vitesse d’élimination du cerveau n’est pas un facteur critique si le cerveau est submergé dans un aCSF refroidi.
  10. Placez le cerveau dans le petit bécher de LCR réfrigéré et carbogéné pour nettoyer et refroidir davantage l’échantillon.
  11. Déplacez le cerveau vers la boîte de Petri à l’envers et placez-la sur le papier filtre. Utilisez un scalpel pointu pour enlever le cervelet et le cortex préfrontal pour « bloquer » le cerveau. Séparez les deux hémisphères en coupant la ligne médiane du cerveau.
    REMARQUE: Le protocole suivant est exécuté un hémisphère à la fois. Il est impératif que l’hémisphère non en cours de préparation reste immergé dans le bécher d’aCSF carbogéné glacé (4 °C).
  12. Pour créer des tranches transversales de l’hippocampe, placez l’hémisphère sur la surface médiale. Inclinez la lame d’un scalpel à ~30° vers l’intérieur et retirez une fine tranche de la surface dorsale du cerveau pour fournir une surface plane pour que le cerveau soit monté sur le piston utilisé par la trancheuse. Retournez le cerveau sur la surface dorsale et tamponnez doucement le tissu sur du papier filtre sec pour éliminer tout excès d’aLCR. À l’aide de colle cyanoacrylate, fixez la surface dorsale du cerveau au piston, en laissant la surface ventrale verticale.
    REMARQUE: Assurez-vous que la colle ne coule pas sur le bord du piston, car cela le ferait adhérer au tube métallique utilisé pour contenir l’agarose et empêcher le mouvement du piston.
  13. Étendez le tube externe du piston sur le cerveau et versez le liquide agarose dans le tube jusqu’à ce que le cerveau soit complètement recouvert. Solidifiez rapidement l’agarose en serrant un bloc de refroidissement sur le tube de piston (Figure 2A).
  14. Placez le piston dans la chambre de la trancheuse et fixez la chambre avec une vis. Fixez la lame et ajoutez de l’aCSF oxygéné glacé à la chambre de trancheuse.
  15. Sur la trancheuse (Figure 2B), réglez la vitesse de coupe sur 4, l’oscillation sur 6 et basculez le commutateur de découpage continu/simple sur continu. Push start pour commencer à sectionner le cerveau à 400 μm.
  16. Au fur et à mesure que la trancheuse coupe le cerveau, utiliser une pipette Pasteur de grand diamètre pour transférer chaque tranche dans le bain de récupération du fACaC oxygéné au fur et à mesure de sa coupe (Figure 2C).
    NOTE: Comme chaque tranche est coupée, elle peut être placée séquentiellement dans les différents puits du bain de récupération. Ce protocole donne généralement entre six et huit tranches, contenant l’hippocampe pour chaque hémisphère. Un atlasde rats 62 peut être utilisé pour identifier la position dorso-ventrale de tranches individuelles dans le cerveau du rat.
  17. Laisser les tranches récupérer à 32 °C pendant 30 min, puis laisser récupérer 30 min supplémentaires à température ambiante (23 °C).
  18. Répétez ces étapes pour créer des tranches à partir du deuxième hémisphère.

7. Électrophysiologie de terrain

REMARQUE: Pour acquérir des enregistrements de champ extracellulaire à partir du gyrus denté (DG), effectuez les étapes suivantes. Après la récupération de 60 minutes, des tranches individuelles d’hippocampe sont prêtes pour les enregistrements extracellulaires sur le terrain.

  1. À l’aide d’un extracteur de micropipettes disponible dans le commerce, tirer des électrodes enregistrantes (1-2 MΩ) à partir de capillaires en verre borosilicaté de 10 cm d’un diamètre extérieur de 1,5 mm et d’un diamètre intérieur de 1,1 mm.
    REMARQUE: L’électrode d’enregistrement doit avoir une résistance de ~ 1 MΩ et les extrémités doivent avoir une taille de ~ 1 mm. La cohérence des paramètres des électrodes est importante pour de bons enregistrements.
  2. Allumez l’ordinateur et l’équipement à utiliser pour les enregistrements : l’amplificateur, le numériseur, le stimulateur, le micromanipulateur, le régulateur de température, la lumière du microscope et la pompe à vide.
  3. Remplissez un bécher avec aCSF et connectez-le à un système de perfusion contrôlé par gravité. Ouvrez la vanne aCSF du système de perfusion pour commencer un écoulement d’aCSF à travers la chambre de perfusion. Maintenir un débit d’environ un ou deux gouttes/s ou 2 mL/min. Carbogénate aCSF en continu pendant la durée des enregistrements électrophysiologiques.
    REMARQUE : Il est impératif de maintenir un taux d’égouttement constant de l’aCSF carbogéné pendant les enregistrements sur le terrain. Il est également impératif que l’électrode de référence soit complètement immergée dans un CSF.
  4. Utilisez une pipette Pasteur pour transférer une tranche d’hippocampe du bain de récupération à la chambre de perfusion continue avec du fLCa carbogéné et maintenue à 30 ± 0,5 °C. Orientez la tranche du cerveau de manière à ce que le gyrus denté et la couche de cellules granulaires soient visibles dans le champ de vision. Stabilisez la tranche avec des poids de fil plié. Démarrez le logiciel informatique pour l’acquisition de données.
    REMARQUE: Il peut être utile d’éteindre la pompe à vide pendant cette étape pour permettre une manipulation libre du tissu. Cela devrait être fait rapidement car trop de manipulation peut endommager le tissu. De plus, la chambre de perfusion peut déborder d’aCSF si cela prend trop de temps. Une fois que le tissu est correctement orienté et stabilisé, allumez la pompe à vide.
  5. Utilisez un microscope droit pour visualiser le DG avec une optique oblique. Placez une électrode concentrique stimulant bipolaire pour activer les fibres du chemin perforant médian (MPP) dans le tiers moyen de la couche moléculaire. Ensuite, placez une micropipette en verre, remplie d’aCSF dans le MPP (Figure 3A,B). Commencez par les électrodes les plus éloignées (c.-à-d. l’électrode stimulante près de CA3 et l’électrode d’enregistrement juste au-dessus du genu du DG), car toucher le tissu endommagera les fibres.
    REMARQUE: Idéalement, tous les enregistrements devraient avoir les électrodes placées à égale distance de la couche cellulaire, à environ 200 μm l’une de l’autre.
  6. Une fois les électrodes de stimulation et d’enregistrement positionnées, visualisez les réponses de champ évoquées à l’aide d’un amplificateur, d’un numériseur et d’un logiciel d’enregistrement.
  7. Pour trouver un potentiel postsynaptique excitateur de champ approprié (fEPSP), stimuler le tissu avec des impulsions de courant de 0,12 ms à 0,2 Hz (toutes les 5 s) lorsque l’utilisateur est compétent pour trouver des réponses, ou à 0,067 Hz (toutes les 15 s) pour les utilisateurs moins compétents afin d’éviter une stimulation excessive. Assurez-vous que le fEPSP a une amplitude minimale de 0,7 mV avec une volée de fibre transparente qui est plus petite que la fEPSP.
    REMARQUE: Il est essentiel de positionner les deux électrodes à égale distance de la couche cellulaire pour obtenir des réponses de champ maximales et suffisamment éloignées (c.-à-d. ~ 200 μm) pour générer une petite volée de fibres. De petits ajustements dans la position de l’électrode peuvent aider à améliorer l’amplitude de la réponse, bien que ceux-ci doivent être réduits au minimum pour éviter les dommages tissulaires.
  8. Déterminer l’amplitude fEPSP maximale en augmentant l’intensité de la stimulation, puis régler l’intensité de simulation de sorte que la fEPSP soit à 70 % de l’amplitude maximale.
    REMARQUE : L’amplitude maximale est fixée à 70 % pour les études sur la dépression à long terme (LTD) et à 50 % pour les études de potentialisation à long terme (LTP). L’amplitude maximale est déterminée en ajustant la force de stimulation jusqu’à ce que l’amplitude de la fEPSP n’augmente plus. Dans le cas d’une FSEPf avec une amplitude maximale de 2 mV, la taille de réponse serait alors ajustée à 1,4 mV pour les études de DLP et à 1,0 mV pour les études de PTL, afin de permettre à la FSPf de déprimer ou de potentialiser (respectivement).
  9. Établissez une ligne de base de préconditionnement stable pendant 20 minutes avec des impulsions de 0,12 ms délivrées à 0,067 Hz. Pour que les tranches soient considérées comme stables, rechercher une variabilité de <10 % de la pente initiale du fEPSP et une pente de la droite de la ligne de meilleur ajustement à travers les pentes fEPSP tracées à <0,5. Passez aux étapes suivantes de l’enregistrement lorsque les EPSP sont vérifiés pour être stables pendant 20 min.
    REMARQUE: Divers antagonistes des récepteurs peuvent être ajoutés à l’aCSF pour bloquer ou améliorer la LTD et la LTP. S’ils sont nécessaires, s’assurer que les tranches sont exposées à ces agents pharmacologiques au cours de cette période de référence et que les exigences relatives aux enregistrements stables sont respectées. Pour des exemples, voir63,64,65.
  10. Tout d’abord, déterminez les changements dans les propriétés synaptiques de base en utilisant des stimuli d’impulsion appariés et en construisant des courbes d’entrée-sortie stimulus-réponse. Pour le test d’impulsions appariées, appliquer une série d’impulsions appariées avec un intervalle inter-impulsions de 50 ms à 0,033 Hz. Pour les courbes entrées-sorties, appliquer une série (10) d’intensités de stimulus croissantes (0,0-0,24 ms) à 0,033 Hz pour tracer le changement de taille de réponse fEPSP.
  11. Pour étudier la DLT qui dépend principalement de l’activation des récepteurs CB164,66, utilisez un protocole de 10 Hz (6 000 impulsions à 10 Hz). Ce protocole prend 10 min à administrer.
  12. Pour les enregistrements post-conditionnement, reprendre l’utilisation de la stimulation à impulsion unique (0,12 ms à une fréquence de 0,067 Hz) pendant 60 minutes supplémentaires.
  13. Après l’enregistrement post-conditionnement, administrer à nouveau les stimuli d’impulsion appariés, suivis d’une courbe entrée-sortie. Comparez-les aux enregistrements de base pour observer les altérations des propriétés de libération présynaptique et aider à évaluer la santé de la tranche pour les enregistrements à long terme.
  14. Au cours de l’analyse, soyez prudent et respectez les critères d’exclusion pour déterminer si les données des tranches individuelles doivent être conservées dans l’ensemble de données sur la plasticité synaptique. Exclure les tranches qui présentent une pente importante dans une ligne de meilleur ajustement des pentes fEPSP pendant la ligne de référence de préconditionnement (pente >0,5), l’instabilité dans la ligne de base de préconditionnement (changement de >10 %) et/ou l’instabilité dans la période post-conditionnement (pente >1,5 en 50-60 minutes de postconditionnement).

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Résultats

Le modèle de traumatisme crânien fermé éveillé est une méthode viable pour induire un TCLr-m chez les rats juvéniles. Les rats exposés au r-mTBI avec le modèle ACHI n’ont pas montré de déficits comportementaux manifestes. Les sujets de ces expériences n’ont présenté aucune latence à droite ou apnée à aucun moment de la procédure r-mTBI, ce qui indique qu’il s’agissait bien d’une procédure TBI légère. Des différences comportementales subtiles sont apparues dans le PAN; Comme décrit ci-dessus, les rats ont été notés sur qu...

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Discussion

La plupart des recherches précliniques ont utilisé des modèles de TCL qui ne récapitulent pas les forces biomécaniques observées dans la population clinique. Ici, il est montré comment le modèle ACHI peut être utilisé pour induire des r-mTBI chez les rats juvéniles. Ce modèle fermé de r-mTBI présente des avantages significatifs par rapport aux procédures plus invasives. Premièrement, l’ACHI ne provoque normalement pas de fractures du crâne, de saignements cérébraux ou de décès, qui seraient tous des contre-indications d’...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

Nous remercions tous les membres du Laboratoire Christie de l’Université de Victoria, passés et présents, pour leur contribution à l’élaboration de ce protocole. Ce projet a été financé par les Instituts de recherche en santé du Canada (IRSC : FRN 175042) et le CRSNG (RGPIN-06104-2019). Le graphique du crâne de la figure 1 a été créé avec BioRender.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Helment imprimé en 3D  ;Conçu et construit par le laboratoire Christie (voir les spécifications dans Christie et al. (2019), Current Protocols in Neuroscience)  ;
Agarose  ;Fisher Scientific (BioReagents)BP160500
Chambre d’anesthésieRécipient enplexiglas/A
Contrôleur de chauffage automatiqueWarner ElectricTC-324B
Axon DigidataMolecular Devices1440ASystème d’acquisition de données à faible bruit
Faisceau d’équilibre  ;Peut être construit ou acheté (100 cm de long x 2 cm de large x 0,75 cm d’épaisseur)
Chlorure de calciumBio Basic Canada Inc.  ;CD0050Pour aCSF
CaméraDage MTINC-70
Réservoir de carbogenPraxairMM OXCD5C-KDioxyde de carbone 5 %, Oxygène 95 %
Clampex SoftwareDispositifs moléculairesClampex 10.5 Version
Compresstome Microtome vibrantPrecisionaryVF 310-0Z
Électrode bipolaire concentriqueFHC Inc.
Dextrose (D-Glucose)Fisher Scientific (Chimique)D16-3aCSF
Amplificateur d’isolement de stimulus numérique  ;   ;Getting Instruments, Inc.  ;Modèle 4D
Phosphate disodiqueFisher Scientific (Chimique)S373-500PBS
Outils
Plume Double tranchant LameMicroscopie électronique Sciences72002-10
Papier filtreWhatman 11001-055
Flamming/Brown Micropipette PullerSutter InstrumentP-1000
Pince à griffesà cheveux Peut être obtenu dans n’importe quel grand magasin
CagesCages à rats normales de l’unité de soins aux animaux.
Hum Bug Suppression du bruitQuest Scientific  ;726300
Isoflurane USPFresenius KabiCP0406V2
Isotemp 215 Bain-marie numériqueFisher Scientific  ;15-462-15
Leica Impact One Unité CCILeica Biosystemsest modifiée pour contenir une pointe d’impact en caoutchouc de 7 mm
Rats Long-Evans, mâlesCharles River Laboratories (St. Constant, PQ)
Tampon3" feuille de mousse de polyuréthane  ;
Chlorure de magnésiumFisher Scientific (Chimique)M33-500aCSF
Mâle Long EvansRats Charles River Laboratories Animauxcommandés aux Charles River Laboratories, ou chiots élevés à l’Université de Victoria
MultiClamp 700B AmplifierMolecular DevicesModèle 700B
Bandelettes de test de pHVWR Chemicals BDHBDH83931.601
Chlorure de potassiumFisher Scientific (chimique)P217-500aCSF, PBS
Phosphatede potassium SigmaP9791-500G Contrôleur à bouton-poussoirPBS
Siskiyou Corporation  ;MC1000eContrôleur à quatre axes en boucle fermée Disques
d’échantillonnageELITechGroupSS-033À utiliser avec l’osmomètre à pression de vapeur
Petite serviette
Bicarbonatede sodium Fisher Scientific (chimique)S233-500aCSF
Chlorure de sodiumFisher Scientific (chimique)S271-3Pour aCSF, PBS
Sodium PhosphateFisher Scientific (Chimique)S369-500aCSF
Cônes de retenue en plastique soupleBraintree Scientificmodèle DC-200
ChronomètreDe nombreux membres du laboratoire utilisent leur iPhone pour cette
table ou un grand chariot avec des bords surélevés  ;Pour NAP et ACHI
Verre borosilicaté à paroi mince (avec filament)Instrument de sutterBF150-110-10Diamètre extérieur : 1,5 mm ; Diamètre intérieur : 1,10 mm ; Longueur : 10 cm
Microscope droitOlympusOlympus BX5OWI5x MPlan 0.10 NA
Objectif Osmomètre à pression de vapeurVaproModèle 5600aCSF doit être de 300-310 mOSM
Adhésif tissulaire Vetbond3M1469SB
Vibraplane Table d’isolation des vibrationsSystèmes cinétiques9101-01-45
N fait maisonCBAPC75de dissection à domicile et de récupération La pointe en mousse basse densité à bouton-poussoir

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