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Article de méthode

Approche chirurgicale, défis et résolutions pour la transplantation utérine chez le rat

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DOI :

10.3791/64757

⸱

14 avril 2023

 ,  ,  ,  , 
1Swiss HPB Laboratory, Department of Visceral & Transplant Surgery, University Hospital Zürich

Dans cet article

Résumé

Le présent protocole décrit toutes les étapes essentielles à la réussite de la transplantation utérine (UTx) chez le rat. Le modèle chez le rat s’est avéré approprié pour promouvoir la mise en œuvre clinique de l’UTx; cependant, l’UTx du rat est une procédure très complexe nécessitant des instructions minutieuses.

Résumé

La transplantation utérine (UTx) est une nouvelle approche pour traiter les femmes atteintes d’infertilité utérine absolue (AUFI). On estime que 3 % à 5 % des femmes souffrent d’AUFI. Ces femmes ont été privées de la possibilité d’avoir des enfants jusqu’à l’avènement de l’UTx. L’application clinique de l’UTx a été motivée par des études expérimentales chez l’animal, et la première UTx réussie a été réalisée chez le rat. Compte tenu de leurs caractéristiques physiologiques, immunologiques, génétiques et reproductives, les rats constituent un système modèle approprié pour de telles greffes. En particulier, leur courte période de gestation est un avantage évident, car le critère d’évaluation habituel de l’UTx expérimentale est une grossesse réussie avec une naissance vivante. Le plus grand défi pour les modèles de rats reste la petite anatomie, qui nécessite des compétences et une expérience avancées en microchirurgie. Bien que l’UTx ait conduit à une grossesse en clinique, la procédure n’est pas établie et nécessite une optimisation expérimentale continue. Ici, un protocole détaillé est présenté, y compris le dépannage essentiel pour l’UTx du rat, ce qui devrait rendre l’ensemble de la procédure plus facile à comprendre pour ceux qui n’ont pas d’expérience dans ce type de microchirurgie.

Introduction

La transplantation utérine (UTx) est un nouveau traitement de l’infertilité absolue du facteur utérin (AUFI). L’AUFI résulte d’une absence (congénitale ou acquise) ou d’une malformation de l’utérus et touche 3% à 5% des femmes dans le monde1. Des raisons éthiques, juridiques ou religieuses excluent l’adoption ou la maternité de substitution pour de nombreuses femmes qui ont un désir de maternité mais souffrent d’AUFI2. Pour ces femmes, UTx reste la seule option pour fonder leur propre famille. UTx a été appliqué en clinique, bien qu’avec un succès mitigé; La procédure est techniquement difficile et nécessite une amélioration constante pour son établissement clinique.

En 2014, la première transplantation d’utérus à partir d’un donneur vivant (LD) - aboutissant à une grossesse réussie - a été réalisée par le groupe suédois pionnier de Brännström3. La première naissance après UTx d’un donneur décédé (DD) a été signalée en 2016 au Brésil4. En 2021, plus de 80 UTxs ont été réalisées dans le monde, mais avec un taux de réussite d’environ 50% et avec des greffes provenant de ML pour la majorité1.

Bien qu’elle ne sauve pas des vies, UTx est une procédure de plus en plus populaire pour satisfaire les désirs de sa propre progéniture. En tant que tel, la demande de greffons augmente, plaçant le don DD dans une priorité future. Cependant, le don de DD est compliqué en raison d’expositions ischémiques considérablement plus longues au froid (et dans le cas d’une mort cardiaque, également chaudes), ce qui augmente les risques de dysfonctionnement et de rejetdu greffon 5,6. La technique chirurgicale, l’appariement exigeant de la compatibilité et l’immunosuppression associée restent des problèmes critiques concernant les résultats UTx7.

Pour gérer les risques ci-dessus en clinique, des modèles animaux appropriés pour l’exploration de l’ischémie et de l’immunosuppression sont nécessaires. Le critère d’évaluation le plus cliniquement pertinent pour les modèles animaux reste la réussite de la naissance; à ce jour, des grossesses après UTx expérimentales ont été réalisées chez des souris, des rats, des moutons, des lapins et des singes cynomolgus8. Alors que les gros animaux sont prédestinés à acquérir et à optimiser les techniques chirurgicales, les rongeurs présentent l’avantage distinct de courtes périodes de gestation. Par conséquent, les modèles de rongeurs sont supérieurs en ce qui concerne les considérations pratiques, financières et éthiques9. Cependant, le principal défi de l’UTx chez la souris est la petite anatomie, avec la chirurgie très exigeante liée à la faible reproductibilité de l’UTx10 murine. En revanche, les rats sont plus accessibles chirurgicalement et conservent les avantages de temps de gestation courts. En tant que tel, le rat est devenu le modèle de choix pour UTx9. Wranning et al. ont introduit le modèle de rat d’UTx orthotopique en 2008, et en utilisant ce modèle, la première naissance vivante après UTx et l’accouplement naturel a étésignalée 11,12,13. Des études ultérieures ont apporté des contributions essentielles à la mise en œuvre de l’UTx chez l’homme9.

Néanmoins, UTx reste difficile chez les rats, et seuls quelques groupes ont encore maîtrisé cette technique chirurgicale. Un obstacle pertinent à la propagation de l’UTx chez le rat parmi les chercheurs est l’absence d’une description précise des étapes microchirurgicales individuelles, des pièges et des mesures correspondantes pour le dépannage14. Ce protocole vise à fournir un guide détaillé pour cette procédure microchirurgicale très complexe afin de faciliter la mise en œuvre de ce modèle animal dans les recherches futures.

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Protocole

Toutes les expérimentations sur les animaux ont été réalisées conformément à la réglementation fédérale sur les animaux et approuvées par l’Office vétérinaire de Zurich (n° 225/2019), garantissant les soins aux humains. Des rats Lewis vierges femelles (poids corporel de 170 à 200 g) et des rats bruns bruns femelles (170 à 200 g) ont été utilisés comme donneuses/receveuses d’utérus, tandis que des rats Lewis mâles (300 à 320 g) ont été utilisés pour l’accouplement. Les rats étaient âgés de 12 à 15 mois. Les animaux provenaient de sources commerciales (voir le tableau des matériaux) et étaient logés dans des conditions contrôlées et dans un environnement enrichi avec un accès gratuit à l’eau et à de la nourriture standard.

1. Prélèvement de l’utérus

NOTE: Pour plus de détails sur la procédure, veuillez consulter les rapports 12,13,15 publiés précédemment.

  1. Induire l’anesthésie avec de l’isoflurane et de l’oxygène dans un récipient en plexiglas fermé (14 cm x 25 cm x 13 cm) pendant 1-2 min (isoflurane à 5 % en volume dans O2).
    1. Administrer la buprénorphine par voie sous-cutanée (0,05 mg/kg) et la bupivacaïne (0,5 %, 8 mg/kg) par voie sous-cutanée dans la région de l’incision abdominale prévue 30 minutes avant la chirurgie.
    2. Rasez toute la peau abdominale du rat avec un rasoir électrique.
    3. Utilisez des rubans adhésifs pour maintenir l’animal fixé sur une plaque chauffante pendant la chirurgie. Appliquez une pommade pour les yeux sur les deux yeux.
    4. Maintenir l’anesthésie pendant la procédure avec 2-4% vol% isoflurane dans l’oxygène par administration continue à travers un petit cône nasal.
    5. Surveiller la profondeur de l’anesthésie à l’aide de paramètres cliniques sans outils spécialisés (fréquence respiratoire de ~70-120/min-une baisse lente du taux de 50 % est acceptable pendant l’anesthésie; vérification de la profondeur de l’anesthésie avec pincement des orteils; la couleur des muqueuses doit être rose, et non bleue ou grise)16, et ajuster la concentration d’isoflurane en conséquence.
      REMARQUE: Facultatif: une surveillance respiratoire fréquente pendant la chirurgie est possible avec l’aide d’un assistant.
    6. Confirmez la profondeur de l’anesthésie en effectuant un pincement de l’orteil.
    7. Nettoyez la peau abdominale dans un mouvement circulaire avec trois écouvillons alternés d’une solution antiseptique et d’alcool à 70%. Laisser sécher.
    8. Placez un champ stérile (voir le tableau des matières) avec une fenêtre abdominale au-dessus de l’animal.
  2. Effectuer une laparotomie médiane.
    1. Ouvrez l’abdomen par une longue incision médiane de 6 à 8 cm, en commençant à 0,5 cm sous le xiphisternum vers l’hypogastrium. Utilisez un scalpel n ° 10 pour l’incision cutanée et de petits ciseaux tranchants pour l’incision linea alba. N’endommagez pas le foie ou la vessie.
    2. Déplacez les intestins à l’extérieur de la cavité abdominale à l’aide de coton-tiges, couvrez-les doucement d’une gaze humidifiée avec une solution saline stérile et protégez-les avec un sac en plastique stérile pour une meilleure isolation.
    3. Insérez des rétracteurs ou des clips (voir le tableau des matières) dans les dossiers des parois abdominales gauche et droite pour garder le muscle péritonéal de côté et l’abdomen ouvert, afin d’obtenir un accès et une visibilité optimaux de l’utérus et des vaisseaux associés. Fixez les clips/rétracteurs avec des rubans.
    4. Appliquez une solution saline préchauffée pour garder la zone chirurgicale et les intestins humides et éviter le dessèchement des viscères.
  3. Récoltez la corne utérine droite avec la cavité utérine et le col de l’utérus communs ainsi que les pédicules vasculaires, y compris les vaisseaux utérins, internes et iliaques droits.
    1. Ligate (polyglactine 4/0; voir le tableau des matériaux), cautériser et sectionner la corne utérine gauche adjacente à la ramification de la cavité utérine commune.
    2. Enlevez l’excès de graisse entourant l’utérus et le vagin.
      REMARQUE: Gardez la graisse autour du système utérin-vasculaire.
    3. Disséquer la vessie à sa fixation au col de l’utérus avec cautérisation de tous les vaisseaux de la vessie drainant et nourrissant. Pendant la cautérisation, maintenez une distance adéquate entre le col de l’utérus et le vagin pour éviter une cautérisation inutile sur ces deux structures. Sinon, le risque de nécrose du greffon augmente.
      REMARQUE: La plupart des manipulations chirurgicales devraient affecter la vessie. Rétractez ou tirez la vessie caudale à l’aide d’une pince vasculaire (voir le tableau des matériaux) pour obtenir une meilleure vue de l’excavatio vesicouterina.
    4. Cautériser et sectionner les vaisseaux utérins descendants au niveau de l’uretère aussi distal que possible au col de l’utérus.
      REMARQUE: Maintenez la microcirculation autour du vagin et du col de l’utérus autant que possible pendant la division.
    5. Séparer la partie cervicale / vaginale du futur greffon de l’attache rectale et des ligaments paravaginaux et paracervicaux.
      NOTE: Évitez toute cautérisation sur le vagin greffé.
    6. Disséquez soigneusement le vagin par diathermie autour de 2-3 mm caudale du col de l’utérus.
      REMARQUE: Aucune villosité (col de l’utérus) n’est visible à l’intérieur de la lumière vaginale.
    7. Localisez à la fois l’artère utérine et la veine à leurs origines. Ligate (polyamide 8/0; voir le tableau des matériaux), cautériser et sectionner les vaisseaux fessiers et tous les vaisseaux caudales des vaisseaux utérins.
      REMARQUE: La ligature directe de la veine caudale iliaque commune à la veine utérine est généralement possible.
    8. Par dissection contondante, libérer les vaisseaux iliaques communs les uns des autres, de la bifurcation de l’aorte et de la veine cave jusqu’à la division des vaisseaux utérins.
      REMARQUE: On peut obtenir un meilleur accès chirurgical à la région en enlevant un ou deux ganglions lymphatiques adjacents.
    9. Extrayez la corne utérine droite à 3 mm de la trompe de Fallope, après cautérisation du pédicule utéro-ovarien au même niveau. Cela permet l’anastomose de la corne utérine greffée à la partie supérieure de la corne utérine receveuse.
    10. Placez des ligatures (polyamide 8/0) directement autour de l’artère iliaque commune droite et de la veine, à proximité des bifurcations aortique et cavale. Faites une petite incision (0,5-1 mm) dans l’artère iliaque commune droite adjacente à la bifurcation, et insérez une aiguille courbée et émoussée de 30 G ou une aiguille droite et émoussée de 25 G dans la lumière (pour rincer). Fixez-le avec une ligature (polyamide 6/0).
      REMARQUE: Une autre option est la fixation supplémentaire avec une pince bulldog pour éviter le déplacement de l’aiguille et / ou du vaisseau.
    11. Disséquer la veine iliaque commune caudale de la ligature au niveau de la veine iliaque commune droite pour permettre l’écoulement pendant le rinçage.
  4. Rincez la greffe en suivant les étapes ci-dessous.
    1. Rincer l’utérus manuellement à l’aide de seringues de 3 mL avec environ 9 mL de solution froide de Ringer (RHX : Ringer supplémenté avec 50 UI/mL d’héparine et 0,4 mg/mL de xylazine) à un débit de 6 mL/min. Rincer de nouveau avec 6 mL de solution de préservation d’organes additionnée d’héparine (50 UI/mL) et de xylazine (0,4 mg/mL) (voir le tableau des matières).
      REMARQUE: Évitez la pression de rinçage élevée et assurez-vous que l’aiguille est bien placée.
    2. Retirez la greffe lorsque le tissu utérin est devenu pâle. Couper l’artère iliaque commune caudale de la ligature à la bifurcation de l’aorte abdominale.
  5. Placer la greffe dans une solution de préservation d’organes réfrigérée (4 °C) pour la préparation et le stockage avant la transplantation.
  6. Après avoir retiré le greffon, euthanasier l’animal en tournant d’abord le réglage d’isoflurane au maximum, puis en provoquant un pneumothorax bilatéral suivi d’une exsanguination17.

2. Transplantation d’utérus syngénique

NOTE: Pour plus de détails sur la procédure, veuillez consulter les rapports 12,13,15 publiés précédemment.

  1. Induire l’anesthésie et préparer l’animal comme mentionné à l’étape 1.1.
    1. Administrer une analgésie efficace (telle que décrite à l’étape 1.1.1) et 200 UI/kg d’héparine de haut poids moléculaire 30 minutes avant la chirurgie.
  2. Effectuer une laparotomie médiane.
    1. Ouvrez l’abdomen par une incision médiane de 6 à 8 cm de long commençant à 0,5 cm sous le xiphisternum vers l’hypogastrium. Utilisez un scalpel n ° 10 pour l’incision cutanée et de petits ciseaux tranchants pour l’incision linea alba. N’endommagez pas le foie et la vessie.
    2. Déplacez l’intestin grêle à l’extérieur de la cavité abdominale à l’aide de coton-tiges, enveloppez-les d’une gaze stérile humidifiée et recouvrez-les d’un sac en plastique stérile pour une meilleure isolation.
    3. Insérez des rétracteurs ou des clips dans les dossiers des parois abdominales gauche et droite pour garder le muscle péritonéal de côté et l’abdomen ouvert, afin d’obtenir un accès et une visibilité optimaux de l’utérus et des vaisseaux associés. Fixez les clips/rétracteurs avec des rubans.
    4. Appliquez une solution saline préchauffée pour garder la zone chirurgicale et les intestins humides et éviter le dessèchement des viscères.
  3. Effectuer une hystérectomie avec dissection et mobilisation du tiers supérieur du vagin du rectum et de la vessie.
    1. Cautériser la microvascularisation autour de l’utérus, du col de l’utérus et du vagin. Coupez et séparez l’utérus des structures environnantes proches de l’organe pour protéger la microcirculation du sinistre utérus.
    2. Enlevez le tissu adipeux de l’environnement.
    3. Amputer la corne gauche par cautérisation. Sur le côté droit, conservez un segment de 7-8 mm de la partie supérieure de l’utérus pour une anastomose ultérieure à la greffe utérine.
  4. Effectuer une greffe d’utérus.
    1. Mobiliser et séparer les vaisseaux iliaques communs droits, de l’origine des vaisseaux utérins jusqu’à la bifurcation aortique/cavale.
    2. Positionnez le greffon dans la cavité abdominale. Enveloppez le greffon dans une gaze imbibée d’une solution froide de préservation d’organes.
      REMARQUE: Le greffon doit être conservé au froid pendant l’anastomose.
    3. Placez des pinces vasculaires atraumatiques sur la veine iliaque commune droite de chaque côté, encadrant le futur site d’anastomose.
      REMARQUE : Abaisser l’anesthésie à 1-1,5 vol% d’isoflurane pour s’adapter à la diminution soudaine de la précharge cardiaque et à l’hypotension qui en résulte.
    4. Couper une fente légèrement plus grande que l’ouverture de la veine du greffon dans la veine iliaque commune.
    5. Positionnez la veine du greffon.
    6. Placer une suture de hauban (polyamide 10/0; voir le tableau des matériaux) dans chaque coin de la fente de la veine iliaque commune droite.
      REMARQUE: Gardez le nœud de suture au coin caudale lâche pour un meilleur ajustement et pour éviter les effets de corde de bourse.
    7. Rincer régulièrement la zone d’anastomose avec RHX refroidi pendant la procédure pour prévenir les thromboses.
    8. Anastomose un côté de la veine du greffon à la veine du receveur avec six à huit boucles d’une suture continue (Figure 1).
      REMARQUE: Commencez par la suture du hauban crânien (polyamide 10/0) et anastomose d’abord la partie entrante des vaisseaux.
    9. Anastomose l’autre côté du navire de la même manière, cette fois en commençant par l’extérieur.
    10. Nouez un nœud à la suture du hauban crânien, puis un autre à la suture caudale (polyamide 10/0), après avoir terminé les anastomoses des deux côtés.
      REMARQUE: Serrez les sutures continues autant que nécessaire pour éviter les effets de cordon de la bourse.
    11. Placez des pinces vasculaires atraumatiques sur l’artère iliaque commune droite de chaque côté, encadrant le futur site d’anastomose.
    12. Effectuer l’anastomose artérielle (artère iliaque commune droite [RCIA] via 8-10 boucles en utilisant des sutures interrompues (polyamide 10/0).
      NOTE: Les sutures interrompues sont plus faciles à contrôler que les sutures continues (facultatives avec la technique « bouche de poisson »)18. Un rinçage constant de la zone d’anastomose avec RHX refroidi pendant la procédure aide à prévenir les thromboses. Lorsque vous utilisez des sutures continues, effectuez cette étape analogue à l’anastomose veineuse.
  5. Effectuer la reperfusion du greffon.
    1. Lorsque les deux sites d’anastomose apparaissent patentés et que tout saignement est arrêté, relâchez les pinces vasculaires sur les vaisseaux du greffon (Figure 2).
    2. Inspectez le greffon pour détecter des signes de reperfusion, tels que rougissement, remplissage de la veine ou pulsation dans l’artère du greffon.
    3. Reliez la brassard vaginal de la greffe à la voûte vaginale de la receveuse en utilisant six à sept sutures interrompues intraluminales (polyglactine 6/0).
      REMARQUE: Commencez par une seule suture à la position 12 heures en premier, et placez les suivantes aux positions 10 et 1 heures. Les deux sutures aux positions 9 et 3 heures doivent être attachées après les sutures de la première rangée19,20.
    4. Anastomose la corne utérine greffée bout à bout au segment utérin crânien restant de l’utérus receveur en utilisant cinq à sept sutures interrompues (polyamide 7/0).
      REMARQUE: Ne coudez pas à travers la lumière.
  6. Fermez l’abdomen avec une suture continue. Utilisez du polyglactin 4/0 pour suturer la couche musculaire et du polyamide 6/0 ou des clips de plaie chirurgicale pour la peau.
  7. Laissez l’animal récupérer dans une cage chauffée une fois la greffe terminée. Restez avec l’animal jusqu’à ce qu’il ait retrouvé sa capacité de couchage sternale et maintenez un logement unique jusqu’à son rétablissement complet. Fournir un traitement analgésique psotopertaïf en administrant par voie sous-cutanée de la buprénorphine (0,05 mg / kg) et des AINS appropriés, mais pas avant 4 à 8 heures après la première dose d’anesthésie. Fournir en continu de la buprénorphine dans l’eau potable (1 mg/kg, voie orale, 5 mL de buprénorphine dans 160 mL d’eau potable (0,3 mg/mL)) pendant trois jours après la chirurgie.
  8. La suture de la peau est retirée 10-14 jours après la chirurgie.

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Résultats

Les résultats de deux groupes de rats sont présentés. UTx a été effectué avant (groupe 1, n = 8) et après (groupe 2, n = 8) ajustement du protocole (tableau 1) pour démontrer les effets de nos modifications (voir la discussion pour une explication de nos modifications)12,15,21.

Le résultat de l’UTx du rat est associé à trois phases clés. La première phase est la récup...

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Discussion

Le protocole présenté ici offre des instructions détaillées pour l’approche chirurgicale derrière la transplantation d’utérus chez le rat. Le protocole a été optimisé pour augmenter les chances de naissances vivantes après UTx et l’accouplement ultérieur. Le protocole original a été repris du groupe Brännström 12,13, inspiré par le travail sur la souris d’Akouri et al.10, et modifié en fonction des expériences des auteurs au cours des dernières années.

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts concurrents.

Remerciements

Cette étude a été soutenue par le Fonds national suisse (subvention de projet n° 310030_192736). Nous remercions le Dr Frauke Seehusen de l’Institut de pathologie vétérinaire de l’Université de Zurich pour son soutien histopathologique.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Ciseaux coudés sur le côté 5 mmF.S.T15008-08
Grand tromboneAucun spécifiqueUtilisé comme écarteur
Aiguille à courbure émoussée G30Unimed S.A.
Bupivacain 0,5 %Sintetica
Buprénorphine 0,3 mg/mLTemgesic
Dosiernadel G25H.SIGRIST& PARTNER AG
Dumont #5SF ForcepsF.S.T11252-00
Ethilon 10/0Ethicon2810G
Ethilon 6/0Ethicon667H
Ethilon 7/0EthiconEH7446H
Ethilon 8/0Ethicon2808G
Femal Brown Norway Rats (150-170 g)Janvier
Rats de Lewis Femal (150-170 g)Charles River Deutschland
Ciseaux fins - SharpF.S.T14060-09Tout autre petit ciseau fonctionne aussi
Halsey Micro Needle HolderF.S.T12500-12Tout autre petit porte-aiguilles fonctionne aussi
Héparine Natrium 25000 I.E./ 5 mLB. Braun
Institute Georges Lopez Solution de perfusion ( IGL)Institut Georges LopezSolution de préservation d’organes  ;   ;
Rats Lewis mâles (300-320 g)Charles River Deutschland
Micro Serrefines 13 mmF.S.T18055-04  ;   ;
Micro Serrefines 16 mm gebogenF.S.T18055-06
Micro-Serrefine Clamp Applicateur avec Lock  ;   ;F.S.T18056-14  ;   ;
Mö ; lnlyncke Op ServietteMö ; lnlyncke800300Champ stérile
NaCl 0.9 %B.Braun
OcteniseptSchü ; lke
Paper TapeTesaPour la fixation de l’animal
Philips Avent Schneller Flaschenwä ; rmer SCF358/02Philips12824216
RingerfundinB.Braun
Rompun 2 %BayerXylazine
Porte-aiguilles à manche rondF.S.T12075-12
Porte-aiguilles à manche rondF.S.T12075-12
S& Pince à dilatation du vaisseau en T - coudée 45° ;F.S.T00276-13
Sacryl NahtKRUUSE152575
Scapel No 10Swann Morton201
Petit Histo-ContainerTout petit histo-conteneur
Petits sacsTous les sacs en plastique transparents sont fins
Steril Coton-tigeLohmann-RauscherTout coton-tige stérile est fin
Gaze stérileLohmann-RauscherToute gaze stérile est fine
Ciseaux droits 8mmF.S.T15024-10
Microscope chirurgical &ndash ; SZX9OlympusOLY-SZX9-B
Sutter Antiadhésif GLISS 0,4 mmSutter78 01 69 SLS
Pince à suture pour attacher  ;F.S.T00272-13
Matelas chauffant ThermoLuxThermoLux
pour la peauToutes les pinces à tissus sont fines
Pince à dilatateur de vaisseauxF.S.T00125-11
Vicryl  ; plus 4/0EthiconVCP292H
fonctionne très bien pour le stockage frigorifique du greffon Plastik Pince à tissus

Références

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