Préparation de vecteur lentiviral pour une modulation efficace des gènes et des microARN de macrophages résidents dans les tissus de la cavité péritonéale in vivo chez la souris

Résumé

Nous démontrons un protocole étape par étape pour l’étude de la fonction des gènes dans les macrophages résidents du tissu péritonéal in vivo, en utilisant des vecteurs lentiviraux.

Résumé

Les macrophages résidents du tissu péritonéal ont de larges fonctions dans le maintien de l’homéostasie et sont impliqués dans des pathologies au sein des tissus locaux et voisins. Leurs fonctions sont dictées par des signaux microenvironnementaux ; Ainsi, il est essentiel d’étudier leur comportement dans une niche physiologique in vivo . À l’heure actuelle, des méthodologies spécifiques de ciblage des macrophages péritonéaux utilisent des modèles transgéniques de souris entières. Ici, un protocole pour une modulation in vivo efficace de l’expression de l’ARNm et des petites espèces d’ARN (par exemple, les microARN) dans les macrophages péritonéaux à l’aide de particules de lentivirus est décrit. Des préparations de lentivirus ont été fabriquées dans des cellules HEK293T et purifiées sur une seule couche de saccharose. La validation in vivo de l’efficacité du lentivirus après injection intrapéritonéale a révélé une infection prédominante des macrophages limitée aux tissus locaux. Le ciblage des macrophages péritonéaux a été couronné de succès pendant l’homéostasie et la péritonite induite par les thioglycolates. Les limites du protocole, y compris l’inflammation de faible niveau induite par l’administration intrapéritonéale de lentivirus et les restrictions de temps pour les expériences potentielles, sont discutées. Dans l’ensemble, cette étude présente un protocole rapide et accessible pour l’évaluation rapide de la fonction des gènes dans les macrophages péritonéaux in vivo.

Introduction

Les macrophages tissulaires (Mφ) sont une population hétérogène de cellules immunitaires phagocytaires qui détectent et répondent aux agents pathogènes envahissants ^1,2. De plus, ils jouent un rôle essentiel dans le développement des tissus, le remodelage et le maintien de l’homéostasie ^1,3. De nombreux tissus Mφ dérivent des progéniteurs du sac vitellin au cours de l’embryogenèse et persistent dans le tissu tout au long de la vie ^4,5. Le phénotype et les fonctions de ces cellules sont dictés par les interactions collaboratives et hiérarchiques de facteurs de transcription spécifiques et du microenvironnement local 6,7,8,9. Une compréhension croissante de cette dépendance augmente le besoin de méthodes in vivo efficaces pour la manipulation génétique de Mφ dans leur niche physiologiquement pertinente.

Les vecteurs lentiviraux sont un outil fréquemment utilisé pour la manipulation des acides nucléiques dans des populations cellulaires spécifiques in vivo 10,11,12, en particulier en raison de leur capacité à infecter à la fois les cellules en division et les cellules non divisées et à s’intégrer de manière stable dans le génome de l’hôte ^13,14. Au cours des deux dernières décennies, la technologie d’administration des lentivirus a été optimisée, et des enveloppes alternatives et des promoteurs synthétiques ont été étudiés pour augmenter le ciblage spécifique à la lignée ^8,15. En raison de son large tropisme cellulaire, la glycoprotéine d’enveloppe du virus de la stomatite vésiculeuse (VSV-G)^16,17 est devenue l’enveloppe de référence utilisée dans la technologie des lentivirus.

Dans ce protocole¹⁸, des particules lentivirales pseudotypées VSV-G sont utilisées pour démontrer l’administration ciblée et efficace de l’ARN en épingle à cheveux court (shRNA) et du microARN (miR) à Mφ (pMφ) péritonéal de souris in vivo, à l’état d’équilibre¹⁹. L’expression du transgène a été déterminée par le promoteur du virus formant un foyer de la rate (SFFV). L’infection productive des cellules a été définie par l’expression de la protéine fluorescente verte (GFP) améliorée dérivée du lentivirus. L’utilisation de cette approche a permis une lecture facile pour les expériences de lentivirus in vivo afin de définir la dose optimale et la période expérimentale. Enfin, la provocation lentivirale in vivo de souris au cours de l’inflammation induite par le thioglycolate a révélé la propension naturelle à l’infection sélective par pMφ.

Protocole

Tous les travaux sur les animaux ont été effectués conformément aux directives de l’Institutional et du Home Office du Royaume-Uni.

REMARQUE : Toutes les études in vivo avec des lentivirus doivent être réalisées conformément aux directives locales et nationales sur l’utilisation éthique des animaux en recherche, ainsi qu’à toutes les réglementations associées à l’utilisation de matières infectieuses de catégorie II. Le bien-être des animaux doit également être surveillé conformément aux réglementations locales. À cette étape du protocole, il faut faire preuve d’une extrême prudence lorsqu’on travaille avec des particules lentivirales et des objets tranchants.

1. Préparation des cellules de HEK293T pour la transfection

REMARQUE : Effectuez ces étapes sous une enceinte de sécurité biologique de culture de tissus stériles.

1. Préparez le milieu d’aigle modifié Dulbecco’s complet (cDMEM) pour les cellules HEK293T en combinant les 450 mL de DMEM avec 10 % (v/v) de sérum de veau fœtal (50 mL) et une concentration finale de 100 U/mL de pénicilline/streptomycine.
2. Dégivrez HEK293T cellules au moins 1 semaine avant la transfection prévue. Maintenez des conditions de croissance saines et passez tous les 2-3 jours en utilisant la trypsine + EDTA pour détacher les cellules du flacon.
3. Un jour avant la transfection, aspirez soigneusement le milieu de croissance des cellules et lavez doucement les cellules avec du DPBS stérile. Ajouter 1 à 5 ml de trypsine dans le ballon et incuber à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO₂ pendant 2 à 5 min.
4. Ajouter 5 à 10 ml de cDMEM et faire tourner les cellules à 350 x g pendant 5 min. Retirez le liquide et remettez en suspension la pastille de cellule dans 10 mL de cDMEM. Compter les cellules et ensemencer 10-11 x 10⁶ cellules HEK293T viables par fiole T175 dans 20 mL de cDMEM.
5. Incuber à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO₂ pendant la nuit pour permettre aux cellules HEK293T d’atteindre une confluence de 70 % à 80 %.
6. Le lendemain, confirmez la confluence des cellules au microscope optique.
7. Retirer le milieu de la fiole à l’aide d’une bande sérologique de 25 mL sans perturber la monocouche cellulaire.
8. Ajoutez délicatement 10 ml de DPBS et basculez la plaque pour laver les cellules, en prenant soin de ne pas perturber la monocouche cellulaire.
9. Retirer le DPBS à l’aide d’une bande sérologique de 25 ml.
10. Ajouter 15 mL de cDMEM neuf sur la paroi par fiole T175 afin de ne pas perturber la monocouche cellulaire, et remettre la plaque dans l’incubateur à 37 °C.

2. Transfection de cellules HEK293T à l’aide d’un réactif de transfection lipidique non liposomale

1. Dans un tube à centrifuger de 15 ml, préparer les composants lentiviraux : 2 μg de plasmide lentiviral, 1,5 μg de pΔ8.91 (pCMV-Δ8.91) et 1 μg de pMD2.G (pCMV-MD2.G) avec Buffer EC (kit de réactif de transfection) jusqu’à un volume final de 600 μL.
2. Ajouter 36 μL de solution d’amplification. Mélangez les composants à l’aide d’une pipette de 1 mL en aspirant à plusieurs reprises une partie du liquide et en la remettant goutte à goutte directement sur la solution restante. Laisser poser 5 min à température ambiante (RT).
3. Ajouter 120 μL de réactif de transfection et mélanger comme ci-dessus environ 20 fois. Incuber pendant 10 min à RT.
4. Ajouter 5,2 mL de cDMEM et mélanger comme ci-dessus avec une bande sérologique de 5 mL.
5. À l’aide d’une pipette de transfert jetable, ajoutez le mélange de transfection goutte à goutte directement sur la monocouche de cellules HEK293T (en évitant les parois du ballon), en étalant le mélange à différents endroits du ballon.
6. Répartissez le plasmide en balançant doucement le ballon d’un côté à l’autre. Évitez de mettre du liquide dans le couvercle de la gourde.
7. Incuber le ballon à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO₂ pendant 48 h. Confirmer la transfection efficace de HEK293T cellules par l’apparition d’un marqueur fluorescent, ici la GFP, dans les 24 heures suivant la transfection surveillée au microscope fluorescent d’imagerie cellulaire.
   REMARQUE : Pour les constructions sans marqueur fluorescent, HEK293T cellules doivent être testées pour détecter la présence du gène marqueur utilisé ou un changement d’expression dans le gène ou la protéine d’intérêt par des techniques appropriées, p. ex., qPCR. Alternativement, la transfection réussie peut être vérifiée indirectement lors de l’essai de la collection de lentivirus sur des cellules Jurkat aux étapes ultérieures du protocole par les techniques ci-dessus.
   ATTENTION : Les cellules HEK293T transfectées sont considérées comme infectieuses, et des précautions de sécurité appropriées doivent être mises en œuvre lors de la manipulation de ces cellules. Les règles locales doivent être respectées, ce qui peut généralement inclure le travail sous une enceinte de sécurité biologique de catégorie II, l’utilisation de gants doubles et d’une solution de décontamination appropriée pour la désinfection, par exemple, une concentration accrue de déchets d’eau de Javel (2 000 ppm) ou une solution équivalente selon les directives de biosécurité institutionnelles. Toutes les solutions et tous les plastiques entrant en contact avec la préparation de lentivirus doivent être désinfectés conformément aux procédures de biosécurité de l’établissement.

3. Collecte de particules lentivirales

1. Préparez une solution de décontamination, une solution d’eau de Javel (hypochlorite de sodium) à forte concentration (2 000 ppm) ou un agent équivalent conformément aux directives de biosécurité de l’établissement dans un seau et placez-le dans l’enceinte de sécurité biologique.
2. Préparez l’enceinte de sécurité biologique en enlevant tous les objets en excès, tels que les supports de tubes vides, etc.
3. Pré-étiquetez un tube à centrifuger de 50 ml par flacon de cellules HEK293T T175 et retirez le couvercle du tube à centrifuger. Placez les tubes dans un support stable.
4. Récupérez le ballon de l’incubateur et confirmez l’expression de la GFP à l’aide d’un microscope fluorescent équipé d’un laser de 488 nm (figure 1A). L’intensité du signal dépend de l’efficacité de transfection de la procédure et des constructions utilisées.
5. Collectez le milieu des cellules dans le tube à centrifuger de 50 ml pré-étiqueté. Inclinez le ballon de HEK293T T175 avec les cellules transfectées de sorte que le milieu s’accumule dans le coin inférieur du ballon. À l’aide d’une bande sérologique de 25 mL, prélever le milieu sans perturber la monocouche cellulaire. Certaines cellules flottantes peuvent être visibles à ce stade. Transférez le fluide dans un tube à centrifuger propre de 50 ml et fermez le couvercle.
   1. À l’aide d’une bande sérologique de 25 ml, ajoutez 25 ml de cDMEM frais et chaud dans la fiole. Assurez-vous de diriger le flux moyen sur les parois du ballon pour ne pas perturber la monocouche cellulaire. Remettre dans l’incubateur le ballon contenant les cellules de HEK293T transfectées (37 °C, 5 % CO₂).
      REMARQUE : Une deuxième collecte de lentivirus et une purification supplémentaire peuvent être effectuées après 24 heures supplémentaires en suivant la procédure décrite dans les étapes ci-dessus.
6. Lorsque la collecte de lentivirus est terminée après 24 h ou 48 h, ajoutez une solution de décontamination aux cellules, en vous assurant qu’elle recouvre la monocouche cellulaire. Maintenez le ballon à l’horizontale pendant les 24 prochaines heures, puis jetez-le conformément à la réglementation appropriée de catégorie II.

4. Purification du lentivirus

1. Filtrez le milieu collecteur à partir de l’étape 3.5.
   1. Retirez le piston de la seringue de 50 ml et insérez un filtre stérile de polyéther sulfone ou de fluorure de polyvinylidène de 0,45 μm à faible liaison protéique dans l’extrémité de la seringue. À l’aide d’une bande sérologique de 25 ml, ajoutez le milieu prélevé à l’étape 3.5.1 dans la seringue et remettez doucement le piston en place.
   2. Poussez lentement le bouchon pour faire passer le fluide à travers le filtre dans un tube à centrifuger frais de 50 ml. Si le débit diminue considérablement, positionnez la seringue avec le filtre vers le haut et tirez suffisamment sur le piston pour dégager le fluide du filtre.
   3. Remplacez soigneusement le filtre de la seringue par un nouveau et jetez le filtre usagé dans la solution de décontamination. Poursuivre la filtration moyenne. Une fois terminé, décontaminez le filtre et la seringue en immergeant le filtre et en remplissant la seringue avec la solution de décontamination.
2. Prérefroidissez l’ultracentrifugeuse en réglant la température à 4 °C et fermez le couvercle pour permettre à la température de s’acclimater.
3. Ajouter 3 mL de solution de saccharose à 20 % (20 % p/v dans de l’eau ultrapure, filtre stérilisé à l’aide d’un filtre de 0,22 μm) dans le fond du tube conique de l’ultracentrifugeuse.
4. À l’aide d’une bande sérologique de 25 ml, superposer un milieu filtré sur la couche de saccharose, en prenant soin de ne pas déranger les couches.
   1. Utilisez le réglage de vitesse le plus bas sur le boyau de pipette. Inclinez le tube conique de l’ultracentrifugeuse à environ 45° et ajoutez lentement le milieu filtré contenant du lentivirus de l’étape 4.1 à la paroi du tube. Assurez-vous que le milieu et le saccharose ne se mélangent pas et que la séparation nette des couches est visible (Figure 1B). Au fur et à mesure que le volume de la couche moyenne augmente, inclinez lentement le tube de l’ultracentrifugeuse en position verticale.
5. Si le volume total, y compris le saccharose et le milieu, dans le tube d’ultracentrifugation est inférieur à 29 ml, complétez avec du cDMEM frais pour éviter que le tube ne s’effondre pendant l’essorage. Pour plusieurs collections de T175 mL, mélanger les préparations de milieux filtrés et utiliser plusieurs tubes à ultracentrifuger. Remplissez le tube final de l’ultracentrifugeuse avec le fluide si nécessaire.
6. Assurez-vous que les godets de l’ultracentrifugeuse sont propres ; Il n’y a pas de résidu de fluide sur le fond du seau ou les bouchons. Si nécessaire, essuyez avec ~70 % d’alcool. Placez les adaptateurs de tube appropriés au fond de chaque seau (Figure 1C) et abaissez doucement les tubes d’ultracentrifugation dans les seaux.
7. Fermez les godets en toute sécurité et accrochez-les aux espaces prévus à cet effet sur le rotor d’essorage.
8. Assurez-vous que les seaux sont équilibrés avec les mêmes volumes de saccharose et de milieu. Un rotor en vrille ne doit jamais fonctionner sans godets, bien que les godets opposés puissent être laissés vides²⁰ (Figure 1D).
9. Insérez délicatement le rotor dans l’ultracentrifugeuse et allumez le vide. Réglez le taux d’accélération et de décélération de l’ultracentrifugeuse sur le réglage le plus bas et exécutez les préparations de lentivirus à 85 000 x g pendant 90 min à 4 °C.
10. Attendez que l’ultracentrifugeuse atteigne la vitesse requise (environ 3 à 5 minutes) avant de vous éloigner pour vous assurer que le rotor est correctement inséré et que l’essorage ne se terminera pas.
11. Pendant que l’ultracentrifugeuse fonctionne, nettoyez l’espace de travail conformément aux exigences de sécurité de catégorie II et préparez l’espace pour les prochaines étapes.
12. Lorsque l’essorage est terminé, désactivez le vide et retirez soigneusement le rotor afin de ne pas perturber les échantillons.
13. Examinez l’ultracentrifugeuse pour tout déversement et confirmez qu’il n’y a pas de fuite des godets. En cas de déversement, doublez le gant et décontaminez la centrifugeuse et la surface externe des seaux avec des produits antiviraux.
14. Retirez les seaux de l’ultracentrifugeuse et transportez-les avec précaution vers l’enceinte de sécurité biologique de catégorie II.
    REMARQUE : Les particules de lentivirus s’accumulent au fond du tube de l’ultracentrifugeuse. La pastille n’est pas visible à l’œil nu.
15. Versez le saccharose et le milieu d’un seul mouvement fluide directement dans le conteneur à déchets avec la solution de décontamination.
16. En gardant le tube de l’ultracentrifugeuse inversé, transférez-le sur la double couche de tissu et laissez-le sécher pendant 10 min. Pendant ce temps, essuyez l’intérieur des seaux avec un mouchoir imbibé d’eau et séchez-les à l’air.
17. Séchez soigneusement tout liquide restant du bord du tube de l’ultracentrifugeuse avec un mouchoir en papier avant de le retourner à la verticale. Désinfectez les tissus et la surface en dessous.
18. Remettre la pastille virale en suspension dans 1 mL de milieu ou de solution sans sérum nécessaire à une expérimentation ultérieure en pipetant doucement la solution de haut en bas. Laissez-le pendant 15 min à RT à l’intérieur de l’enceinte de sécurité biologique de catégorie II.
19. Mélanger délicatement les préparations de lentivirus à l’aide d’une pipette de 1 mL avant de faire l’aliquotage dans des tubes à vis de 1,5 mL (p. ex., cryotubes). Préparer les aliquotes pour le travail in vivo (multiplicité de 100 μL) et pour le titre de lentivirus dans les cellules T Jurkat (1 x 20 μL) (voir étape 5).
20. Éviter les cycles de gel-dégel ; Les préparations lentivirales peuvent être conservées à -80 °C jusqu’à 6 mois sans effet négatif sur l’infectiosité.

5. Titrage de la production de lentivirus dans les lymphocytes T Jurkat

1. Préparez le milieu complet du Roswell Park Memorial Institute 1640 (cRPMI-1640) pour les lymphocytes T Jurkat en complétant 500 mL de RPMI-1640 avec 10 % (v/v) de sérum de veau fœtal et la concentration finale de 100 U/mL de pénicilline/streptomycine.
2. Pour assurer une culture saine de cellules T Jurkat, maintenez les cellules en culture jusqu’à 1 semaine avant l’infection.
3. Le jour du titrage du lentivirus, mettre en plaque les lymphocytes T Jurkat viables dans une plaque de 24 puits à raison de 2 x 10⁵ cellules/puits dans 200 μL par puits de cRPMI-1640.
4. Utilisez du lentivirus fraîchement prélevé ou décongelez le flacon de lentivirus contenant 20 μL sur de la glace et mélangez doucement en pipetant de haut en bas.
5. En utilisant la dilution en série dans cRPMI-1640, infectez les lymphocytes T Jurkat avec 0,25 μL, 0,5 μL, 1 μL, 2,5 μL, 5 μL et 10 μL de stock de lentivirus. Basculez doucement la plaque pour assurer une répartition égale du lentivirus. Les lymphocytes T Jurkat non infectés servent de contrôle négatif.
6. Incuber la plaque à 37 °C. Après 4 h, remplissez chaque puits avec du cRPMI jusqu’à un volume total de 400 μL. Remettez la plaque dans l’incubateur à 37 °C pendant 3 jours.
7. 48 h après l’infection, confirmer l’expression de la GFP sous un système d’imagerie fluorescente.
8. 3 jours après l’infection, prélever chaque puits de la plaque à 24 puits dans des tubes de prélèvement séparés de 1,5 mL et centrifuger les cellules à 350 x g à 4 °C pendant 5 min.
9. Jetez le surnageant. Remettre la pastille en suspension dans 300 μL de paraformaldéhyde (PFA) à 2 % (p/v) préparé dans du DPBS et la laisser pendant 15 min sur de la glace dans l’obscurité.
10. Centrifuger les cellules à 350 x g à 4 °C pendant 5 min et remettre la pastille en suspension dans un tampon de tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) (DPBS stérile + 4 % de FCS + 1 mM d’EDTA stérile).
11. Analysez la fréquence d’expression de la GFP et l’intensité fluorescente moyenne du lentivirus infecté et de ses cellules témoins à l’aide de la cytométrie en flux (Figure 2).

6. Infection par lentivirus in vivo des macrophages péritonéaux résidant dans les tissus

1. Dans une enceinte de sécurité biologique de catégorie II, chargez les aiguilles à insuline d’un volume total de 200 μL de milieu de milieu sans sérum contenant la quantité requise de lentivirus (utilisez des aiguilles à usage unique, 30 G pour le bien-être des animaux et pour éviter la perte de liquide dans l’aiguille).
2. Replacez la gaine de l’aiguille sur l’aiguille en utilisant la technique de la cuillère à une main. Gardez l’aiguille sur de la glace et injectez dans les 30 minutes.
3. Dans l’animalerie, mettre en place une enceinte de sécurité biologique de catégorie II avant les injections (figure 1E).
   1. Posez une feuille de tissu propre. Desserrez la gaine de l’aiguille à insuline contenant le lentivirus.
   2. Préparez une boîte de Pétri contenant de petits morceaux de tissu et un désinfectant à base de gluconate de chlorhexidine, un tube de 50 ml contenant une solution de décontamination (solution d’eau de Javel à 2 000 ppm) et un contenant bien sûr et tranchant.
4. Retenir la souris en saisissant la peau au niveau de la nuque²¹. Une souris correctement retenue est immobile, ce qui est nécessaire pour des raisons de sécurité.
5. Avec l’abdomen vers le haut, pointez la tête de l’animal légèrement vers le bas. Injectez le lentivirus par voie intrapéritonéale dans le quadrant inférieur droit de la cavité abdominale. Il s’agit d’éviter l’injection dans les organes de la cavité péritonéale.
6. Avant de relâcher la souris, remplissez la seringue de solution de décontamination et jetez-la en toute sécurité dans la boîte de sécurité tranchante.
7. Essuyez le site d’injection sur l’abdomen de la souris avec un tissu imbibé de désinfectant et remettez l’animal dans la cage.
8. Hébergez la souris injectée de lentivirus dans un scantainer de catégorie II ou dans des cages ventilées individuellement (cages isolées avec filtration de l’air à haute efficacité) pendant au moins 72 heures après l’injection. Placez une carte d’information appropriée à l’avant de la cage.
9. Déplacez la souris dans la nouvelle cage de détention de catégorie I après 72 heures après l’infection, en fonction des approbations de sécurité locales. Surveiller les souris quotidiennement pendant un total de 3 jours à compter de l’injection.

7. Collecte de cellules péritonéales de souris infectées par des lentivirus

ATTENTION : Pour les prélèvements dans les 72 heures suivant l’injection de lentivirus, suivez les règles de sécurité biologique de catégorie II de l’établissement. La litière et la cage d’attente où les animaux infectés ont été gardés dans les 72 heures suivant l’injection de lentivirus doivent être décontaminées conformément aux règles de sécurité biologique de catégorie II de l’établissement.

1. Euthanasier les souris conformément aux réglementations institutionnelles, par exemple par inhalation d’une concentration croissante de CO₂, suivie d’une confirmation de la mort par luxation cervicale.
2. Nettoyez l’abdomen de la souris avec 70% d’isopropanol et coupez soigneusement la peau pour exposer la membrane de la cavité péritonéale.
3. Lavez la cavité péritonéale avec 6 ml de tampon FACS glacé à l’aide d’une seringue de 10 ml et d’une aiguille de 23 g. Évitez de perforer des organes.
4. Massez doucement le péritoine pour déloger les cellules vers le tampon FACS.
5. Prélevez le liquide péritonéal à l’aide de la même seringue et de la même aiguille.
6. Retirez l’aiguille et transférez les cellules dans un tube à centrifuger de 15 ml.
7. Gardez les lavages péritonéaux sur de la glace.
8. Prélever d’autres organes nécessaires et les stocker selon les besoins de l’étude.
9. Éliminer les carcasses d’animaux conformément aux directives locales en matière d’animaux et de sécurité.

8. Coloration et analyse des cellules péritonéales

1. Centrifuger le lavage péritonéal à 350 x g à 4 °C pendant 5 min, jeter le surnageant dans la solution de décontamination et remettre les cellules en suspension dans 1 mL de tampon FACS.
2. Comptez les cellules collectées et la plaque 4 x 10⁵ cellules par puits dans une plaque à fond en V de 96 puits.
3. Effectuez une coloration de viabilité à l’aide d’un réactif fixable (par exemple, le kit de coloration à cellules mortes Fixable Near-IR utilisé ici) conformément aux instructions du fabricant.
4. Si des cellules ont été infectées au cours des 72 dernières heures, fixez-les dans un PFA à 2 % pendant 15 minutes sur de la glace. Ajouter un volume égal de DPBS froid et centrifuger à nouveau à 350 x g à 4 °C pendant 5 min.
5. Préparez le tampon de blocage : Mélangez 4 μg/mL d’anticorps 2.4G2 dans du sérum de rat à 10 % (v/v) dans un tampon FACS pour la coloration de surface ou un tampon de perméabilisation pour la coloration intracellulaire.
6. Remettre en suspension chaque puits contenant des pastilles de cellule dans 50 μL de tampon de blocage et incuber à 4 °C pendant 15 min.
7. Préparez un mélange d’anticorps dans 50 μL de tampon FACS (pour la coloration de surface) ou de tampon de perméabilisation (pour la coloration intracellulaire) pour chaque échantillon. Le volume final de coloration pour chaque échantillon sera de 100 μL, y compris 50 μL de tampon de blocage. Calculez les concentrations d’anticorps en conséquence (tableau 1).
8. Ajouter 50 μL de mélange d’anticorps aux échantillons et 50 μL de témoins d’isotypes et de tampon de contrôle aux échantillons de contrôle. Incuber les échantillons pendant 30 min sur de la glace dans l’obscurité. Inclure des cellules non colorées et des contrôles d’isotype, au besoin.
9. Lavez chaque puits avec 100-200 μL de DPBS glacé et centrifugez la plaque à 350 x g à 4 °C pendant 5 min. Répétez cette étape pour éliminer tous les anticorps non liés. Analysez les échantillons sur un cytomètre en flux.

9. Extraction de cellules d’organes

1. Préparez 1 mL de mélange de digestion par organe : Mélangez la solution saline équilibrée de Hank (HBSS), 2 mg/mL de collagénase de type IV et 0,03 mg/mL de DNase I (y compris 1,5 mg/mL d’hyaluronidase pour la digestion pulmonaire).
2. Transférez l’organe prélevé dans 1 mL de mélange de digestion et hachez-le avec des ciseaux.
3. Filtrer les cellules à travers une crépine de 40 μm et centrifuger à 350 x g à 4 °C pendant 5 min.
4. Si vous isolez des cellules du poumon, de la rate ou du foie, lysez les globules rouges à l’aide d’un tampon de lyse ACK (150 mM NH₄Cl, 10 mM KHCO₃, 0,1 mM Na₂EDTA pH = 7,4). Filtrer les cellules à travers une crépine de 40 μm et centrifuger à 350 x g à 4 °C pendant 5 min.
5. Colorez et analysez les cellules comme décrit dans la section 8.

Résultats

Lorsqu’il est suivi intégralement et correctement, ce protocole produit un total de 1,5 mL de stock de lentivirus de haute qualité par préparation unique, ce qui est suffisant pour douze injections in vivo au volume optimal déterminé dans cette étude¹⁸. Le succès de la transfection peut être évalué tôt dans le protocole. Les cellules HEK293T saines et confluentes devraient présenter, si elles sont présentes dans les plasmides, un signal marqueur facilement détectable (p. ex., GFP utilisé dans cette étude) 48 heures après la transfection du plasmide (figure 1A). La faible intensité du signal, le détachement cellulaire excessif et la faible confluence aux premières étapes du protocole pourraient indiquer la mort cellulaire et entraîner un faible rendement de la préparation de lentivirus. Une partie du détachement de la cellule avant le prélèvement facultatif II (étape 3.5.1.) est visible et prévue.

Trois plasmides sont utilisés dans ce protocole pour la génération de particules de lentivirus : le plasmide d’emballage pCMV-ΔR8.91 codant pour la protéine structurelle du VIH-1 (Gag), les protéines accessoires Tat et Rev et la transcriptase inverse polymérase (Pol)²² ; enveloppe VSV-G codant pMD2.G sous promoteur CMV¹³ ; et le plasmide pHR’SIN-cPPT-SEW (codant pour un marqueur GFP amélioré)¹⁹ modifié en conséquence pour l’expression de shRNA ou de microARN.

Les préparations de lentivirus sont titrées dans la lignée de cellules T Jurkat en raison de leur infectiosité élevée²³. Une préparation réussie du lentivirus permet d’atteindre un taux d’infection de plus de 95 % avec une dose aussi petite que 5 μL (figure 2A). L’intensité fluorescente moyenne des cellules infectées continue d’augmenter avec les doses plus élevées (figures 2B et C). Si nécessaire, les titres viraux peuvent être mesurés à l’aide de la PCR en temps réel des composants viraux intégrés, par exemple, le promoteur du SFFV, qui est corrélé linéairement avec le pourcentage de cellules exprimant la GFP et logarithmiquement avec la MFI GFP (Figure 2D). Selon la construction, en particulier celles avec un grand insert²⁴, certaines préparations de lentivirus peuvent présenter une infectivité réduite dans les cellules T Jurkat, comme démontré pour la construction Cre-GFP utilisée dans cette étude (Figure 2E,F). Dans un tel cas, plusieurs préparations de particules de lentivirus pourraient être combinées et remises en suspension dans 1 mL. Nous recommandons de valider les réponses immunitaires à ces préparations in vivo avant l’expérimentation. Naturellement, les préparations de lentivirus avec des récepteurs d’entrée alternatifs au VSV-G utilisés ici pourraient présenter une efficacité d’infection différente dans la lignée de cellules T Jurkat, en fonction de l’expression du récepteur sur les cellules. Les lignées cellulaires utilisées pour le titrage doivent être sélectionnées de manière à ce qu’elles expriment le récepteur utilisé par les particules de lentivirus pour pénétrer dans les cellules et qu’elles soient préférentiellement dépourvues ou très faibles de l’expression des facteurs de restriction²⁵.

La production réussie de particules lentivirales est également mise en évidence par l’infection par pMφ (définie comme CD11b⁺ F4/80⁺ et population Tim4⁺)¹⁸ (Figure 3A). Nous avons déterminé que l’injection intrapéritonéale de 100 μL de préparation de lentivirus (dans un volume total de 200 μL de milieu sans sérum) produit le pourcentage et l’intensité les plus élevés du signal GFP dans ces cellules (Figure 3B,C). Les injections de doses plus élevées (150 μL et 200 μL de préparation de lentivirus) n’ont pas eu d’impact bénéfique sur l’expression de la GFP dans le pMφ. Des expériences de parcours temporel à 4 h, 3 jours, 7 jours et 14 jours après l’injection intrapéritonéale (i.p) avec 100 μL de lentivirus ont révélé un pourcentage significatif de pMφ résident exprimant la GFP aux jours 3 et 7, suivi de la disparition de la population infectée au jour 14 (figures 3D, E). Il est intéressant de noter que la pMφ exprimant la GFP disparaît principalement au 14e jour après l’infection, en partie en raison de la reconnaissance immunitaire du marqueur GFP. En effet, des expériences de lentivirus avec un marqueur GFP chez des souris sélectives T-Reg Foxp3-DTR-eGFP empêchent le rejet du pMφ résident infecté jusqu’au 21e jour au moins (Figure 3F). Pour les préparations de lentivirus dont l’efficacité est réduite dans les cellules de Jurkat, une quantité plus élevée serait nécessaire pour atteindre le taux d’infection attendu in vivo. Cependant, comme on l’a démontré avec la préparation du lentivirus Cre-GFP, selon la conception de la construction, même une dose de 300 μL à 7 jours après l’injection i.p pourrait donner un mauvais résultat (figure 3G). Nous avons précédemment démontré l’utilisation réussie de ce protocole pour la surexpression et l’inactivation de gènes in vivo dans le pMφ de souris, y compris l’inhibition de Map3k8 et Gata6 médiée par lentiviral shRNA, et la surexpression de Gata6 ¹⁹. Ici, nous montrons que ce protocole peut également être utilisé avec succès pour la surexpression du microARN murin 146b (mmu-miR-146b) et pour l’inactivation de la molécule d’adhésion intercellulaire 1 (ICAM1, CD54) en utilisant des shRNA dérivés lentiviraux dans pMφ résident (Figure 3H,I).

L’infection des cellules primaires, telles que les macrophages, nécessite un apport plus élevé de lentivirus, probablement en raison de la présence de facteurs de restriction dans ces cellules. Les facteurs de restriction sont des mécanismes de protection naturels des cellules qui interfèrent avec les étapes du cycle de vie des virus, telles que la transcription inverse ou l’intégration, conduisant à l’inhibition de l’expression génique des constructions.

De plus, la validation in vivo du protocole n’a montré aucun effet de l’administration du lentivirus i.p sur la viabilité des cellules immunitaires péritonéales (figure 4A) et a indiqué une infectivité distincte des sous-populations pMφ résidentes (définies par l’expression des marqueurs CD73 et Tim4) (figures 4B et C). Il est important de noter que l’infection productive par le lentivirus était limitée à Mφ résident au site d’injection, comme en témoigne l’absence d’expression significative de la GFP dans les ganglions lymphatiques mésentériques (LNm), les poumons, le foie ou la rate Mφ après la provocation (figure 4D). Considérant que dans de nombreux cas, le ciblage génétique de Mφ doit être effectué dans des conditions inflammatoires, nous avons étudié l’efficacité de ce protocole chez des souris exposées par voie intrapéritonéale avec 0,1 mL de thioglycolate à 4 %. L’injection de thioglycolate déclenche un afflux de cellules Mφ et monocytaires inflammatoires dérivées des monocytes qui peuvent être divisées en 5 populations distinctes (Figure 4E). L’analyse par cytométrie en flux a révélé un phénotype réfractaire de cellules de type monocytaire (Ly6C^hi populations 1 et 2) à l’infection par lentivirus, conformément aux résultats précédents dans les cellules humaines²⁶. En revanche, les Mφ résidents et les monocytes (groupes 3 à 5) sont restés les plus sensibles à l’infection (Figure 4F).

L’analyse cytométrique en flux détaillée a détecté l’expression de la GFP principalement dans le Mφ péritonéal résident et le complexe majeur d’histocompatibilité (CMH) de classe II⁺ pMφ résident (MHCII⁺ F4/80⁺ Tim4⁺) (jusqu’à 60 % au jour 3 après l’injection) (Figure 5A). Peu ou pas de signal GFP a été détecté dans d’autres populations de cellules péritonéales, y compris les Mφs/DC péritonéaux dérivés de la moelle osseuse (MHCII⁺, CD11b⁺, CD11c⁺), les lymphocytes B (CD19⁺), les lymphocytes T (CD3⁺), les mastocytes (CD11b^-, FcεR1⁺), les éosinophiles (Siglec-F⁺), les cellules NK (CD19^-, NK1.1⁺) et les neutrophiles (Ly6G⁺) (Figure 5A,B). La longévité de l’expression de la GFP (Figure 5C) dans toutes les populations a suivi celle de Mφ péritonéale résident (Figure 1D). Une augmentation transitoire de la fréquence des neutrophiles a été enregistrée après 4 heures après l’injection i.p de 100 μL (dans un volume total de 200 μL de milieu sans sérum) de lentivirus (figure 5D), indiquant une légère inflammation précoce présente chez les animaux en difficulté. Enfin, le pMφ résident a connu une baisse importante de la fréquence entre les jours 7 et 14 après l’infection (Figure 5E), suggérant la meilleure fenêtre expérimentale entre les jours 3 et 7 après l’injection.

Figure 1 : Production de lentivirus dans les cellules HEK293T. (A) Images représentatives d’immunofluorescence de cellules HEK293T 48h après la transfection réussie (microscope fluorescent [pic d’excitation de 488 nm, pic d’émission de 510 nm], grossissement de 20x, barre d’échelle = 400 μm). (B) Photographie d’un tube conique d’ultracentrifugeuse contenant une couche de 20 % de saccharose (en bas, transparent) et une couche de milieu prélevée dans des cellules de HEK293T transfectées (en haut, en rouge). (C) Photographie de l’insertion correcte de l’ultracentrifugeuse conique dans le godet, y compris l’adaptateur. (D) Photographies montrant l’équilibrage correct et incorrect du rotor de l’ultracentrifugeuse. (E) Photographie de la configuration optimale de l’armoire Cat II et des matériaux pour les injections in vivo pour un droitier. Cette figure a été modifiée avec la permission d’Ipseiz N et ^al.18. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Titrage du lentivirus dans les lymphocytes T Jarkat. (A) Analyse cytométrique en flux représentative des lymphocytes T Jurkat 72 h après l’infection avec des doses croissantes de lentivirus contenant un plasmide GFP montrant le pourcentage de cellules GFP⁺ (GFP⁺), (B) intensité de fluorescence moyenne (MFI) des cellules GFP⁺ et (C) un histogramme représentatif de l’expression de la GFP. (D) Nuage de points montrant l’IMF (Y de gauche) et le pourcentage de cellules infectées par un lentivirus exprimant la GFP (Y de droite) par rapport au nombre de copies du virus détectées par page d’ADN (axe des x). (E) Un histogramme représentatif de l’infection par les lymphocytes T Jurkat avec une préparation sous-optimale du lentivirus Cre-GFP (Cre-GFP LV) et des données récapitulatives (F) montrant le pourcentage de lymphocytes T Jurkat infectés par le lentivirus Cre-GFP (GFP⁺). Cette figure a été modifiée avec la permission d’Ipseiz N et ^al.18. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Efficacité de l’infection du pMФ résident. (A) Stratégie de contrôle des cellules résidentes pMφ (CD11b⁺, Tim4⁺, F4/80⁺) et ^Tim4-, F4/80⁺. Les cellules ont été fermées sur des singets, suivies de CD11b⁺. (B) des diagrammes à points représentatifs, et (C) un résumé de la fréquence de l’infection (% de cellules GFP+) et de l’intensité (MFI) des cellules GFP⁺ isolées 3 jours après l’infection in vivo avec différentes quantités de préparation de lentivirus GFP. (D) un graphique à points représentatif, et (E) un résumé de la fréquence de l’infection (% de cellules GFP+) et de l’intensité (MFI) des cellules GFP+ isolées à différents moments après l’infection in vivo avec 100 μL de lentivirus dans un volume total de 200 μL de milieu sans sérum. (F) Un résumé du nombre de cellules aux jours 7, 14 et 21 après l’administration intra-péritonéale du lentivirus exprimant la GFP chez les souris Foxp3-DTR-eGFP montrant le nombre de pMφ exprimant la GFP et les macrophages inflammatoires et cellules dendritiques (InfMØs/DCs [F480^faible]). (n = 1-2 par groupe). (G) Diagramme à points représentatif de l’infection in vivo sous-optimale de Gata6-KO ^{mye 19} pMφ résident avec 300 μL de lentivirus Cre-GFP 7 jours après l’injection i.p. (H) Quantification par RT-qPCR de l’expression mmu-miR-146b-5p du Mφ péritonéal résident défié in vivo avec un lentivirus de 100 μL codant pour le microARN-146b murin (miR-146b) ou le contrôle (C). Cellules résidentes pMφ (cercles blancs) et cellules Tim4^-, F4/80⁺ (cercles gris). (I) Un graphique à points représentatif de la régulation négative réussie d’ICAM1 sur pMφ chez des souris femelles 129S6, 7 jours après l’injection i.p de lentivirus contenant des shRNA cibles. Le shRNA de contrôle est illustré. La superposition montre le contrôle de l’isotype. Données exprimées en moyenne ± souris SEM, n≥2. Cette figure a été modifiée avec la permission d’Ipseiz N et ^al.18. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Efficacité de l’infection des sous-populations résidentes de pMφ. (A) Pourcentage de cellules uniques totales et de Mφ résident viables 7 jours après l’injection de 100 μL de milieu sérique sans sérum (-) ou de lentivirus GFP (+) par voie i.p. (B) Stratégie de contrôle montrant quatre populations principales de pMφ trouvées in vivo : CD73⁺Tim4⁺, CD73-Tim4^-, CD73⁺Tim4^-, CD73-Tim4⁺, et (C) la fréquence (% de cellules GFP+) et l’intensité (MFI des cellules GFP+) correspondantes de ces populations. (D) Pourcentage de cellules GFP+ dans plusieurs organes 7 jours après l’injection de 100 μL de lentivirus i.p. Abréviations : mLN, ganglion lymphatique mésentérique. (E) Des souris ont reçu une injection intraveineuse de 0,1 mL de thioglycolate à 4 % pendant 5 jours, suivie d’une injection intraveineuse de lentivirus. Stratégie de déclenchement de pMφ et des monocytes après 3 jours après l’injection de lentivirus i.p. (F) Analyse de la fréquence d’infection, de l’IMF et du nombre de cellules des monocytes GFP+ (Ly6C⁺) et Mφ (Ly6C^-). Données exprimées en moyenne ± souris SEM, n≥3. Cette figure a été modifiée avec la permission d’Ipseiz N et ^al.18. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Impact de l’injection de lentivirus sur l’inflammation péritonéale. Des souris ont reçu une injection in vivo i.p de lentivirus exprimant la GFP. (A) Fréquence d’infection des populations cellulaires dans la cavité péritonéale à la suite de diverses quantités d’injections de lentivirus (50 μL, 100 μL, 150 μL ou 200 μL). (B) Intensité de l’expression de la GFP dans les populations cellulaires infectées de manière productive 7 jours après l’injection i.p. (C) Fréquence d’infection des populations cellulaires dans la cavité péritonéale à divers moments après l’injection i.p. (D) et (E) Pourcentage de cellules à divers moments après l’injection i.p. Toutes les injections de lentivirus ont été effectuées avec le même volume total de 200 μL complété par un milieu sans sérum. Sauf indication contraire, une dose de 100 μL de lentivirus a été utilisée. Les souris témoins (« C ») ont reçu 200 μL de milieu de milieu pur sans sérum. Données exprimées en moyenne ± souris SEM, n≥3. Cette figure a été modifiée avec la permission d’Ipseiz N et ^al.18. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Cible d’anticorps	Fluorophore	Clone	Dilution utilisée	concentration finale [μg/mL]
Antigène du noyau du VIH-1	RD1	FH190-1-1	1/100	1
I-A/I-E	PerCpCy5.5	M5/114.15.2	1/400	0.5
Ly6G	PerCpCy5.5	1A8	1/400	0.5
CD3e	PerCpCy5.5	17A2	1/200	1
CD3e	PE/Cy7	Référence 500A2	1/400	0.5
CD11c	PE/Cy7	N418	1/800	0.25
CD11c	BV605	N418	1/400	0.5
CD226	AF647	10 E 5	1/400	1.25
Tim4	AF647	RTM4-54	1/600	0.83
CD4	APC	GK1.5	1/400	0.5
CD11b	AF700	M1/70	1/700	0.71
CD11b	PerCpCy5.5	M1/70	1/400	0.5
F4/80	Bleu Pacifique	BM8	1/700	0.71
F4/80	BV605	BM8	1/400	0.25
F4/80	BV711	BM8	1/400	0.5
CD73	eFluor450	TY/11.8	1/400	2.5
CD19	V450	1D3	1/400	0.5
CD19	APC	1D3	1/400	0.5
CD8a	eFluor450	53-6.7	1/400	0.5
SiglecF	BV421	E50-2440	1/400	0.5
NK1.1	APC/Cy7	Réf. PK136	1/400	0.5
FceR1	eFluor450	MARS-1	1/400	0.5
ICAM1	PE	1A29	1/100	2
Contrôle des isotypes IgG1 κ chez le rat	PE		1/100	2

Tableau 1 : Liste des anticorps

Discussion

Les macrophages résidents dans les tissus remplissent une gamme de fonctions homéostatiques et inflammatoires spécifiques aux tissus ^1,2 dictées par leur environnement physiologique ^6,7,8,9. Dans ce protocole, une méthode efficace¹⁸ de manipulation des macrophages résidents péritonéaux in vivo à l’aide de particules de lentivirus a été introduite pour étudier la fonction des macrophages dans leur microenvironnement biologique.

Il est essentiel pour le succès du protocole d’utiliser des cellules HEK293T saines. Il est préférable de décongeler les cellules au moins une semaine avant le début de ce protocole pour assurer la récupération des cellules et un bon nombre. Les cellules doivent être ensemencées dans un volume approprié de milieu un jour avant la transfection prévue et doivent atteindre une confluence d’environ 80 % le jour de la transfection. Des préparations cellulaires sous-confluentes ou trop confluentes entraîneront une réduction du rendement en lentivirus. Nous recommandons de transfecter HEK293T cellules avec le réactif de transfection selon les instructions du fabricant pour obtenir les meilleurs résultats. Les étapes essentielles de la transfection comprennent le mélange approprié des plasmides et des réactifs et l’ajout goutte à goutte du mélange directement à la monocouche de cellules HEK293T. La transfection du phosphate de calcium des cellules HEK293T^27,28 pourrait être utilisée dans ce protocole. Cependant, l’utilisateur doit être conscient que l’efficacité de cette méthode peut varier et qu’elle peut entraîner une diminution de l’efficacité de la transfection.

Des précautions de sécurité doivent être prises en compte dans le protocole dès le jour de la transfection de cellules HEK293T. Il s’agit notamment de travailler dans une enceinte de sécurité de catégorie II, de porter des gants doubles lors de la manipulation de matériaux contaminés et de blanchir correctement les matériaux contaminés (avec une solution de décontamination, par exemple, une solution d’eau de Javel à 2 000 ppm) pendant au moins 4 heures. Les utilisateurs doivent se référer à la réglementation de leur établissement concernant le travail avec des agents pathogènes et des déchets de catégorie II.

Dans ce protocole, la préparation de lentivirus est d’abord purifiée à l’aide d’un filtre de 0,45 μm pour éliminer HEK293T débris cellulaires. L’utilisation de filtres plus petits (0,22 μm) et de membranes à base d’esters de cellulose doit être évitée, car elle entraînerait la perte de particules de lentivirus. Il est recommandé d’utiliser des filtres à faible liaison protéique, en polyéther, sulfone ou en polyfluorure de vinylidène²⁹. La deuxième étape de purification est effectuée sur l’unique couche de saccharose à 20 % dans une ultracentrifugeuse pour éliminer les impuretés restantes, ce qui est particulièrement important pour l’administration in vivo de la préparation de lentivirus. Dans les établissements où il n’existe pas d’ultracentrifugeuse, d’autres^ont décrit la purification de lentivirus à base de saccharose à l’aide d’une centrifugeuse de laboratoire standard. Cela pourrait être mis en œuvre dans ce protocole à titre d’alternative. La préparation de lentivirus est titrée dans les lymphocytes T Jurkat en fonction de l’expression du signal marqueur (par exemple, GFP utilisé dans ce protocole). Pour les constructions sans marqueurs, les particules physiques de lentivirus pourraient être évaluées par quantification de la protéine p24gag du VIH-1 par le kit^{ELISA 31}, analyse par cytométrie en flux de l’antigène central du VIH-1¹⁸ ou mesure des modifications apportées au gène ciblé (de préférence en utilisant les méthodes permettant de mesurer les modifications dans les cellules individuelles, par exemple, cytométrie en flux ou microscopie). Si le titrage du témoin et celui du lentivirus diffèrent significativement chez les lymphocytes T Jurkat, les volumes utilisés pour les études in vivo peuvent être ajustés pour obtenir l’infection la plus comparable entre les préparations de lentivirus.

La principale limitation du protocole est la disparition observée de la Mφ péritonéale résidente GFP⁺ dans les 14 jours suivant l’injection du lentivirus i.p. Pour les études à long terme, les lignées de souris présentant une altération génétique stable dans un type de cellule ou des tissus spécifiques doivent être prises en compte³². Par exemple, comme les macrophages péritonéaux n’expriment pas Foxp3 (une protéine T-Reg), nous avons utilisé des souris Foxp3-DTR-eGFP³³ et avons confirmé que l’expression de la GFP est maintenue dans le Mφ péritonéal 21 jours après l’infection (Figure 3F). Cependant, il est important de noter que les lentivirus contiennent d’autres composants étrangers, et que cette extension de la persistance des cellules infectées chez les souris Foxp3-DTR-GFP peut ne pas être permanente. Une autre faiblesse de cette méthode est un faible niveau d’inflammation qui peut être observé dans la cavité péritonéale après l’injection de lentivirus, comme en témoigne l’afflux de neutrophiles 4 heures après l’injection (Figure 5D), ce qui peut signifier que des infections répétées accéléreraient la perte associée à l’inflammation de Mφ péritonéale résident exprimant la GFP. Bien que nous n’ayons pas détecté d’interférons de type I (IFN) dans la cavité péritonéale, il a été démontré précédemment que les particules de lentivirus pseudotypées VSV-G induisent certains des gènes stimulés par l’IFN chez le Mφ humain en l’absence d’IFN détectables³⁴. Cela devrait être pris en compte lors de l’utilisation de ce protocole pour des expériences portant sur les réponses immunitaires antivirales. L’apparition d’une inflammation aiguë et soutenue après l’injection intramusculaire d’une préparation de lentivirus pourrait indiquer une contamination de la préparation.

Les domaines de dépannage comprennent : 1) pour un titre de lentivirus faible, assurer la santé des cellules HEK293T et une transfection efficace (p. ex., expression du marqueur, le cas échéant, dans HEK293T cellules). Si le taux d’infection reste faible, tenez compte de la taille de la construction. Les constructions avec des inserts plus grands ou des structures secondaires plus complexes peuvent affecter le titre final de lentivirus et l’infectiosité²⁴. Par conséquent, chaque construction doit être testée indépendamment et parallèlement à son vecteur de contrôle respectif ; 2) Si une grande quantité de lentivirus est nécessaire, il est recommandé de préparer plusieurs flacons T175 de cellules HEK293T et d’augmenter la production en conséquence. Pour éviter toute variation des préparations de lentivirus, il est préférable de fusionner les collections finales avant l’aliquotage et l’entreposage. Pour une production aussi importante, le mélange de plasmides (section 2) doit être préparé dans des tubes de 50 ml pour assurer un mélange efficace des composants.

Malgré son large tropisme, les particules lentivirales pseudotypées VSV-G ciblent principalement les macrophages tissulaires, comme démontré précédemment pour l’alvéolaire³⁵, et ici¹⁸ pour le pMФ lorsqu’ils sont administrés par les voies respectives. Les altérations de l’enveloppe sur les particules de lentivirus peuvent, dans certains cas, entraîner une diminution de la transduction des macrophages in vivo³⁶ et sont inutiles pour ce protocole. Par rapport à d’autres approches virales pour la manipulation de gènes in vivo dans les macrophages (examinées dans³⁷), l’utilisation de vecteurs lentiviraux offre une intégration stable du transgène dans les macrophages tissulaires³⁵, une expression efficace des transgènes et la plus grande limite de taille de vecteur (environ 8 Kb).

Les Mφ péritonéaux jouent un rôle important dans la prévention, l’apparition, la progression et la résolution de diverses maladies, notamment les cancers abdominaux, la pancréatite et la péritonite³⁸. Ce protocole décrit un outil efficace pour la modification génique dans le pMφ murin, permettant d’étudier les processus biologiques à l’origine de ces pathologies au sein d’un microenvironnement physiologiquement pertinent. Alors que les vecteurs lentiviraux eux-mêmes deviennent un outil d’intérêt pour les interventions cliniques³⁹, en raison de leur origine du virus de l’immunodéficience et d’une intégration stable du génome, les problèmes de sécurité entravent leur mise en œuvre thérapeutique. Une meilleure compréhension des réponses des macrophages à la modulation des gènes lentiviraux pourrait faire progresser l’application de cet outil très efficace dans un cadre clinique.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
0,05 % Trypsine-EDTA (1x) (Trypsine 500 mg/L ou 0,02 mM)	Thermo Fisher Scientific	25300054
0,22 &mu ; m filtre stérile millex GP	Merck	SLGS033SS
0.45 &mu ; m filtre stérile millex gp	Merck	SLHP033RS
0,5 mL Seringue à insuline U-100 avec aiguille, 0,33 mm x 12,7 mm (29 G)	BD	324892
1 litre Conteneur pour objets tranchants	N/A	N/A
2.4G2 anticorps (TruStain FcX anti-souris CD16/32)	Biolegend	101320
40 &mu ; Filtre Thermo	Fisher Scientific	22363547
AimV medium (qualité recherche), AlbuMax Supplement	Thermo Fisher Scientific	31035025
Tampon de blocage	préparé sur place
Milieu de thioglycolate Brewer	Sigma-Aldrich	B2551	Solution mère à 4 % préparée dans de l’eau, autoclavée et conservée congelée.
CD11b	Biolegend	101222	Voir le tableau 1 pour la dilution et la concentration
CD11b	BD	550993	Voir le tableau 1 pour la dilution et la concentration
CD11c	Biolegend	117317	Voir le tableau 1 pour la dilution et la concentration
CD11c	Biolegend	117333	Voir le tableau 1 pour la dilution et la concentration
CD19	BD	560375	Voir le tableau 1 pour la dilution et la concentration
CD19	Biolegend	152410	Voir le tableau 1 pour la dilution et la concentration
CD226	Biolegend	128808	Voir le tableau 1 pour la dilution et la concentration
CD3e	BD	560527	Voir le tableau 1 pour la dilution et la concentration
CD3e	Biolegend	152313	Se reporter au tableau 1 pour la dilution et la concentration
CD4	Biolegend	100412	Se reporter au tableau 1 pour la dilution et la concentration
CD73	eBioscience	16-0731-82	Se référer au tableau 1 pour la dilution et la concentration
CD8a	eBioscience	48-0081-82	Se référer au tableau 1 pour la dilution et la concentration
Fiole de culture cellulaire (T175 fask, 175 cm2, 550 mL)	Greiner Bio One 658175
Tubes à centrifuger, tubes à fond conique 25 mm x 89 mm	Beckman Coulter	358126
centrifugeuses	Beckman Coulter		Ultracentrifuge et centrifugeuse TC
Collagénase type IV	Sigma-Aldrich	C5138
Tubes à centrifuger coniques (15 mL et 50 mL)	Greiner Bio One	11512303 & 11849650
Cryotubes	Greiner Bio One	123277	ou cryotubes
DMEM medium (1x) + 4,5g/L de D-glucose, 400 µ ; M L-glutamine	Thermo Fisher Scientific	41965-062
Dnase I	Sigma-Aldrich	11284932001
Réactif de transfection Effectene	Qiagen	301425
F4/80	Biolegend	123123	Voir le tableau 1 pour la dilution et la concentration
F4/80	Biolegend	123133	Se référer au tableau 1 pour la dilution et la concentration
F4/80	Biolegend	123147	Voir le tableau 1 pour la dilution et la concentration
FceR1	eBioscience	48-5898-80	Se référer au tableau 1 pour la dilution et la concentration
Sérum de veau fœtal (SCF)  ;	Thermo Fisher Scientific	10270-106	chaleur inactivée pendant 30 min à 56 ° ; C et stérile filtré à travers 0,22 &mu ; Cytomètre
flux	Thermo Fisher Scientific	; Tampon de cytométrie en flux Attune NxT
(FACS)	préparé en interne
Microscope fluorescent de culture tissulaire	Thermo Fisher Scientific	EVOS FL
Forceps	N/A	N/A Préférence	de l’utilisateur
Solution saline équilibrée de Hank (HBSS)	Gibco, Life Technologies	14175-053
HEK293T lignée		cellulaire	cultivé pendant au moins une semaine avant la transfection. Antigène HIV-1 Core exempt de mycoplasmes
	Beckman Coulter	6604667
Hyaluronidase	Sigma-Aldrich	H3506
Gommage chirurgical Hydrex, gluconate de chlorhexidation 4 % p/v nettoyant pour la peau	Ecolab	3037170
I-A/I-E	Biolegend	107625	Reportez-vous au tableau 1 pour la dilution et la concentration
ICAM1	Becton Dickinson	554970	Voir le tableau 1 pour la dilution et la concentration de
la lignée			cultivée pendant au moins une semaine avant l’utilisation. Kit
coloration de cellules mortes proche IR fixable	Thermo Fisher Scientific	L34975
Ly6G	Biolegend	127615	Reportez-vous au tableau 1 pour la dilution et la concentration
Souris			utilisées ici C57BL/6 femelles, âgées de 8 à 12 semaines (Charles Rivers), sauf indication contraire
Pipettes microcapillaires (plage de volume 0,5-1 000 &mu ; L)	Fisher Scientific & Starlab	11963466 & 11943466 & 11973466 & S1111-3700
NK1.1	Biolegend	108724	Voir le tableau 1 pour la dilution et la concentration
de paraformaldéhyde	Sigma-Aldrich	P6148-500G	préparé à 2 % p/v dans le
PBS pCMV-&Delta ; Le plasmide d’emballage R8.91	Zuffrey, R., et al. 1997		Résistance à l’ampiciline.
Pénicilline/Streptomycine (100x, 10 000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140122 Boîte de
Pétri	Greiner Bio One	664160
pHR’SIN-cPPT-SEW plasmide		Rosas, M. et al. 2014	modifié pour les études d’expression shRNA et miR. Code pour le marqueur EGFP en aval du promoteur du SFFV et en amont de l’amplificateur du virus hépatique Woodchuck. Résistance à l’ampiciline.
	pMD2.G	Naldini, L. et al. 1996	code pour l’enveloppe de la glycoprotéine g du virus de la stomatisation vésiculaire (VSV-G). Résistance à l’ampiciline.
Contrôle des isotypes IgG1, &kappa ;	Becton Dickinson	550617	Reportez-vous au tableau 1 pour la dilution et la concentration
Sérum de rat	Sigma-Aldrich	R9759-10ML
Tampon de lyse ACK des globules rouges	préparé sur place
RPMI 1640 moyen (1x) + 400 uM L-glutamine	Thermo Fisher Scientific	21875-091
Saponin	Sigma-Aldrich	S4521
SiglecF	BD	562681	Reportez-vous au tableau 1 pour la dilution et la concentration Pastilles d’hypochlorite
de sodium (eau de Javel, 2 000 ppm)	Guest Medical	H8818
Plaque de culture cellulaire stérile à 24 puits	Greiner Bio One	662160
Stérile Dulbecco’s PBS (DPBS) (1x) Mg++ et Ca2+ - gratuit	Thermo Fisher Scientific	14190144
Stérile EDTA	Thermo Fisher Scientific	15575020
Pipettes de transfert jetables stériles VWR (23,0 mL, 30 cm)	VWR	612-4515
Saccharose	Thermo Fisher Scientific	15503022
ciseaux chirurgicaux	N/A	N/A N/A	Préférence de l’utilisateur
Seringues (50 mL et 1 0mL)	Fisher Scientific	10084450 & 768160
Tim4	Biolegend	130007	Reportez-vous au tableau 1 pour la dilution et la concentration de la
plaque de culture cellulaire à 96 puits à fond en U	Greiner Bio One	650180