Analyse phénotypique semi-automatisée de cultures fonctionnelles de cellules sphéroïdes 3D

Résumé

Nous présentons un protocole de culture de sphéroïdes hautement reproductibles et leur caractérisation phénotypique par capture d’images et protéomique.

Résumé

Nous présentons un protocole qui décrit les propriétés et les avantages de l’utilisation d’un incubateur de clinostat autonome pour la culture, le traitement et le suivi des cultures cellulaires 3D. Le clinostat imite un environnement où les cellules peuvent s’assembler sous forme de sphéroïdes hautement reproductibles avec de faibles forces de cisaillement et une diffusion active des nutriments. Nous démontrons que les hépatocytes cancéreux et non cancéreux (lignées cellulaires HepG2/C3A et THLE-3) ont besoin de 3 semaines de croissance avant d’atteindre des fonctionnalités comparables à celles des cellules hépatiques. Ce protocole met en évidence la commodité de l’utilisation d’incubateurs pour les cellules 3D avec des caméras surveillant la croissance cellulaire, car des instantanés peuvent être pris pour compter et mesurer les sphéroïdes lors du traitement. Nous décrivons la comparaison des lignées cellulaires THLE-3 et HepG2/C3A, montrant comment des lignées cellulaires non cancéreuses peuvent être cultivées ainsi que des cellules cancéreuses immortalisées. Nous démontrons et illustrons comment des expériences de protéomique peuvent être menées à partir de quelques sphéroïdes, qui peuvent être collectés sans perturber la signalisation cellulaire, c’est-à-dire sans trypsinisation requise. Nous montrons que l’analyse protéomique peut être utilisée pour surveiller le phénotype typique du métabolisme de la chaîne respiratoire et la production de protéines impliquées dans la détoxification des métaux et décrivons un système semi-automatisé pour compter et mesurer l’aire du sphéroïde. Dans l’ensemble, le protocole présente une boîte à outils qui comprend une caractérisation phénotypique via la capture d’images et un pipeline protéomique pour expérimenter sur des modèles de culture cellulaire 3D.

Introduction

Les cultures cellulaires in vitro se sont avérées nécessaires et inestimables pour établir des connaissances fondamentales en biologie. Une grande partie de la compréhension scientifique en biologie et en cancer en particulier provient du système de culture 2D, c’est-à-dire des cellules qui se développent dans une monocouche. Bien que la culture 2D ait été le système de culture cellulaire dominant, elle présente de nombreux inconvénients qui peuvent potentiellement étouffer les progrès biologiques. Par exemple, les cultures 2D manquent d’interactions cellule-cellule importantes pour la signalisation cellulaire et la prolifération¹. À ce jour, il a été démontré que les systèmes de culture 3D modélisent mieux la différenciation, la réponse aux médicaments, l’invasion tumorale et la biologie 2,3,4,5. La modélisation 3D des cancers malins est particulièrement vitale en raison de l’augmentation du vieillissement de la population et de la mortalité par cancer. Le carcinome hépatocellulaire (CHC) est l’une des principales causes de mortalité liée au cancer dans le monde et a souvent un pronostic catastrophique⁶. Le CHC est connu pour avoir un faible taux de guérison, une faible réponse aux médicaments et un taux élevé de récurrence ^6,7,8. Plusieurs modèles 3D pour le foie normal et le CHC ont été développés qui imitent la physiologie du tissu hépatique normal et malin in in vivo ^9,10.

Certains des systèmes 3D actuels comprennent des revêtements liquides, des bioréacteurs, de l’hydrogel, des échafaudages et des structures imprimées en 3D. Les sphéroïdes générés dans les bioréacteurs offrent des avantages uniques car ils imitent la distribution tumorale de l’exposition aux nutriments, des échanges gazeux et de la prolifération/quiescence cellulaire¹¹. Les bioréacteurs sont particulièrement adaptés aux modèles de cancer en raison de leur facilité d’utilisation, de leur grande évolutivité, de la diffusion des nutriments et de leur accessibilité¹¹. De plus, les bioréacteurs peuvent permettre des expériences à haut débit, une plus grande reproductibilité et une diminution des erreurs humaines. Le bioréacteur utilisé dans cette étude est unique parce qu’il simule un système de gravité réduite, ce qui minimise les forces de cisaillement perturbatrices appliquées dans les bioréacteurs typiques, ce qui permet une meilleure reproductibilité¹². La gravité omnidirectionnelle et la réduction des forces de cisaillement permettent aux cellules de se développer de manière plus physiologique. Pour preuve, les cellules HepG2/C3A cultivées selon cette méthodologie développent des organites sphériques qui produisent in vivo des niveaux d’ATP, d’adénylate kinase, d’urée et de cholestérol^13,14. De plus, les traitements médicamenteux dans ce système 3D sont plus avancés et automatisés par rapport aux cultures 2D. Dans les cultures 2D, les traitements médicamenteux doivent souvent avoir une courte durée en raison de la nécessité de trypsiniser et de maintenir la santé cellulaire. Pourtant, dans notre cas, nous pouvons effectuer des traitements médicamenteux à long terme des sphéroïdes sans avoir besoin de perturber la structure et la physiologie des cellules. Par conséquent, un passage des cultures 2D à 3D est nécessaire pour mieux modéliser les phénomènes biologiques in vivo et poursuivre le développement scientifique.

Cet article présente une méthodologie pour la culture de sphéroïdes hautement reproductibles (Figure 1 et Figure 2) et montre un système semi-automatisé pour caractériser phénotypiquement des structures 3D (Figure 3). Au niveau de l’image, nous fournissons des informations sur le comptage et la mesure de l’aire des sphéroïdes (Figure 3). En utilisant des méthodes de spectrométrie de masse, nous montrons comment la protéomique peut être utilisée pour évaluer des fonctions biologiques spécifiques (Figure 4). En collectant et en analysant ces données, nous espérons améliorer la compréhension de la biologie derrière les systèmes de culture cellulaire 3D.

Protocole

1. Tampons et réactifs

1. Milieux de croissance cellulaire pour les cellules HepG2/C3A : Préparer le milieu d’Eagle modifié de Dulbecco (DMEM, 4,5 g/L de glucose) contenant 10 % de sérum de veau fœtal (FBS), des acides aminés non essentiels (1 % v/v), de la L-glutamine (1 % v/v) et de la pénicilline/streptomycine (0,5 % v/v). Conservez le milieu de culture à une température de 4 °C.
2. Milieux de croissance cellulaire pour les cellules THLE-3 : Préparer un milieu de croissance des cellules épithéliales bronchiques [BEGM] contenant ses suppléments (extrait hypophysaire bovin [BPE], hydrocortisone, facteur de croissance épidermique humain [hEGF], épinéphrine, transferrine, insuline, acide rétinoïque, triiodothyronine, sulfate-amphotéricine de gentamicine [GA]) ainsi que 10 % de FBS, 5 ng/mL de hEGF et 70 ng/mL de phosphoétanolamine.
3. 500 mM de DL-Dithiothréitol (DTT) : Pour préparer 10 mL, remettre en suspension 0,771 g de DTT dans 10 mL d’eau de qualité HPLC. Conserver 100 μL d’aliquotes à -20 °C.
4. 200 mM d’iodoacétamide : Pour préparer 1 mL, remettre en suspension 36 mg d’iodoacétamide dans 1 mL de bicarbonate d’ammonium à 50 mM. Ne pas conserver l’iodoacétamide remis en suspension.
5. Dodécylsulfate de sodium (SDS) à 5 % : Pour préparer 50 mL, remettre en suspension 2,5 g de SDS dans 50 mL de bicarbonate d’ammonium à 50 mM. Conserver à 4 °C.
6. Acide phosphorique à 12 % : Pour préparer 100 mL, diluer 14,1 mL d’acide phosphorique à 85 % dans 85,9 mL d’eau de qualité HPLC. Conserver dans une bouteille en verre à température ambiante (RT).
7. Tampon de liaison : Pour préparer 1 L, ajouter 900 mL de méthanol concentré à 100 mL de bicarbonate d’ammonium ou de TEAB à 10 mM.
8. Solution d’acide trifluoroacétique (AGT) à 0,1 % : Ajouter 1 mL d’AGT concentré à 999 mL d’eau de qualité HPLC. Conserver à 4 °C.
9. Solution à 60 % d’acétonitrile/0,1 % d’AGT : Ajouter 600 mL d’acétonitrile de qualité HPLC (60 % v/v) à 399 mL d’eau de qualité HPLC. Ensuite, ajoutez 1 mL d’AGT concentré à cette solution, puis conservez-le à 4 °C.
10. Phase mobile A (MPA) - 0,1 % d’acide formique : Ajouter 1 mL d’acide formique concentré à 999 mL d’eau de qualité HPLC et bien mélanger.
11. Phase mobile B (MPB) - 80 % d’acétonitrile de qualité HPLC + 0,1 % d’acide formique : Ajouter 800 mL d’acétonitrile de qualité HPLC à 199 mL d’eau de qualité HPLC. Ensuite, ajoutez 1 mL d’acide formique concentré à cette solution et mélangez.

2. Préparation des sphéroïdes

REMARQUE : La figure 1A représente les étapes initiales de la préparation et de la culture des sphéroïdes 3D à partir de lignées cellulaires.

1. Décongeler les cellules HepG2/C3A et THLE-3 congelées et les cultiver en monocouche à l’aide d’un milieu de culture standard dans une fiole ou une boîte de culture tissulaire jusqu’à ce qu’elles atteignent environ 80 % de confluence.
   REMARQUE : Lorsque les cellules atteignent la confluence, vérifiez la morphologie cellulaire générale et les modèles de croissance à l’aide d’un microscope. Il n’est pas recommandé d’utiliser des cellules à un nombre de passages élevé.
2. Laver les cellules deux fois avec la solution saline équilibrée de Hank (HBSS, utiliser 5 ml pour un flacon T75 cm² ou un plat de 10 cm).
3. Ajouter 5 mL de trypsine-EDTA à 0,05 % diluée dans de l’HBSS (dilution 1 :2) et incuber pendant 5 min à 37 °C avec 5 % de CO₂. Utiliser un microscope pour évaluer le détachement cellulaire et ajouter 3 mL de FBS ou de milieu de culture (contenant 10 % de FBS) pour neutraliser la réaction à la trypsine.
4. Transférer la suspension cellulaire dans un tube de 15 ml. Essorez à 270 x g à RT pendant 5 min.
5. Aspirer le surnageant et remettre les cellules en suspension dans 5 mL de milieu de culture complet.
   REMARQUE : S’il y a trop de cellules, diluez la suspension cellulaire avant de compter.
6. Compter le nombre de cellules et diluer la suspension cellulaire dans un milieu de culture complet pour obtenir 1 x 10⁶ dans un volume maximum de 1,5 mL.
7. Équilibrez une plaque inférieure ronde à 24 puits à fixation ultra-basse contenant des micropuits.
   1. Laver les puits avec 0,5 mL de milieu de culture.
   2. Centrifuger la plaque à 3 000 x g pendant 5 min (cela permet d’éliminer les bulles d’air de la surface des puits).
8. Transvaser la suspension cellulaire (préparée à l’étape 1.4) dans la plaque et centrifuger pendant 3 min à 120 x g.
   REMARQUE : Le volume de la suspension cellulaire peut varier en fonction du nombre de cellules, mais il est important de le limiter à 1,5 ml.
9. Incuber la plaque pendant 24 h à 37 °C avec 5 % de CO₂ pour commencer la formation de sphéroïdes.

3. Culture de sphéroïdes dans des bioréacteurs (Figure 2)

REMARQUE : Pour préserver la structure des sphéroïdes, utilisez des pointes à alésage large lorsque vous manipulez des sphères 3D.

1. Équilibrer le bioréacteur en remplissant la chambre d’humidité avec 25 mL d’eau stérile et la chambre cellulaire avec 9 mL de milieu de culture 24 h avant d’y transférer les sphéroïdes (Figure 2A). Assurez-vous d’utiliser une seringue de 10 ml couplée à une longue aiguille pour remplir les chambres d’humidité et de cellule.
2. Incuber le bioréacteur, en rotation (15 tr/min) dans l’incubateur 3D (Figure 2D,F), pendant 24 h à 37 °C avec 5 % de CO₂.
3. À l’aide d’embouts à alésage large de 1 mL, pipeter doucement de haut en bas pour détacher les sphéroïdes de la plaque de fixation ultra-basse et transférer les sphéroïdes dans une boîte de culture tissulaire.
4. Lavez la plaque de fixation à très basse température avec 0,5 mL de milieu de culture préchauffé pour capturer les sphéroïdes restants et transférez-les dans le même plat à partir de l’étape 3.3.
5. Évaluez la taille, la compacité et la rondeur des sphéroïdes à l’aide d’un microscope optique (grossissement 4x) et sélectionnez ceux qui sont suffisamment formés.
   REMARQUE : Les cellules sont suffisamment formées lorsqu’elles sont compactes et qu’elles ne se désagrègent pas lors de la manipulation. Il est également important que les sphéroïdes forment une seule unité et ne soient pas agglomérés. Une taille de sphéroïde comprise entre 100 et 200 μm est préférable lorsqu’elle est transférée au bioréacteur.
6. Transférez les sphéroïdes dans le bioréacteur équilibré rempli de 5 mL de milieu de culture frais. Après avoir transféré les sphéroïdes, remplissez complètement le bioréacteur avec des milieux de croissance frais et assurez-vous d’éviter d’ajouter des bulles au bioréacteur lorsque vous le remplissez de milieux.
7. Placez le bioréacteur dans l’incubateur 3D et ajustez la vitesse de rotation à l’aide de l’unité de commande (Figure 2C). Pour les sphéroïdes HepG2/C3A, réglez la vitesse de rotation sur 10-11 tr/min ; pour les sphéroïdes THLE-3, réglez-le sur 11-12 tr/min.
   REMARQUE : La vitesse de rotation est correctement réglée lorsque les sphéroïdes sont répartis uniformément au centre du bioréacteur et ne touchent pas ses parois. La figure 2E montre un bioréacteur en rotation.
8. Remplacez les milieux de culture tous les 2 à 3 jours en retirant 10 mL d’anciens milieux et en les remplaçant par 10 mL de milieux neufs ; assurez-vous de ne pas retirer les sphéroïdes lors de l’échange de milieux (Figure 2B).
   REMARQUE : Il est recommandé d’avoir une routine d’échange de médias (par exemple, 48 h/48 h/72 h) et de tenir un registre détaillé.
9. Ajustez la vitesse de rotation chaque fois que le support est changé. Augmentez la vitesse au fur et à mesure que les sphéroïdes grandissent en taille et en nombre.
10. Après 15 jours de culture, diviser les sphéroïdes en deux nouveaux bioréacteurs.
    REMARQUE : En fonction de la lignée cellulaire et du taux de croissance, le temps peut varier et doit être optimisé individuellement.
11. Après 20 jours, les sphéroïdes sont prêts à être collectés.

4. Capture d’images et comptage de sphéroïdes

REMARQUE : Le pipeline simplifié pour le nombre de sphéroïdes est illustré à la figure 3A. Pour le comptage des sphéroïdes et la détermination de l’aire (section 5), il est essentiel d’évaluer la compacité des structures 3D. Cela contribuera à un contraste de couleurs plus amélioré, ce qui est nécessaire pour que la méthode soit précise.

1. Ouvrez l’application 3D installée sur la tablette.
2. Sélectionnez le bioréacteur et prenez un instantané.
   REMARQUE : Alternativement, une photo peut être prise. Les paramètres suivants doivent être pris en compte.
   1. Placez un fond noir derrière le bioréacteur (un support noir est fourni dans le boîtier du bioréacteur).
   2. Assurez-vous qu’il n’y a pas de réflexion de lumière sur la chambre cellulaire.
   3. Prenez la photo le plus près possible du bioréacteur.
3. Ouvrez une image dans FIJI (ImageJ).
4. Préparez l’image pour l’analyse :
   1. Sélectionnez l’outil Ovale . Tracez un cercle autour de la fiche.
   2. Cliquez sur Supprimer sur le clavier pour noircir tout ce qui se trouve à l’intérieur du cercle. Tracez un cercle autour de la chambre cellulaire. Assurez-vous que tous les sphéroïdes sont à l’intérieur du cercle.
5. Exécutez la macro pour compter les sphéroïdes :
   1. Cliquez sur Plugins > Macro > Record. Copiez le texte de la macro du fichier supplémentaire 1 dans l’enregistreur.
   2. Appuyez sur Créer et une nouvelle fenêtre s’ouvrira. Appuyez sur Exécuter pour analyser l’image ouverte.
   3. Une nouvelle fenêtre s’ouvrira avec les résultats (nombre, surface totale, taille moyenne et pourcentage de surface).
6. Fermez l’image et répétez les étapes 4.4 et 4.5 pour chaque image pour laquelle le nombre de sphéroïdes est nécessaire. Pour un traitement plus facile et plus rapide, enregistrez la macro et exécutez-la en cliquant sur Plugins > Macro > Exécuter et sélectionnez la macro enregistrée.

5. Détermination planimétrique de l’aire sphéroïdale

REMARQUE : La canalisation simplifiée pour la détermination de la surface sphéroïde est illustrée à la figure 3B.

1. Prenez des images comme décrit à l’étape 3.5.
2. Avant de commencer, définissez une échelle globale pour mesurer l’aire des sphéroïdes.
   1. Ouvrez dans FIDJI une image avec une barre d’échelle avec le grossissement souhaité. Sélectionnez l’outil Ligne. Dessinez au-dessus de la barre d’échelle (la ligne doit être aussi longue que la barre d’échelle).
   2. Ouvrez Analyser > définir l’échelle. Ecrire la distance de connaissance (la longueur de la ligne est automatiquement entrée dans la Distance en Pixels. Assurez-vous de cocher Global.
   3. Appuyez sur OK. Maintenant, l’échelle est réglée pour l’image qui sera analysée.
3. Pour lancer la détermination planimétrique, exécutez la macro (Fichier supplémentaire 2).
   1. Cliquez sur Traiter > Batch > macro. Choisissez le dossier qui contient les images à analyser. Ce dossier sera l’entrée.
   2. Choisissez le dossier créé à l’étape 5.3.1 comme Sortie. Appuyez sur Processus.
4. Pour vérifier la qualité, évaluez si la surface sphéroïdale mesurée correspond à l’image d’origine.
   REMARQUE : La macro exclut les sphéroïdes sur le bord où seule une partie du sphéroïde peut être mesurée.

6. Collection de sphéroïdes

REMARQUE : Il est fortement conseillé de prélever les sphéroïdes à l’aide de pointes à alésage large afin de préserver leur structure 3D. Le prélèvement peut être effectué à l’aide de la fiche située à l’avant du bioréacteur (figure 2A).

La taille des sphéroïdes au moment du prélèvement peut varier en fonction de la lignée cellulaire, du nombre initial de cellules et du processus de fractionnement (jours de culture, nombre de sphéroïdes par bioréacteur et taux de fractionnement).

1. Pour recueillir les sphéroïdes, prélever 5 mL de milieu du bioréacteur par l’orifice supérieur à l’aide d’une seringue couplée à une longue aiguille. Assurez-vous de laisser les sphéroïdes couler au centre inférieur du bioréacteur (près de l’orifice inférieur).
2. Ouvrez l’orifice avant et collectez les sphéroïdes à l’aide d’un embout de 1 ml de large. Placez les sphéroïdes dans des tubes de microcentrifugation. Centrifuger les sphéroïdes à 500 x g pendant 5 min et jeter le milieu.
3. Lavez les sphéroïdes avec 200 μL d’HBSS pour éliminer le FBS. Centrifuger à 500 x g pendant 5 min et jeter le surnageant.
4. Congelez le sphhéroïde avec de l’azote liquide et conservez-le à -80 °C jusqu’au traitement.

7. Viabilité des sphéroïdes

NOTA : La viabilité sphéroïde a été déterminée en mesurant l’activité de l’adénylate kinase (AK) libérée par les cellules endommagées (Figure 4A). En raison du gradient de diffusion, la mesure de l’AK est efficace lorsque les sphéroïdes ont un diamètre inférieur à 900 μm¹². Si les sphéroïdes grossissent, ou s’il y a un doute sur la mesure de la viabilité, un test ATP peut être effectué¹⁵.

1. Prélever le surnageant sphéroïde et transférer 20 μL dans une plaque à 96 puits à paroi blanche (fond plat transparent). Ajouter 100 μL de réactif de détection de l’adénylate kinase dans chaque puits et homogénéiser en pipetant doucement de haut en bas.
2. Éliminer les bulles par centrifugation dans le vide rapide pendant 2 min à RT. Incuber les plaques pendant 20 min à RT.
3. Placez la plaque dans le luminomètre (lecteur de plaques, mode luminescence) et lancez le programme. Réglez les paramètres selon les instructions du fabricant du kit.
   REMARQUE : Dans les essais de viabilité bioluminescente, la puissance lumineuse directe du luminomètre (généralement RLU) peut être utilisée pour calculer la réponse cellulaire. Comme l’adénylate kinase ne s’échappe que des cellules dont l’intégrité cellulaire a été compromise, il est possible d’obtenir un contrôle total de l’adénylate kinase en utilisant un réactif de lyse.

8. Extraction des protéines

REMARQUE : La figure 1B représente le flux de travail pour le traitement des sphéroïdes et l’extraction des protéines.

1. Recueillir les sphéroïdes (section 6) le jour 36. Remettre en suspension les sphéroïdes dans 25 μL de SDS à 5 % pour lyser les cellules.
   1. Après avoir ajouté 5 % de SDS, homogénéisez la pastille en pipetant de haut en bas. Dans certains cas, lorsqu’il est difficile de lyser les sphéroïdes, utilisez un petit pilon.
2. Incuber les échantillons avec 20 mM de DTT pendant 1 h pour réduire les protéines. Mélangez en pipetant de haut en bas.
3. Incuber les échantillons avec de l’iodoacétamide à 40 mM pendant 30 min à l’abri de la lumière à alkyler les protéines. Mélangez en pipetant de haut en bas.
4. Ajouter une solution d’acide phosphorique à 12 % (10x) aux échantillons à une concentration finale de 1,2 %.
5. Diluer les échantillons dans six volumes de tampon de liaison et mélanger délicatement.
6. Chargez l’échantillon sur une plaque filtrante S-Trap et faites-le tourner à 500 x g pendant 30 s.
   REMARQUE : Si le volume total de l’échantillon à l’étape 8.4 dépasse la capacité de volume de la colonne, chargez les échantillons par lots et répétez l’étape 8.6 jusqu’à ce que tout passe dans la colonne.
7. Laver les échantillons deux fois avec 150 μL de tampon de liaison. Après chaque lavage, essorez à 500 x g pendant 30 s et jetez l’écoulement.
8. Incuber les échantillons avec 1 μg de trypsine de qualité séquençage diluée dans 50 mM de bicarbonate d’ammonium pendant une nuit à 37 °C.
   REMARQUE : Au moins 20 μg de protéines sont recommandés comme matière première pour une analyse complète du protéome. Pour cela, 1 μg de trypsine est la quantité idéale pour une digestion efficace. Éliminez toutes les bulles entre le tampon et le lit de colonne.
9. Peptides élués avec 40 μL de bicarbonate d’ammonium de 50 mM et s’accumulent dans le même tube de collecte.
10. Tourner vers le bas à 500 x g pendant 30 s. Peptides élués avec 40 μL d’AGT à 0,1 % et les regrouper dans le même tube de collecte.
11. Tourner vers le bas à 500 x g pendant 30 s. Éluez les peptides avec 40 μL d’acétonitrile à 60 % et 0,1 % d’AGT et regroupez-les dans le même tube de collecte.
12. Tourner vers le bas à 500 x g pendant 30 s. Les éluats accumulés à sec sont soumis à l’aspiration rapide et stockent les échantillons à -80 °C jusqu’au traitement.

9. Nettoyage de l’échantillon

REMARQUE : Avant de procéder à l’analyse protéomique, il est nécessaire d’éliminer le sel présent dans les échantillons. Les sels peuvent interférer avec l’analyse par chromatographie liquide et spectrométrie de masse à haute performance (HPLC-MS) car ils s’ionisent pendant l’électropulvérisation, supprimant le signal des peptides. La configuration de dessalage utilisée dans cette étude a déjà été démontrée par Joseph-Chowdhury et ses collègues¹⁶.

1. Avant de commencer, assurez-vous qu’il y a une plaque de collecte propre de 96 puits pour recueillir le débit pendant les étapes suivantes. Mélanger la résine C18 (50 mg/mL dans 100% acétonitrile) sur une plaque d’agitation magnétique.
2. Ajouter 70 μL de la suspension de résine C18 par puits de la plaque filtrante à 96 puits, en veillant rapidement à ce que la résine C18 ne s’accumule pas au fond de la pipette.
3. Allumez doucement l’aspirateur pour éviter les éclaboussures. Jeter l’écoulement collecté sur la plaque de collecte à 96 puits.
4. Laver la résine avec 100 μL d’AGT à 0,1 %. Allumez doucement l’aspirateur pour éviter les éclaboussures et le mélange des échantillons et jetez l’écoulement.
5. Remettre chaque échantillon en suspension dans 100 μL d’AGT à 0,1 %. Vérifiez et assurez-vous que le pH est compris entre 2 et 3.
6. Chargez chaque échantillon dans chaque puits de la plaque filtrante. Allumez doucement l’aspirateur pour éviter les éclaboussures et le mélange des échantillons et jetez l’écoulement.
7. Laver avec 100 μL d’AGT à 0,1 %. Allumez doucement l’aspirateur pour éviter les éclaboussures et le mélange des échantillons. Jetez l’écoulement.
8. Remplacez la plaque de prélèvement à 96 puits par une nouvelle plaque à 96 puits pour recueillir les échantillons dessalés.
9. Ajouter 60 μL d’acétonitrile/0,1 % d’AGT par puits. Pour éluer les échantillons de la résine C18, allumez doucement l’aspirateur pour éviter les éclaboussures.
10. Recueillir l’écoulement et sécher dans un vide rapide à RT. Procéder à la LC-MS/MS ou stocker la plaque à -80 °C jusqu’à ce qu’elle soit prête à traiter les échantillons.

10. Analyse protéomique par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse

NOTE : Pour générer les données de ce manuscrit, on a utilisé un système nLC-MS/MS avec une configuration de système à deux colonnes avec une colonne de piège C18 de 300 μm de diamètre intérieur x 0,5 cm et une nanocolonne analytique C18-AQ (3 μm) de 75 μm de diamètre intérieur x 25 cm emballée en interne.

1. Préparez les phases mobiles pour qu’elles s’exécutent sur l’HPLC :
   Phase mobile A (MPA) : 0,1 % d’acide formique dans l’eau de qualité HPLC
   Phase mobile B (MPB) : 0,1 % d’acide formique dans de l’acétonitrile de qualité HPLC
2. Programmez la méthode HPLC comme suit : 4 %-34 % MPB sur 120 min, 34 %-90 % MPB sur 5 min, isocratique 90 % MPB sur 5 min ; débit : 300 nL/min.
3. Configurez la méthode d’acquisition MS pour effectuer une acquisition indépendante des données (DIA) afin de générer des spectres MS/MS des signaux peptidiques détectés.
4. Remettre en suspension 1 μg d’échantillons dans 10 μL d’AGT à 0,1 % avant de placer les échantillons dans l’échantillonneur automatique nLC.
5. Exécutez la méthode nLC-MS telle qu’elle est programmée pour l’acquisition de protéomique canonique :
   1. Réglez le balayage MS complet à 300-1100 m/z dans l’orbitrap, avec une résolution de 120 000 (à 200 m/z) et une cible de contrôle automatique du gain (AGC) de 125.
   2. Placer MS/MS dans l’orbitrap avec une fenêtre d’isolement séquentielle de 50 m/z avec une cible AGC de 400 et une énergie de dissociation collisionnelle (HCD) de plus haute énergie de 30.

11. Analyse des données

1. Importez les fichiers de données brutes nLC-MS/MS dans un logiciel de détection de pics compatible avec la plateforme MS utilisée.
2. Sélectionnez la base de données appropriée (humain, souris, etc.).
3. Définir l’acétylation N-terminale comme modification variable et la carbamidométhylcystéine comme modification fixe.
4. Spécifiez la trypsine comme enzyme digestive avec deux clivages manqués autorisés.
5. Définissez la tolérance de masse en fonction de l’analyseur de masse utilisé pour l’acquisition des spectres.
6. Exportez l’analyse sous forme de feuille de calcul et traitez les données selon vos besoins.

Résultats

Dans ce protocole, nous décrivons les propriétés d’un incubateur cellulaire 3D innovant et sans stress, un système conçu spécifiquement pour la culture de sphéroïdes 3D (Figure 2). Nous avons optimisé le protocole pour la culture 3D des lignées cellulaires THLE-3 et HepG2/C3A. Le protocole décrit ici est simple à utiliser et permet la reproductibilité et la culture rentable de > 100 sphéroïdes par bioréacteur. Une fois dans le bioréacteur, les sphéroïdes sont traités de la même manière que les cellules maintenues en culture 2D. Des conditions de croissance optimales sont obtenues en changeant les milieux deux à trois fois par semaine (figure 2B) et en ajustant la vitesse de rotation en fonction de la croissance et de la taille des sphéroïdes (figure 2C). Ce système, dans lequel des sphéroïdes 3D sont cultivés dans des bioréacteurs rotatifs (Figure 2E, F), fournit un environnement de croissance optimal pour les structures 3D en exposant le sphéroïde à une force de cisaillement égale et très faible.

Nous avons déjà montré comment les sphéroïdes peuvent être utilisés pour l’analyse de la modification de la chromatine¹⁶. Ici, nous montrons en détail comment obtenir des sphéroïdes hépatiques et comment des expériences de protéomique peuvent être menées pour l’analyse du protéome complet (Figure 1). En bref, le protocole a été initié en utilisant des cellules plates THLE-3 ou HepG2/C3A jusqu’à ce que la culture atteigne 80 % de confluence. Pour cultiver des cellules sous forme de sphéroïdes, environ 2 000 cellules ont été plaquées dans une plaque de fixation ultra-basse contenant des micropuits pour leur permettre de s’auto-agréger, puis les sphéroïdes formés ont été transférés dans un bioréacteur (Figure 1A). Bien qu’ils soient fonctionnellement actifs après 3 semaines de culture, comme démontré précédemment¹⁷, nous montrons les résultats des sphéroïdes collectés après 36 jours de culture pour ce protocole. Après la collecte, les sphéroïdes ont été filés vers le bas, et les pastilles et le surnageant ont été stockés pour analyse. La viabilité cellulaire a été évaluée à partir du surnageant pour la quantification de l’adénylate kinase libérée par les cellules endommagées, comme décrit précédemment¹⁷. Les protéines cellulaires ont été extraites de la pastille cellulaire et le protéome complet a été analysé par spectrométrie de masse à haute résolution (Figure 1B).

Ce protocole fait également la démonstration d’une méthode semi-automatisée de comptage des sphéroïdes (Figure 3A) à l’aide du programme de traitement d’images public FIJI (Fiji Is Just ImageJ)¹⁸. Une image de bonne qualité du sphéroïde doit être prise pour l’analyse, et certains paramètres doivent être pris en compte comme mentionné à la section 5. Ensuite, après avoir préparé l’image pour l’analyse, un script macro (Fichier supplémentaire 1) est utilisé pour compter les sphéroïdes. La macro fonctionne en créant d’abord un dossier appelé FIJI Spheroids counting, à l’intérieur du dossier où se trouvent les images sphéroïdes. Dans ce dossier, toutes les informations de l’analyse sont enregistrées. Cela inclut une photo des sphéroïdes qui ont été comptés, avec un numéro d’identification sur chaque sphéroïde. Il comprend également un fichier Excel appelé comptage sphéroïde. Ce fichier contient la zone de pixel et le numéro d’identification de chaque sphéroïde qui a été compté. Les données correspondant à une image analysée sont présentées dans chaque onglet du fichier. L’onglet est étiqueté en fonction du nom de l’image analysée. Comme la taille des sphéroïdes peut être altérée par de nombreux facteurs, notamment le nombre de structures à l’intérieur d’un vaisseau et le traitement médicamenteux, il est également important de surveiller leur surface (planimétrie). Le script macro présenté ici (fichier supplémentaire 2) fonctionne en mesurant les zones noires, qui correspondent aux sphéroïdes de l’image (Figure 3B). La sortie est rassemblée dans un fichier appelé planimétrie.xlsx, qui contient la surface, le périmètre et le diamètre mesurés de chaque sphéroïde. Il existe également une mesure appelée Féret, utilisée pour calculer le diamètre. Le diamètre du Féret est le plus long possible, tandis que le diamètre du minFéret est le plus court. Le diamètre est la moyenne de ces deux. Dans le dossier de sortie, outre le fichier planimétrique.xlsx, il y a aussi une image des sphéroïdes qui ont été mesurés.

Avant de procéder à l’analyse du protéome, la viabilité des sphéroïdes a été évaluée au cours de la culture. Les niveaux d’AK augmentent jusqu’au jour 17, atteignant environ 7 % de la mort cellulaire, puis la mortalité diminue jusqu’à des niveaux inférieurs à 5 % (Figure 4A), ce qui est conforme aux travaux publiés précédemment¹⁷. Ce protocole montre également l’analyse complète du protéome pour le suivi du phénotype cellulaire. Tout d’abord, les protéomes des cellules plates et des sphéroïdes THLE-3 et HepG2/C3A ont été comparés. En analysant le premier composant principal (PC1), il est évident qu’il y a une séparation stricte des échantillons sphéroïdes des cultures de cellules plates, et il semble que la corrélation du type de cellule (THLE-3 et HepG2/C3A) ne soit pas pertinente (Figure 4B). Bien que les sphéroïdes THLE-3 et HepG2/C3A ne se regroupent pas, ils partagent des profils similaires compatibles avec la fonction hépatique. Nous démontrons dans ce protocole l’exemple des métallothionéines, qui ont un rôle dans la détoxification des métaux effectuée par le foie. Nous avons identifié dans l’analyse protéomique 2 isoformes surexprimées dans les sphéroïdes par rapport aux cellules plates (MT1E et MT1X) (Figure 4C). Nous montrons également l’enrichissement en ontologie génique (GO) des deux lignées cellulaires cultivées sous forme de sphéroïdes. Le processus métabolique glucidique, qui comprend le cycle de l’acide tricarboxylique (cycle TCA), la chaîne de transport d’électrons (respiration cellulaire) et le métabolisme du pyruvate, est un terme fréquent et est enrichi en sphéroïdes HepG2/C3A et THLE-3 (Figure 4D,E). La détoxification cellulaire, le métabolisme des acides gras et du cholestérol sont d’autres fonctions enrichies dans les deux sphéroïdes. Ensemble, ces fonctions sont connues pour être cruciales pour la fonction hépatique.

Figure 1 : Flux de travail pour la culture de sphéroïdes et la préparation d’échantillons. (A) Approche expérimentale de la culture cellulaire 3D. Des cultures de cellules plates à la confluence désirée ont été trypsinisées et ensemencées sur une plaque de 24 puits à fixation ultra-faible contenant des micropuits, où les cellules s’auto-assemblent en sphéroïdes. Après 24 h, les sphéroïdes ont été transférés dans un bioréacteur et cultivés jusqu’à ce qu’ils soient prêts à être analysés. (B) Après la collecte, les sphéroïdes ont été granulés et les pastilles et le surnageant de culture ont été entreposés jusqu’à leur traitement. Les protéines histones¹⁶et non-histones ont été extraites, digérées en peptides et analysées par spectrométrie de masse à haute résolution. Les fichiers bruts obtenus à partir de la spectrométrie de masse ont été recherchés dans la base de données humaine, et les données ont été traitées ultérieurement. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Système de culture cellulaire 3D. (A) Pièces de bioréacteur. Le bioréacteur est composé d’une chambre d’échange gazeux et d’humidification contenant des billes d’eau et d’une chambre cellulaire ouvrante avec deux bouchons pour l’échange de milieux et la collecte des sphéroïdes. (B) Échange de milieux de bioréacteurs. Le bioréacteur est rempli de 10 mL de milieu de culture à l’aide d’une seringue munie d’une aiguille. (C) L’application de contrôle du système. La vitesse de rotation, le niveau de CO2, la température, le journal des alarmes et d’autres fonctionnalités peuvent être contrôlés à l’aide de l’unité de commande. (D) Placer le bioréacteur dans l’incubateur 3D. Chaque bioréacteur est associé à un moteur qui peut faire tourner le bioréacteur lentement. (E) Bioréacteur en mouvement avec la vitesse (tr/min) contrôlée par un comprimé (C). La vitesse (tr/min) est ajustée en fonction de la taille des sphéroïdes. (F) Bioréacteurs à l’intérieur de l’incubateur 3D. L’incubateur 3D peut accueillir jusqu’à 6 bioréacteurs contrôlés individuellement. Photo reproduite avec l’aimable autorisation de Jason Torres Photography. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Caractérisation phénotypique des sphéroïdes par capture d’image. (A) Comptage semi-automatisé des sphéroïdes. Après avoir pris des clichés des sphéroïdes dans le bioréacteur, l’image est préparée pour être analysée aux FIDJI. Chaque sphéroïde est compté et un numéro d’identification est fourni pour chacun d’eux. Une macro est utilisée et les résultats sont affichés indiquant l’ID du sphéroïde compté, l’étiquette (nom de l’image analysée) et la zone (le nombre de pixels comptés dans le sphéroïde). (B) Détermination planimétrique de l’aire sphéroïdale. À l’aide d’une macro, l’aire, le périmètre et le diamètre d’un sphéroïde spécifique sont déterminés. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Analyse du protéome des sphéroïdes hépatiques. (A) La viabilité des sphéroïdes a été calculée sur la base de la libération d’adénylate kinase (AK) sur le surnageant de culture. Les résultats sont les moyens de points de données dupliqués ± écart-type. (B) Une analyse en composantes principales (ACP) a été effectuée pour comparer le protéome des cellules planes et des sphéroïdes THLE-3 et HepG2/C3A. (C) Abondance relative des métallothionéines, qui sont des protéines exprimées par le foie humain. Les données sont représentées sous forme de moyens ± MEB. (D) Les réseaux regroupés fonctionnellement montrent l’enrichissement GO pour les sphéroïdes HepG2/C3A et (E) les sphéroïdes THLE-3, où seule l’étiquette du terme le plus significatif par groupe est indiquée. Le réseau a été construit à l’aide de ClueGo¹⁹. La taille du nœud représente l’importance de l’enrichissement du terme. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Fichier supplémentaire 1 : Script de macro pour le comptage des sphéroïdes. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 2 : Macro pour la détermination planimétrique des sphéroïdes. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Comprendre la biologie derrière les structures cellulaires tridimensionnelles (3D) est extrêmement important pour une connaissance plus complète de leurs fonctionnalités. L’utilisation de modèles 3D pour l’étude de la biologie complexe et le dépistage de la toxicité suscite un intérêt croissant. Lors de la culture de cellules en 3D, de nombreux facteurs doivent être pris en compte, y compris l’évaluation phénotypique du système modèle. Un phénotype est défini comme un groupe de caractéristiques observables d’un organisme spécifique, telles que la morphologie, le comportement, les propriétés physiologiques et biochimiques²⁰.

Dans ce protocole, nous démontrons comment des expériences de protéomique peuvent être menées à partir de quelques sphéroïdes et peuvent être utilisées pour surveiller le phénotype typique du foie. La spectrométrie de masse est devenue une méthode largement appliquée pour la caractérisation cellulaire 3D, permettant l’étude d’une variété de questions biologiques 12,16,21,22. Pour une analyse complète du protéome, il est recommandé d’utiliser au moins 20 μg de matière première protéique, à partir de laquelle 1 μg est injecté dans le spectromètre de masse. Il est important de mentionner que l’ajout de moins d’échantillon peut entraîner une perte de sensibilité, et que l’ajout d’un échantillon supplémentaire détériorerait progressivement la qualité de la chromatographie et finirait par entraîner le blocage de la colonne. Dans cette étude, nous avons montré que les sphéroïdes HepG2/C3A et THLE-3 sont enrichis en protéines importantes provenant de la glycolyse et du cycle du TCA, qui sont des voies hépatiques spécifiques et sont essentielles au maintien de la glycémie et à la production d’énergie^23,24. En fait, l’analyse par spectrométrie de masse fournit non seulement des informations au niveau des protéines, mais permet également d’étudier les modifications post-traductionnelles des protéines, comme l’a montré précédemment notre groupe¹⁶.

Un autre aspect à prendre en compte dans les études phénotypiques 3D est le nombre et la taille des sphéroïdes. En plus de rendre les expériences plus reproductibles, il est essentiel de compter le nombre de sphéroïdes et de déterminer leur taille pour déterminer quand diviser la culture en plusieurs bioréacteurs, car le nombre de structures 3D dans un récipient peut avoir un impact sur la taille des sphéroïdes et les niveaux d’activité métabolique. Cependant, il est important de souligner que le nombre et la taille des sphéroïdes dépendent de la lignée cellulaire, du nombre de cellules de départ, du processus de division et du moment de la collecte. Des détails sur la culture sphéroïdale de l’HepG2/C3A, tels que le nombre de cellules par sphéroïde, la teneur en protéines et la taille en fonction de l’âge, ont été fournis par Fey, Korzeniowska et Wrzesinski²⁵. Pour une analyse précise et réussie à l’aide de la méthode semi-automatisée décrite ici, l’étape la plus critique est une bonne image des sphéroïdes. Pour simplifier, la photo peut être prise avec un téléphone ou une tablette, mais sa résolution doit être maintenue aussi élevée que possible. Comme les images sont rapides à acquérir, elles permettent des expériences de dépistage à grande échelle pour visualiser des caractéristiques phénotypiques spécifiques ou étudier les réponses au traitement médicamenteux. Par conséquent, en raison du nombre croissant de tests cellulaires, un certain nombre de logiciels open source ont été développés au cours des 10 dernières années pour l’analyse d’images²⁶. Dans ce protocole, nous décrivons un système semi-automatisé utilisant le logiciel FIJI¹⁸ pour compter et mesurer la taille des sphéroïdes. Nous avons présenté des scripts (commandes de programmation simples) pour définir une séquence d’opérations algorithmiques qui peuvent être appliquées à une collection d’images, ce qui rend l’analyse facile et rapide. Cependant, en fonction des caractéristiques du sphéroïde, une mesure manuelle doit être utilisée. Par exemple, si les sphéroïdes sont trop translucides, l’écriture FIDJI sera imprécise. D’ailleurs, l’un des critères les plus importants pour que cette méthode fonctionne est la compacité des sphéroïdes. Cette caractéristique contribuera à un contraste de couleur plus élevé entre les sphéroïdes et l’arrière-plan, ce qui est nécessaire pour que la méthode soit précise.

En résumé, outre la présentation d’une méthodologie de culture de sphéroïdes hautement reproductibles, un système semi-automatisé couplé à une caractérisation phénotypique via la capture d’images et la protéomique a également été décrit. Nous nous attendons à ce que cette boîte à outils pour l’analyse des cellules 3D devienne plus robuste avec un logiciel d’analyse d’images entièrement automatisé et des spectromètres de masse de nouvelle génération.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tubes microcentrifuges de 1,5 mL	Bio-Rad	2239480
seringue de 10 mL	Fisher Scientific	1481754	pointe Luer lock, graduée à 12 mL
1000 µ ; L pointes de pipette à large diamètre	Fisher Scientific	14222703
200 & micro ; Pointes de pipette à large diamètre Fisher	Scientific	14222730
plaque filtrante Orochem à 96 puits	Orochem  ;	OF1100
Plaque à jupe à 96 puits	Axygen	PCR-96-FS-C
Collecteur à vide à 96 puits	Millipore	MAVM0960R
Bicarbonate d’ammonium	Sigma	A6141-25G
Milieu de croissance des cellules épithéliales bronchiques (BEGM)	Lonza	CC-3170
Eau de qualité culture cellulaire	Corning	25-055-CV
ClinoReactor Bioréacteur	CelVivo	N/A	pour la culture cellulaire 3D
Incubateur ClinoStar	CelVivo	N/A	CO2 incubateur pour culture cellulaire 3D
DTT	Sigma	D0632-5G
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)	Fisher Scientific	MT17205CV
Elplasia 24 puits à fond rond Plaque de fixation ultra-basse contenant des micropuits	Corning	4441
Sérum de veau fœtal	Fisher Scientific	MT35010CV
Acide formique	Thermo	28905
Solution saline équilibrée de Hank (HBSS)	Fisher Scientific	MT21022CV
hEGF	Corning	354052
HERAcell vios 160i	Thermo	51033557	CO2 incubateur pour culture cellulaire 2D
Acétonitrile de qualité HPLC	Fisher Scientific	A955-4
Méthanol de qualité HPLC	Fisher Scientific	A452-1
Eau de qualité HPLC	Fisher Scientific	W5-4
Iodoacétamide	Sigma	I1149-5G
L-glutamine	Fisher Scientific	MT25015CI
Acides aminés non essentiels	Fisher Scientific	MT25025CI
Oasis HLB Résine 30 & micro ; m	Waters	186007549
Orbitrap Fusion Lumos Spectromètre de masse Tribrid	Thermo	IQLAAEGAAPFADBMBHQ	Spectromètre de masse haute résolution
Microscope PAULA	Leica
Pénicilline-Streptomycine	Fisher Scientific	MT3002CI
PerkinElmer Lecteur de microplaques multi-étiquettes Victor X2	PerkinElmer
Papier pH	Hydrion	93
Phosphoétanolamine	Sigma	P0503
Acide phosphorique	Fisher Scientific	A260-500
Pistolet pipette	Eppendorf	Z666467 (Milipore Sigma)
Centrifugeuse réfrigérée	Thermo	75-217-420
Résine Reprosil-Pur	MSWIL	R13. AQ.003	120 & Aring ; taille des pores, phase C18-AQ, 3 &mu ; M taille de perle
SDS	Bio-Rad	1610301
Trypsine modifiée de qualité séquençage	Promega	V511A
Concentrateur sous vide SpeedVac (plaques à 96 puits)	Thermo	15308325	Savant SPD1010
Capot stérile	Thermo	1375
Pipettes sérologiques	stériles Fisher Scientific	1367549
Siphon	en S Protifi	C02-micro-80
Aiguille pour seringue (18 G)	Fisher Scientific	14817100	3 » de longueur, 0,05 » de diamètre
Acide trifluoroacétique (TFA)	Thermo	28904
Trypsine-EDTA	Gibco	25300-054
Vortex	Sigma	Z258415
Bain d’eau	Fisher Scientific