Microinjection ciblée et électroporation d’organoïdes cérébraux de primates pour la modification génétique

Étudier le développement (physio)physiologique et l’évolution du cortex cérébral est une tâche formidable qui est entravée par le manque de systèmes modèles appropriés. Auparavant, ces études se limitaient à des modèles de culture cellulaire bidimensionnelle (tels que les cultures de cellules neuronales primaires ou neuronales) et à des modèles animaux distants de l’évolution (tels que les rongeurs)^1,2. Bien que ces modèles soient utiles pour répondre à certaines questions, ils sont limités dans la modélisation de la complexité, de la composition du type cellulaire, de l’architecture cellulaire et des modèles d’expression génique du néocortex humain en développement dans des états sains et malades. Ces limitations conduisent, par exemple, à la faible transposabilité des modèles murins de maladies humaines à la situation humaine, comme décrit pour certains cas de microcéphalie (par exemple, Zhang et ^al.3). Récemment, les primates transgéniques non humains, qui sont un modèle évolutif, fonctionnel et morphologiquement plus proche du développement du néocortex humain, ont attiré l’attention 4,5,6,7,8 alors qu’ils surmontent de nombreuses limitations des modèles basés sur la culture cellulaire et les rongeurs. Cependant, l’utilisation de primates non humains dans la recherche est non seulement très coûteuse et prend beaucoup de temps, mais soulève également des préoccupations éthiques. Plus récemment, le développement de la technologie des organoïdes cérébraux 9,10 est apparu comme une alternative prometteuse qui résout bon nombre des limitations des modèles précédents 11,12,13,14,15,16.

Les organoïdes cérébraux sont des structures multicellulaires tridimensionnelles (3D) qui émulent les principales caractéristiques de la cytoarchitecture et de la composition de type cellulaire d’une ou de plusieurs régions du cerveau pendant une fenêtre temporelle de développement définie 11,12,13,14,17. Ces structures 3D sont générées soit à partir de cellules souches pluripotentes induites (CSPi) ou, si elles sont disponibles pour l’espèce d’intérêt, à partir de cellules souches embryonnaires (CSE). En général, deux types d’organoïdes cérébraux peuvent être distingués en fonction de la méthodologie utilisée: les organoïdes cérébraux non guidés et régionalisés (guidés)¹⁸. Lors de la génération de ce dernier type d’organoïdes, de petites molécules ou facteurs sont fournis qui guident la différenciation des cellules souches pluripotentes en organoïdes d’une région particulière du cerveau (par exemple, les organoïdes du cerveau antérieur)¹⁸. En revanche, chez les organoïdes non guidés, la différenciation n’est pas guidée par l’addition de petites molécules, mais repose exclusivement sur la différenciation spontanée des CSPi/ESC. Les organoïdes cérébraux qui en résultent sont constitués de types de cellules représentant différentes régions du cerveau (p. ex., les organoïdes cérébraux)¹⁸. Les organoïdes cérébraux combinent de nombreuses caractéristiques clés du développement du cerveau avec une génération relativement rentable et rapide à partir de toute espèce d’intérêt pour laquelle des CSPi ou des CSE sont disponibles^11,12,13,14. Cela fait des organoïdes cérébraux un excellent modèle pour de nombreux types d’études neurobiologiques, allant des questions évolutives et développementales à la modélisation des maladies et aux tests de médicaments^15,16. Cependant, la résolution de ces questions à l’aide d’organoïdes cérébraux dépend fortement de la disponibilité de différentes méthodes de modification génétique.

Un aspect clé de l’étude du développement (physio)physiologique du néocortex et de son évolution est l’analyse fonctionnelle des gènes et des variantes génétiques. Ceci est généralement réalisé par expression (ectopique) et / ou par knock-down (KD) ou knock-out (KO) de ces gènes. Ces modifications génétiques peuvent être classées en modifications génétiques stables et transitoires, ainsi qu’en modifications limitées temporellement et spatialement ou non restreintes. La modification génétique stable est définie par l’introduction d’une altération génétique dans le génome de l’hôte qui est transmise à toutes les générations cellulaires ultérieures. Selon le moment de la modification génétique, elle peut affecter toutes les cellules d’un organoïde ou peut être limitée à certaines populations cellulaires. Le plus souvent, une modification génétique stable est obtenue dans les organoïdes cérébraux au niveau iPSC/ESC en appliquant des lentivirus, des systèmes de type transposon et la technologie CRISPR/Cas9 (examinée par, par exemple, Fischer et al.17, Kyrousi et ^al.19, et Teriyapirom et ^al.20). Cela a l’avantage que toutes les cellules de l’organoïde cérébral portent la modification génétique et qu’elle n’est pas restreinte dans le temps ou dans l’espace. Cependant, la génération et la caractérisation de ces lignées stables d’iPSC/ESC prennent beaucoup de temps, prenant souvent plusieurs mois avant que les premiers organoïdes cérébraux modifiés puissent être analysés (examinés par exemple par Fischer et al.17, Kyrousi et ^al.19, ou Teriyapirom et ^al.20).

En revanche, la modification génétique transitoire est définie par la livraison d’une cargaison génétique (p. ex., un plasmide d’expression génique) qui ne s’intègre pas dans le génome de l’hôte. Bien que cette modification puisse, en principe, être transmise aux générations cellulaires suivantes, la cargaison génétique délivrée sera progressivement diluée à chaque division cellulaire. Par conséquent, ce type de modification génétique est généralement limité dans le temps et dans l’espace. La modification génétique transitoire peut être effectuée dans les organoïdes cérébraux par des virus adéno-associés ou par électroporation (examinés par, par exemple, Fischer et al.17, Kyrousi et ^al.19 et Teriyapirom et ^al.20), ces derniers étant décrits en détail dans cet article. Contrairement à la modification génétique stable, cette approche est très rapide et rentable. En effet, l’électroporation peut être effectuée en quelques minutes et, selon la ou les populations de cellules cibles, les organoïdes électroporés sont prêts à être analysés en quelques jours (examinés par, par exemple, Fischer et al.17 et Kyrousi et ^al.19). Cependant, les changements morphologiques bruts de l’organoïde cérébral, tels que les différences de taille, ne peuvent pas être détectés à l’aide de cette méthode, car ce type de modification génétique est limité dans le temps et dans l’espace. Cette restriction peut également être un avantage, par exemple, dans le cas de l’étude de populations cellulaires individuelles au sein de l’organoïde ou des effets sur les organoïdes cérébraux à des moments précis du développement (examinés par, par exemple, Fischer et al.17 et Kyrousi et ^al.19).

Une approche classique pour étudier la fonction des gènes au cours du développement et de l’évolution du cerveau est l’électroporation in utero. L’électroporation in utero est une technique bien connue et utile pour l’administration de constructions d’expression génique dans les cerveaux des rongeurs 21,22,23 et des furets^24,25. Tout d’abord, une solution contenant la ou les constructions d’expression d’intérêt est microinjectée à travers la paroi utérine dans un certain ventricule du cerveau embryonnaire, en fonction de la région à cibler. Dans la deuxième étape, des impulsions électriques sont appliquées pour transfecter les cellules qui tapissent directement le ventricule ciblé. Cette approche ne se limite pas seulement à l’expression ectopique ou à la surexpression des gènes, car elle peut également être appliquée dans les études KD ou KO par micro-injection d’épingle à cheveux courte (shRNA) ou de CRISPR/Cas9 (sous forme de plasmides d’expression ou de ribonucléoprotéines [RNP]), respectivement^26,27. Cependant, l’électroporation in utero d’embryons de souris, de rats et de furets présente les mêmes limites que celles décrites ci-dessus pour ces modèles animaux.

Idéalement, on aimerait effectuer une électroporation in utero directement chez les primates. Bien que cela soit, en principe, techniquement possible, l’électroporation in utero n’est pas effectuée chez les primates en raison de préoccupations éthiques, de coûts élevés d’entretien des animaux et de la petite taille des portées. Pour certains primates, comme les grands singes (y compris les humains), ce n’est pas possible du tout. Cependant, ces primates ont le plus grand potentiel pour l’étude du développement du néocortex humain (physionomique) physiologique et de son évolution. Une solution à ce dilemme est d’appliquer la technique d’électroporation aux organoïdes cérébraux des primates²⁸.

Cet article présente un protocole pour l’électroporation d’un sous-type d’organoïdes cérébraux de primates, les organoïdes cérébraux des primates. Cette approche permet la modification génétique rapide et rentable des populations cellulaires dans les structures ventriculaires des organoïdes. Plus précisément, nous décrivons un protocole unifié pour la génération d’organoïdes cérébraux de primates à partir d’iPSC humains (Homo sapiens), de chimpanzés (Pan troglodytes), de macaques rhésus (Macaca mulatta) et de ouistiti commun (Callithrix jacchus). De plus, nous décrivons en détail la technique de micro-injection et d’électroporation et fournissons des critères « go » et « no-go » pour effectuer l’électroporation organoïde cérébrale des primates. Cette approche est un outil efficace pour étudier le développement (physionomophysiologique) du néocortex et son évolution dans un modèle particulièrement proche de la situation humaine.

1. Culture des CSPi des primates

REMARQUE: En raison de sa robustesse, la méthode présentée ici peut être appliquée à n’importe quelle lignée iPSC de primate. Dans cet article, nous décrivons la production d’organoïdes cérébraux à partir de lignées d’iPSC humaines (iLonza2.2)29, de chimpanzés (Sandra A)³⁰, de macaques rhésus (iRh33.1)²⁹ et de ouistiti commun (cj_160419_5)³¹. Les conditions de culture sont résumées dans le tableau 1. Voir le tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux, réactifs et équipements utilisés dans ce protocole.

1. Pour la culture des CSPi respectives, suivez les conditions de culture décrites à l’origine. En général, pour la génération et l’électroporation réussies des organoïdes cérébraux, utilisez des lignées iPSC qui n’ont pas été cultivées pendant plus de 90 passages. De plus, au début de la génération d’organoïdes cérébraux, s’assurer que les CSPi présentent des caractéristiques de pluripotence sans aucun signe de différenciation.

2. Génération d’organoïdes cérébraux à partir de CSPi de primates

NOTE: Le protocole pour la génération d’organoïdes cérébraux est basé sur une version modifiée 28,30,32,33 du protocole organoïde cérébral^{original 10,34} avec quelques modifications spécifiques à l’espèce (détaillées ci-dessous).

1. Ensemencement de CSPi pour générer des corps embryoïdes (EB)
   1. Une fois que les CSPi ont atteint une confluence de 80 % à 90 %, lavez-les avec la solution saline tamponnée au phosphate (DPBS) de Dulbecco et ajoutez 500 μL de substitut de trypsine recombinant ou 1 mL de mélange protéolytique et collagénolytique.
      NOTE: En règle générale, les CSPi sont cultivées dans une boîte de culture cellulaire de 60 mm pour obtenir environ 900 000 cellules, ce qui est suffisant pour générer 96 organoïdes cérébraux. Le nombre de cellules peut être ajusté en fonction du nombre d’organoïdes nécessaires. Sachez que tous les organoïdes cérébraux générés peuvent ne pas convenir à l’électroporation.
   2. Incuber la capsule à 37 °C pendant 2 min pour détacher les cellules.
      REMARQUE : Jusqu’à 2 minutes supplémentaires d’incubation à 37 °C peuvent être nécessaires en fonction de la lignée iPSC ou de l’enzyme utilisée. Il est conseillé d’examiner la capsule au microscope pour s’assurer que les cellules ont commencé à se détacher.
   3. Ajouter 1,5 mL de milieu de culture iPSC préchauffé (37 °C) pour arrêter la réaction, et pipeter de haut en bas 7x-10x (pas plus de 10x) pour dissocier les cellules de la boîte de culture cellulaire et obtenir une suspension unicellulaire.
   4. Transférer la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger conique de 15 ml et centrifuger les cellules à 200 × g pendant 5 minutes à température ambiante.
   5. Aspirer le surnageant et remettre en suspension la pastille dans 2 mL de milieu de culture iPSC complété par 50 μM Y27632 ou 50 μM de composé pro-survie.
   6. Utilisez 10 μL de la suspension cellulaire pour compter les cellules à l’aide d’une chambre Neubauer.
   7. Ajuster la suspension cellulaire à une concentration de 9 000 cellules par 150 μL (60 000 cellules/mL) en utilisant un milieu de culture iPSC complété par 50 μM Y27632 ou 50 μM de composé pro-survie.
   8. Pour générer des corps embryoïdes (EB), ensemencez 150 μL de la suspension cellulaire dans chaque puits d’une plaque de 96 puits à très faible attache. Pendant le pipetage, agiter doucement le tube contenant la suspension cellulaire pour empêcher les cellules de sédimenter.
   9. Culture des EB dans une atmosphère humifiée de 5 % de CO₂ et de 95 % d’air à 37 °C (0 jour après l’ensemencement [dps]). Ne pas déranger les EB dans les 24 heures suivant l’ensemencement.
      NOTE: Les EB générés à partir de CSPi de ouistiti doivent être cultivés dans une atmosphère humifiée dans des conditions hypoxiques (5% CO 2, 5% O 2 et 90% N ₂) à 37 ° C.
   10. Après ~48 h (2 dps), remplacer le milieu par un milieu de culture iPSC sans Y27632/composé pro-survie. Retirer 100 μL de milieu par puits et ajouter 150 μL de milieu frais préchauffé (37 °C) sans Y27632. Allez ligne par rangée.
   11. Effectuer d’autres changements de milieu tous les deux jours; retirer 150 μL de milieu de chaque puits et ajouter 150 μL de milieu frais préchauffé (37 °C) sans Y27632/composé pro-survie par puits.
       REMARQUE: Après 4-5 dps, la périphérie des EB devrait devenir translucide.
2. Induction du neuroectoderme
   REMARQUE: En général, les EB de bonne qualité doivent avoir des contours lisses et des bordures translucides à ce stade. Les points temporels de l’induction neuronale diffèrent légèrement entre les espèces de primates et les lignées iPSC. Dans le cas des lignées cellulaires utilisées ici (voir la section 1 et le tableau des matériaux), l’induction neuronale pour les EB ouistitis doit généralement être commencée à 4 dps, pour le macaque rhésus à 5 dps, et pour les EB humains et chimpanzés à 4-5 dps (Figure 1A), en fonction de l’état des EB (voir ci-dessus).
   1. Retirer 150 μL de milieu de chaque puits de la première rangée de la plaque de 96 puits et ajouter 150 μL de milieu d’induction neuronale préchauffé (37 °C) (voir le tableau 2) par puits de la même rangée.
   2. Continuez à changer le milieu comme décrit ci-dessus rangée par rangée pour l’ensemble de la plaque de 96 puits. Effectuer d’autres modifications du milieu d’induction neuronale (NIM) tous les deux jours en retirant 150 μL de NIM de chaque puits et en ajoutant 150 μL de NIM frais préchauffé (37 °C).
      NOTE: À partir de ce moment, les EB ouistitis doivent être cultivés dans les mêmes conditions que les autres EB de primates (atmosphère humifiée de 5% de CO₂ et 95% d’air à 37 ° C).
3. Intégration dans la matrice membranaire basale
   REMARQUE: Une fois que les EB ont développé un neuroépithélium prononcé, translucide et organisé radialement à la surface, un soutien structurel doit être fourni pour le développement de structures de type ventricule. Ceci est réalisé en incorporant les EB dans une matrice membranaire basale. En raison des différences dans les taux de développement, les EB de macaque ouistiti et rhésus sont prêts à être intégrés déjà à 7 dps, tandis que les EB humains et chimpanzés sont généralement intégrés à 8-9 dps. Pour simplifier, la matrice membranaire basale fait uniquement référence à Matrigel dans ce protocole. Cependant, Geltrex peut être utilisé en remplacement.
   1. En préparation de l’encastrement, stérilisez aux UV des ciseaux, des pinces, une petite grille pour tubes de 0,2 mL et trois à six carrés de parafilm traités avec de l’éthanol à 70% (vol/vol) sous la hotte à flux laminaire pendant 15 min. Laissez la matrice membranaire basale dégeler sur la glace pendant plusieurs heures (~1,5 mL de matrice membranaire basale est généralement suffisante pour 96 EB).
      REMARQUE: Gardez toujours la matrice de membrane basale sur la glace.
   2. Créez une grille à fossettes 4 x 4 sur le parafilm. Placez la grille de parafilm sur le support de tube de 0,2 mL de manière à ce que le côté enveloppé de papier soit orienté vers le haut et appuyez doucement un doigt ganté contre chaque trou du rack.
   3. Retirez le papier et découpez la grille de fossettes du carré de parafilm à l’aide de ciseaux pour ajuster sa taille afin de l’adapter à une boîte de culture cellulaire de 60 mm. Replacez le parafilm alvéolé sur le support de tube de 0,2 mL pour fournir une base pour la génération de gouttelettes de la matrice membranaire basale.
   4. À l’aide d’une pipette avec une pointe de pipette coupée de 200 μL, transférer soigneusement les EB l’un après l’autre du puits de la boîte de culture aux fossettes de parafilm.
   5. Après avoir déplacé 16 EB vers la grille, prenez une nouvelle pointe de pipette de 200 μL et retirez le milieu restant des fossettes.
   6. Pipeter une goutte (~15 μL) de matrice membranaire basale sur chaque fossette contenant un EB.
   7. Prenez une pointe de pipette de 10 μL et déplacez rapidement les EB au centre de chaque gouttelette sans perturber les bords des gouttelettes.
   8. Placer le parafilm alvéolé avec les gouttes de la matrice membranaire basale dans une boîte de culture cellulaire de 60 mm et incuber pendant 15-30 min à 37 °C pour permettre à la matrice de polymériser.
   9. Pour détacher les EB intégrés dans la matrice du parafilm, ajouter 5 mL de milieu de différenciation (MS) sans vitamine A ( voir le tableau 2) dans la capsule et retourner le parafilm à l’envers à l’aide d’une pince de sorte que le côté avec les EB soit orienté vers le fond de la boîte.
   10. Secouez soigneusement le plat pour que les gouttes de matrice de membrane basale contenant les EB se détachent du parafilm. Si certains d’entre eux sont encore attachés, prenez un bord du carré du parafilm à l’aide d’une pince et roulez-le rapidement vers le centre du plat plusieurs fois.
   11. Culture des organoïdes cérébraux sur un agitateur orbital à 55 rpm dans une atmosphère humifiée de 5% de CO₂ et 95% d’air à 37 °C. Conservez-les en DM sans vitamine A avec des changements moyens tous les deux jours. Pour induire la production de neurones, passer au DM avec de la vitamine A (acide rétinoïque, PR) après 13 dps pour les organoïdes cérébraux de macaque ouistiti et rhésus ou 14-15 dps pour les organoïdes cérébraux humains et chimpanzés (Figure 1A). À partir de ce moment, changez le milieu tous les 3-4 jours.
       REMARQUE: Pour soutenir la survie neuronale, le DM contenant de la vitamine A peut être complété par 20 μg / mL de neurotrophine humaine 3 (NT3), 20 μg / mL de facteur neurotrophique dérivé du cerveau (BDNF) et 1 μL / mL de matrice membranaire basale à partir de 40 dps.

3. Electroporation des organoïdes cérébraux des primates

NOTE: D’un point de vue technique, l’électroporation des organoïdes cérébraux peut être effectuée dès que les structures ventriculaires sont suffisamment prononcées pour être ciblées par microinjection. La fenêtre temporelle optimale d’électroporation dépend de la question biologique et de la ou des populations cellulaires d’intérêt. Par exemple, si les progéniteurs apical (PA) sont la cible principale, alors les organoïdes cérébraux à environ 30 dps conviennent déjà. Si les progéniteurs basaux (BP) ou les neurones sont les principales cibles, des organoïdes cérébraux plus anciens de plus de 50 dps doivent être utilisés (voir, par exemple, Fischer et ^al.28).

1. Préparation de la configuration de l’électroporation
   NOTE: L’efficacité d’électroporation est fortement affectée par la taille et la concentration du ou des plasmides électroporés (voir la section discussion pour plus de détails).
   1. Préparer une quantité suffisante de mélange d’électroporation pour le contrôle et le gène d’intérêt (GOI), par exemple, 10 μL de mélange d’électroporation pour chaque témoin et GOI pour électroporer environ 30 organoïdes cérébraux par condition.
      NOTE: Pour la composition des mélanges d’électroporation, voir tableau 3.
   2. Préchauffer (non stérile) le mélange médium/nutritif Eagle modifié de Dulbecco F-12 (DMEM/F12) et DM avec de la vitamine A jusqu’à 37 °C. Préparez une petite spatule et des ciseaux fins et normaux, et vaporisez les instruments avec de l’éthanol à 70% (vol/vol).
      REMARQUE : Les étapes suivantes peuvent être effectuées dans des conditions stériles ou non stériles, car le DM contient des antibiotiques (voir le tableau 2). D’après notre expérience, l’absence de stérilité n’a jamais causé de contamination.
   3. Préparez des boîtes de culture cellulaire de 35 mm et connectez la chambre de l’électrode de la boîte de Petri à l’électroporateur.
      REMARQUE: Les chambres d’électrodes de boîte de Petri sont disponibles dans le commerce. Cependant, ils peuvent être facilement produits de manière rentable (voir le dossier supplémentaire 1).
   4. À l’aide d’embouts de microchargeur, remplissez les aiguilles de microinjection avec 8 μL de chaque mélange d’électroporation. Coupez les pointes des aiguilles à l’aide de ciseaux fins avant la première utilisation pour obtenir un écoulement stable. Cependant, ne retirez qu’une petite partie de la pointe, car une pointe émoussée et large peut gravement endommager les organoïdes.
      REMARQUE : Les aiguilles de micro-injection sont soit disponibles dans le commerce sous forme d’aiguilles de micro-injection prétirées, soit peuvent être retirées en laboratoire si un extracteur d’aiguilles est disponible. Suivez les instructions du fabricant de l’extracteur d’aiguilles pour générer des aiguilles de microinjection avec une longue conicité et un diamètre d’embout de 10 μm.
2. Microinjection et électroporation
   1. Au microscope, choisissez cinq organoïdes cérébraux avec des bords lisses et des structures ventriculaires clairement visibles. Placez-les dans une boîte de culture cellulaire de 35 mm contenant du DMEM/F12 préchauffé (37 °C) à l’aide d’un embout de pipette coupé de 1 000 μL.
      REMARQUE : Choisissez des organoïdes cérébraux avec des structures ventriculaires prononcées et accessibles (voir Figure 1B).
   2. Pour injecter une structure en forme de ventricule, insérez soigneusement l’aiguille à travers sa paroi et infusez-la avec le mélange d’électroporation jusqu’à ce qu’elle soit visiblement remplie. N’appliquez pas de pression excessive sur les structures ventriculaires pour éviter qu’elles n’éclatent. Procédez avec six à huit structures ventriculaires de chaque organoïde cérébral de cette manière.
      REMARQUE: Si l’aiguille est obstruée pendant le processus de micro-injection, la pointe doit être légèrement coupée.
   3. Transférer un organoïde cérébral micro-injecté dans la chambre d’électrode de la boîte de Petri avec une petite quantité de DMEM/F12. Disposer l’organoïde de manière à ce que les surfaces des structures ventriculaires microinjectées soient orientées vers l’électrode reliée au pôle positif de l’électroporateur.
      REMARQUE: L’orientation des structures de cette manière garantit que les cellules sont transfectées du côté de la structure ventriculaire qui n’est pas affectée par une structure adjacente.
   4. Électroporate les organoïdes cérébraux un par un en utilisant les réglages suivants : 5 impulsions de 80 V, une durée d’impulsion de 50 ms et un intervalle de 1 s. Déplacer les organoïdes électroporés dans une nouvelle boîte de culture cellulaire de 35 mm remplie de DMEM/F12 préchauffé (37 °C).
      REMARQUE: Les paramètres d’électroporation peuvent dépendre de l’électroporateur à ondes carrées disponible. Ces réglages sont optimisés pour le système d’électroporation référencé. L’augmentation de la tension peut entraîner le déplacement des cellules.
   5. Procéder de la même manière avec les cinq organoïdes cérébraux suivants en utilisant le deuxième mélange d’électroporation (par exemple, GOI).
      NOTA : Répétez les étapes 3.2.1 à 3.2.5 jusqu’à ce que le nombre souhaité d’organoïdes cérébraux électroporés soit atteint.
   6. Si la microinjection et l’électroporation ont été effectuées dans des conditions non stériles, transférer les organoïdes électroporés dans une boîte de culture cellulaire stérile de 35 mm sous une hotte à flux laminaire tout en déplaçant le moins possible de DMEM/F12 vers la nouvelle boîte de culture cellulaire.
3. Culture et fixation ultérieures d’organoïdes cérébraux
   1. Culture des organoïdes électroporés en DM avec de la vitamine A sur un agitateur orbital à 55 rpm dans une atmosphère humifiée de 5% de CO₂ et 95% d’air à 37 °C.
   2. Le lendemain de l’électroporation, vérifiez la réussite de l’électroporation des organoïdes cérébraux au microscope à fluorescence inversée conventionnel.
      NOTE: Selon la durée de la culture ultérieure après électroporation, différentes populations cellulaires au sein de l’organoïde cérébral sont affectées (voir également la section des résultats représentatifs).
   3. Procéder aux applications en aval après la culture des organoïdes cérébraux électroporés pendant une durée appropriée à la question biologique d’intérêt.
      REMARQUE : Les organoïdes cérébraux électroporés peuvent être traités pour différentes applications en aval (p. ex., fixation pour coloration par immunofluorescence ou surgélation instantanée pour l’isolement de l’ARN et la qRT-PCR). Ici, nous décrivons la fixation des organoïdes cérébraux électroporés.
   4. Transférer les organoïdes électroporés dans un tube à centrifuger conique de 15 mL à l’aide d’un embout de pipette coupé de 1 000 μl et enlever l’excès de milieu.
   5. Ajouter une quantité suffisante de 4% de paraformaldéhyde (PFA) dans le DPBS (pH 7,5) et incuber pendant 30 min à température ambiante.
      ATTENTION : Le PFA est classé comme cancérogène pour l’homme et peut causer des dommages irréparables pour la santé. Des mesures de précaution supplémentaires, y compris des gants et des lunettes en nitrile, sont fortement recommandées.
   6. Aspirer le PFA, ajouter 5 mL de DPBS, agiter un peu et aspirer le DPBS. Répétez cette opération 2x. Conserver les organoïdes dans du DPBS à 4 °C jusqu’à nouvelle utilisation.
      REMARQUE: Le protocole peut être interrompu ici, car les organoïdes cérébraux fixés au PFA peuvent être conservés à 4 ° C pendant plusieurs mois. Les organoïdes électroporés fixés au PFA peuvent être analysés par cryosectionnement et immunofluorescence ^10,28 ou par coloration et effacement ^35,36. Pour des exemples d’images, voir la section des résultats représentatifs (voir le tableau 4 pour les détails sur les anticorps).

Le protocole décrit ici permet la génération efficace d’organoïdes cérébraux à partir de lignées d’iPSC humaines, de chimpanzés, de macaques rhésus et de ouistitis communs avec un minimum de modifications temporelles requises entre les espèces (Figure 1A). Ces organoïdes peuvent être électroporés dans la plage de 20 dps à 50 dps, selon l’accessibilité des structures ventriculaires et l’abondance de la ou des populations cellulaires d’intérêt. Cependant, avant l’électroporation, il est important de déterminer si les organoïdes cérébraux sont de qualité suffisante pour être électroporés.

Un organoïde cérébral idéal pour l’électroporation devrait présenter des structures lumineuses prononcées ressemblant à des ventricules à la périphérie, aucun signe de dégénérescence (p. ex. détachement des cellules, élargissement du noyau apoptotique) et une morphologie saine généralement compacte (p. ex. pas d’excroissance excessive) (Figure 1B, « Go »). Il est préférable de choisir des organoïdes cérébraux avec de grandes structures ventriculaires bien organisées pour cibler un plus grand nombre de cellules. Si la zone périphérique d’un organoïde est sombre et ne présente aucune structure saillante, il est recommandé de ne pas l’utiliser pour l’électroporation, car les micro-injections précises pourraient être compromises par l’absence de repères visuels (Figure 1B, « No-go »). Pour obtenir une morphologie organoïde cérébrale optimale, il est essentiel de s’assurer que les étapes critiques telles que l’induction du neuroectoderme et l’incorporation de la matrice sont bien synchronisées. Les problèmes concernant la morphologie organoïde cérébrale proviennent généralement d’une défaillance du neuroectoderme et / ou de la formation de bourgeons neuroépithéliaux. Ceci est normalement causé par un moment sous-optimal de l’induction neuronale et / ou de l’incorporation de la matrice de la membrane basale et peut être résolu en ajustant le calendrier de ces étapes (d’autres conseils de dépannage pour la formation d’organoïdes cérébraux peuvent être trouvés dans Lancaster et Knoblich34).

Après électroporation, une première évaluation de son succès et de son efficacité peut être effectuée après 12 h, lorsque l’expression GFP des cellules transfectées devient détectable sous un microscope à fluorescence inversée classique. Idéalement, à ce stade, les structures multiples en forme de ventricule émettent une fluorescence vert vif localisée sur l’un de leurs côtés (Figure 2A). Cela indique la grande précision et l’efficacité de la procédure. Les organoïdes cérébraux électroporés avec succès des quatre espèces de primates différentes (c.-à-d. humain, chimpanzé, macaque rhésus et ouistiti commun) présentent des profils GFP positifs similaires dans les structures ventriculaires ciblées (Figure 2A). De plus, après la fixation et la cryosection d’organoïdes cérébraux de primates électroporés, les structures ventriculaires électroporées réussies des quatre espèces présentent des colonnes de cellules GFP positives dans la zone ventriculaire (VZ) organisée radialement et densément compactée (Figure 2B). La quantification des cellules DAPI positives qui étaient également GFP-positives dans ces régions des organoïdes cérébraux du chimpanzé et du ouistiti 2 jours après l’électroporation (17 ventricules de 12 organoïdes quantifiés) a montré qu’en moyenne, environ un tiers des cellules (33%, SD ± 12%) ont été électroporées avec succès.

Les électroporations sous-optimales sont marquées soit par un petit nombre de cellules GFP-positives dans la structure ventriculaire (Figure 3A), soit par quelques cellules GFP-positives éloignées de toute structure ventriculaire (Figure 3B). Un faible nombre de cellules GFP positives est causé par une mauvaise absorption plasmidique. Cela peut être dû soit à une faible concentration plasmidique causée par une quantité insuffisante de mélange d’électroporation microinjecté, soit à des impulsions électriques qui ne sont pas bien dirigées, ce qui peut être causé par un positionnement sous-optimal des organoïdes cérébraux dans la chambre d’électrode de la boîte de Pétri. Un faible nombre de cellules GFP positives éloignées de toute structure ventriculaire est causé par l’électroporation de cellules postmitotiques dans l’organoïde cérébral (par exemple, les neurones) en raison d’une micro-injection imprécise. Ces électroporations sous-optimales doivent être exclues de toute analyse ultérieure.

L’identification fiable des types cellulaires présents dans les organoïdes cérébraux repose, entre autres, sur la position cellulaire dans une structure ventriculaire, ce qui nécessite une définition de frontière entre la zone VZ et la zone enrichie en SVZ/neurones. Cette bordure peut être identifiée par l’organisation radiale et les caractéristiques de densité cellulaire élevée du VZ (voir coloration DAPI dans la figure supplémentaire S1). La confirmation de la frontière VZ/SVZ peut être réalisée par coloration par immunofluorescence pour les marqueurs progéniteurs neuraux tels que PAX6 ou SOX2, qui sont exprimés par pratiquement toutes les cellules VZ (AP) et certaines cellules SVZ (BP). La présence d’une zone enrichie en neurones peut être validée par coloration par immunofluorescence pour des marqueurs neuronaux tels que la β-tubuline de classe III (TUJ1) ou NeuN (figure supplémentaire S1).

La durée de la culture organoïde cérébrale après électroporation dépend de la question biologique et des populations cellulaires d’intérêt. Dans une étude récente, il a été démontré que différentes longueurs de culture ultérieure après électroporation affectent différentes populations cellulaires chez les organoïdes cérébraux des chimpanzés, allant des PA aux neurones de la couche supérieure24. Ici, nous montrons des résultats similaires pour les organoïdes de ouistiti électroporés. Plus précisément, 2 jours après l’électroporation, les cellules GFP positives sont presque exclusivement localisées dans le VZ et sont également positives pour PAX6 – un marqueur des cellules progénitrices neurales – indiquant que ces cellules sont des AP ou des PA nouveau-nés (Figure 4A). Si la période de culture après l’électroporation est prolongée à 10 jours, les cellules GFP positives sont localisées dans les régions basales (c.-à-d. la SVZ et la zone enrichie en neurones) (Figure 4B, C). Ces cellules peuvent (en plus du signal GFP) également être positives pour PAX6 (Figure 4B), qui est indicative de BP, ou NeuN (Figure 4C), qui est indicative de neurones. Des résultats similaires peuvent être obtenus pour les organoïdes cérébraux électroporés humains et rhésus. En résumé, différents types de progéniteurs, ainsi que des neurones, peuvent être ciblés avec succès par cette technique.

Presque toutes les données présentées précédemment ont été dérivées de l’immunomarquage de coupes histologiques générées à partir d’organoïdes cérébraux électroporés. Cependant, une autre façon élégante d’analyser ces organoïdes est d’effectuer une immunomarquation à montage entier suivie d’un effacement optique35,36. Cela permettrait une reconstruction 3D des organoïdes cérébraux électroporés pour obtenir une impression de la distribution 3D des cellules GFP-positives. La figure 5 et la vidéo 1 montrent un exemple représentatif du signal GFP dans un organoïde cérébral électroporé et effacé optiquement.

En résumé, le protocole d’électroporation décrit ici fournit un moyen précis et efficace d’introduire des modifications génétiques transitoires dans différents types de progéniteurs et neurones d’organoïdes cérébraux dérivés de différentes lignées de CSPi chez les primates.

Figure 1 : Vue d’ensemble schématique de la génération d’organoïdes cérébraux chez les primates et des critères morphologiques « go » et « no-go » pour l’électroporation. (A) Chronologie de la génération et de l’électroporation des organoïdes cérébraux chez les primates mettant en évidence les différents calendriers des étapes du protocole pour l’homme et le chimpanzé (bleu), le macaque rhésus (violet) et le ouistiti (magenta). Notez que la chronologie de la chronologie n’est pas à l’échelle. (B) Images en fond clair d’un organoïde cérébral humain approprié (image de gauche, Go) et inapproprié (image de droite, No-go) de 32 dps. Les pointes de flèches indiquent des exemples de structures ventriculaires appropriées pour la micro-injection. Les images ont été acquises à l’aide d’un microscope à fluorescence inversée Zeiss Axio Observer.Z1 avec un objectif 2,5x. Barres d’échelle = 500 μm. Abréviations : BDNF = facteur neurotrophique dérivé du cerveau; dps = jours après l’ensemencement; NT3 = neurotrophine 3; PR = acide rétinoïque. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Exemples d’organoïdes cérébraux de primates électroporés avec succès. (A) Images en fond clair (colonne de gauche), en fluorescence (colonne du milieu) et fusionnées (colonne de droite) de 22 dps humains, 32 dps de chimpanzés, de 32 dps de macaque rhésus et 31 dps d’organoïdes cérébraux de marmouset (de haut en bas) 15 à 48 h après électroporation avec le plasmide exprimant la GFP. Les pointes de flèches noires indiquent des exemples de structures individuelles électroporées ressemblant à des ventricules. Les images ont été acquises à l’aide d’un microscope à fluorescence inversée Zeiss Axio Observer.Z1 avec un objectif 2,5x. Barres d’échelle = 500 μm. (B) Immunofluorescence pour la GFP (vert) combinée à la coloration DAPI (cyan) de 32 dps humain, 34 dps chimpanzé, 32 dps macaque rhésus et 32 dps organoïdes cérébraux marmouset (de haut en bas) 2-4 jours après l’électroporation avec le plasmide exprimant la GFP. Les pointes de flèches gris clair indiquent les frontières des régions électroporées dans les structures ventriculaires. Les images ont été acquises à l’aide d’un microscope confocal Zeiss LSM 800 avec un objectif 10x. Barres d’échelle = 150 μm. Abréviations : DAPI = 4',6-diamidino-2-phénylindole; dps = jours après l’ensemencement; GFP = protéine fluorescente verte. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Exemples d’organoïdes cérébraux de primates électroporés sans succès. (A,B) Immunofluorescence pour la GFP (vert) associée à une coloration DAPI (cyan) d’un organoïde cérébral de macaque rhésus de 34 dps 4 jours après électroporation avec le plasmide exprimant la GFP et de (B) d’un organoïde cérébral de macaque rhésus de 32 dps 2 jours après électroporation avec le plasmide exprimant la GFP. Les pointes de flèches gris clair indiquent des cellules électroporées. Le contour pointillé gris clair indique la frontière entre la zone VZ et la zone enrichie en SVZ/neurones d’une structure ventriculaire adjacente aux cellules électroporées. Les images ont été acquises à l’aide d’un microscope confocal Zeiss LSM 800 avec un objectif 10x. Barres d’échelle = 150 μm. Abréviations : DAPI = 4',6-diamidino-2-phénylindole; dps = jours après l’ensemencement; GFP = protéine fluorescente verte; SVZ = zone sous-ventriculaire; VZ = zone ventriculaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Visualisation des différentes populations cellulaires présentes dans les organoïdes cérébraux des primates après électroporation. (A-C) Double immunofluorescence pour la GFP (vert) et PAX6 (A,B ; magenta) ou NeuN (C ; magenta), dans tous les cas associée à une coloration DAPI (cyan), d’un organoïde cérébral ouistiti (A) 32 dps 2 jours après électroporation avec le plasmide exprimant la GFP, et (B,C) d’un organoïde cérébral ouistiti à 40 dps 10 jours après l’électroporation avec le plasmide exprimant la GFP. Les pointes de flèches gris clair indiquent les cellules (A,B) GFP+ et PAX6+ ou (C) NeuN+ doublement positives. Les lignes pointillées gris clair indiquent la frontière entre le VZ et la zone enrichie en SVZ/neurones. Les images ont été acquises à l’aide d’un microscope confocal Zeiss LSM 800 avec un objectif 20x. Barres d’échelle = 100 μm. Abréviations : DAPI = 4',6-diamidino-2-phénylindole; dps = jours après l’ensemencement; GFP = protéine fluorescente verte; NeuN = protéine des noyaux neuronaux; PAX6 = protéine appariée de la boîte 6; SVZ = zone sous-ventriculaire; VZ = zone ventriculaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Reconstruction tridimensionnelle d’images électroporées par imagerie confocale 3D d’organoïdes cérébraux de primates électroporés après effacement optique. Vues frontales (image de gauche), pivotées à 45° (image du milieu) et tournées à 90° (image de droite) d’un organoïde cérébral humain électroporé en 32 dps reconstruit en 3D 2 jours après l’électroporation avec le plasmide exprimant la GFP. Avant l’imagerie, l’organoïde a été optiquement effacé sur la base de la méthode 2Eci35. Une reconstruction 3D de l’organoïde électroporé entier a été générée à partir de 269 coupes optiques (épaisseur de 1 μM chacune) distantes de 3,73 μm les unes des autres à l’aide d’un microscope confocal Zeiss LSM 800 avec un objectif 10x. Les images ont été traitées pour la reconstruction 3D en utilisant Fidji. Notez que les images ont été prises à partir du même organoïde reconstruit en 3D montré dans la vidéo 1. Barre d’échelle = 500 μm. Abréviation : GFP = protéine fluorescente verte. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Vidéo 1 : Un organoïde cérébral humain électroporé en 3D après effacement optique. Vidéo d’un organoïde cérébral humain électroporé en 32 dps reconstruit en 3D 2 jours après l’électroporation avec le plasmide exprimant la GFP. Avant l’imagerie, l’organoïde a été optiquement effacé sur la base de la méthode 2Eci35. Une reconstruction 3D de l’organoïde électroporé entier a été générée à partir de 269 coupes optiques (épaisseur de 1 μM chacune) distantes de 3,73 μm les unes des autres à l’aide d’un microscope confocal Zeiss LSM 800 avec un objectif 10x. Les images ont été traitées pour la reconstruction 3D en utilisant Fidji. Notez que la vidéo a été prise à partir du même organoïde reconstruit en 3D illustré à la figure 5. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

Tableau 1 : Conditions de culture des CSPi des primates utilisées dans cette publication. Abréviation : CSPi = cellules souches pluripotentes induites.

Tableau 2 : Composition des milieux utilisés pour la production et la culture d’organoïdes cérébraux chez les primates.

Tableau 3 : Composition du mélange d’électroporation (approche des plasmides séparés) pour le témoin et le gène d’intérêt. Abréviation : GOI = gène d’intérêt.

Tableau 4 : Anticorps utilisés pour la coloration par immunofluorescence.

Figure supplémentaire S1 : Détermination des frontières VZ/SVZ chez les organoïdes cérébraux de primates électroporés. Double immunofluorescence pour PAX6 (magenta) et TUJ1 (jaune) combinée à une coloration DAPI (cyan) d’un organoïde cérébral ouistiti 32 dps 2 jours après électroporation avec le plasmide exprimant la GFP. L’immunofluorescence pour la GFP n’est pas indiquée. Les lignes pointillées gris clair indiquent la frontière entre le VZ et la zone enrichie en SVZ/neurones. Les images ont été acquises à l’aide d’un microscope confocal Zeiss LSM 800 avec un objectif 20x. Barre d’échelle = 100 μm. Abréviations : DAPI = 4',6-diamidino-2-phénylindole; dps = jours après l’ensemencement; PAX6 = protéine appariée de la boîte 6; SVZ = zone sous-ventriculaire; TUJ1 = classe III β-tubuline; VZ = zone ventriculaire. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Dossier supplémentaire 1 : instructions d’assemblage de la chambre d’électroporation de la boîte de Pétri. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Les auteurs déclarent n’avoir aucun conflit d’intérêts.