Article de méthode

Microinjection ciblée et électroporation d’organoïdes cérébraux de primates pour la modification génétique

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DOI :

10.3791/65176

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24 mars 2023

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1German Primate Center, Leibniz Institute for Primate Research, 2Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics

Dans cet article

Résumé

L’électroporation des organoïdes cérébraux des primates fournit une approche précise et efficace pour introduire des modifications génétiques transitoires dans différents types de progéniteurs et de neurones dans un système modèle proche du développement du néocortex (patho)physiologique des primates. Cela permet l’étude des processus neurodéveloppementaux et évolutifs et peut également être appliqué à la modélisation des maladies.

Résumé

Le cortex cérébral est la structure cérébrale la plus externe et est responsable du traitement des entrées sensorielles et des sorties motrices; Il est considéré comme le siège des capacités cognitives d’ordre supérieur chez les mammifères, en particulier les primates. L’étude des fonctions des gènes dans le cerveau des primates est difficile pour des raisons techniques et éthiques, mais la mise en place de la technologie organoïde du cerveau a permis l’étude du développement du cerveau dans des modèles traditionnels de primates (par exemple, le macaque rhésus et le ouistiti commun), ainsi que chez des espèces de primates auparavant inaccessibles expérimentalement (par exemple, les grands singes), dans un système éthiquement justifiable et moins exigeant techniquement. De plus, les organoïdes cérébraux humains permettent l’investigation avancée des troubles neurodéveloppementaux et neurologiques.

Comme les organoïdes cérébraux récapitulent de nombreux processus de développement du cerveau, ils représentent également un outil puissant pour identifier les différences et comparer fonctionnellement les déterminants génétiques sous-jacents au développement du cerveau de diverses espèces dans un contexte évolutif. Un grand avantage de l’utilisation d’organoïdes est la possibilité d’introduire des modifications génétiques, ce qui permet de tester les fonctions des gènes. Cependant, l’introduction de telles modifications est laborieuse et coûteuse. Cet article décrit une approche rapide et rentable pour modifier génétiquement les populations cellulaires dans les structures ventriculaires des organoïdes cérébraux des primates, un sous-type d’organoïdes cérébraux. Cette méthode combine un protocole modifié pour la génération fiable d’organoïdes cérébraux à partir de cellules souches pluripotentes induites (CSPi) humaines, chimpanzés, macaques rhésus et communes dérivées de ouistitis. Cela fournit un outil efficace pour l’étude des processus neurodéveloppementaux et évolutifs qui peut également être appliqué à la modélisation de la maladie.

Introduction

Étudier le développement (physio)physiologique et l’évolution du cortex cérébral est une tâche formidable qui est entravée par le manque de systèmes modèles appropriés. Auparavant, ces études se limitaient à des modèles de culture cellulaire bidimensionnelle (tels que les cultures de cellules neuronales primaires ou neuronales) et à des modèles animaux distants de l’évolution (tels que les rongeurs)1,2. Bien que ces modèles soient utiles pour répondre à certaines questions, ils sont limités dans la modélisation de la complexité, de la composition du type cellulaire, de l’architecture cellulaire et des modèles d’expression génique du néocortex humain en développement dans des états sains et malades. Ces limitations conduisent, par exemple, à la faible transposabilité des modèles murins de maladies humaines à la situation humaine, comme décrit pour certains cas de microcéphalie (par exemple, Zhang et al.3). Récemment, les primates transgéniques non humains, qui sont un modèle évolutif, fonctionnel et morphologiquement plus proche du développement du néocortex humain, ont attiré l’attention 4,5,6,7,8 alors qu’ils surmontent de nombreuses limitations des modèles basés sur la culture cellulaire et les rongeurs. Cependant, l’utilisation de primates non humains dans la recherche est non seulement très coûteuse et prend beaucoup de temps, mais soulève également des préoccupations éthiques. Plus récemment, le développement de la technologie des organoïdes cérébraux 9,10 est apparu comme une alternative prometteuse qui résout bon nombre des limitations des modèles précédents 11,12,13,14,15,16.

Les organoïdes cérébraux sont des structures multicellulaires tridimensionnelles (3D) qui émulent les principales caractéristiques de la cytoarchitecture et de la composition de type cellulaire d’une ou de plusieurs régions du cerveau pendant une fenêtre temporelle de développement définie 11,12,13,14,17. Ces structures 3D sont générées soit à partir de cellules souches pluripotentes induites (CSPi) ou, si elles sont disponibles pour l’espèce d’intérêt, à partir de cellules souches embryonnaires (CSE). En général, deux types d’organoïdes cérébraux peuvent être distingués en fonction de la méthodologie utilisée: les organoïdes cérébraux non guidés et régionalisés (guidés)18. Lors de la génération de ce dernier type d’organoïdes, de petites molécules ou facteurs sont fournis qui guident la différenciation des cellules souches pluripotentes en organoïdes d’une région particulière du cerveau (par exemple, les organoïdes du cerveau antérieur)18. En revanche, chez les organoïdes non guidés, la différenciation n’est pas guidée par l’addition de petites molécules, mais repose exclusivement sur la différenciation spontanée des CSPi/ESC. Les organoïdes cérébraux qui en résultent sont constitués de types de cellules représentant différentes régions du cerveau (p. ex., les organoïdes cérébraux)18. Les organoïdes cérébraux combinent de nombreuses caractéristiques clés du développement du cerveau avec une génération relativement rentable et rapide à partir de toute espèce d’intérêt pour laquelle des CSPi ou des CSE sont disponibles11,12,13,14. Cela fait des organoïdes cérébraux un excellent modèle pour de nombreux types d’études neurobiologiques, allant des questions évolutives et développementales à la modélisation des maladies et aux tests de médicaments15,16. Cependant, la résolution de ces questions à l’aide d’organoïdes cérébraux dépend fortement de la disponibilité de différentes méthodes de modification génétique.

Un aspect clé de l’étude du développement (physio)physiologique du néocortex et de son évolution est l’analyse fonctionnelle des gènes et des variantes génétiques. Ceci est généralement réalisé par expression (ectopique) et / ou par knock-down (KD) ou knock-out (KO) de ces gènes. Ces modifications génétiques peuvent être classées en modifications génétiques stables et transitoires, ainsi qu’en modifications limitées temporellement et spatialement ou non restreintes. La modification génétique stable est définie par l’introduction d’une altération génétique dans le génome de l’hôte qui est transmise à toutes les générations cellulaires ultérieures. Selon le moment de la modification génétique, elle peut affecter toutes les cellules d’un organoïde ou peut être limitée à certaines populations cellulaires. Le plus souvent, une modification génétique stable est obtenue dans les organoïdes cérébraux au niveau iPSC/ESC en appliquant des lentivirus, des systèmes de type transposon et la technologie CRISPR/Cas9 (examinée par, par exemple, Fischer et al.17, Kyrousi et al.19, et Teriyapirom et al.20). Cela a l’avantage que toutes les cellules de l’organoïde cérébral portent la modification génétique et qu’elle n’est pas restreinte dans le temps ou dans l’espace. Cependant, la génération et la caractérisation de ces lignées stables d’iPSC/ESC prennent beaucoup de temps, prenant souvent plusieurs mois avant que les premiers organoïdes cérébraux modifiés puissent être analysés (examinés par exemple par Fischer et al.17, Kyrousi et al.19, ou Teriyapirom et al.20).

En revanche, la modification génétique transitoire est définie par la livraison d’une cargaison génétique (p. ex., un plasmide d’expression génique) qui ne s’intègre pas dans le génome de l’hôte. Bien que cette modification puisse, en principe, être transmise aux générations cellulaires suivantes, la cargaison génétique délivrée sera progressivement diluée à chaque division cellulaire. Par conséquent, ce type de modification génétique est généralement limité dans le temps et dans l’espace. La modification génétique transitoire peut être effectuée dans les organoïdes cérébraux par des virus adéno-associés ou par électroporation (examinés par, par exemple, Fischer et al.17, Kyrousi et al.19 et Teriyapirom et al.20), ces derniers étant décrits en détail dans cet article. Contrairement à la modification génétique stable, cette approche est très rapide et rentable. En effet, l’électroporation peut être effectuée en quelques minutes et, selon la ou les populations de cellules cibles, les organoïdes électroporés sont prêts à être analysés en quelques jours (examinés par, par exemple, Fischer et al.17 et Kyrousi et al.19). Cependant, les changements morphologiques bruts de l’organoïde cérébral, tels que les différences de taille, ne peuvent pas être détectés à l’aide de cette méthode, car ce type de modification génétique est limité dans le temps et dans l’espace. Cette restriction peut également être un avantage, par exemple, dans le cas de l’étude de populations cellulaires individuelles au sein de l’organoïde ou des effets sur les organoïdes cérébraux à des moments précis du développement (examinés par, par exemple, Fischer et al.17 et Kyrousi et al.19).

Une approche classique pour étudier la fonction des gènes au cours du développement et de l’évolution du cerveau est l’électroporation in utero. L’électroporation in utero est une technique bien connue et utile pour l’administration de constructions d’expression génique dans les cerveaux des rongeurs 21,22,23 et des furets24,25. Tout d’abord, une solution contenant la ou les constructions d’expression d’intérêt est microinjectée à travers la paroi utérine dans un certain ventricule du cerveau embryonnaire, en fonction de la région à cibler. Dans la deuxième étape, des impulsions électriques sont appliquées pour transfecter les cellules qui tapissent directement le ventricule ciblé. Cette approche ne se limite pas seulement à l’expression ectopique ou à la surexpression des gènes, car elle peut également être appliquée dans les études KD ou KO par micro-injection d’épingle à cheveux courte (shRNA) ou de CRISPR/Cas9 (sous forme de plasmides d’expression ou de ribonucléoprotéines [RNP]), respectivement26,27. Cependant, l’électroporation in utero d’embryons de souris, de rats et de furets présente les mêmes limites que celles décrites ci-dessus pour ces modèles animaux.

Idéalement, on aimerait effectuer une électroporation in utero directement chez les primates. Bien que cela soit, en principe, techniquement possible, l’électroporation in utero n’est pas effectuée chez les primates en raison de préoccupations éthiques, de coûts élevés d’entretien des animaux et de la petite taille des portées. Pour certains primates, comme les grands singes (y compris les humains), ce n’est pas possible du tout. Cependant, ces primates ont le plus grand potentiel pour l’étude du développement du néocortex humain (physionomique) physiologique et de son évolution. Une solution à ce dilemme est d’appliquer la technique d’électroporation aux organoïdes cérébraux des primates28.

Cet article présente un protocole pour l’électroporation d’un sous-type d’organoïdes cérébraux de primates, les organoïdes cérébraux des primates. Cette approche permet la modification génétique rapide et rentable des populations cellulaires dans les structures ventriculaires des organoïdes. Plus précisément, nous décrivons un protocole unifié pour la génération d’organoïdes cérébraux de primates à partir d’iPSC humains (Homo sapiens), de chimpanzés (Pan troglodytes), de macaques rhésus (Macaca mulatta) et de ouistiti commun (Callithrix jacchus). De plus, nous décrivons en détail la technique de micro-injection et d’électroporation et fournissons des critères « go » et « no-go » pour effectuer l’électroporation organoïde cérébrale des primates. Cette approche est un outil efficace pour étudier le développement (physionomophysiologique) du néocortex et son évolution dans un modèle particulièrement proche de la situation humaine.

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Protocole

1. Culture des CSPi des primates

REMARQUE: En raison de sa robustesse, la méthode présentée ici peut être appliquée à n’importe quelle lignée iPSC de primate. Dans cet article, nous décrivons la production d’organoïdes cérébraux à partir de lignées d’iPSC humaines (iLonza2.2)29, de chimpanzés (Sandra A)30, de macaques rhésus (iRh33.1)29 et de ouistiti commun (cj_160419_5)31. Les conditions de culture sont résumées dans le tableau 1. Voir le tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux, réactifs et équipements utilisés dans ce protocole.

  1. Pour la culture des CSPi respectives, suivez les conditions de culture décrites à l’origine. En général, pour la génération et l’électroporation réussies des organoïdes cérébraux, utilisez des lignées iPSC qui n’ont pas été cultivées pendant plus de 90 passages. De plus, au début de la génération d’organoïdes cérébraux, s’assurer que les CSPi présentent des caractéristiques de pluripotence sans aucun signe de différenciation.

2. Génération d’organoïdes cérébraux à partir de CSPi de primates

NOTE: Le protocole pour la génération d’organoïdes cérébraux est basé sur une version modifiée 28,30,32,33 du protocole organoïde cérébraloriginal 10,34 avec quelques modifications spécifiques à l’espèce (détaillées ci-dessous).

  1. Ensemencement de CSPi pour générer des corps embryoïdes (EB)
    1. Une fois que les CSPi ont atteint une confluence de 80 % à 90 %, lavez-les avec la solution saline tamponnée au phosphate (DPBS) de Dulbecco et ajoutez 500 μL de substitut de trypsine recombinant ou 1 mL de mélange protéolytique et collagénolytique.
      NOTE: En règle générale, les CSPi sont cultivées dans une boîte de culture cellulaire de 60 mm pour obtenir environ 900 000 cellules, ce qui est suffisant pour générer 96 organoïdes cérébraux. Le nombre de cellules peut être ajusté en fonction du nombre d’organoïdes nécessaires. Sachez que tous les organoïdes cérébraux générés peuvent ne pas convenir à l’électroporation.
    2. Incuber la capsule à 37 °C pendant 2 min pour détacher les cellules.
      REMARQUE : Jusqu’à 2 minutes supplémentaires d’incubation à 37 °C peuvent être nécessaires en fonction de la lignée iPSC ou de l’enzyme utilisée. Il est conseillé d’examiner la capsule au microscope pour s’assurer que les cellules ont commencé à se détacher.
    3. Ajouter 1,5 mL de milieu de culture iPSC préchauffé (37 °C) pour arrêter la réaction, et pipeter de haut en bas 7x-10x (pas plus de 10x) pour dissocier les cellules de la boîte de culture cellulaire et obtenir une suspension unicellulaire.
    4. Transférer la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger conique de 15 ml et centrifuger les cellules à 200 × g pendant 5 minutes à température ambiante.
    5. Aspirer le surnageant et remettre en suspension la pastille dans 2 mL de milieu de culture iPSC complété par 50 μM Y27632 ou 50 μM de composé pro-survie.
    6. Utilisez 10 μL de la suspension cellulaire pour compter les cellules à l’aide d’une chambre Neubauer.
    7. Ajuster la suspension cellulaire à une concentration de 9 000 cellules par 150 μL (60 000 cellules/mL) en utilisant un milieu de culture iPSC complété par 50 μM Y27632 ou 50 μM de composé pro-survie.
    8. Pour générer des corps embryoïdes (EB), ensemencez 150 μL de la suspension cellulaire dans chaque puits d’une plaque de 96 puits à très faible attache. Pendant le pipetage, agiter doucement le tube contenant la suspension cellulaire pour empêcher les cellules de sédimenter.
    9. Culture des EB dans une atmosphère humifiée de 5 % de CO2 et de 95 % d’air à 37 °C (0 jour après l’ensemencement [dps]). Ne pas déranger les EB dans les 24 heures suivant l’ensemencement.
      NOTE: Les EB générés à partir de CSPi de ouistiti doivent être cultivés dans une atmosphère humifiée dans des conditions hypoxiques (5% CO 2, 5% O 2 et 90% N 2) à 37 ° C.
    10. Après ~48 h (2 dps), remplacer le milieu par un milieu de culture iPSC sans Y27632/composé pro-survie. Retirer 100 μL de milieu par puits et ajouter 150 μL de milieu frais préchauffé (37 °C) sans Y27632. Allez ligne par rangée.
    11. Effectuer d’autres changements de milieu tous les deux jours; retirer 150 μL de milieu de chaque puits et ajouter 150 μL de milieu frais préchauffé (37 °C) sans Y27632/composé pro-survie par puits.
      REMARQUE: Après 4-5 dps, la périphérie des EB devrait devenir translucide.
  2. Induction du neuroectoderme
    REMARQUE: En général, les EB de bonne qualité doivent avoir des contours lisses et des bordures translucides à ce stade. Les points temporels de l’induction neuronale diffèrent légèrement entre les espèces de primates et les lignées iPSC. Dans le cas des lignées cellulaires utilisées ici (voir la section 1 et le tableau des matériaux), l’induction neuronale pour les EB ouistitis doit généralement être commencée à 4 dps, pour le macaque rhésus à 5 dps, et pour les EB humains et chimpanzés à 4-5 dps (Figure 1A), en fonction de l’état des EB (voir ci-dessus).
    1. Retirer 150 μL de milieu de chaque puits de la première rangée de la plaque de 96 puits et ajouter 150 μL de milieu d’induction neuronale préchauffé (37 °C) (voir le tableau 2) par puits de la même rangée.
    2. Continuez à changer le milieu comme décrit ci-dessus rangée par rangée pour l’ensemble de la plaque de 96 puits. Effectuer d’autres modifications du milieu d’induction neuronale (NIM) tous les deux jours en retirant 150 μL de NIM de chaque puits et en ajoutant 150 μL de NIM frais préchauffé (37 °C).
      NOTE: À partir de ce moment, les EB ouistitis doivent être cultivés dans les mêmes conditions que les autres EB de primates (atmosphère humifiée de 5% de CO2 et 95% d’air à 37 ° C).
  3. Intégration dans la matrice membranaire basale
    REMARQUE: Une fois que les EB ont développé un neuroépithélium prononcé, translucide et organisé radialement à la surface, un soutien structurel doit être fourni pour le développement de structures de type ventricule. Ceci est réalisé en incorporant les EB dans une matrice membranaire basale. En raison des différences dans les taux de développement, les EB de macaque ouistiti et rhésus sont prêts à être intégrés déjà à 7 dps, tandis que les EB humains et chimpanzés sont généralement intégrés à 8-9 dps. Pour simplifier, la matrice membranaire basale fait uniquement référence à Matrigel dans ce protocole. Cependant, Geltrex peut être utilisé en remplacement.
    1. En préparation de l’encastrement, stérilisez aux UV des ciseaux, des pinces, une petite grille pour tubes de 0,2 mL et trois à six carrés de parafilm traités avec de l’éthanol à 70% (vol/vol) sous la hotte à flux laminaire pendant 15 min. Laissez la matrice membranaire basale dégeler sur la glace pendant plusieurs heures (~1,5 mL de matrice membranaire basale est généralement suffisante pour 96 EB).
      REMARQUE: Gardez toujours la matrice de membrane basale sur la glace.
    2. Créez une grille à fossettes 4 x 4 sur le parafilm. Placez la grille de parafilm sur le support de tube de 0,2 mL de manière à ce que le côté enveloppé de papier soit orienté vers le haut et appuyez doucement un doigt ganté contre chaque trou du rack.
    3. Retirez le papier et découpez la grille de fossettes du carré de parafilm à l’aide de ciseaux pour ajuster sa taille afin de l’adapter à une boîte de culture cellulaire de 60 mm. Replacez le parafilm alvéolé sur le support de tube de 0,2 mL pour fournir une base pour la génération de gouttelettes de la matrice membranaire basale.
    4. À l’aide d’une pipette avec une pointe de pipette coupée de 200 μL, transférer soigneusement les EB l’un après l’autre du puits de la boîte de culture aux fossettes de parafilm.
    5. Après avoir déplacé 16 EB vers la grille, prenez une nouvelle pointe de pipette de 200 μL et retirez le milieu restant des fossettes.
    6. Pipeter une goutte (~15 μL) de matrice membranaire basale sur chaque fossette contenant un EB.
    7. Prenez une pointe de pipette de 10 μL et déplacez rapidement les EB au centre de chaque gouttelette sans perturber les bords des gouttelettes.
    8. Placer le parafilm alvéolé avec les gouttes de la matrice membranaire basale dans une boîte de culture cellulaire de 60 mm et incuber pendant 15-30 min à 37 °C pour permettre à la matrice de polymériser.
    9. Pour détacher les EB intégrés dans la matrice du parafilm, ajouter 5 mL de milieu de différenciation (MS) sans vitamine A ( voir le tableau 2) dans la capsule et retourner le parafilm à l’envers à l’aide d’une pince de sorte que le côté avec les EB soit orienté vers le fond de la boîte.
    10. Secouez soigneusement le plat pour que les gouttes de matrice de membrane basale contenant les EB se détachent du parafilm. Si certains d’entre eux sont encore attachés, prenez un bord du carré du parafilm à l’aide d’une pince et roulez-le rapidement vers le centre du plat plusieurs fois.
    11. Culture des organoïdes cérébraux sur un agitateur orbital à 55 rpm dans une atmosphère humifiée de 5% de CO2 et 95% d’air à 37 °C. Conservez-les en DM sans vitamine A avec des changements moyens tous les deux jours. Pour induire la production de neurones, passer au DM avec de la vitamine A (acide rétinoïque, PR) après 13 dps pour les organoïdes cérébraux de macaque ouistiti et rhésus ou 14-15 dps pour les organoïdes cérébraux humains et chimpanzés (Figure 1A). À partir de ce moment, changez le milieu tous les 3-4 jours.
      REMARQUE: Pour soutenir la survie neuronale, le DM contenant de la vitamine A peut être complété par 20 μg / mL de neurotrophine humaine 3 (NT3), 20 μg / mL de facteur neurotrophique dérivé du cerveau (BDNF) et 1 μL / mL de matrice membranaire basale à partir de 40 dps.

3. Electroporation des organoïdes cérébraux des primates

NOTE: D’un point de vue technique, l’électroporation des organoïdes cérébraux peut être effectuée dès que les structures ventriculaires sont suffisamment prononcées pour être ciblées par microinjection. La fenêtre temporelle optimale d’électroporation dépend de la question biologique et de la ou des populations cellulaires d’intérêt. Par exemple, si les progéniteurs apical (PA) sont la cible principale, alors les organoïdes cérébraux à environ 30 dps conviennent déjà. Si les progéniteurs basaux (BP) ou les neurones sont les principales cibles, des organoïdes cérébraux plus anciens de plus de 50 dps doivent être utilisés (voir, par exemple, Fischer et al.28).

  1. Préparation de la configuration de l’électroporation
    NOTE: L’efficacité d’électroporation est fortement affectée par la taille et la concentration du ou des plasmides électroporés (voir la section discussion pour plus de détails).
    1. Préparer une quantité suffisante de mélange d’électroporation pour le contrôle et le gène d’intérêt (GOI), par exemple, 10 μL de mélange d’électroporation pour chaque témoin et GOI pour électroporer environ 30 organoïdes cérébraux par condition.
      NOTE: Pour la composition des mélanges d’électroporation, voir tableau 3.
    2. Préchauffer (non stérile) le mélange médium/nutritif Eagle modifié de Dulbecco F-12 (DMEM/F12) et DM avec de la vitamine A jusqu’à 37 °C. Préparez une petite spatule et des ciseaux fins et normaux, et vaporisez les instruments avec de l’éthanol à 70% (vol/vol).
      REMARQUE : Les étapes suivantes peuvent être effectuées dans des conditions stériles ou non stériles, car le DM contient des antibiotiques (voir le tableau 2). D’après notre expérience, l’absence de stérilité n’a jamais causé de contamination.
    3. Préparez des boîtes de culture cellulaire de 35 mm et connectez la chambre de l’électrode de la boîte de Petri à l’électroporateur.
      REMARQUE: Les chambres d’électrodes de boîte de Petri sont disponibles dans le commerce. Cependant, ils peuvent être facilement produits de manière rentable (voir le dossier supplémentaire 1).
    4. À l’aide d’embouts de microchargeur, remplissez les aiguilles de microinjection avec 8 μL de chaque mélange d’électroporation. Coupez les pointes des aiguilles à l’aide de ciseaux fins avant la première utilisation pour obtenir un écoulement stable. Cependant, ne retirez qu’une petite partie de la pointe, car une pointe émoussée et large peut gravement endommager les organoïdes.
      REMARQUE : Les aiguilles de micro-injection sont soit disponibles dans le commerce sous forme d’aiguilles de micro-injection prétirées, soit peuvent être retirées en laboratoire si un extracteur d’aiguilles est disponible. Suivez les instructions du fabricant de l’extracteur d’aiguilles pour générer des aiguilles de microinjection avec une longue conicité et un diamètre d’embout de 10 μm.
  2. Microinjection et électroporation
    1. Au microscope, choisissez cinq organoïdes cérébraux avec des bords lisses et des structures ventriculaires clairement visibles. Placez-les dans une boîte de culture cellulaire de 35 mm contenant du DMEM/F12 préchauffé (37 °C) à l’aide d’un embout de pipette coupé de 1 000 μL.
      REMARQUE : Choisissez des organoïdes cérébraux avec des structures ventriculaires prononcées et accessibles (voir Figure 1B).
    2. Pour injecter une structure en forme de ventricule, insérez soigneusement l’aiguille à travers sa paroi et infusez-la avec le mélange d’électroporation jusqu’à ce qu’elle soit visiblement remplie. N’appliquez pas de pression excessive sur les structures ventriculaires pour éviter qu’elles n’éclatent. Procédez avec six à huit structures ventriculaires de chaque organoïde cérébral de cette manière.
      REMARQUE: Si l’aiguille est obstruée pendant le processus de micro-injection, la pointe doit être légèrement coupée.
    3. Transférer un organoïde cérébral micro-injecté dans la chambre d’électrode de la boîte de Petri avec une petite quantité de DMEM/F12. Disposer l’organoïde de manière à ce que les surfaces des structures ventriculaires microinjectées soient orientées vers l’électrode reliée au pôle positif de l’électroporateur.
      REMARQUE: L’orientation des structures de cette manière garantit que les cellules sont transfectées du côté de la structure ventriculaire qui n’est pas affectée par une structure adjacente.
    4. Électroporate les organoïdes cérébraux un par un en utilisant les réglages suivants : 5 impulsions de 80 V, une durée d’impulsion de 50 ms et un intervalle de 1 s. Déplacer les organoïdes électroporés dans une nouvelle boîte de culture cellulaire de 35 mm remplie de DMEM/F12 préchauffé (37 °C).
      REMARQUE: Les paramètres d’électroporation peuvent dépendre de l’électroporateur à ondes carrées disponible. Ces réglages sont optimisés pour le système d’électroporation référencé. L’augmentation de la tension peut entraîner le déplacement des cellules.
    5. Procéder de la même manière avec les cinq organoïdes cérébraux suivants en utilisant le deuxième mélange d’électroporation (par exemple, GOI).
      NOTA : Répétez les étapes 3.2.1 à 3.2.5 jusqu’à ce que le nombre souhaité d’organoïdes cérébraux électroporés soit atteint.
    6. Si la microinjection et l’électroporation ont été effectuées dans des conditions non stériles, transférer les organoïdes électroporés dans une boîte de culture cellulaire stérile de 35 mm sous une hotte à flux laminaire tout en déplaçant le moins possible de DMEM/F12 vers la nouvelle boîte de culture cellulaire.
  3. Culture et fixation ultérieures d’organoïdes cérébraux
    1. Culture des organoïdes électroporés en DM avec de la vitamine A sur un agitateur orbital à 55 rpm dans une atmosphère humifiée de 5% de CO2 et 95% d’air à 37 °C.
    2. Le lendemain de l’électroporation, vérifiez la réussite de l’électroporation des organoïdes cérébraux au microscope à fluorescence inversée conventionnel.
      NOTE: Selon la durée de la culture ultérieure après électroporation, différentes populations cellulaires au sein de l’organoïde cérébral sont affectées (voir également la section des résultats représentatifs).
    3. Procéder aux applications en aval après la culture des organoïdes cérébraux électroporés pendant une durée appropriée à la question biologique d’intérêt.
      REMARQUE : Les organoïdes cérébraux électroporés peuvent être traités pour différentes applications en aval (p. ex., fixation pour coloration par immunofluorescence ou surgélation instantanée pour l’isolement de l’ARN et la qRT-PCR). Ici, nous décrivons la fixation des organoïdes cérébraux électroporés.
    4. Transférer les organoïdes électroporés dans un tube à centrifuger conique de 15 mL à l’aide d’un embout de pipette coupé de 1 000 μl et enlever l’excès de milieu.
    5. Ajouter une quantité suffisante de 4% de paraformaldéhyde (PFA) dans le DPBS (pH 7,5) et incuber pendant 30 min à température ambiante.
      ATTENTION : Le PFA est classé comme cancérogène pour l’homme et peut causer des dommages irréparables pour la santé. Des mesures de précaution supplémentaires, y compris des gants et des lunettes en nitrile, sont fortement recommandées.
    6. Aspirer le PFA, ajouter 5 mL de DPBS, agiter un peu et aspirer le DPBS. Répétez cette opération 2x. Conserver les organoïdes dans du DPBS à 4 °C jusqu’à nouvelle utilisation.
      REMARQUE: Le protocole peut être interrompu ici, car les organoïdes cérébraux fixés au PFA peuvent être conservés à 4 ° C pendant plusieurs mois. Les organoïdes électroporés fixés au PFA peuvent être analysés par cryosectionnement et immunofluorescence 10,28 ou par coloration et effacement 35,36. Pour des exemples d’images, voir la section des résultats représentatifs (voir le tableau 4 pour les détails sur les anticorps).

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Résultats

Le protocole décrit ici permet la génération efficace d’organoïdes cérébraux à partir de lignées d’iPSC humaines, de chimpanzés, de macaques rhésus et de ouistitis communs avec un minimum de modifications temporelles requises entre les espèces (Figure 1A). Ces organoïdes peuvent être électroporés dans la plage de 20 dps à 50 dps, selon l’accessibilité des structures ventriculaires et l’abondance de la ou des populations cellulaires d’intérêt. Cependant, avant l’électroporation, il est import...

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Discussion

Les procédures décrites ici représentent un protocole unifié pour la génération d’organoïdes cérébraux à partir de différentes espèces de primates avec une approche d’électroporation ciblée. Cela permet l’expression ectopique d’un GOI dans un système modèle qui émule le développement du néocortex (patho)physiologique des primates (y compris humains). Ce protocole unifié pour la génération d’organoïdes cérébraux de primates utilise les mêmes matériaux (p. ex., les mêmes milieux) et les mêmes étapes de protocole pour les q...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent n’avoir aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Nous nous excusons auprès de tous les chercheurs dont les travaux n’ont pas pu être cités en raison du manque d’espace. Nous remercions Ulrich Bleyer des services techniques de DPZ et Hartmut Wolf de l’atelier de MPI-CBG pour la construction des chambres d’électrodes de la boîte de Petri ; Stoyan Petkov et Rüdiger Behr pour avoir fourni des CSPi humaines (iLonza2.2), rhésus (iRh33.1) et ouistitis (cj_160419_5); Sabrina Heide pour la cryosectionnement et la coloration par immunofluorescence; et Neringa Liutikaite et César Mateo Bastidas Betancourt pour la lecture critique du manuscrit. Les travaux dans le laboratoire de W.B.H. ont été soutenus par une subvention ERA-NET NEURON (MicroKin). Les travaux dans le laboratoire de M.H. ont été soutenus par une bourse de démarrage du CER (101039421).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
20 et micro ; L MicroloaderEppendorf5242956003
2-MercaptoethanolMerck8.05740.0005
Boîtes de culture cellulaire de 35 mmSarstedt83.3900
Boîtes de culture cellulaire de 60 mmCytoOneCC7682-3359
Activin ASigma-AldrichSRP3003
AOC1SelleckchemS7217
Axio Observer.Z1 Microscope à fluorescence inverséeZeissremplaçable par des microscopes fluorescents comparables
AZD0530Selleckchem  ;S1006
B-27 Supplément de vitamine A (acide rétinoïque, RA) (50x)Gibco17504-044
B-27 sans vitamine A (50x)Gibco12587-010
BTX ECM 830 Système d’électroporation à ondes carréesBTX45-2052
CGP77675Sigma-AldrichSML0314
lignée de cellules souches pluripotentes induite par le chimpanzé Sandra Adoi : 10.7554/elife.18683  ;
Lignée de cellules souches pluripotentes induites par le ouistiti commun cj_160419_5doi : 10.3390/cells9112422
Mélange de milieux et de nutriments modifiés Eagle de Dulbecco F-12 (DMEM/F12)Gibco11320-033
Solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS)Gibco14190-094pH 7,0 et moins ; 7.3; Chauffer à température ambiante avant utilisation
Fast GreenSigma-AldrichF7252-5G
ForskolinSelleckchem2449
Supplément GlutaMAX (100x)Gibco35050-061Supplément de substitut de glutamine
Héparine (1 mg/mL stock)Sigma-AldrichH3149
Lignée de cellules souches pluripotentes induites par l’homme iLonza2.2doi : 10.3390/cells9061349
Neurotrophine-3 humaine (NT-3)PeproTech450-03
InsulineSigma-Aldrich19278
IWR1Sigma-AldrichI0161
Stéréomicroscope Leica MS5 (base en lumière transmise MDG 17)Leica10473849remplaçable par des stéréomicroscopes comparables
MatrigelCorning354277/354234matrice de membrane basale ; alternativement, Geltrex (ThermoFisher Scientific, A1413302) peut être utilisé
MEM Solution d’acides aminés non essentiels (100x)Sigma-AldrichM7145
N-2 Supplement (100x)Gibco17502-048
Milieu neurobasalGibco21103-049
ParafilmSigma-AldrichP7793
Paraformaldéhyde  ;Merck 818715 poignée avec causion due à la cancérogénicité
Pénicilline/Streptomycine (10 000 U/mL)PanBiotechP06-07100
Chambre d’électrode en boîte de Pétriautoproduite (voir Dossier supplémentaire 1)également disponible dans le commerce
Pipettes en verre pré-tiréWPITIP10LTpipettes en verre borosilicaté à cône long, 10 µ ; m tip
diameter Pro-Survival CompoundMerckMillipore529659
Recombinant Human/Murine/RatBrain Derived Neurotrophic Factor (BDNF)PeproTechAF-450-02
Lignée de cellules souches pluripotentes induite par le macaque rhésus iRh33.1doi : 10.3390/cells9061349
StemMACS iPS-Brew XFMiltenyi Biotech130-104-368
Réactif de dissociation cellulaire StemPro AccutaseGibcomélange d’enzymes protéolytiques et collagénolytiques
TrypLEGibco12604-013substitut de trypsine recombinant ; réchauffé à température ambiante avant
utilisation Fixation ultra-faible Plaques à 96 puitsCostar7007
Y27632Stemcell Technologies72305
A1110501

Références

  1. Marchetto, M. C. N., Winner, B., Gage, F. H. Pluripotent stem cells in neurodegenerative and neurodevelopmental diseases. Human Molecular Genetics. 19 (R1), R71-R76 (2010).
  2. Zhao, X., Bhattacharyya, A. Human models are needed for studying human neurodevelopmental disorders. The American Journal of Human Genetics. 103 (6), 829-857 (2018).
  3. Zhang, W., et al. Modeling microcephaly with cerebral organoids reveals a WDR62–CEP170–KIF2A pathway promoting cilium disassembly in neural progenitors. Nature Communications. 10 (1), 2612(2019).
  4. Sasaki, E., et al. Generation of transgenic non-human primates with germline transmission. Nature. 459 (7246), 523-527 (2009).
  5. Niu, Y., et al. Transgenic rhesus monkeys produced by gene transfer into early-cleavage–stage embryos using a simian immunodeficiency virus-based vector. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (41), 17663-17667 (2010).
  6. Niu, Y., et al. Generation of gene-modified cynomolgus monkey via Cas9/RNA-mediated gene targeting in one-cell embryos. Cell. 156 (4), 836-843 (2014).
  7. Shi, L., et al. Transgenic rhesus monkeys carrying the human MCPH1 gene copies show human-like neoteny of brain development. National Science Review. 6 (3), 480-493 (2019).
  8. Heide, M., et al. Human-specific ARHGAP11B increases size and folding of primate neocortex in the fetal marmoset. Science. 369 (6503), 546-550 (2020).
  9. Kadoshima, T., et al. Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell–derived neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20284-20289 (2013).
  10. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  11. Kelava, I., Lancaster, M. A. Stem cell models of human brain development. Cell Stem Cell. 18 (6), 736-748 (2016).
  12. Lullo, E. D., Kriegstein, A. R. The use of brain organoids to investigate neural development and disease. Nature Reviews Neuroscience. 18 (10), 573-584 (2017).
  13. Arlotta, P. Organoids required! A new path to understanding human brain development and disease. Nature Methods. 15 (1), 27-29 (2018).
  14. Heide, M., Huttner, W. B., Mora-Bermúdez, F. Brain organoids as models to study human neocortex development and evolution. Current Opinion in Cell Biology. 55, 8-16 (2018).
  15. Qian, X., Song, H., Ming, G. Brain organoids: Advances, applications and challenges. Development. 146 (8), dev166074(2019).
  16. Sun, N., Meng, X., Liu, Y., Song, D., Jiang, C., Cai, J. Applications of brain organoids in neurodevelopment and neurological diseases. Journal of Biomedical Science. 28 (1), 30(2021).
  17. Fischer, J., Heide, M., Huttner, W. B. Genetic modification of brain organoids. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 558(2019).
  18. Pașca, S. P., et al. A nomenclature consensus for nervous system organoids and assembloids. Nature. 609 (7929), 907-910 (2022).
  19. Kyrousi, C., Cappello, S. Using brain organoids to study human neurodevelopment, evolution and disease. Wiley Interdisciplinary Reviews: Developmental Biology. 9 (1), e347(2020).
  20. Teriyapirom, I., Batista-Rocha, A. S., Koo, B. -K. Genetic engineering in organoids. Journal of Molecular Medicine. 99 (4), 555-568 (2021).
  21. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental Biology. 240 (1), 237-246 (2001).
  22. Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8. Science. 294 (5544), 1071-1074 (2001).
  23. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: Visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).
  24. Kawasaki, H., Toda, T., Tanno, K. In vivo genetic manipulation of cortical progenitors in gyrencephalic carnivores using in utero electroporation. Biology Open. 2 (1), 95-100 (2012).
  25. Kawasaki, H., Iwai, L., Tanno, K. Rapid and efficient genetic manipulation of gyrencephalic carnivores using in utero electroporation. Molecular Brain. 5 (1), 24(2012).
  26. Bai, J., et al. RNAi reveals doublecortin is required for radial migration in rat neocortex. Nature Neuroscience. 6 (12), 1277-1283 (2003).
  27. Kalebic, N., et al. CRISPR/Cas9-induced disruption of gene expression in mouse embryonic brain and single neural stem cells in vivo. EMBO reports. 17 (3), 338-348 (2016).
  28. Fischer, J., et al. Human-specific ARHGAP11B ensures human-like basal progenitor levels in hominid cerebral organoids. EMBO Reports. 23 (11), e54728(2022).
  29. Stauske, M., et al. Non-human primate iPSC generation, cultivation, and cardiac differentiation under chemically defined conditions. Cells. 9 (6), 1349(2020).
  30. Mora-Bermúdez, F., et al. Differences and similarities between human and chimpanzee neural progenitors during cerebral cortex development. eLife. 5, e18683(2016).
  31. Petkov, S., Dressel, R., Rodriguez-Polo, I., Behr, R. Controlling the switch from neurogenesis to pluripotency during marmoset monkey somatic cell reprogramming with self-replicating mRNAs and small molecules. Cells. 9 (11), 2422(2020).
  32. Camp, J. G., et al. Human cerebral organoids recapitulate gene expression programs of fetal neocortex development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (51), 15672-15677 (2015).
  33. Kanton, S., et al. Organoid single-cell genomic atlas uncovers human-specific features of brain development. Nature. 574 (7778), 418-422 (2019).
  34. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (10), 2329-2340 (2014).
  35. Cakir, B., et al. Engineering of human brain organoids with a functional vascular-like system. Nature Methods. 16 (11), 1169-1175 (2019).
  36. Masselink, W., et al. Broad applicability of a streamlined ethyl cinnamate-based clearing procedure. Development. 146 (3), dev166884(2019).
  37. Denoth-Lippuner, A., Royall, L. N., Gonzalez-Bohorquez, D., Machado, D., Jessberger, S. Injection and electroporation of plasmid DNA into human cortical organoids. STAR Protocols. 3 (1), 101129(2022).
  38. Denoth-Lippuner, A., et al. Visualization of individual cell division history in complex tissues using iCOUNT. Cell Stem Cell. 28 (11), 2020.e12-2034.e12 (2021).
  39. Kelava, I., Chiaradia, I., Pellegrini, L., Kalinka, A. T., Lancaster, M. A. Androgens increase excitatory neurogenic potential in human brain organoids. Nature. 602 (7895), 112-116 (2022).
  40. Lancaster, M. A., et al. Guided self-organization and cortical plate formation in human brain organoids. Nature Biotechnology. 35 (7), 659-666 (2017).
  41. Kalebic, N., et al. Neocortical expansion due to increased proliferation of basal progenitors is linked to changes in their morphology. Cell Stem Cell. 24 (4), 535.e9-550.e9 (2019).

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Mots-clés

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