Échafaudages décellularisés dérivés de la pomme pour l’ingénierie des tissus osseux in vitro et in vivo

Les gros défauts osseux causés par une blessure ou une maladie nécessitent souvent des greffes de biomatériaux pour une régénération complète¹. Les techniques actuelles visant à améliorer la régénération du tissu osseux utilisent régulièrement des greffes autologues, allogéniques, xénogéniques ou synthétiques². Pour la greffe osseuse autologue, considérée comme la pratique de greffe « de référence » pour réparer les grands défauts osseux, l’os est extrait du patient. Cependant, cette procédure de greffe présente plusieurs inconvénients, notamment des limites de taille et de forme, la disponibilité des tissus et la morbidité du site d’échantillonnage³. De plus, les procédures de greffe autologue sont sensibles aux infections du site chirurgical, aux fractures ultérieures, à la formation d’hématome au niveau du site de prélèvement ou de reconstruction et à la douleur postopératoire⁴. L’ingénierie du tissu osseux (BTE) offre une alternative potentielle aux méthodes conventionnelles de greffe osseuse⁵. Il combine des biomatériaux structurels et des cellules pour construire de nouveaux tissus osseux fonctionnels. Lors de la conception de biomatériaux pour le contour d’oreille, il est essentiel de combiner une structure macroporeuse, une chimie de surface qui favorise la fixation cellulaire et des propriétés mécaniques qui ressemblent beaucoup à celles de l’os natif⁶. Des recherches antérieures ont indiqué que la taille idéale des pores et le module d’élasticité pour les biomatériaux utilisés dans les contours d’oreille sont d’environ 100 à 200 μm⁷ et 0,1 à 20 GPa, respectivement, selon le site de greffe⁸. En outre, la porosité et l’interconnectivité des pores des échafaudages sont des facteurs critiques affectant la migration cellulaire, la diffusion des nutriments et l’angiogenèse⁸.

Le contour d’oreille a montré des résultats prometteurs avec divers biomatériaux développés et évalués comme options alternatives aux greffes osseuses. Certains de ces biomatériaux sont des matériaux ostéo-inductifs, des matériaux hybrides et des hydrogels avancés⁸. Les matériaux ostéoinductifs stimulent le développement des structures osseuses nouvellement formées. Les matériaux hybrides sont composés de polymères synthétiques et/ou naturels⁸. Les hydrogels avancés imitent la matrice extracellulaire (MEC) et sont capables de fournir les facteurs bioactifs nécessaires pour favoriser l’intégration du tissu osseux⁸. L’hydroxyapatite est un matériau traditionnel et un choix courant pour les contours d’oreille en raison de sa composition et de sa biocompatibilité⁹. Le verre bioactif est un autre type de biomatériau pour les contours d’oreille, dont il a été démontré qu’il stimule des réponses cellulaires spécifiques pour activer les gènes nécessaires à l’ostéogenèse^10,11. Les polymères biodégradables, y compris l’acide poly(glycolique) et l’acide poly(lactique), ont également été largement utilisés dans les applications de contours d’oreille¹². Enfin, les polymères naturels ou d’origine naturelle comme le chitosane, la chitine et la cellulose bactérienne ont également démontré des résultats encourageants pour le BTE¹³. Cependant, bien que les polymères synthétiques et naturels présentent un potentiel pour les contours d’oreille, le développement d’un échafaudage fonctionnel avec la macrostructure souhaitée nécessite généralement des protocoles étendus.

À l’inverse, les structures macroscopiques de cellulose native peuvent être facilement dérivées de diverses plantes et notre groupe de recherche a précédemment démontré l’applicabilité des échafaudages à base de cellulose dérivés de plantes à différentes reconstructions tissulaires. En effet, à la suite d’un simple traitement tensioactif, nous avons exploité la structure inhérente de la matière végétale, mettant en évidence son potentiel en tant que biomatériau polyvalent¹⁴. De plus, ces échafaudages à base de cellulose peuvent être utilisés pour des applications in vitro de culture cellulaire de mammifères¹⁴, sont biocompatibles et favorisent la vascularisation sous-cutanée spontanée 14,15,16,17. Notre groupe de recherche et d’autres ont démontré que ces échafaudages peuvent être obtenus à partir de plantes spécifiques en fonction de l’application prévue 14,15,16,17,18,19,20. Par exemple, la structure vasculaire observée dans les tiges et les feuilles des plantes présente une similitude frappante avec la structure trouvée dans les tissus animaux¹⁹. De plus, les échafaudages en cellulose dérivés de plantes peuvent être facilement façonnés et soumis à des modifications biochimiques de surface pour obtenir les caractéristiques souhaitées¹⁶. Dans une étude récente, nous avons incorporé un tampon salin pendant le processus de décellularisation, ce qui a conduit à une meilleure fixation cellulaire observée à la fois in vitro et in vivo ¹⁶. Dans la même étude, nous avons démontré l’applicabilité des échafaudages cellulosiques d’origine végétale dans les biomatériaux composites en coulant des hydrogels sur la surface des échafaudages. Dans des études récentes, il a été démontré que la fonctionnalisation d’échafaudages d’origine végétale améliore leur efficacité¹⁸. Par exemple, une étude menée par Fontana et al. (2017) a révélé que l’adhésion des fibroblastes dermiques humains était soutenue par des tiges décellularisées enrobées de RGD, alors que les tiges non enrobées ne présentaient pas la même capacité¹⁸. De plus, les auteurs ont également démontré que des fluides corporels simulés modifiés pouvaient être utilisés pour minéraliser artificiellement les tiges de plantes décellularisées. Dans des études plus récentes, nous avons exploré le concept d’ostéogenèse mécanosensible dans les échafaudages cellulosiques d’origine végétale et évalué leur potentiel pour le contour d’oreille^17,20. De plus, Lee et al. (2019) ont utilisé des échafaudages d’origine végétale pour cultiver des tissus osseux dans un environnement in vitro ²¹. Grâce à des évaluations complètes de différentes sources végétales, les auteurs ont identifié les échafaudages dérivés de la pomme comme les plus optimaux pour la culture et la différenciation des cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSC). De plus, les auteurs ont proposé que les caractéristiques structurelles et mécaniques des échafaudages dérivés de la pomme jouent un rôle central dans leur adéquation à l’usage prévu. En tant que premiers échafaudages d’origine végétale mis en œuvre dans des applications d’ingénierie tissulaire, il a été largement démontré que les échafaudages dérivés de la pomme possèdent une architecture étonnamment similaire à celle de l’os humain, notamment en termes de pores interconnectés allant de 100 à 200 μm de diamètre^14,21.

Dans la présente étude, nous avons étudié plus en détail le potentiel des échafaudages en cellulose dérivés de la pomme pour les contours d’oreille et avons effectué une analyse de leurs propriétés mécaniques in vitro et in vivo. Bien qu’il y ait eu des études sur le potentiel des échafaudages dérivés de la pomme pour les contours d’oreille 17,20,21, leurs propriétés mécaniques ont été sous-étudiées. Les résultats ont montré une invasion sauvage et une différenciation ostéogénique des préostéoblastes MC3T3-E1 ensemencés dans des échafaudages qui ont été cultivés dans un milieu de différenciation pendant 4 semaines. Le module de Young de ces échafaudages était de 192,0 ± 16,6 kPa, ce qui était significativement plus élevé que ceux des échafaudages vierges (échafaudages sans cellules ensemencées) (31,6 ± 4,8 kPa) et des échafaudages à ensemencement cellulaire cultivés en milieu non différencié (24,1 ± 8,8 kPa). Cependant, il convient de noter que le module de Young du tissu osseux humain sain se situe généralement dans la plage de 0,1 à 2 GPa pour l’os trabéculaire et d’environ 15 à 20 GPa pour l’os cortical⁸. Néanmoins, après une implantation de 8 semaines dans un défaut calvaire de rongeur, les échafaudages ensemencés de cellules semblaient bien intégrés dans l’os environnant, comme le démontre une force maximale moyenne de 113,6 N ± 18,2 N dans les tests de poussée, ce qui est similaire à la charge de fracture précédemment rapportée de l’os calvaire natif²². Dans l’ensemble, les résultats obtenus dans le cadre de cette étude sont très prometteurs, en particulier pour les applications non porteuses. Cependant, les échafaudages en cellulose dérivés de la pomme ne possèdent pas actuellement les propriétés mécaniques nécessaires pour correspondre précisément au tissu osseux environnant sur un site d’implantation. Par conséquent, un développement supplémentaire est nécessaire pour libérer tout le potentiel de ces échafaudages.

Les protocoles expérimentaux ont été examinés et approuvés par le Comité de protection des animaux de l’Université d’Ottawa.

1. Préparation de l’échafaudage

1. À l’aide d’une mandoline, couper les pommes McIntosh (Canada Fancy) en tranches de 8 mm d’épaisseur. Coupez le tissu hypanthium des tranches de pomme en carrés de 5 mm x 5 mm.
2. Placez les échantillons carrés dans du dodécylsulfate de sodium (SDS) à 0,1 % pendant 2 jours.
3. Lavez les échantillons décellularisés avec de l’eau déminéralisée et incubez-les pendant une nuit à température ambiante (RT) dans 100 mM de CaCl2_{pour éliminer} le tensioactif restant.
4. Stérilisez les échantillons (c’est-à-dire les échafaudages) dans de l’éthanol à 70 % pendant 30 minutes, lavez-les avec de l’eau déminéralisée et placez-les dans une plaque de culture à 24 puits avant l’ensemencement des cellules.

2. Culture cellulaire et ensemencement d’échafaudages

1. Maintenir MC3T3-E1 Subclone 4 cellules dans des boîtes de 10 cm de diamètre traitées par culture cellulaire dans des conditions de culture cellulaire (37°C dans une atmosphère humidifiée de 95% d’air et 5% de CO₂).
2. Préparer un milieu de culture cellulaire composé du milieu essentiel minimum d’Eagle - la modification alpha (α-MEM) complété par 10 % de sérum de veau fœtal (FBS) et 1 % de pénicilline/streptomycine.
3. Détacher les cellules des boîtes de culture par trypsinisation (0,05 % trypsine-EDTA) une fois qu’elles ont atteint 80 % de confluence.
4. Centrifuger la suspension cellulaire à environ 200 x g pendant 3 min. Aspirer le surnageant et remettre les cellules en α-MEM à raison de 2,5 x 10⁷ cellules par mL.
5. Pipeter une aliquote de 40 μL de la suspension cellulaire à la surface des échafaudages et laisser adhérer les cellules pendant 1 h dans des conditions de culture cellulaire. Par la suite, ajoutez 2 mL de milieu de culture dans chaque puits de culture de la plaque de culture.
6. Réapprovisionnez le milieu de culture tous les 2-3 jours pendant 14 jours.
7. Préparer un milieu de différenciation en ajoutant 50 μg/mL d’acide ascorbique et 4 mM de phosphate de sodium au milieu de culture cellulaire décrit précédemment.
8. Induire la différenciation des cellules MC3T3-E1 en incubant les échafaudages dans un milieu de différenciation pendant 4 semaines. Réapprovisionnez le milieu tous les 3-4 jours. En parallèle, incuber les échafaudages dans un milieu de culture sans différenciation (c’est-à-dire un milieu sans les suppléments pour induire la différenciation) pendant la même durée, avec le même calendrier de changement de milieu pour servir de témoin négatif.

3. Mesures de la taille des pores à l’aide de la microscopie confocale à balayage laser

1. Lavez les échafaudages décellularisés dérivés de pommes avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
2. Incuber les échafaudages dans 1 mL de coloration blanche au calcofluor à 10 % (v/v) pendant 25 min dans l’obscurité à RT.
3. Lavez les échafaudages (n = 3) avec du PBS et imagez trois zones choisies au hasard par échafaudage à l’aide d’un microscope confocal confocal à balayage laser résonant (CLSM) à grande vitesse, à un grossissement de 10x, à l’aide d’un canal DAPI, comme suit :
   1. Configuration du filtre d’émission laser : 405 nm (laser) ; 425-475 nm (émission)
   2. Ajustez manuellement la puissance du laser et le détecteur pour assurer une acquisition d’image optimale. Acquérez une pile z de 20 images avec une taille de pas de 5 μm.
4. À l’aide du logiciel ImageJ, traitez et analysez les images confocales comme suit :
   1. Utilisez la fonction Z-Project to Maximum Intensity (Projeter en Z) sur l’intensité maximale pour créer une image et appliquez la fonction Rechercher les bords pour mettre en surbrillance le bord des pores.
   2. Tracez les pores manuellement à l’aide de l’outil Sélection à main levée .
   3. Ajustez chaque pore comme une ellipse, mesurez la longueur du grand axe, compilez toutes les mesures (un total de 54 dans la présente étude - 6 dans 3 zones choisies au hasard pour chaque échafaudage) et calculez la longueur moyenne.

4. Analyse de la distribution cellulaire à l’aide de la microscopie confocale à balayage laser

1. Lavez trois fois les échafaudages ensemencés en cellules cultivés dans le milieu de non-différenciation ou de différenciation avec du PBS. Fixez les échafaudages avec 4% de paraformaldéhyde pendant 10 min.
2. Lavez soigneusement chaque échafaudage avec de l’eau déminéralisée, perméabilisez les cellules avec une solution Triton-X 100 pendant 5 minutes et lavez à nouveau avec du PBS.
3. Incuber les échafaudages dans 1 mL d’acide périodique à 1 % pendant 40 min et rincer à l’eau déminéralisée^14,16.
4. Incuber les échafaudages dans 1 mL d’une solution contenant 100 mM de métabisulfite de sodium et 0,15 M d’acide chlorhydrique, complétée par 100 μg/mL d’iodure de propidium. Immergez complètement les échafaudages dans la solution.
5. Lavez les échafaudages avec du PBS et colorez les noyaux cellulaires en incubant les échafaudages dans une solution de DAPI à 5 mg/mL pendant 10 min dans l’obscurité. Lavez soigneusement à nouveau et rangez les échafaudages dans PBS avant l’imagerie.
6. Imagez trois surfaces sélectionnées au hasard de trois échafaudages différents ensemencés en cellules avec un CLSM résonant à grande vitesse à un grossissement de 10x, en utilisant les canaux DAPI et TRITC, comme suit :
   1. Configuration du filtre d’émission laser :
      DAPI : Laser : 405 nm ; Émission : 425-475 nm
      TRITC : Laser : 561 nm ; Émission : 570-620 nm
   2. Ajustez manuellement la puissance du laser et le détecteur pour assurer une acquisition d’image optimale. Acquérez une pile z de 20 images avec une taille de pas de 5 μm.
7. Utilisez le logiciel ImageJ pour traiter les images confocaux et créer une projection maximale sur l’axe z pour l’analyse d’images à l’aide de la fonction Z-Project to Maximum Intensity .

5. Analyse de la phosphatase alcaline

1. Lavez trois fois les échafaudages ensemencés en cellules cultivés dans le milieu de non-différenciation ou de différenciation avec du PBS. Fixez les échafaudages avec 10 % de formol tamponné neutre pendant 30 min. Fixez les échafaudages vierges (échafaudages sans cellules ensemencées) pour servir de contrôle négatif.
2. Préparer une solution de coloration au 5-bromo-4-chloro-3'-indolyphosphate et tétrazolium au bleu nitro (BCIP/NBT) en dissolvant un comprimé de BCIP/NBT dans 10 mL d’eau déminéralisée.
3. Lavez les échafaudages fixes avec une solution d’interpolation à 0,05 % et teignez-les avec la solution BCIP/NBT pendant 20 minutes à RT. Lavez les échafaudages tachés avec une solution d’interpolation à 0,05 % et rangez-les dans du PBS avant l’imagerie.
4. Imaginez les échafaudages tachés avec un appareil photo numérique de 12 mégapixels.

6. Analyse des dépôts de calcium

1. Lavez trois fois les échafaudages ensemencés en cellules cultivés dans le milieu de non-différenciation ou de différenciation avec du PBS. Fixez les échafaudages avec 10 % de formol tamponné neutre pendant 30 min. Fixez les échafaudages vierges (échafaudages sans cellules ensemencées) pour servir de contrôle négatif.
2. Préparez une solution de coloration au rouge d’alizarine S (ARS) à 2 % (p/v).
3. Lavez les échafaudages fixes avec de l’eau déminéralisée et teignez-les avec la solution ARS pendant 1 h à RT. Lavez les échafaudages tachés avec de l’eau déminéralisée et stockez-les dans PBS avant l’imagerie.
4. Imaginez les échafaudages tachés avec un appareil photo numérique de 12 mégapixels.

7. Analyse de la minéralisation

1. Lavez trois fois les échafaudages ensemencés en cellules cultivés dans le milieu de non-différenciation ou de différenciation avec du PBS. Fixez les échafaudages avec 4% de paraformaldéhyde pendant 48 h. Fixez les échafaudages vierges (échafaudages sans cellules ensemencées) pour servir de contrôle négatif.
2. Déshydrater les échantillons dans des solutions contenant des concentrations d’éthanol augmentant de 50 % à 100 %, comme décrit précédemment²³.
3. Effectuer la microscopie électronique à balayage (MEB) et la spectroscopie à dispersion d’énergie (EDS) pour analyser les agrégats minéraux comme suit :
   1. Séchez les échantillons à l’aide d’un séchoir à point critique, en suivant le protocole du fabricant²⁴.
   2. Appliquez une couche d’or de 5 nm sur les échafaudages à l’aide d’une coucheuse de pulvérisation d’or, en suivant le protocole²⁵ du fabricant.
   3. Imagez la surface des échafaudages à l’aide d’un microscope électronique à balayage réglé à 3 kV, à un grossissement de 85x.
   4. Effectuez l’EDS en réglant le microscope électronique à balayage à 15 kV. Sur trois zones choisies au hasard par échafaudage, acquérir des spectres EDS pour l’analyse de la composition des agrégats minéraux.

8. Mesures du module de Young

1. Retirez les échafaudages ensemencés de cellules de leur milieu d’incubation respectif et testez immédiatement les échantillons.
2. À l’aide d’un appareil de compression uniaxiale construit sur mesure équipé d’un capteur de pesage de 1,5 N, comprimer les échafaudages (n = 3 par condition) à une vitesse constante de 3 mm·^min-1 jusqu’à une déformation de compression maximale de 10 % de la hauteur de l’échafaudage.
3. Déterminer le module de Young à partir de la pente de la partie linéaire des courbes contrainte-déformation. Dans la présente étude, le module a été déterminé entre 9 % et 10 % de déformation.

9. Analyse de l’infiltration cellulaire et de la minéralisation par histologie : Échafaudages in vitro

1. Lavez trois fois les échafaudages ensemencés en cellules cultivés dans un milieu de non-différenciation ou de différenciation avec du PBS.
2. Fixer les échafaudages ensemencés en cellules avec du paraformaldéhyde à 4 % pendant 48 h avant de les remettre en suspension dans de l’éthanol à 70 % pour le stockage.
3. Histologie:
   NOTE : Dans la présente étude, l’ensemble de la préparation histologique (enrobage, coupe et coloration) décrite dans les étapes suivantes a été réalisée par la Plateforme de recherche en histologie Louise Pelletier (Université d’Ottawa).
   1. Après déshydratation et enrobage dans de la paraffine, découpez les échantillons en sections en série de 5 μm d’épaisseur, en commençant par 1 mm à l’intérieur des échafaudages, et montez les sections sur des lames de microscope.
   2. Colorer les sections avec des colorations à l’hématoxyline et à l’éosine (H&E) ou von Kossa (VK).
   3. Imager les coupes à l’aide d’un microscope à balayage de lames à un grossissement de 40x (n = 1 échafaudage dans un milieu non différencié et n = 2 échafaudages dans un milieu de différenciation dans la présente étude).
   4. À l’aide du logiciel ImageJ, évaluez visuellement l’infiltration cellulaire (coloration H&E) et la minéralisation (coloration VK).

10. Modèle de défaut calvaire de rat

1. Faites examiner et approuver les protocoles expérimentaux par le comité local de protection des animaux.
2. Préparer des échafaudages circulaires (5 mm de diamètre et 1 mm d’épaisseur) décellularisés en suivant la section 1 décrite ci-dessus et en utilisant un poinçon de biopsie de 5 mm.
3. Effectuer une craniotomie bilatérale en suivant un protocole établi²⁶, comme suit :
   1. Anesthésier les rats Sprague-Dawley mâles avec de l’isoflurane, d’abord à 3 % jusqu’à ce qu’ils soient inconscients, puis à 2-3 % tout au long de la procédure.
   2. Exposez le périoste et le crâne en coupant la peau sus-jacente à l’aide d’une lame de scalpel. Retirez le périoste.
   3. Créer des défauts bilatéraux dans les deux os pariétaux de chaque côté de la suture sagittale à l’aide d’une perceuse dentaire équipée d’une tréphine de 5 mm de diamètre sous irrigation constante de 0,9% de NaCl.
   4. Nettoyez l’os environnant avec 0,9 % de NaCl pour éliminer tout fragment d’os.
   5. Placez les échafaudages circulaires et décellularisés dans les défauts.
   6. Fermez la peau sus-jacente avec des sutures 4-0.
4. Donnez aux rats un accès illimité à la nourriture et à l’eau et surveillez-les quotidiennement.
5. Après 8 semaines après l’implantation, euthanasier les rats par inhalation de CO₂ et perforation thoracique comme mesure d’euthanasie secondaire.
6. Pour exposer le crâne et récupérer les implants, retirez la peau recouvrant le crâne à l’aide d’une lame de scalpel.
7. Coupez le crâne au niveau des os frontaux et occipitaux et sur le côté des deux os pariétaux à l’aide d’une perceuse dentaire pour enlever complètement la partie supérieure du crâne.

11. Test de poussée

1. Connectez un dispositif de compression uniaxiale (avec un capteur de pesage de 445 N) au module d’acquisition de données USB.
2. Connectez le module d’acquisition de données à un ordinateur équipé d’une application logicielle d’acquisition de données.
3. Immédiatement après l’extraction crânienne, placer chaque échantillon (n = 7 implants provenant de 4 animaux dans la présente étude) sur le porte-échantillon du dispositif de compression uniaxiale de manière à ce que la face dorsale de l’os soit orientée vers le haut.
4. Abaissez le piston à 0,5 mm/min jusqu’à ce qu’il touche légèrement l’implant extrait.
5. Lancez le test en abaissant le piston à travers l’implant jusqu’à ce qu’il soit complètement expulsé tout en appliquant une compression à une vitesse constante de 0,5 mm/min à l’aide du logiciel d’acquisition de données.
6. Enregistrez la force maximale sur la courbe de force en fonction du déplacement à l’aide du logiciel d’acquisition de données.

12. Analyse d’infiltration et de minéralisation cellulaire par histologie : échafaudages in vivo

1. Fixer la calvaria extraite et les implants dans du formol tamponné neutre à 10 % pendant 72 h avant de les remettre en suspension dans de l’éthanol à 70 % pour le stockage.
2. Histologie:
   NOTE : Dans la présente étude, toute la préparation histologique (enrobage, coupe et coloration) décrite dans les étapes suivantes a été réalisée par Accel Labs (Montréal, QC, Canada).
   1. Découpez les échantillons (incorporés dans du méthacrylate de méthyle) en sections de 6 μm d’épaisseur à trois niveaux différents (haut, bas et vers le centre) et montez-les sur des lames de microscope.
   2. Teindre les sections avec du H&E ou du trichrome de Masson-Goldner (MGT).
3. Imagez les coupes avec un microscope à balayage de lames à un grossissement de 40x (4 explants de 2 animaux dans la présente étude).
4. À l’aide du logiciel ImageJ, évaluez visuellement l’infiltration cellulaire (coloration H&E) et le dépôt de collagène (coloration MGT).

Mesure de la taille des pores, de la distribution cellulaire et de la minéralisation in vitro (Figure 1 et Figure 2)
L’élimination complète des composants cellulaires natifs des échafaudages de tissus de pommier a été obtenue après le traitement des échafaudages avec du SDS et du CaCl2 (figure 1A). Les échafaudages présentaient une structure très poreuse, ce qui a été confirmé par microscopie confocale. La quantification des images a démontré une taille moyenne des pores de 154 μm ± 40 μm. La distribution de la taille des pores variait entre 73 μm et 288 μm. Cependant, la majorité des pores se situaient entre 100 μm et 200 μm (figure 1C).

Après une période de culture de 4 semaines en milieu de différenciation, les échafaudages ensemencés en cellules présentaient des dépôts de minéraux blancs étendus (Figure 1A). Les échafaudages contenant des cellules présentaient une coloration blanche opaque, suggérant une minéralisation, qui n’a pas été observée dans les échafaudages vierges (échafaudages sans cellules ensemencées). De plus, l’analyse par microscopie confocale à balayage laser a révélé une distribution cellulaire homogène à l’intérieur des échafaudages (Figure 1B).

Les échafaudages ensemencés ou non avec des cellules ont été colorés avec BCIP/NBT et ARS pour analyser l’activité et la minéralisation de l’ALP, respectivement (Figure 1D). La coloration BCIP/NBT a révélé une augmentation substantielle de l’activité de l’ALP (représentée par une forte couleur violette) dans les échafaudages à graines cellulaires cultivés en milieu de différenciation, contrairement aux échafaudages vierges ou aux échafaudages à graines cellulaires cultivés en milieu non différencié. De même, les échafaudages à graines cellulaires cultivés en milieu de différenciation présentaient une couleur rouge plus intense lors de la coloration à l’ARS, indiquant une plus grande minéralisation par rapport aux échafaudages vierges ou aux échafaudages à ensemencement cellulaire cultivés en milieu non différencié. Une coloration de fond a été observée dans les échafaudages vierges, possiblement en raison de la présence de CaCl2 dans le protocole de décellularisation.

Des colorations (H&E et VK) ont été effectuées sur les échafaudages pour analyser l’infiltration et la minéralisation des cellules, et le MEB et l’EDS ont été utilisés pour évaluer plus en détail la minéralisation (Figure 2). La coloration H&E (Figure 2A) a montré une bonne infiltration cellulaire dans les échafaudages ensemencés en cellules cultivés en milieu de non-différenciation ou de différenciation. De multiples noyaux étaient visibles à la périphérie et dans les échafaudages. La présence de collagène a également été observée dans les échafaudages en rose pâle. De plus, la coloration VK réalisée sur les échafaudages après 4 semaines de culture en milieu de différenciation a révélé que les parois des pores étaient colorées alors que des dépôts de calcium n’ont été détectés que le long des bords extérieurs des parois des pores dans les échafaudages cultivés en milieu de non-différenciation et peuvent avoir résulté de l’absorption du calcium pendant le traitement de décellularisation. Une minéralisation localisée à la surface des échafaudages ensemencés en cellules cultivées en milieu de différenciation pendant 4 semaines a été observée par analyse MEB (Figure 2B). Plus précisément, des dépôts minéraux ressemblant à des agrégats sphéroïdes ont été observés à la périphérie des pores. En revanche, aucun agrégat minéral n’a été observé sur les échafaudages vierges ou les échafaudages ensemencés en cellules cultivés pendant 4 semaines en milieu de non-différenciation. Des pics caractéristiques distincts correspondant au phosphore (P) et au calcium (Ca) ont été observés dans les spectres EDS des régions d’intérêt sélectionnées, en particulier sur les dépôts minéraux observés sur les échafaudages à ensemencement cellulaire cultivés pendant 4 semaines en milieu de différenciation (Figure 2B).

Analyse biomécanique in vitro (Figure 3)
Le module de Young des échafaudages ensemencés en cellules a été mesuré après 4 semaines de culture dans un milieu de non-différenciation ou de différenciation (n = 3 pour chaque condition expérimentale). Il a été comparé au module de Young des échafaudages vierges (échafaudages sans cellules ensemencées) (Figure 3). Aucune différence significative n’a été observée dans le module entre les échafaudages vierges (31,6 kPa ± 4,8 kPa) et les échafaudages à ensemencement cellulaire cultivés en milieu non différencié (24,1 kPa ± 8,8 kPa ; p = 0,88). En revanche, une différence significative a été notée entre le module des échafaudages vierges (31,6 kPa ± 4,8 kPa) et celui des échafaudages à graines cellulaires cultivés en milieu de différenciation (192,0 kPa ± 16,6 kPa ; p < 0,001). De plus, une différence significative (p < 0,001) a été observée entre les modules de Young des échafaudages ensemencés en cellules cultivés dans des milieux de non-différenciation et de différenciation. La figure supplémentaire 1 montre une courbe contrainte-déformation typique pour le calcul du module de Young.

Performance biomécanique in vivo et régénération osseuse (Figure 4 et Figure 5)
Des craniotomies chirurgicales ont été réalisées sur un total de 6 rats Sprague-Dawley. Des défauts bilatéraux de 5 mm de diamètre ont été créés dans les deux os pariétaux du crâne à l’aide d’une fraise trépanine, et des échafaudages de cellulose dérivés de pomme sans cellules ensemencées ont été implantés dans les défauts calvaires (Figure 4A). Après 8 semaines d’implantation, les animaux ont été euthanasiés et la partie supérieure de leur crâne a été prélevée et traitée pour des tests mécaniques ou une analyse histologique.

Sur la base d’une évaluation visuelle, les échafaudages semblaient bien intégrés dans les tissus entourant le crâne. Des essais de poussée mécanique ont été réalisés pour évaluer quantitativement l’intégration des échafaudages (n = 7) dans la calvaria hôte. Les mesures ont été effectuées à l’aide d’un dispositif de compression uniaxiale (Figure 4B) immédiatement après l’euthanasie des animaux. Les résultats ont révélé que la force maximale était de 113,6 N ± 18,2 N (tableau 1).

Une analyse histologique a été réalisée pour évaluer l’infiltration cellulaire et le dépôt de matrice extracellulaire à l’intérieur des échafaudages implantés (Figure 5). La coloration H&E a révélé une infiltration cellulaire dans les pores de l’échafaudage et des signes de vascularisation, comme le montre la présence de vaisseaux sanguins à l’intérieur des échafaudages. De plus, la coloration au MGT a démontré la présence de collagène à l’intérieur des échafaudages.

Figure 1 : Images d’échafaudage, distribution de la taille des pores et minéralisation in vitro. (A) Photographies représentatives d’un échafaudage de cellulose dérivé de la pomme après élimination des cellules natives et du tensioactif (à gauche) et d’un échafaudage ensemencé de cellules MC3T3-E1 après 4 semaines de culture dans un milieu de différenciation ostéogénique (à droite). La barre d’échelle représente 2 mm. (B) Images confocales représentatives au microscope à balayage laser montrant des cellules ensemencées dans des échafaudages de cellulose dérivés de pommes après 4 semaines de culture dans un milieu de non-différenciation (« ND ») ou un milieu de différenciation ostéogénique (« D »). La barre d’échelle représente 50 μm. La coloration de la cellulose (rouge) à l’iodure de propidium et des noyaux cellulaires (bleus) à l’aide de DAPI a été réalisée sur les échafaudages. (C) Distribution de la taille des pores des échafaudages de cellulose décellularisés dérivés de pommes, avant d’être ensemencés avec des cellules MC3T3-E1, à partir des projections maximales sur l’axe z des images confocales. L’analyse a été effectuée sur un total de 54 pores dans 3 échafaudages différents (6 pores dans 3 régions d’intérêt sélectionnées au hasard par échafaudage). (D) Images représentatives d’échafaudages colorés au 5-bromo-4-chloro-3'-indolyphosphate et au tétrazolium bleu nitro (BCIP/NBT) pour évaluer l’activité de la phosphatase alcaline (ALP) et au rouge d’alizarine S (ARS) pour visualiser le dépôt de calcium, indiquant la minéralisation (barre d’échelle = 2 mm - s’applique à tous). Les échafaudages étiquetés comme « vierges » (échafaudages sans cellules ensemencées) n’ont montré aucune coloration au BCIP/NBT, ce qui indique l’absence d’activité de l’ALP. D’autre part, les échafaudages à graines cellulaires cultivés en milieu de différenciation (« D ») ont montré une activité ALP plus élevée, indiquée par une couleur bleue plus intense, par rapport aux échafaudages à graines cellulaires cultivés en milieu non différencié (« ND »). Pour la coloration ARS, les échafaudages vierges et les échafaudages cultivés en milieu de non-différenciation (« ND ») présentaient une nuance de rouge plus claire par rapport aux échafaudages cultivés en milieu de différenciation (« D »). La présence de dépôts de calcium dans les échafaudages cultivés en milieu de différenciation (« D ») a été illustrée par une couleur rouge foncé intense. Chaque analyse a été effectuée sur trois échafaudages différents (n = 3). Cette figure a été adaptée avec la permission de Leblanc Latour (2023)27. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Analyse histologie, microscopie électronique à balayage (MEB) et spectroscopie à dispersion d’énergie (EDS) d’échafaudages in vitro. (A) Images représentatives des coupes histologiques supérieures des échafaudages. Les échafaudages enrobés de paraffine ont été découpés en sections de 5 μm d’épaisseur qui ont été colorées avec de l’hématoxyline et de l’éosine (H&E) pour visualiser l’infiltration cellulaire, ou avec von Kossa (VK) pour visualiser la minéralisation à l’intérieur des échafaudages. Les échafaudages étaient infiltrés avec des cellules MC3T3-E1, comme le montrent les colorations bleues (noyaux) et roses (cytoplasme) visibles à la périphérie et dans tout l’échafaudage. Du collagène (rose pâle) était également visible (encart agrandi de « H&E - D »). La minéralisation n’a été observée qu’à la périphérie des parois poreuses dans les échafaudages cultivés en milieu de non-différenciation (« ND »). Les parois des pores des échafaudages cultivés en milieu de différenciation (« D ») étaient entièrement teintées de noir. L’analyse a été effectuée sur un échafaudage cultivé dans un milieu de non-différenciation (« ND ») et sur deux échafaudages cultivés dans un milieu de différenciation (« D ») (barre d’échelle pour les images à faible grossissement = 1 mm, barre d’échelle pour les images à fort grossissement = 50 μm). (B) Micrographies représentatives obtenues par MEB ainsi que des spectres EDS. Les échafaudages ont été recouverts d’or par pulvérisation cathodique et ont été imagés à l’aide d’un microscope électronique à balayage à émission de champ à une tension de 3,0 kV (barre d’échelle = 100 μm - s’applique à tous). Des spectres EDS ont été acquis sur chaque échafaudage. Les pics de phosphore (2,013 keV) et de calcium (3,69 keV) sont indiqués sur chaque spectre EDS. Le MEB et l’EDS ont été réalisés sur trois échafaudages différents. Vide : échafaudages sans cellules ensemencées. Cette figure a été adaptée avec la permission de Leblanc Latour (2023)27. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Modules de Young des échafaudages in vitro après 4 semaines de culture en milieu de non-différenciation (ND) ou en milieu de différenciation (D). Les données sont présentées sous forme de moyenne ±'erreur-type de la moyenne (MEB) de trois échantillons répétés pour chaque condition. La signification statistique (* indique p<0,05) a été déterminée à l’aide d’une analyse de variance à un facteur (ANOVA) et du test post-hoc de Tukey. Vide : échafaudages sans cellules ensemencées. Cette figure a été adaptée avec la permission de Leblanc Latour (2023)27. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Photographie de l’échafaudage avant l’implantation et test de poussée après 8 semaines d’implantation : (A) Photographie représentative d’un échafaudage avant l’implantation ; (B) Dispositif de compression uniaxiale utilisé pour les essais de poussée, avec le capteur de pesage indiqué par un astérisque (*) et l’échantillon indiqué par une flèche. Cette figure a été adaptée avec la permission de Leblanc Latour (2023)27. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Analyse histologique d’échafaudages in vitro. Images représentatives de coupes histologiques d’échafaudages non ensemencés après 8 semaines d’implantation. Les coupes ont été colorées soit avec de l’hématoxyline et de l’éosine (H&E) pour visualiser les cellules, soit avec du trichrome de Masson-Goldner (MGT) pour visualiser le collagène. La flèche indique les globules rouges. La présence de collagène est visible (barre d’échelle = 1 mm et 200 μm pour les inserts gauche et droit, respectivement). Cette figure a été adaptée avec la permission de Leblanc Latour (2023)27. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Force de crête mesurée à partir d’essais de poussée.

Figure supplémentaire 1 : Courbe contrainte-déformation typique pour le calcul du module de Young. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Déclaration de conflit d’intérêts : M.L.L., M.T., R.J.H., C.M.C., I.C. et A.P. sont des inventeurs dans le cadre de demandes de brevet déposées par l’Université d’Ottawa et Spiderwort Inc. concernant l’utilisation de cellulose d’origine végétale pour les demandes de contours d’alliance. M.L.L., R.J.H., C.M.C. et A.P. ont des intérêts financiers dans Spiderwort Inc.