Implant d’entraînement léger pour enregistrements de tétrodes chroniques chez des souris juvéniles

Le cerveau subit des changements à grande échelle au cours des fenêtres de développement critiques de l’enfance et de l’adolescence ^1,2,3. De nombreuses maladies neurologiques et psychiatriques, y compris l’autisme et la schizophrénie, se manifestent d’abord comportementalement et biologiquement au cours de cette période de développement du cerveau juvénile et adolescent ^4,5,6. Bien que l’on en sache beaucoup sur les changements cellulaires, synaptiques et génétiques qui se produisent au début du développement, on en sait relativement peu sur la façon dont les processus au niveau du circuit ou du réseau changent tout au long de cette fenêtre temporelle. Il est important de noter que la fonction cérébrale au niveau du circuit, qui sous-tend finalement les comportements complexes, la mémoire et la cognition, est une propriété émergente non prévisible de la fonction cellulaire et synaptique 7,8,9,10. Ainsi, pour bien comprendre le fonctionnement cérébral au niveau du réseau, il est nécessaire d’étudier directement l’activité neuronale au niveau d’un circuit neuronal intact. En outre, pour identifier comment l’activité cérébrale est modifiée tout au long de la progression des troubles neuropsychiatriques, il est essentiel d’examiner l’activité du réseau dans un modèle de maladie valide pendant la fenêtre temporelle spécifique lorsque les phénotypes comportementaux de la maladie se manifestent et de suivre les changements observés à mesure qu’ils persistent à l’âge adulte.

L’un des organismes modèles scientifiques les plus courants et les plus puissants est la souris, avec un grand nombre de souches génétiques uniques qui modélisent les troubles neurodéveloppementaux avec l’apparition en fonction de l’âge des phénotypes comportementaux et / ou mnémoniques 11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 . Bien qu’il soit difficile de corréler des points de temps de développement précis entre les cerveaux des humains et des souris, les comparaisons morphologiques et comportementales indiquent que les souris p20-p21 représentent les âges humains de 2-3 ans, et les souris p25-p35 représentent les âges humains de 11-14 ans, les souris atteignant probablement l’équivalent de développement d’un adulte humain de 20 ans par p60^{3, 22}. Ainsi, pour mieux comprendre comment le cerveau juvénile se développe et identifier comment les réseaux neuronaux du cerveau deviennent dysfonctionnels dans des maladies comme l’autisme ou la schizophrénie, il serait idéal de surveiller directement l’activité cérébrale in vivo chez des souris âgées de 20 jours à 60 jours.

Cependant, un défi fondamental dans la surveillance de l’activité cérébrale tout au long du développement précoce chez la souris est la petite taille et la faiblesse relative des souris juvéniles. L’implantation chronique d’électrodes, qui est nécessaire pour les études longitudinales du développement du cerveau, nécessite généralement un boîtier volumineux et encombrant pour protéger les fils d’électrodes fins et les cartes d’interface^23,24, et les implants doivent être fermement attachés au crâne de souris^, qui est plus mince et moins rigide chez les jeunes souris en raison de l’ossification réduite. Ainsi, pratiquement toutes les études sur la physiologie in vivo des rongeurs ont été réalisées chez des sujets adultes en raison de leur taille relative, de leur force et de l’épaisseur du crâne. À ce jour, la plupart des études explorant la physiologie in vivo du cerveau des rongeurs juvéniles ont été réalisées sur des rats juvéniles de type sauvage, ce qui limite nécessairement la capacité de surveiller expérimentalement la fonction cérébrale juvénile dans un modèle de comportement libre d’un trouble humain 25,26,27,28,29,30.

Ce manuscrit décrit un nouveau boîtier implantaire, une procédure d’implantation chirurgicale et une stratégie de récupération post-chirurgicale pour étudier de manière chronique la fonction cérébrale in vivo à long terme (jusqu’à 4 semaines ou plus) de souris juvéniles sur une fenêtre temporelle critique pour le développement (p20 à p60 et au-delà). La procédure d’implantation permet l’apposition fiable et permanente des électrodes sur le crâne de souris juvéniles. De plus, la conception du micro-entraînement est légère, car ce micro-entraînement pèse ~ 4-6 g lorsqu’il est complètement assemblé, et en raison du contrepoids minimal requis pour compenser le poids de l’implant, il n’a pas d’impact sur les performances comportementales des souris juvéniles au cours des paradigmes comportementaux typiques.

La présente étude a été approuvée par le comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux du Southwestern Medical Center de l’Université du Texas (protocole 2015-100867) et réalisée conformément aux directives institutionnelles et du National Institute of Health. Les souris mâles et femelles C57/Bl6 utilisées dans la présente étude ont été implantées à p20 (poids 8,3-11,1 g au moment de l’implantation).

1. Conception et construction de micro-entraînements

1. Conception et impression numériques du micro-entraînement (Figure 1)
   1. Téléchargez les modèles de modèles de micro-entraînements (https://github.com/Brad-E-Pfeiffer/JuvenileMouseMicroDrive).
   2. Identifier les emplacements stéréotaxiques de la ou des régions cérébrales cibles dans un atlas stéréotaxique approprié.
   3. À l’aide d’un logiciel de conception assistée par ordinateur (CAO 3D) en trois dimensions, chargez la canule du micro-entraînement modèle (Figure 1B).
   4. Si nécessaire, modifiez les emplacements de sortie des canules sur le modèle de canule micro-entraînement pour cibler la ou les régions cérébrales souhaitées.
      NOTE: Chaque extrusion de trou de canule doit avoir une longueur d’au moins 2 mm pour s’assurer que la tétrode sortira du trou de la canule visant directement la cible. Le modèle de canule micro-entraînement est conçu pour cibler bilatéralement le cortex cingulaire antérieur (une tétrode par hémisphère), la zone hippocampique CA1 (quatre tétrodes par hémisphère) et la zone hippocampique CA3 (deux tétrodes par hémisphère), avec une tétrode de référence par hémisphère positionnée dans la substance blanche au-dessus de la zone de l’hippocampe CA1.
   5. Si nécessaire, modifier le corps du micro-entraînement (Figure 1A) pour l’adapter à la fixation de la carte d’interface électronique (BEI).
   6. Imprimez le corps du micro-entraînement, la canule, le cône et le couvercle à haute résolution sur une imprimante 3D (idéalement avec une résolution supérieure à 25 μm) et préparez les documents imprimés conformément aux protocoles du fabricant. Utilisez des résines d’imprimante à haute rigidité.
2. Assemblage des vis et accessoires personnalisés (Figure 2A, B)
   1. À l’aide d’un logiciel de CAO 3D, chargez les modèles de fixation à vis (Figure 1E).
   2. Imprimez les accessoires à vis en haute résolution sur une imprimante 3D (idéalement avec une résolution d’au moins 25 μm) et préparez les documents imprimés selon les protocoles du fabricant. Utilisez des résines d’imprimante à haute rigidité.
   3. Fixez les attaches de vis à chaque vis d’avancement de tétrode (figure 1F) (les vis d’avancement de tétrode sont fabriquées sur mesure dans un atelier d’usinage avant la construction du microentraînement).
      1. Fixez deux fixations à vis sur chaque vis, l’une au-dessus et l’autre au-dessous de la crête. Assurez-vous que le bas de chaque fixation de vis entre en contact avec la crête. Tenez les attaches à vis ensemble avec du cyanoacrylate de gel.
      2. Une fois fixées, assurez-vous que les attaches à vis ne bougent pas dans l’axe longitudinal de la vis mais tournent librement avec une résistance minimale.
3. Assemblage du corps du micro-entraînement (Figure 2C, D)
   1. À l’aide de ciseaux fins et tranchants, couper les grands tubes en polyimide (diamètre extérieur: 0,2921 mm, diamètre intérieur: 0,1803 mm) en sections de ~6 cm de long.
   2. Passez les grandes sections de polyimide à travers les trous de sortie de la canule micro-entraînement de sorte que chaque tube s’étende de quelques millimètres au-delà du fond de la canule.
   3. À l’aide d’une aiguille propre de 30 G, fixer le polyimide à la canule en appliquant de petites quantités de cyanoacrylate liquide. Veillez à ne pas laisser le cyanoacrylate pénétrer à l’intérieur du tube en polyimide.
      REMARQUE: L’égouttement de cyanoacrylate liquide dans la canule par le haut du corps d’entraînement peut accélérer ce processus, mais nécessitera un nouveau dégagement des trous de guidage plus tard avec une perceuse à pointe fine.
   4. Passez les grands tubes en polyimide du haut de la canule du micro-entraînement à travers les grands trous de polyimide appropriés dans le corps du micro-entraînement.
   5. Poussez lentement la canule du micro-entraînement et le corps du micro-entraînement ensemble jusqu’à ce qu’ils soient adjacents et que les languettes de fixation de la canule/du corps s’emboîtent. Veillez à ne pas plier ou endommager les tubes en polyimide dans le processus.
      REMARQUE: Chaque tube en polyimide doit passer en douceur du bas de la canule vers le haut du corps du micro-entraînement. Une légère flexion est normale, mais une flexion excessive du tube en polyimide peut déformer la tétrode et l’empêcher de passer directement dans le cerveau.
   6. Fixez ensemble le corps du micro-entraînement et la canule du micro-entraînement à l’aide de cyanoacrylate.
   7. À l’aide d’une nouvelle lame de rasoir tranchante, coupez les grandes extrémités du tube en polyimide qui extrudent du fond des trous de sortie de la canule. Assurez-vous que la coupe est exactement à la base de la canule, en faisant affleurer les tubes et le fond de la canule l’un avec l’autre.
   8. À l’aide de ciseaux tranchants, coupez le grand tube en polyimide juste au-dessus du bord du bord intérieur du corps d’entraînement à un angle de ~45°.
4. Chargement des vis personnalisées assemblées (Figure 2E)
   1. Vissez chaque vis personnalisée assemblée dans les trous extérieurs du corps du micro-entraînement. Assurez-vous que le poteau de guidage à vis passe à travers le grand trou dans les attaches à vis. Faites avancer chaque vis complètement jusqu’à ce qu’elle n’avance plus loin. Il est recommandé de prélubrifier les vis avec de l’huile minérale ou de la graisse d’essieu.
   2. À l’aide de ciseaux extrêmement tranchants, coupez de petits tubes en polyimide (diamètre extérieur: 0,1397 mm, diamètre intérieur: 0,1016) en sections de ~4 cm de long.
   3. Passez les petites sections de polyimide à travers le grand tube en polyimide déjà monté dans le micro-entraînement. Assurez-vous que l’excès de petits tubes en polyimide dépasse du haut et du bas de chaque grand tube en polyimide.
   4. Fixez les petits tubes en polyimide aux attaches à vis via du cyanoacrylate, en prenant soin de ne laisser aucun cyanoacrylate pénétrer dans les grands ou les petits tubes en polyimide.
   5. À l’aide d’une nouvelle lame de rasoir tranchante, coupez les petites extrémités du tube en polyimide qui extrudent du fond des trous de canule. Assurez-vous que la coupe est exactement à la base de la canule et que la coupe est propre, sans que rien ne bloque le trou du tube en polyimide.
   6. À l’aide de ciseaux tranchants, coupez le haut du petit polyimide à quelques millimètres au-dessus du haut de la fixation de vis à un angle de ~45°. Assurez-vous que la coupe est propre, sans que rien ne bloque le trou du tube en polyimide.
5. Chargement des tétrodes
   1. Préparer les tétrodes (~6 cm de longueur) en utilisant les méthodes décrites précédemment³¹.
   2. À l’aide de pinces à embout en céramique ou en caoutchouc, passez soigneusement une tétrode à travers l’un des petits tubes en polyimide, en laissant ~2 cm dépasser du haut du petit tube en polyimide.
   3. Fixez la tétrode sur le dessus du petit tube en polyimide via du cyanoacrylate liquide, en prenant soin de ne pas fixer les petits et grands tubes en polyimide ensemble dans le processus.
   4. Rétractez la vis jusqu’à ce qu’elle soit près du haut du lecteur.
   5. Saisissez le fil tétrode qui dépasse du bas du lecteur et pliez-le doucement à l’endroit où il émerge de la canule.
   6. Replacez complètement la vis dans le lecteur.
   7. À l’aide de ciseaux très tranchants, coupez le fil tétrode juste au-dessus du pli. Au microscope, assurez-vous que la coupure est propre et que le métal des quatre tétrodes est exposé.
   8. Rétractez la vis jusqu’à ce que la tétrode soit juste fixée dans la canule.
   9. Répétez les étapes 1.5.2 à 1.5.8 pour toutes les vis.
   10. Fixez la BEI à la plate-forme de soutien de la BEI au moyen de petites vis à bijoux.
   11. Connectez chaque électrode de chaque tétrode au port approprié de la BEI.
6. Préparer le micro-entraînement pour la chirurgie
   1. Plaquer électriquement les tétrodes pour réduire l’impédance électrique en utilisant les méthodes décrites précédemment³¹.
   2. Après le placage, assurez-vous que chaque tétrode est logée dans la canule de telle sorte que l’extrémité de la tétrode affleure le fond de chaque trou de canule.
   3. Faites glisser le cône du micro-entraînement autour du micro-drive terminé. Fixez le couvercle du micro-entraînement au cône du micro-entraînement en faisant glisser le pôle de fixation du cône dans le port du couvercle.
   4. Orientez le cône de manière à ce que les connecteurs EIB passent librement à travers les trous de passage de la connexion EIB lorsque le couvercle est fermé, et collez le cône en place avec du cyanoacrylate placé autour de la base du cône, en prenant soin de ne laisser aucun cyanoacrylate pénétrer dans l’un des trous de sortie de la canule. Retirez le couvercle.
   5. Remplissez soigneusement chaque trou de canule avec de l’huile minérale stérile pour empêcher les fluides corporels de pénétrer dans les trous de polyimide après l’implantation chirurgicale.
   6. Enduisez soigneusement la base de la canule de vaseline stérile. Cela servira de barrière pour empêcher les agents chimiques (par exemple, le ciment dentaire) de pénétrer dans le cerveau exposé pendant la chirurgie.
   7. Pesez le micro-entraînement, le couvercle et les quatre vis osseuses entièrement assemblés pour préparer un contrepoids de poids égal.
   8. En option, avant la chirurgie, extrudez les tétrodes à une distance appropriée pour atteindre les régions cérébrales cibles une fois que le lecteur est au ras du crâne.
      REMARQUE: Avant l’implantation chirurgicale, stérilisez l’implant par stérilisation au gaz dans de l’oxyde d’éthylène (500-1200 mg / L, 2-4 heures).  Toutes les vis osseuses et les instruments chirurgicaux doivent être stérilisés par autoclave (121°C, 30 minutes).

2. Implantation chirurgicale

1. Anesthésier la souris et la monter dans l’appareil stéréotaxique
   1. Placez la souris dans une petite boîte avec suffisamment d’espace pour bouger et anesthésiez la souris avec 3% -4% d’isoflurane.
      REMARQUE: D’autres agents anesthésiques peuvent être utilisés, mais la prudence doit être utilisée en raison de l’âge, de la taille et du poids de la souris juvénile.
   2. Une fois que la souris ne répond pas (pas de réponse au pincement de la queue, un taux de ventilation de ~60 respirations par minute), retirez-la de la boîte et montez-la rapidement sur l’appareil stéréotaxique.
   3. Rapidement, placez le masque stéréotaxique sur le museau de la souris et maintenez l’anesthésie à 1-3% d’isoflurane. Appliquez tout soulagement de la douleur approuvé par un vétérinaire, tel que la buprénorphine à libération prolongée (0,05-0,5 mg / kg sous-cutané), ou des agents anti-inflammatoires, tels que le carprofène (5-10 mg / kg sous-cutané), avant l’incision chirurgicale initiale.
   4. Fixez complètement la tête de la souris dans l’appareil stéréotaxique à l’aide de barres d’oreille. Assurez-vous que le crâne est plat et immobile sans exercer de pression inutile sur les conduits auditifs de la souris. En raison de l’ossification limitée des os du crâne juvénile, il est possible de causer des dommages permanents lors de la fixation de la tête.
2. Préparer la souris à la chirurgie et exposer le crâne
   1. Protégez les yeux de la souris en plaçant un petit volume de gel lacrymal synthétique sur chaque œil et en couvrant chaque œil avec une plaque de papier d’aluminium autoclavée.
      REMARQUE: Les larmes synthétiques garderont les yeux humides, tandis que la feuille empêchera toute source de lumière de causer des dommages à long terme. Les solutions de larmes synthétiques plus épaisses sont préférées car elles peuvent également servir de barrière à l’introduction accidentelle d’autres solutions chirurgicales potentiellement toxiques (éthanol, acrylique dentaire, etc.) dans les yeux.
   2. À l’aide d’écouvillons stériles à pointe de coton, appliquez de la crème dépilatoire sur la zone chirurgicale pour enlever les poils du cuir chevelu. Veillez à ne pas mettre la crème près des yeux. Après avoir enlevé les cheveux, placez un champ stérile sur le cuir chevelu pour sécuriser la zone chirurgicale.
   3. À l’aide d’écouvillons stériles à embout de coton, nettoyer le cuir chevelu en lavant trois lavages consécutifs de solution de povidone iodée (10 %) suivie d’alcool isopropylique (100 %).
   4. À l’aide d’un scalpel stérile ou de ciseaux fins, retirez le cuir chevelu.
   5. À l’aide d’écouvillons stériles à pointe de coton et de solutions stériles de solution saline (0,9% de NaCl) et de peroxyde d’hydrogène, nettoyez soigneusement le crâne.
   6. Identifiez le bregma et, à l’aide de l’appareil stéréotaxique, marquez soigneusement les emplacements d’enregistrement de la cible sur le crâne avec un marqueur permanent.
3. Ouverture du trou de la canule et fixation des ancrages osseux
   1. Retirez le crâne recouvrant les sites d’enregistrement. # En raison de la minceur du crâne à cet âge, coupez le crâne avec une lame de scalpel; Cela élimine la nécessité d’utiliser une perceuse, ce qui peut endommager la dura sous-jacente. Gardez la dure-mère exposée humide avec l’application d’une solution saline stérile (0,9% NaCl) ou d’huile minérale stérile. Ne retirez pas ou ne percez pas la dure-mère à ce stade, car elle est suffisamment mince chez les souris juvéniles pour que les tétrodes puissent passer dans les étapes futures.
   2. Percez soigneusement les trous pilotes pour quatre vis à os.
      1. Placez les vis osseuses dans les parties latérales extrêmes et rostrales ou caudales du crâne, là où l’os est le plus épais et les vis osseuses suffisamment éloignées de l’implant micro-entraînement. Pour les vis à os, utilisez des vis stériles pour bijoux fins (p. ex., filetage UNM 120, tête de 1,5 mm).
      2. Enrouler hermétiquement une vis osseuse avec un fil mince et hautement conducteur qui servira de terre et sera fixé à la BEI à l’étape 2.4.6.
   3. À l’aide d’une lame de scalpel ou d’un foret avec précaution, marquez le crâne près des emplacements des trous de vis en os. La notation est importante pour fournir une surface suffisamment rugueuse pour que le cyanoacrylate liquide puisse se lier à l’étape 2.3.5.
   4. À l’aide d’un tournevis stérile et d’une pince à vis stérile, enfilez chaque vis à os stérile en place, en prenant soin de ne pas percer la dure-mère sous-jacente.
   5. À l’aide d’une aiguille stérile de 30 G, placer du cyanoacrylate liquide autour de chaque vis osseuse. Cela épaissit efficacement le crâne où les vis osseuses ont été fixées. Veillez à ne laisser aucun cyanoacrylate pénétrer dans la dure-mère exposée au-dessus des sites d’enregistrement.
4. Abaissement et fixation du micro-entraînement (Figure 2G)
   1. Montez le micro-entraînement terminé sur l’appareil stéréotaxique pour être soigneusement abaissé sur le crâne de la souris. Assurez-vous que la canule du micro-entraînement sera aux coordonnées appropriées lorsqu’elle sera abaissée.
   2. Abaissez lentement le micro-entraînement, en ne vous déplaçant que dans la direction dorsale / ventrale. Abaisser le micro-entraînement avec les tétrodes déjà avancées hors des trous de canule (étape 1.6.6) afin de visualiser leur entrée dans le cerveau; Tout mouvement médian / latéral ou rostral / caudale lorsque les tétrodes touchent la souris peut plier les tétrodes et leur faire manquer leur destination finale.
   3. Une fois le micro-entraînement complètement abaissé, assurez-vous que la base de la canule entre en contact avec le crâne / la dure-mère. La couche de vaseline et/ou d’huile minérale servira de barrière pour couvrir la dure-mère exposée. Si nécessaire, ajoutez de la vaseline stérile ou de la cire d’os stérile pour couvrir l’excès de dure-mère exposée.
   4. Tout en maintenant le micro-entraînement en place avec l’appareil stéréotaxique, enduisez le crâne de ciment dentaire pour fixer la base du micro-entraînement aux vis osseuses implantées.
      REMARQUE: Le ciment dentaire doit envelopper entièrement toutes les vis osseuses et doit couvrir le rebord d’ancrage du ciment dentaire sur la canule du micro-entraînement.
   5. Pendant que le ciment dentaire durcit, façonnez-le soigneusement pour éviter les angles vifs ou les bords qui pourraient endommager la souris ou endommager le micro-entraînement. Assurez-vous qu’il y a suffisamment de ciment dentaire pour maintenir le micro-entraînement, mais éliminez l’excès de ciment dentaire qui ajoutera un poids inutile.
   6. Enfilez soigneusement le fil de terre à travers le micro-entraînement et fixez-le à la fente appropriée de la BEI.
   7. Une fois que le ciment dentaire est complètement pris, détachez soigneusement le micro-entraînement de l’appareil stéréotaxique. Placez le couvercle sur le micro-entraînement.
   8. Avec un écouvillon stérile à pointe de coton et une solution saline stérile, nettoyez la souris.
   9. Avec un écouvillon stérile à pointe de coton, appliquez une fine couche de pommade antibiotique sur tout cuir chevelu exposé près du site de l’implant.
   10. Retirez la feuille d’aluminium des yeux de la souris.
   11. Retirez la souris de l’appareil stéréotaxique en prenant soin de supporter le poids supplémentaire du micro-entraînement pendant que la souris est transportée dans une cage propre.

3. Récupération post-opératoire

1. Récupération immédiate
   1. Avant la chirurgie, préparez le système de contrepoids en raccordant un tuyau en PVC de 0,75 de diamètre, comme illustré à la figure 2G. Un bras du système passe à travers des trous percés dans le couvercle de la cage, le deuxième bras repose sur le couvercle de la cage et le troisième bras s’étend au-dessus et au-delà de la cage. Le bras le plus haut est coiffé.
   2. Fixez délicatement le microentraînement au système de contrepoids (Figure 2G-I) et utilisez un poids de contrepoids identique au poids du microentraînement et des vis osseuses. Faites passer un fil solide ou une ligne de pêche à partir d’un connecteur fixé à la BEI sur les trois bras du système de contrepoids jusqu’au poids de contrepoids, qui pend au-dessus du bras supérieur.
   3. Assurez-vous que le contrepoids est fortement connecté au micro-entraînement EIB et qu’il y a suffisamment de ligne pour donner à la souris un accès complet à l’intégralité du boîtier.
   4. Fournir un gel riche en nutriments dans la cage aux côtés d’un chow de rongeur normal humidifié pour assurer la réhydratation et la récupération.
   5. Surveillez la souris jusqu’à ce qu’elle se rétablisse complètement de l’anesthésie chirurgicale.
2. Reprise à long terme
   1. À tout moment, lorsqu’il n’est pas fixé à l’appareil de contrôle, assurez-vous que le micro-entraînement est pris en charge par le système de contrepoids. Réduisez le contrepoids au fil du temps, mais ne le retirez jamais complètement pour éviter un stress imprévu à la souris ou un couple aux vis osseuses.
   2. Pour éviter d’endommager l’implant et le système de contrepoids, logez la souris sans possibilité d’interaction directe avec d’autres souris pendant toute la durée de l’expérience.
   3. Fournir un gel riche en nutriments pendant au moins 3 jours après la chirurgie, après quoi les aliments solides seuls seront suffisants.
      1. En raison des exigences en matière de frais généraux du système de contrepoids, ne fournissez pas de nourriture et d’eau dans un treillis métallique aérien; Placez la nourriture sur le sol de la cage et fournissez de l’eau par le côté de la cage. Pour éviter la détérioration, remplacez les aliments entièrement tous les jours.
   4. Au quotidien, assurez-vous que la souris a libre accès à l’intégralité de la cage et que le contrepoids est solidement et fortement attaché au micro-entraînement.

Le protocole décrit ci-dessus a été utilisé pour enregistrer simultanément des signaux potentiels de champ local et des unités uniques de plusieurs zones du cerveau chez la souris, avec des enregistrements quotidiens effectués chez les mêmes souris de p20 à p60. Sont rapportés ici des enregistrements électrophysiologiques représentatifs de deux souris et une histologie post-expérience démontrant les emplacements d’enregistrement finaux.

Implantation chirurgicale du micro-drive chez des souris p20
Un micro-entraînement (Figure 1) a été construit (Figure 2) et implanté chirurgicalement dans une souris p20, comme décrit ci-dessus. Immédiatement après l’opération, la souris a été attachée au système de contrepoids (Figure 2G-I) et laissée récupérer. Une fois la souris complètement mobile, le micro-entraînement a été branché sur un système d’enregistrement électrophysiologique in vivo. Les câbles reliant le micro-entraînement à l’appareil d’enregistrement étaient suspendus au-dessus de la souris. Des enregistrements électrophysiologiques (32 kHz) ont été obtenus sur tous les canaux pendant 1 h pendant que la souris se comportait naturellement dans sa cage d’origine. Après l’enregistrement, la souris a été débranchée du système d’enregistrement, rattachée au système de contrepoids et renvoyée au vivarium avec un accès gratuit à l’eau et au chow.

Enregistrement quotidien de l’activité neuronale
Des enregistrements électrophysiologiques ont été obtenus quotidiennement pendant plusieurs semaines pour permettre la surveillance chronique de la même région du cerveau à travers les fenêtres de développement critiques de p20-p60. Les échantillons bruts de potentiels locaux (LFP) provenant des enregistrements chroniques sont présentés à la figure 3A,C. Des unités individuelles isolées ont été obtenues simultanément à partir de plusieurs tétrodes (figure 3B). Des unités avec des formes d’onde similaires ont été identifiées sur plusieurs jours (figure 3B, milieu et droite), mais en raison de la dérive potentielle de l’électrode d’enregistrement, il n’a pas été possible d’affirmer avec certitude que la même unité était identifiée sur plusieurs jours. Chez une souris séparée implantée à p20 et enregistrée quotidiennement pendant plusieurs semaines, l’activité neuronale a été examinée sur une tétrode ciblant la région dorsale CA1. Des ondulations de grande amplitude et des unités individuelles bien isolées ont été identifiées chaque jour de l’enregistrement (figure 4). Ces données indiquent que des enregistrements électrophysiologiques in vivo stables et de haute qualité pourraient provenir de la même souris au début du développement.

Confirmation histologique des sites d’enregistrement et de l’impact sur le développement de l’implantation chronique
Après la dernière journée d’enregistrement, la souris a été soigneusement anesthésiée par anesthésie à l’isoflurane suivie d’une injection létale de pentobarbital sodique, et un courant a été passé à travers les extrémités des électrodes pour produire de petites lésions aux sites d’enregistrement. La coupe histologique post-expérience du cerveau de la souris a permis de visualiser les sites d’enregistrement finaux (Figure 5A,B). Dans une cohorte distincte, trois souris mâles et trois souris femelles ont été implantées chirurgicalement à p20 comme décrit ci-dessus. Un nombre égal de compagnons de portée ont été laissés non implantés et maintenus dans des conditions de logement identiques. Les souris ont été sacrifiées à p62 (6 semaines après la chirurgie pour la cohorte implantée). Les crânes ont été soigneusement nettoyés et des mesures externes ont été prises de la distance bregma-lambda (Figure 5C, en haut à gauche) et de la largeur maximale externe du crâne au lambda (Figure 5C, en haut à droite). Une incision a été faite le long de la ligne médiane du crâne, et la moitié du crâne a été retirée pour exciser le cerveau pour la mesure de la masse (Figure 5C, en bas à droite). La hauteur de la cavité crânienne au niveau du bregma a été mesurée à partir de la moitié du crâne intacte (Figure 5C, en bas à gauche). Aucune mesure n’était significativement différente entre les cohortes implantées et non implantées (test de somme de rang de Wilcoxon), indiquant que l’implantation à long terme, à partir de p20, n’a pas d’impact brut sur le développement naturel du crâne ou du volume cérébral.

Figure 1 : Composants des micro-entraînements. Rendus tridimensionnels du (A) corps du micro-entraînement, (B) canule, (C) cône, (D) couvercle, (E) attaches à vis et (F) vis avançant la tétrode. Les caractéristiques critiques de chaque composant sont indiquées. Les détails de mesure peuvent être extraits des fichiers de modèles disponibles à https://github.com/Brad-E-Pfeiffer/JuvenileMouseMicroDrive/. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Construction des microentraînements. (A) Vue latérale et (B) vue supérieure de la vis d’avancement de la tétrode avec les attaches de vis supérieure et inférieure connectées. (C) Vue latérale et (D) vue de dessus du microentraînement avec le corps et la canule attachés et le grand tube en polyimide traversant chaque trou de canule et fixé au fond de la canule. (E) Vue latérale du micro-entraînement avec les vis et le petit tube en polyimide en place. Le dessus des petits tubes en polyimide est coupé immédiatement avant le chargement des tétrodes. (F) Micro-entraînement complet fixé à l’appareil stéréotaxique. Le cône de protection qui entourerait normalement le micro-entraînement a été retiré à des fins de visualisation. Notez que certains des accessoires à vis ont été imprimés dans une résine noire pour ce micro-entraînement. G) Système de soutien à contrepoids. (H) Vue latérale et (I) de dessus d’une cage à souris avec le système de support de contrepoids attaché. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Enregistrements électrophysiologiques représentatifs. Une souris p20 a été implantée avec un micro-entraînement comme décrit ci-dessus. À partir de p21 et tous les jours par la suite pendant 2 semaines, la souris a été attachée à l’appareil d’enregistrement et l’activité neuronale a été enregistrée pendant au moins 1 h. (A) Enregistrements bruts du potentiel de champ local (LFP) du bilatéral (L = gauche; R = droite) cortex cingulaire antérieur (ACC), aire hippocampique CA3 (CA3) et aire hippocampique CA1 (CA1). Les données étaient recueillies tous les jours; Pour plus de clarté, seules les données des jours impairs sont affichées. Toutes les traces ont été prises pendant les périodes d’immobilité dans la cage familiale. Barre d’échelle: 1 mV, 2 s. (B) Unités individuelles représentatives isolées de la zone de l’hippocampe CA3 (à gauche) et CA1 (à droite) pour les enregistrements du panneau A. Toutes les formes d’onde brutes sur chaque électrode sont montrées en noir; La moyenne est en rouge. Barre d’échelle: 50 μV, 0,2 ms. (C) Traces LFP brutes représentatives tous les 10 jours jusqu’au dernier jour d’enregistrement à p60 pour une deuxième souris implantée à p20. Les données étaient recueillies tous les jours; Pour plus de clarté, seules les données de tous les 10 jours sont affichées. Toutes les traces ont été prises pendant les périodes d’immobilité dans la cage domestique. Barre d’échelle: 1 mV, 2 s. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Graphique 4. Stabilité des enregistrements chroniques. Une souris p20 a été implantée avec un micro-entraînement, comme décrit ci-dessus. À partir de p21 et ensuite pendant 4 semaines, la souris a été attachée à l’appareil d’enregistrement et l’activité neuronale a été enregistrée pendant au moins 1 h. Les données des tétrodes ciblant l’hippocampe dorsal CA1 sont présentées. (A) LFP brut (en haut) et filtré par ondulation (en bas) pour les événements d’ondulation identifiés à p21, p30 et p40. Pour identifier les événements d’ondulation, le LFP brut a été filtré passe-bande entre 125 Hz et 300 Hz, et les événements d’ondulation ont été identifiés comme des augmentations transitoires de la puissance de la bande d’ondulation supérieures à 3 écarts-types au-dessus de la moyenne. Le début et la fin de chaque ondulation ont été définis comme le point où la puissance de la bande d’ondulation est revenue à la moyenne. Les ondulations identifiées sont indiquées en rouge. Barre d’échelle : 100 ms, de haut en bas : 1 000 μV, 140 μV, 1 800 μV, 180 μV, 9 000 μV, 1 200 μV, 10 000 μV, 1 000 μV. (B) Une unité unique représentative de chaque jour à partir de la tétrode ciblée CA1 pour les enregistrements dans le panneau A. Toutes les formes d’onde brutes sur chaque électrode sont montrées en noir; La moyenne est en rouge. Barre d’échelle 0,2 ms, de haut en bas: 50 μV, 100 μV, 100 μV. (C) Autocorrelogramme de toutes les pointes pour les unités individuelles du panneau B. Ces données démontrent un placement stable des électrodes dans la couche pyramidale de l’hippocampe sur plusieurs semaines. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Histologie représentative et impact sur le développement du crâne. Une souris p20 a été implantée avec un micro-entraînement, comme décrit ci-dessus. Après la dernière journée d’enregistrement sur p60, des lésions électrolytiques ont été produites sur les sites d’enregistrement et le cerveau a été perfusé avec 4% de paraformaldéhyde. Pour identifier les sites d’enregistrement, des sections de 50 μm ont été produites. (A) Lésions dans CA1 et CA3 de l’hippocampe. La pointe de flèche indique le site d’enregistrement CA3; la double flèche indique le site d’enregistrement CA1. Barre d’échelle: 0,5 mm. (B) Lésions dans le CCA bilatéral. Les pointes de flèches indiquent les sites d’enregistrement ACC. Barre d’échelle: 0,5 mm. (C) Mesures de la taille du crâne et de la masse cérébrale de souris p62 implantées avec un micro-entraînement à p20 (gris) et de compagnons de portée non implantés (blanc). La valeur p du test de somme de rang de Wilcoxon est indiquée pour chaque mesure. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Les auteurs n’ont rien à divulguer.