Optimisation des paramètres de performance du test de longueur des télomères TAGGG

Les télomères sont les séquences d’ADN répétitives présentes à l’extrémité des chromosomes. Ils ont des répétitions en tandem de TTAGGG et maintiennent l’intégrité du génome en protégeant le chromosome à la fois de l’effilochage et du problème de réplication finale, ce qui signifie qu’une partie du surplomb 3' est incapable d’être répliquée par l’ADN polymérase ^1,2. Les télomères courts entraînent des anomalies chromosomiques dans les cellules, en raison desquelles les cellules sont arrêtées de façon permanente dans un stade appelé sénescence^{réplicative 3}. Les télomères courts causent également une foule d’autres problèmes, tels que le dysfonctionnement des mitochondries ^4,5 et le dysfonctionnement cellulaire.

Les répétitions télomériques de l’ADN sont perdues au fur et à mesure que la cellule se divise, avec une perte moyenne de 25 à 200 pb par an 6, entraînant une sénescence cellulaire après un certain nombre de divisions⁶. Le vieillissement est associé à une fréquence plus élevée de comorbidités, marquée par un raccourcissement de la longueur des télomères⁷. L’analyse des fragments de restriction des télomères (TRF), telle que décrite par Mender, est une méthode très coûteuse⁸. Pour cette raison, il n’est pas mis en œuvre lors de la quantification de la longueur des télomères dans la plupart des études.

À l’heure actuelle, la majorité des études épidémiologiques utilisent des mesures quantitatives de la longueur des télomères basées sur la réaction en chaîne par polymérase (qPCR). Cependant, la méthode basée sur la qPCR est une méthode de mesure relative, car elle mesure le rapport entre les télomères et les produits d’amplification génique à copie unique, et non la longueur absolue des télomères. La mesure de la longueur des télomères à l’aide du protocole TRF est la méthode de référence, car elle peut mesurer la distribution de la longueur des télomères dans l’échantillon et les mesures peuvent être exprimées en valeurs absolues en kilobases (kb). Cependant, son utilisation est limitée car elle est encombrante, à forte intensité de main-d’œuvre et coûteuse. Nous présentons ici un protocole optimisé pour la mesure de la longueur des télomères à l’aide de TRF basés sur la chimiluminescence.

L’analyse TRF comprend sept étapes principales: 1) culture de cellules pour l’extraction d’ADN génomique, 2) extraction d’ADN génomique à l’aide de la méthode phénol:chloroforme:isoamylalcool (P:C:I), 3) digestion de restriction de l’ADN génomique, 4) électrophorèse sur gel d’agarose, 5) transfert de Southern du fragment d’ADN de digestion de restriction, 6) hybridation et détection via la sonde télomère immobilisée est visualisée par un substrat chimioluminescent très sensible pour la phosphatase alcaline, la 2-chloro-5-(4-méthoxyspiro[1,2-dioxétane-3,2′-(5-chlorotricyclo[3.3.1.13.7]décan])-4-yl]-1-phényl phosphate (CDP-Star) - et 7) pour obtenir des informations sur la longueur moyenne des télomères et la gamme de ces frottis télomères.

REMARQUE: Voir le tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les réactifs utilisés dans le protocole ci-dessous. Le tableau 1 fait appel à des réactifs fabriqués en laboratoire ainsi qu’à des volumes optimisés et le tableau 2 montre les concentrations de travail des réactifs disponibles dans le commerce.

1. Culture cellulaire

1. Maintenir les cellules dont la longueur des télomères doit être mesurée (utilisées ici étaient des cellules A2780, qui est une lignée cellulaire d’adénocarcinome ovarien) dans le milieu complet du milieu aigle modifié (DMEM) de Dulbecco complété par 10% de sérum bovin fœtal (FBS), de streptomycine, de pénicilline et d’amphotéricine B dans une boîte de Petri de 6 cm. Incuber à 37 °C dans un environnement humidifié et contrôlé contenant 5% de dioxyde de carbone jusqu’à ce que les cellules soient confluentes à 80%-100%.
2. Retirer le média et laver avec 5 ml de 1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
3. Traiter les cellules avec 1 mL d’acide trypsine-éthylènediaminetétraacétique (EDTA) pour détacher les cellules en les incubant à 37 °C pendant 3 à 5 minutes.
4. Ajouter 2 mL de milieu complet DMEM pour inactiver la trypsine et recueillir les cellules dans un tube de centrifugation.
5. Enduire les cellules à 2 348 × g pendant 5 min.
6. Laver la pastille avec 1x PBS et centrifuger à 2 348 × g pendant 5 min.
7. Conserver la pastille à -80 °C jusqu’à nouvelle utilisation.
   REMARQUE: Le nombre de cellules peut varier en fonction de la lignée cellulaire. Nous avons obtenu environ 2,5 × 10⁶ cellules dans le cas de la lignée cellulaire A2780, qui est utilisée dans les étapes ultérieures.

2. Isolement de l’ADN génomique

1. Ajouter 500 μL de tampon de lyse (10 mM de tris-Cl, pH 8,0; 25 mM d’EDTA, pH 8,0; 100 mM de NaCl; 0,5 % p/v de dodécylsulfate de sodium) à la pastille de cellule et mélanger délicatement à l’aide d’une pointe coupée (avec un diamètre d’ouverture d’au moins 2 mm). Ajouter 20 μg/mL de RNase A fraîchement préparée et mélanger doucement par inversion.
2. Incuber à 37 °C pendant 30 min et retourner occasionnellement le tube pendant l’incubation.
3. Ajouter la protéinase K jusqu’à une concentration finale de 100 μg/mL et mélanger doucement par inversion 10 fois. Incuber à 55 °C pendant 2 h. Retourner le tube à intervalles réguliers (toutes les 10 minutes) pendant l’incubation.
4. Ajouter 500 μL de réactif phénol:chloroforme:alcool isoamylique (25:24:1) et mélanger doucement par inversion 20 fois. Centrifuger à 9 391 × g pendant 15 min à température ambiante (environ 25 °C).
   NOTE: La figure 1A montre les trois couches obtenues après centrifugation.
5. Retirer la couche aqueuse supérieure visqueuse des trois couches visibles, placer dans un tube frais à l’aide d’une pointe coupée et ajouter une quantité égale de chloroforme. Mélanger par inversion douce 20 fois.
6. Centrifuger les tubes à 9 391 × g pendant 15 min à température ambiante.
7. Recueillir la couche aqueuse et ajouter une quantité appropriée de 5 M de NaCl de sorte que la concentration finale de NaCl soit de 0,2 M.
8. Ajouter deux volumes d’éthanol à 100%. Mélanger par inversion douce 20-25 fois. Centrifuger à 15 871 × g pendant 5 min à température ambiante.
9. Retirer le surnageant et ajouter 500 μL d’éthanol à 70 % pour laver la pastille. Centrifuger à 15 871 × g pendant 5 min à température ambiante.
10. Retirez le surnageant, séchez la pastille à l’air pendant quelques minutes et ajoutez 50 μL d’eau stérile sans nucléase. Laissez l’ADN se réhydrater pendant 1-2 jours à température ambiante. Mélanger par pipetage, à l’aide de l’embout coupé.
11. Mesurer la concentration d’ADN à l’aide de la spectrophotométrie ultraviolette (UV). Diluer à nouveau les échantillons, si nécessaire, en utilisant de l’eau stérile exempte de nucléase pour obtenir une concentration minimale de 300-500 ng/μL.
12. Vérifiez l’intégrité de l’ADN en l’appliquant sur un gel d’agarose à 1 % (Figure 1B).
13. Conservez l’ADN dilué à -20 °C jusqu’à nouvel usage.

3. Digestion de l’ADN génomique

1. Préparer un mélange enzymatique de Rsa1 (20 U) et Hinf1 (20 U) et ajouter 2 μL de tampon de digestion de restriction par réaction.
2. Prélever un volume approprié d’ADN génomique tel que la quantité totale d’ADN soit de 1,5 μg. Compléter le volume avec de l’eau stérile sans nucléase, de sorte que le volume total après l’ajout d’enzymes soit de 20 μL.
3. Bien mélanger en tapant, suivi d’un tour d’impulsion.
4. Incuber le mélange à 37 °C pendant 2 h.

4. Électrophorèse sur gel d’agarose

1. Préparer un gel d’agarose de 10 cm × 15 cm à 0,8 % dans 1x tampon d’acétate de tris EDTA (TAE) en utilisant de l’agarose de haute qualité.
2. Ajouter 5 μL de colorant de chargement à chaque échantillon d’ADN génomique digéré, ce qui fait le volume final 25 μL, et charger les échantillons sur le gel.
3. Préparez un mélange de marqueurs moléculaires en utilisant 1 μL de marqueur moléculaire (échelle), 3 μL d’eau stérile sans nucléase et 1 μL de colorant de chargement 5x.
4. Charger 5 μL de mélange de marqueurs moléculaires des deux côtés des échantillons digérés d’ADN génomique s’il y a un nombre plus élevé d’échantillons (~10), ou seulement d’un côté s’il y a moins de cinq échantillons ou égal.
5. Faites couler le gel à 5 V/cm pendant 6 h. Une fois la course terminée, faites une encoche sur un coin du gel pour marquer l’ordre de chargement.
6. Immerger le gel dans 0,25 M HCl pendant 10 min à température ambiante en agitant doucement.
7. Rincez le gel deux fois avec de l’eau distillée.
8. Dénaturer l’ADN en immergeant le gel dans une solution de 0,5 M de NaOH et de 1,5 M de NaCl deux fois pendant 15 min chacune à température ambiante avec une agitation douce.
9. Rincez le gel deux fois avec de l’eau distillée.
10. Neutraliser l’ADN en immergeant le gel dans une solution de 0,5 M de tris-HCl et 3 M de NaCl (pH 7,5) deux fois pendant 15 min à température ambiante avec agitation douce.

5. Transfert sud

1. Coupez une membrane de nylon de 10 cm × 12 cm et faites une encoche dans la même position que le gel.
2. Activer la membrane en la plongeant dans de l’eau distillée suivie d’un tampon de citrate de solution saline de sodium (SSC) 20x (voir le tableau 1).
3. Configurez le transfert.
   1. Prenez un plateau en verre propre et placez-y un autre plateau en position inversée. Créez une mèche en utilisant du papier filtre ordinaire de sorte que les extrémités touchent la base du plateau extérieur.
   2. Placez le gel sur le papier filtre. Placez doucement la membrane de nylon activée sur le gel, avec les encoches qui se chevauchent, et enlevez les bulles d’air en roulant sur une tige de verre.
   3. Placer un tas de 2 cm de papier filtre en cellulose de 9,5 cm × 11,5 cm, suivi d’un tas de 6 cm de papier filtre ordinaire de mêmes dimensions. Placez un poids au-dessus de cette configuration de telle sorte qu’il y ait une répartition égale du poids en dessous. Remplissez le bac extérieur avec un tampon SSC 20x (voir Figure 2).
   4. Quittez l’installation pour le transfert de nuit.
4. Après le transfert Southern, fixez l’ADN transféré sur la membrane par réticulation UV sur un transilluminateur UV ou un réticulateur UV. Utilisez une lampe 302 nm 8 W pendant 5 min, ou une lampe 254 nm 8 W pendant 2 min, ce qui correspond à environ 120 mJ. Assurez-vous que le côté de la membrane sur lequel l’ADN est transféré fait face à la lampe.
5. Lavez la membrane deux fois avec 25 ml de tampon 2x SSC.
6. Suspendre le protocole, si nécessaire, en séchant complètement le transfert et en le stockant à 2-8 ° C après l’avoir enveloppé de manière lâche dans du papier d’aluminium, jusqu’à la poursuite du traitement.

6. Hybridation et détection par chimiluminescence

1. Préchauffer le tampon de préhybridation à 42 °C.
   REMARQUE : Les étapes suivantes comprennent les volumes de solutions/tampons à utiliser par 100^cm2 de transfert.
2. Incuber la membrane dans 10 mL de tampon de préhybridation pendant 1 h à 42 °C en agitant doucement pour la préhybridation.
3. Ajouter 0,5 μL de sonde télomère par 5 mL de tampon de préhybridation préchauffé pour obtenir la solution d’hybridation.
4. Incuber le transfert dans 10 mL de solution d’hybridation à 42 °C pendant 3 h en agitant doucement.
5. Laver le blot avec un tampon strict 1 (tableau 1) deux fois pendant 10 minutes (25 ml chacun) à température ambiante en agitant doucement.
6. Préchauffer le tampon strict 2 (tableau 1) pendant 30 min à 50 °C.
7. Laver le blot avec un tampon strict 2 deux fois pendant 15 min (25 ml chacun) à 50 °C en agitant doucement.
8. Rincer avec 15 ml de tampon de lavage pendant 5 min en agitant doucement à TA.
9. Incuber la membrane dans 10 mL de solution de blocage 1x fraîchement préparée pendant 30 min à température ambiante en agitant doucement.
10. Incuber la membrane dans 10 mL d’anti-digioxigénine conjuguée à une solution de travail de phosphatase alcaline (voir tableau 2) pendant 30 min à TA avec agitation douce.
11. Laver le blot deux fois avec un tampon de lavage à température ambiante pendant 15 min en agitant doucement.
12. Incuber dans 10 mL de tampon de détection pendant 5 min à TA avec une agitation douce.
13. Retirez le tampon de détection de l’excès et maintenez la membrane avec l’ADN tournée vers le haut sur un sac d’hybridation ou une feuille d’acétate. Ajouter ~1-1,5 mL de solution de substrat goutte à goutte sur la membrane, placer immédiatement une autre feuille dessus et incuber pendant 5 minutes à TA.
14. Extraire l’excès de solution de substrat pour l’imagerie.
15. Imagez le transfert pendant environ 20 minutes dans un système d’imagerie de documentation sur gel, en collectant plusieurs images à différents moments. Sélectionnez des images non saturées pour une analyse plus approfondie.
    REMARQUE: Dans le cas où le signal est faible, l’imagerie peut être effectuée pendant une période plus longue.

7. Analyse

1. Après avoir obtenu les fichiers image, exportez-les pour publication dans .tif format à la résolution la plus élevée possible (600 ppp dans ce cas).
2. Installez le logiciel Telotool . Cela nécessite une version spécifique (R2012a) de MATLAB (disponible gratuitement) pour fonctionner.
3. Ouvrez le logiciel et cliquez sur le bouton Charger le fichier image en haut à droite.
4. Une fois l’image chargée, cliquez sur Inverser l’image afin que l’arrière-plan de l’image soit noir et que les taches/bandes soient blanches.
5. Recadrez l’image avec les coins supérieurs à partir des puits. Une fois la sélection de recadrage effectuée, cliquez avec le bouton droit de la souris dessus et sélectionnez Recadrer l’image.
6. Une fois l’image recadrée, cliquez sur Calculer les voies et autorisez la détection des voies à se produire automatiquement.
7. Si les voies n’ont pas été détectées correctement, par exemple, si certaines voies n’ont pas été détectées du tout, ou si des voies supplémentaires ou partielles ont été détectées, effectuez le réglage de la voie comme décrit ci-dessous.
   1. Cliquez sur Ajuster les voies et dans la fenêtre contextuelle qui s’ouvre, ajoutez et / ou ajustez les voies au besoin, puis cliquez sur Appliquer et fermer.
8. Après avoir ajusté les voies, assurez-vous qu’un point rouge est visible sur chacune des voies et ajustez les échelles à l’aide du bouton Ladder Fit , en vous assurant que le nombre de pics dans les deux voies d’échelle est dans la même position. Supprimez tous les pics étrangers à l’aide du bouton Supprimer l’extremum .
9. Une fois les échelles ajustées, sélectionnez Profils de voie, cliquez sur Ajustement de l’échelle, puis sélectionnez Ajustement polynomial.
10. Cliquez sur Trendline, comme recommandé par le logiciel, puis sélectionnez Corrigé dans l’option suivante.
11. Cliquez sur Obtenir les résultats pour afficher les résultats sous forme de tableau, dans lequel la ligne TRF moyenne est la mesure de la longueur des télomères des échantillons de voies respectifs.
12. Cliquez sur Enregistrer tout pour stocker les résultats sous la forme d’une feuille de calcul.

L’ADN génomique extrait (ADNg), qui a été exécuté sur un gel d’agarose à 1%, a montré une bonne intégrité, comme le montre la figure 1B, ce qui indique que l’échantillon pourrait être utilisé pour un traitement ultérieur en aval des TRF. Le test TRF a ensuite été réalisé en modifiant les volumes de solutions nécessaires à chaque étape (voir Tableau 1 et Tableau 2). Le signal TRF était clairement visible (Figure 3). Ainsi, en modifiant les volumes et les concentrations de la solution, davantage d’échantillons pourraient être traités sans aucun effet négatif sur les résultats, et la longueur des télomères pourrait être déterminée avec succès à l’aide d’un logiciel disponible gratuitement tel que Telotool10.

Figure 1 : Isolement et contrôle qualité de l’ADN génomique. (A) Trois phases de séparation distinctes obtenues par centrifugation après addition phénol:chloroforme:alcool isoamylique. La couche aqueuse supérieure contient l’ADNg, l’interphase contient les protéines et la phase organique inférieure contient l’ARN dégradé, les débris cellulaires et les lipides. (B) Image d’un gel d’agarose à 1% montrant un ADNg intact non digéré. La voie 1 montre une échelle de 1 kb et la voie 2 montre l’ADNg non digéré de la lignée cellulaire cancéreuse A2780. Abréviation : ADNg = ADN génomique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Illustration de la configuration du transfert par transfert par transfert par transfert Sud. Diagramme représentatif montrant l’assemblage du système pour le transfert des frottis répétés des télomères du gel à la membrane de nylon par capillarité. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Détection par chimiluminescence des TRF après le transfert et l’hybridation de Southern. Tache montrant une gamme de répétitions télomériques comme frottis dans la voie 2. La voie 1 montre un marqueur moléculaire, avec les poids moléculaires (kb) des bandes indiquées sur le côté gauche. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Liste des réactifs utilisés dans ce protocole. Le tableau contient les réactifs préparés en laboratoire ainsi que les détails de leur stockage, l’utilisation recommandée des réactifs du kit de dosage de longueur des télomères TAGGG et leurs volumes d’utilisation modifiés, conformément à l’optimisation de ce protocole. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 2 : Liste des réactifs disponibles dans le commerce avec instructions d’utilisation modifiées. Le tableau contient les réactifs disponibles dans le commerce ainsi que les différentes dilutions, les détails de leur stockage et leur utilisation recommandée par le kit d’essai de longueur des télomères TAGGG et les volumes d’utilisation modifiés, conformément à l’optimisation de ce protocole. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts.