Détection quantitative des réticulations ADN-protéines et de leurs modifications post-traductionnelles

Les dommages génomiques à l’ADN sont dus à la désintégration spontanée, à des dommages internes et à des facteurs environnementaux¹. Les lésions de l’ADN qui en résultent comprennent des bases endommagées, des discordances, des cassures simple et double brin, des réticulations inter- et intra-brin et des réticulations ADN-protéines (DPC). Un DPC est formé lorsqu’une protéine liée à la chromatine est piégée sur l’ADN par liaison covalente. Les CPD sont induites par des lésions endogènes de l’ADN et des métabolites réactifs, ainsi que par des agents exogènes tels que des agents chimiothérapeutiques et des agents de réticulation bifonctionnels. Dans certaines circonstances, un dysfonctionnement enzymatique peut également conduire à la formation de DPC². La grande différence dans les inducteurs de DPC se traduit par une différence dans l’identité de la protéine liée à la covalence, la région chromosomique où la DPC est formée, le type de structure de l’ADN réticulé à la protéine et la propriété chimique de la liaison covalente entre la protéine et l’ADN ^2,3,4.

Sur la base de leur nature chimique, les DPC sont généralement classés en deux groupes : les DPC enzymatiques et les DPC non enzymatiques. Certaines enzymes telles que les topoisomérases, les glycosylases et les méthyl/acyltransférases agissent en formant des intermédiaires covalents enzyme-ADN réversibles au cours de leurs réactions catalytiques normales. Il s’agit d’intermédiaires enzyme-ADN à courte durée de vie qui peuvent être convertis en DPC enzymatiques à longue durée de vie lors de leur piégeage par des agents endogènes ou exogènes, en particulier par des agents chimiothérapeutiques³. Les DPC de la topoisomérase sont parmi les DPC enzymatiques les plus fréquentes dans les cellules eucaryotes, qui peuvent être générées par des inhibiteurs de la topoisomérase cliniquement utiles (topotécan et irinotécan pour la topoisomérase I [TOP1] et étoposide et doxorubicine pour la topoisomérase II [TOP2]) et sont les principaux mécanismes thérapeutiques de ces inhibiteurs ^5,6. Les ADN méthyltransférases (DNMT) 1, 3A et 3B sont la cible de la 5-aza-2'-désoxycytidine (également connue sous le nom de décitabine) et forment des DPC lors de l’exposition au médicament⁷. Les agents réactifs, ainsi que la lumière ultraviolette et les rayonnements ionisants, induisent des DPC non enzymatiques en réticulant de manière non spécifique des protéines à l’ADN. Les aldéhydes réactifs tels que l’acétaldéhyde et le formaldéhyde (AG) sont souvent générés en tant que sous-produits des métabolismes cellulaires, parmi lesquels l’AG est produit à des concentrations micromolaires pendant le métabolisme du méthanol, la peroxydation lipidique et la déméthylation des histones. De plus, l’AF est un produit chimique de production à grande échelle fabriqué dans le monde entier, auquel de nombreuses personnes sont exposées à la fois sur le plan environnemental et professionnel ^8,9.

Les DPC enzymatiques et non enzymatiques sont hautement toxiques pour les cellules car leurs composants protéiques volumineux entravent efficacement presque tous les processus à base de chromatine, y compris la réplication et la transcription, entraînant l’arrêt du cycle cellulaire et l’apoptose s’ils ne sont pas réparés. Au cours des deux dernières décennies, la réparation des DPC a été vigoureusement étudiée, et plusieurs protéines/voies ont été identifiées comme des facteurs clés qui réparent directement les DPC ou modulent leurs processus de réparation. Par exemple, il a été bien établi que la protéolyse de la masse protéique d’un DPC est une étape cruciale de la réparation du DPC, et que la protéolyse peut être catalysée par les protéases SPRTN 10,11,12,13,14, FAM111A¹⁵, GCNA 16,17 ou le complexe protéasome^26S 18,19,20,21,22 ,23,24,25,26,27 d’une manière dépendante du type de cellule ou du contexte cellulaire. L’identification et la caractérisation de ces protéases se sont largement appuyées sur le complexe in vivo du test enzymatique (ICE)^28,29 et le test RADAR (Rapid Approach to DNA Adduit Recovery)^30,31, qui isolent tous deux les molécules d’ADN et leurs protéines liées covalentes à partir de protéines cellulaires libres pour permettre la détection des DPC par slot-blot à l’aide d’anticorps ciblant les protéines réticulées. De plus, le test d’immunomarquage de l’ADN d’agarose piégée (TARDIS) a été utilisé comme moyen de détecter et de quantifier les DPC au niveau de la cellule unique³². À l’heure actuelle, les chercheurs choisissent le test RADAR plutôt que le test ICE pour mesurer les DPC, car le test ICE repose sur la purification des acides nucléiques à l’aide de l’ultracentrifugation par gradient de chlorure de césium, ce qui prend énormément de temps, tandis que le test RADAR précipite les acides nucléiques à l’aide d’éthanol dans un délai beaucoup plus court.

Au cours des dernières années, de plus en plus de preuves ont émergé que de multiples modifications post-traductionnelles (PTM) sont impliquées dans la signalisation et le recrutement de protéases ciblant les DPC 3,33,34,35. Par exemple, les DPC TOP1 et TOP2 se sont avérés être conjugués par un petit modificateur de type ubiquitine (SUMO)-2/3, puis SUMO-1 par la ligase SUMO E3 PIAS4, indépendamment de la réplication et de la transcription de l’ADN. Les modifications séquentielles de SUMO semblent être une cible de l’ubiquitine, qui est déposée dans les TOP-DPC SUMOylés et forme des chaînes polymères à travers son résidu lysine 48 par une ubiquitine ligase ciblée par SUMO appelée RNF4. Par la suite, le polymère ubiquitine émet un signal et recrute le protéasome 26S vers les TOP-DPCs^23,36. Il a récemment été démontré que la même voie SUMO-ubiquitine agit sur les DNMT1-DPC ainsi que sur les complexes PARP-ADN pour leur réparation^37,38. De plus, l’ubiquitylation indépendante de SUMO par l’ubiquitine E3 ligase TRAIP a été rapportée pour amorcer les DPC pour la dégradation protéasomale d’une manière couplée à la réplication³⁹. À l’instar de la dégradation protéasomale des TOP-DPC, la protéolyse des DPC enzymatiques et non enzymatiques par la métalloprotéase couplée à la réplication SPRTN nécessite également l’ubiquitylation des substrats de DPC en tant que mécanisme d’engagement de SPRTN^40,41. La délimitation du rôle de la SUMOylation et de l’ubiquitylation nécessite la détection des DPC marqués avec ces PTM. Étant donné que les tests ICE et RADAR originaux reposent sur des appareils à fente/taches/points pour mesurer des échantillons d’ADN non digérés, aucun de ces deux tests n’est capable de résoudre et de visualiser des espèces de DPC conjuguées PTM avec des poids moléculaires différents. Pour pallier ce problème, nous avons digéré les échantillons d’ADN après leur purification par précipitation à l’éthanol et leur normalisation avec une nucléase micrococcique, une endo-exonucléase d’ADN et d’ARN pour libérer les protéines réticulées, ce qui nous a permis de résoudre les protéines ainsi que leurs PTMs covalents avec l’électrophorèse sur gel de polyacrylamide dodécylsulfate de sodium (SDS-PAGE). L’électrophorèse nous a permis de détecter et de quantifier les DPC conjugués PTM à l’aide d’anticorps spécifiques ciblant les PTM. Nous avons d’abord nommé cette méthode améliorée le test DUST, afin de mettre en évidence sa robustesse dans la détection des TOP-DPC ubiquitylés et SUMOylés²³. Plus tard, nous avons élargi l’utilisation du test pour évaluer quantitativement l’ADP-ribosylation des TOP1-DPC in vivo, en utilisant des anticorps dirigés contre les polymères poly-ADP-ribose²⁰.

Nous présentons ici un protocole détaillé pour le test qui détecte et mesure les DPC ubiquitylés, SUMOylés et ADP-ribosylés, qui a été optimisé pour les TOP-DPC modifiés qui sont induits par leurs inhibiteurs et les DPC non spécifiques/non enzymatiques qui sont induits par FA. Ce test isole les DPC conjugués PTM en lyquant les cellules avec un agent chaotropique, en précipitant l’ADN avec de l’éthanol et en libérant les protéines autrement réticulées et leurs modificateurs avec la nucléase micrococcique. Les protéines autrement liées à l’ADN et leurs PTM sont quantifiées par immunotransfert à l’aide d’anticorps spécifiques. Ce test ouvre une nouvelle voie pour élucider les mécanismes moléculaires par lesquels la cellule répare les DPC enzymatiques et non enzymatiques. Plus précisément, il permet d’étudier en détail l’induction et la cinétique des PTMs importants pour la régulation de la dégradation et de la réparation des TOP-DPC, et permet ainsi la découverte de nouveaux facteurs tels que les ligases E3 dictant les PTM. ainsi que des inhibiteurs ciblant ces facteurs. Étant donné que certains des PTM responsables de la réparation des TOP-DPC sont probablement impliqués dans la réparation des DPC induites par d’autres agents chimiothérapeutiques, tels que les médicaments à base de platine²², ce test a également le potentiel d’être appliqué à la découverte de nouveaux médicaments et à l’optimisation rationnelle des thérapies combinatoires avec des inhibiteurs de la topoisomérase ou des antinéoplasiques à base de platine dans les cellules des patients pour guider les schémas thérapeutiques.

1. Culture cellulaire et traitement médicamenteux dans la lignée cellulaire du rein embryonnaire humain 293 (HEK293)

1. Préparer le milieu de culture, le milieu d’aigle modifié de Dulbecco (DMEM), complété par 10 % de sérum de veau fœtal, 1 % de L-glutamine de 2 mM et 100 unités/mL de pénicilline-streptomycine.
2. Semer 1 x 10⁶ cellules dans une plaque de 60 mm ou une plaque à 6 puits selon les conditions de traitement et le contrôle.
3. Le lendemain, traitez les cellules avec les inducteurs DPC de votre choix.
   1. Pour induire les TOP1-DPC et leur ubiquitylation et SUMOylation, ajoutez l’inhibiteur de TOP1 camptothécine à 20 μM aux cellules et collectez les cellules à 20, 60 et 180 min.
   2. Pour induire les TOP2α et les β-DPC et leur ubiquitylation et SUMOylation, exposez les cellules pour ajouter l’étoposide inhibiteur de TOP2 à 200 μM aux cellules et collectez les cellules à 20, 60 et 180 min.
   3. Pour induire des DPC non enzymatiques et leur ubiquitylation et SUMOylation, ajouter de l’AG à 1 mM et prélever les cellules 2 h après l’exposition.
   4. Pour induire la PARylation des TOP1-DPC, prétraiter les cellules pendant 1 h pour bloquer la déPARylation avec un inhibiteur de la poly(ADP-ribose) glycohydrolase (PARG) PDD00017273 à 10 μM, suivi d’un co-traitement avec 20 μM de camptothécine pendant 20, 60 et 180 min.

2. Isolement et normalisation de l’ADN contenant des protéines réticulées

1. Aspirez rapidement le milieu à l’aide d’une pipette aspirante après le traitement et rincez les cellules avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) glacée et glacée. Lyser immédiatement les cellules dans 600 μL de réactif DNAzol contenant 1x inhibiteur du cocktail de protéases, 1 mM de dithiothréitol (DTT) et 20 mM de N-éthylmaléimide (inhibiteur des enzymes déSUMOylantes et déubiquitylantes).
2. Agiter lentement la plaque sur une plate-forme vibrante pendant 10 min à 4 °C.
3. Ajouter 1/2 volume d’éthanol froid à 100 % (0,3 ml) directement dans la plaque et répéter l’étape 2.2 jusqu’à ce que l’agrégat d’acide nucléique opaque devienne visible. Transférez le lysat cellulaire dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL et soumettez le tube à une centrifugation à vitesse maximale (20 000 x g) pendant 15 min à 4 °C pour précipiter l’acide nucléique et ses protéines réticulées.
4. Aspirer le surnageant à l’aide d’une pipette aspirante et laver la pastille d’acide nucléique dans 1 mL d’éthanol à 75 % suivi de 2 min de centrifugation à 20 000 x g à 4 °C.
5. Aspirez le surnageant, essorez à la même vitesse et retirez le liquide restant à l’aide d’une pipette P20. Séchez le granulé à l’air libre pendant 5 min.
6. Dissoudre rapidement la pastille d’acide nucléique dans 0,1 mL de ddH₂O. Remettre la pastille en suspension par pipetage répété, puis incuber au bain-marie à 37 °C jusqu’à ce que la pastille gonfle au moins trois fois plus (environ 30 min).
7. Soniser les échantillons à l’aide d’une sonde à processeur à ultrasons à 30 % d’amplitude pendant 10 s pour dissoudre complètement la pastille.
8. Étape facultative : Traiter les échantillons avec le mélange RNase A/T1 (10 μg de RNase A et 25 U de RNase T1) et incuber à 37 °C pendant 15 min. Ajouter 1/10 de volume d’acétate de sodium 3 M et deux volumes d’éthanol 100 % glacé dans le tube, suivi d’une centrifugation à 20 000 x g pendant 10 min pour récupérer l’ADN. Retirer le surnageant et dissoudre l’ADN précipité dans 0,1 mL de ddH₂O.
9. Étape facultative : Centrifuger l’échantillon pendant 5 min à 20 000 x g et transférer le surnageant dans un nouveau tube.
10. Quantifier la concentration d’ADN à l’aide d’un spectromètre ultraviolet-visible (UV-Vis). Le rendement typique en ADN est d’environ 600-800 ng/μL. Le rapport A260/A280 doit être réduit de 2,0-2,1 à 1,8-1,9 après l’élimination de l’ARN.
11. Ajustez la concentration de l’ADN à 400-500 ng/μL dans 0,12 mL de ddH 2 O. Transférez 20 μL de l’échantillon dans un nouveau tube de microcentrifugation pour contrôler la charge d’ADN non digéré (voir l’étape_2.4).
12. Pour digérer l’ADN dissous dans les 100 μL restants de ddH 2 O, ajoutez₂000 unités de gel de nucléase micrococcique ainsi que 1/10 de volume (~11 μL) de tampon de réaction de nucléase micrococcique calcique 10x à l’échantillon. Incuber à 37 °C pendant 30 min.

3. Western blot d’échantillons d’ADN digérés

1. Ajouter 4x tampon d’échantillon Laemmli, puis faire bouillir l’échantillon pendant 5 min.
2. Charger 5 à 6 μg d’échantillon digéré (~15 μL) sur un gel de polyacrylamide à 4 % à 20 %, suivi d’une FDS-PAGE⁴² pour résoudre les DPC non modifiés et conjugués au PTM.
3. Pour détecter les espèces de DPC non enzymatiques induites par l’AF, incuber le gel avec la coloration bleue de Coomassie pendant la nuit à température ambiante. Lavez le gel avec du ddH 2 O pendant₂h et obtenez une image à l’aide d’un système d’imagerie.
4. Transférez le gel et incubez les membranes pendant une nuit à 4 °C avec des dilutions appropriées d’anticorps primaires dans un tampon bloquant.
   1. Pour détecter l’ubiquitylation, faites une dilution de 1 :100 d’anticorps anti-ubiquitine.
   2. Pour détecter une modification SUMO-1 ou SUMO-2/3, faites une dilution de 1 :250 d’anticorps anti-SUMO-1 ou anti-SUMO-2/3.
   3. Pour détecter la ribosylation de l’ADP, faites une dilution de 1 :500 de l’anticorps anti-PAR.
   4. Pour détecter les TOP1-, TOP2α- ou TOP2β-DPC totaux, faites une dilution de 1 :500 d’anticorps anti-TOP1, anti-TOP2α ou anti-TOP2β.
      REMARQUE : Reportez-vous au tableau des matériaux pour plus de détails sur la dilution des anticorps.
5. Incuber une membrane lavée 1x PBS-T (0,1 % tween 20) avec un anticorps secondaire dilué 5 000 fois dans un tampon bloquant pendant 60 min à température ambiante.
6. Développez la membrane avec un réactif de chimiluminescence améliorée (ECL) et obtenez une image à l’aide du système d’imagerie.

4. Transfert d’échantillons d’ADN non digérés

1. Diluer l’échantillon d’ADN non digéré de 20 μL dans 180 μL de tampon phosphate de sodium (25 mM, pH 6,6).
2. Couper la membrane de nitrocellulose (0,45 μm) et l’équilibrer pendant 5 min dans le tampon phosphate de sodium.
3. Assemblez l’appareil de transfert à fente conformément aux instructions du fabricant et connectez-le à un système d’aspiration.
4. Lavez les puits avec un tampon de phosphate de sodium en appliquant le vide. Assurez-vous qu’il n’y a pas de fuite des puits.
5. Arrêtez le vide et chargez 200 μL d’ADN par échantillon (1 μg). Remplir les puits vides avec 200 μL de tampon phosphate de sodium.
6. Appliquez l’aspirateur.
7. Lorsque tous les puits sont complètement vides, arrêtez le vide, chargez 200 μL de tampon de phosphate de sodium dans chaque puits et répétez l’étape 4.6.
8. Récupérez la membrane et bloquez avec un tampon bloquant à 5 % pendant 0,5 h à température ambiante.
9. Sonde avec anticorps anti-ADN double brin (ADNdb) à une dilution de 1 :5 000 pendant la nuit à 4 °C.
10. Laver 3 fois avec 1 PBS-T et incuber avec 1 :5 000 anticorps secondaire anti-souris dilué lié à la peroxydase de raifort (HRP).
11. Développez la membrane avec un réactif de chimiluminescence améliorée (ECL) et obtenez une image à l’aide du système d’imagerie.

5. Analyse densitométrique

1. À l’aide d’ImageJ, calculez le rapport de l’intensité de chaque bande/frottis par rapport à l’intensité de la fente d’ADN non digéré et normalisez le rapport à celui des cellules sans/avant traitement médicamenteux.

Les résultats représentatifs présentés dans la figure 1 montrent la formation et la cinétique des TOP1-DPC induites par les médicaments, ainsi que leur SUMOylation et leur ubiquitylation. TOP1 a clivé un brin du duplex de l’ADN et a formé un intermédiaire covalent enzyme-ADN, appelé complexe de clivage TOP1 (TOP1cc). Le traitement de la camptothécine (CPT), un inhibiteur de TOP1, lié et stabilisé TOP1cc, conduisant à la formation de TOP1-DPC à longue durée de vie. On a observé que les TOP1-DPC étaient induits et qu’ils atteignaient un pic 20 minutes après l’exposition à la CPT. Simultanément, les TOP1-DPC ont été modifiés par SUMO-2/3, qui a également atteint un pic 20 minutes après le traitement par CPT. Comme SUMO-2 et SUMO-3 partagent 95 % d’identité de séquence, l’anticorps ne les distingue pas l’un de l’autre. À 60 min, les TOP1-DPC et leur modification SUMO-2/3 ont diminué, accompagnés de l’aboutissement de leur modification SUMO-1 et de leur ubiquitylation. Après le traitement médicamenteux de 60 minutes, les niveaux de modification et d’ubiquitylation de TOP1-DPC SUMO-1 ont commencé à diminuer. Chez les mammifères, les isoenzymes TOP2 α et β agissent en introduisant une cassure double brin de l’ADN, ainsi que via la formation d’un complexe enzymatique-ADN covalent transitoire et réversible (TOP2cc). Les inhibiteurs de TOP2, tels que l’étoposide (ETOP), convertissent TOP2cc en TOP2-DPC et induisent leur SUMOylation et leur ubiquitylation. À l’instar de la cinétique des TOP1-DPC et de leurs PTM, les TOP2α- et β-DPC et leur modification SUMO-2/3 ont atteint un pic à 20 min, puis ont commencé à diminuer ; pendant ce temps, leurs modifications SUMO-1 et ubiquitine ont culminé à 60 minutes (Figure 2). Il a été démontré que la clairance des TOP-DPC résulte de la dégradation protéasomale, et la clairance de la SUMOylation et de l’ubiquitylation de TOP-DPC est probablement due au recyclage par déSUMOylation et déubiquitylation, respectivement, par leurs enzymes inverses. Les expériences de la figure 3 ont examiné les DPC non enzymatiques induits par l’AF et leurs PTM. Il a été observé que les DPC et leur SUMO-2/3, SUMO-1 et ubiquitylation se formaient et s’accumulaient d’une manière dose-dépendante de l’AG. Enfin, la PARylation des TOP1-DPC a été détectée quantitativement avec un anticorps anti-PAR en utilisant la même méthode (Figure 4). La PARylation TOP1-DPC n’était pas détectable à moins qu’un inhibiteur de PARG ne soit ajouté à la cellule, ce qui suggère que la PARylation se produit rapidement et est très dynamique. Conformément à la découverte précédente, l’inhibition de la déPARylation par PARGi semble accumuler des TOP1-DPC, probablement en bloquant la dégradation protéolytique.

Figure 1 : Analyses quantitatives de la formation et de la cinétique des TOP1-DPC et de leur SUMOylation et ubiquitylation lors d’un traitement CPT dans des cellules HEK293. (A) Les cellules HEK293 ont été traitées avec 20 μM CPT pendant des périodes de temps indiquées. Les lysats cellulaires ont été prélevés et soumis au test RADAR modifié et au western blot avec des anticorps indiqués. Des échantillons d’ADN non digérés ont été soumis à un transfert par fente en utilisant des anticorps anti-ADNdb comme contrôle de charge. (B) Les intensités de bande ont été quantifiées à l’aide du logiciel ImageJ et tracées à l’aide du logiciel Prism. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Analyses quantitatives de la formation et de la cinétique des TOP2-DPC et de leur SUMOylation et ubiquitylation lors du traitement ETOP dans les cellules HEK293. (A) Les cellules HEK293 ont été traitées avec 200 μM d’ETOP pendant des périodes de temps indiquées. Les lysats cellulaires ont été prélevés et soumis au test RADAR modifié et au western blot avec des anticorps indiqués. Des échantillons d’ADN non digérés ont été soumis à un transfert par fente en utilisant des anticorps anti-ADNdb comme contrôle de charge. (B) Les intensités de bande ont été quantifiées à l’aide du logiciel ImageJ et tracées à l’aide du logiciel Prism. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Analyses quantitatives des DPC non enzymatiques et de leur SUMOylation et ubiquitylation lors d’un traitement par FA dans des cellules HEK293. (A) Les cellules HEK293 ont été traitées avec des FA aux concentrations indiquées pendant 2 h. Les lysats cellulaires ont été prélevés et soumis au test RADAR modifié et au western blot avec des anticorps indiqués. Des échantillons d’ADN non digérés ont été soumis à un transfert par fente en utilisant des anticorps anti-ADNdb comme contrôle de charge. (B) Les intensités de bande ont été quantifiées à l’aide du logiciel ImageJ et tracées à l’aide du logiciel Prism. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Analyses quantitatives des TOP1-DPCs et de leur PARylation lors d’un traitement CPT dans des cellules HEK293. (A) Les cellules HEK293 ont été prétraitées avec 10 μM de PARGi pendant 1 h, puis co-traitées avec CPT pendant des périodes de temps indiquées. Les lysats cellulaires ont été prélevés et soumis au test RADAR modifié et au western blot avec des anticorps indiqués. Des échantillons d’ADN non digérés ont été soumis à un transfert par fente en utilisant des anticorps anti-ADNdb comme contrôle de charge. (B) Les intensités de bande ont été quantifiées à l’aide du logiciel ImageJ et tracées à l’aide du logiciel Prism. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

L’auteur déclare qu’il n’y a pas d’intérêts concurrents.