Article de méthode

Isolement des cellules endothéliales lymphatiques dermiques murines

DOI :

10.3791/65393

⸱

21 juillet 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmaceutical Sciences, School of Pharmacy, Texas Tech University Health Sciences Center, 2Laboratory of Molecular Pharmacology, Department of Pharmacy, University of Patras, 3Division of Flow Cytometry and Division of MDx & Life Sciences, SB BioAnalytica, 4Basic Sciences Laboratory, Department of Physiotherapy, University of Peloponnese, 5Division of Hematology, Department of Internal Medicine, Medical School, University of Patras, 6School of Basic Pharmaceutical and Toxicological Sciences, College of Pharmacy, University of Louisiana at Monroe

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cet article décrit une méthode d’isolement par billes magnétiques de cellules endothéliales murines à partir de capillaires lymphatiques dermiques. Les cellules endothéliales lymphatiques isolées peuvent être utilisées pour des expériences in vitro en aval et l’analyse de l’expression des protéines.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le système lymphatique participe à la régulation de la surveillance immunitaire, de l’absorption des lipides et de l’équilibre des fluides tissulaires. L’isolement des cellules endothéliales lymphatiques murines est un processus important pour la recherche lymphatique, car il permet de réaliser des expériences in vitro et biochimiques sur les cellules isolées. De plus, le développement de la technologie Cre-lox a permis de dénombrer des gènes spécifiques aux tissus qui ne peuvent pas être ciblés à l’échelle mondiale, ce qui a permis de déterminer avec précision leur rôle dans les tissus étudiés. La dissection du rôle de certains gènes dans la physiologie lymphatique et la physiopathologie nécessite l’utilisation de promoteurs spécifiques lymphatiques, et donc, la vérification expérimentale des niveaux d’expression des gènes ciblés.

Les méthodes d’isolement efficace des cellules endothéliales lymphatiques de souris de type sauvage ou transgéniques permettent d’utiliser des essais ex vivo et in vitro pour étudier les mécanismes régulant les fonctions lymphatiques et l’identification des niveaux d’expression des protéines étudiées. Nous avons développé, normalisé et présenté un protocole pour l’isolement efficace des cellules endothéliales lymphatiques dermiques (DLEC) murines par purification par billes magnétiques basée sur l’expression de LYVE-1. Le protocole décrit vise à doter les chercheurs d’un outil permettant de mieux comprendre et d’élucider les acteurs importants des fonctions des cellules endothéliales lymphatiques, en particulier dans les installations où l’équipement de tri cellulaire activé par fluorescence n’est pas disponible.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le système lymphatique joue un rôle central dans la physiologie humaine. Il est considéré comme un facteur homéostatique vital, qui facilite des fonctions importantes, telles que le maintien de l’équilibre hydrique tissulaire-plasmatique, la surveillance immunitaire et l’absorption des lipides1, ainsi que des fonctions récemment identifiées, telles que la capacité de réparation du cœur2 et la capacité de régénération de l’os et l’hématopoïèse3. Malgré le rôle important du système lymphatique, plusieurs aspects du rôle des lymphatiques, ainsi que les mécanismes moléculaires régissant certains paramètres physiologiques et les réponses restent insaisissables. De plus, les anomalies vasculaires lymphatiques sont des facteurs déclenchants ou détériorants dans certaines conditions physiopathologiques. Des exemples bien connus sont les lymphœdèmes primaires et secondaires, en fonction de l’origine génétique ou non génétique de la maladie, respectivement, tandis que le rôle du système lymphatique sur la croissance tumorale primaire et la dissémination métastatique est crucial, car il peut agir comme un conduit pour les métastases et un modulateur des fonctions immunitaires1.

Le retard dans l’étude et la connaissance du système vasculaire lymphatique par rapport au système vasculaire sanguin est principalement dû à la découverte ultérieure du système lymphatique par rapport au système vasculaire sanguin et au retard dans l’identification des marqueurs moléculaires spécifiques du lymphe. Cela s’est considérablement amélioré au cours des dernières décennies, conduisant à l’altération de l’image conventionnelle des lymphatiques à l’état d’équilibre et dans des états pathologiques1. Semblable à l’angiogenèse, la lymphangiogenèse est la formation de nouveaux vaisseaux lymphatiques à partir de vaisseaux préexistants et joue un rôle central dans le développement d’un large éventail de maladies 4,5,6. Cependant, contrairement à l’angiogenèse, l’étude de la lymphangiogenèse a été limitée à des modèles principalement in vivo axés sur la formation de vaisseaux développementaux et les défauts structurels dans des modèles pathologiques. L’isolement des cellules endothéliales lymphatiques est important pour les études in vitro, et cela peut être fourni par le protocole présenté.

Plusieurs protocoles d’isolement endothélial lymphatique chez la souris ont été développés, qui nécessitent l’utilisation du tri cellulaire activé par fluorescence7. L’avantage du trieur de cellules, lorsqu’il est disponible, est le degré de pureté plus élevé, contrairement à l’isolement à base de billes, ce dernier offrant un rendement plus élevé. Le protocole utilise l’expression du récepteur endothélial lymphatique 1 (LYVE-1), un marqueur endothélial lymphatique, important pour le trafic cellulaire dans les vaisseaux lymphatiques 4,8. Étant donné que l’expression de LYVE-1 est limitée aux capillaires lymphatiques et non aux vaisseaux lymphatiques collecteurs, la technique convient à l’isolement des cellules endothéliales lymphatiques spécifiquement à partir des capillaires lymphatiques, contrairement à d’autres marqueurs lymphatiques, tels que la podoplanine, qui sont exprimés uniformément dans toutes les cellules endothéliales lymphatiques9. Pour le protocole, d’autres marqueurs lymphatiques importants qui n’étaient pas transmembranaires, tels que Prox1, ont été exclus.

Comme le résultat physiologique était la lymphangiogenèse, qui est généralement initiée au niveau des capillaires lymphatiques, LYVE-1 a été sélectionné comme cible en raison de sa sélectivité dans ces cellules et parce que l’anticorps sélectionné offrait un rendement élevé. Les enzymes utilisées étaient la collagénase de type II, qui est généralement connue pour être plus efficace dans la dissociation du collagène que le type I10, et la dispase, une protéase plus large, régulièrement utilisée pour la séparation dermis-épiderme11 ; Cependant, d’autres enzymes pour la séparation des tissus ont été signalées12,13 et peuvent être utilisées. L’objectif de ce protocole est de décrire une méthode d’isolement des cellules endothéliales lymphatiques dermiques à partir des capillaires lymphatiques de souris adultes à haut rendement en utilisant la purification par billes magnétiques, en particulier dans les endroits où le tri cellulaire activé par fluorescence n’est pas facilement disponible. La méthode convient aux applications où la pureté des cellules endothéliales lymphatiques peut être compromise pour les applications en aval.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les études sur les animaux ont été réalisées conformément aux protocoles approuvés par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) du Centre des sciences de la santé de l’Université Texas Tech (TTUHSC) pour les expériences au TTUHSC et par l’Administration vétérinaire de la préfecture de Grèce occidentale conformément à la directive 2010/63 pour les expériences à l’Université de Patras. Respectez scrupuleusement les règlements sur l’élimination des déchets lors de l’élimination des déchets animaux.

1. Isolement du derme de souris

  1. Jour 1
    REMARQUE : Le jour 1 ; Préparez le matériel et l’équipement suivants : chambre d’anesthésie, tondeuse à poils d’animaux, isoflurane, pinces fines, filtres pour seringues de 0,2 μm.
    1. Préparez une solution de dispase à 2 mg/mL dans du DMEM avec 1 solution antibiotique-antimycosique et filtrez-la.
      REMARQUE : L’utilisation du milieu ou du PBS peut être remplacée par HBSS, car il a été utilisé avec succès dans d’autres protocoles rapportés12. La solution antibiotique-antimycosique 1x peut être remplacée par l’ajout de pénicilline (100 UI/ml), de streptomycine (100 μg/mL) et d’amphotéricine (2,5 μg/mL).
    2. Anesthésier la souris en la plaçant dans une chambre d’anesthésie avec administration d’isoflurane (0,5-2% d’isoflurane, débit : 1 L/min). Une fois que la souris a cessé de bouger, transférez-la hors de la cage et continuez l’anesthésie en ajustant un cône nasal avec un flux d’isoflurane similaire. Pincez les orteils de l’animal pour confirmer des niveaux d’anesthésie suffisants et surveillez constamment la souris pour vous assurer que l’anesthésie profonde est préservée (pas de motilité). Coupez environ 9 cm2 de la fourrure dorsale et ventrale (dos et abdomen de la souris respectivement) longitudinalement le long de la ligne médiane, à l’aide d’une tondeuse à cheveux. Laissez la souris se remettre de l’anesthésie et retournez-la dans la cage.
      REMARQUE : Une crème dépilatoire (épilation) peut être utilisée à la place. Assurez-vous que la fourrure est complètement enlevée dans les zones cutanées à isoler tout en préservant l’intégrité de la peau. Essayez de couper la zone de peau la plus étendue possible. Pour s’assurer que l’inflammation potentielle de l’épilation est résolue, l’isolement cellulaire doit avoir lieu le lendemain. Pour augmenter le nombre de cellules isolées, regroupez 2 à 4 souris par groupe.
  2. Jour 2
    REMARQUE : Gardez le matériel et l’équipement suivants à portée de main : chambre d’euthanasie, enceinte de biosécurité, incubateur de CO2 , éthanol, ciseaux fins, pinces fines, pinces émoussées, plaque de culture tissulaire de 100 mm, dispase, DMEM, 1 solution antibiotique-antimycosique.
    1. Euthanasiez la souris par administration de CO2 et placez-la en position couchée, en exposant la zone coupée. Vaporisez de l’éthanol à 70 % comme désinfectant.
      REMARQUE : À partir de cette étape, toutes les étapes doivent être effectuées dans des conditions stériles (dans une enceinte de biosécurité).
    2. Placez une plaque de culture tissulaire stérile de 100 mm sur de la glace.
    3. Faites une coupe superficielle de 0,5 pouce au niveau de l’abdomen et coupez longitudinalement le long de la ligne médiane jusqu’au cou et au bas-ventre. Faites des entailles latérales pour pouvoir ouvrir la peau.
      REMARQUE : La taille de l’incision et la zone cutanée isolée dépendent de la taille de la souris.
    4. À l’aide d’une pince émoussée, séparez soigneusement la peau des tissus environnants. Faites-le en faisant le tour de tout le torse de la souris, en coupant la peau latéralement autour du cou et du bas-ventre.
    5. Placez délicatement la peau dans la plaque de culture tissulaire de 100 mm, avec le côté derme vers le bas, en gardant la peau aussi étirée que possible. Couvrez les assiettes et gardez-les sur de la glace. Terminez l’isolement de toutes les souris du groupe.
    6. Une fois la peau extraite de toutes les souris, incubez les plaques pendant 10 min à température ambiante pour aplatir l’explant.
    7. Ajouter 6 mL de solution de Dispase dans la plaque, en s’assurant que la peau est complètement immergée et incuber pendant la nuit en agitant légèrement à 4 °C.
      REMARQUE : Au lieu de Dispase, la digestion de la trypsine peut également être effectuée12, suivie d’un traitement Liberase au lieu de la Collagénase de type II (ci-dessous).

2. Isolement cellulaire du derme

  1. Jour 3
    REMARQUE : Gardez le matériel et l’équipement suivants à portée de main : centrifugeuse, incubateur de CO2 , enceinte de biosécurité, ciseaux, DMEM, 1 solution antibiotique-antimycosique, collagénase de type II, PBS, tube conique de 50 ml, plaques de culture tissulaire de 100 mm et 60 mm, solution d’ADN I, collagène de type I, filtres à cellules de 70 μm et 40 μm, filtres de seringue de 0,2 μm, milieu LEC.
    1. Préparez 500 mL de 1x PBS (1,37 M NaCl, 27 mM KCl, 100 mM Na2HPO4, 18 mM KH2PO4, pH 7,4) et autoclave pendant 20 min à 15 psi ou filtrez-stériliser. Vous pouvez également utiliser du PBS stérile disponible dans le commerce.
    2. Préparez 10 ml de solution de collagénase de type II à 2 mg/mL dans du DMEM avec 1 solution antibiotique-antimycosique et stérilisez-la.
      REMARQUE : Effectuez les étapes suivantes sous une hotte stérile pour réduire les risques de contamination de l’échantillon.
    3. À l’aide d’une pipette, retirez le liquide du plat.
    4. Utilisez des pinces pour séparer le derme (bas de la peau) de l’épiderme (haut) et retirez tout tissu adipeux évident. Transférez le derme dans une plaque de culture tissulaire propre.
    5. Ajoutez 1 ml de DMEM avec 1 solution antibiotique-antimycosique dans la plaque de culture tissulaire propre et inclinez-la de manière à ce que le liquide s’accumule d’un côté de la plaque.
    6. Coupez le derme en2 morceaux de 1 à 2 mm et transférez-les dans un nouveau tube conique de 50 ml.
      REMARQUE : Idéalement, cette étape doit être terminée dans un délai de 4 à 5 minutes, car un traitement plus long ne devrait pas permettre d’obtenir un rendement plus élevé ou une survie cellulaire.
    7. Ajouter 10 ml de la solution de collagénase de type II.
    8. Ajouter 50 μL (25 unités/mL de solution) de solution d’ADN I (réduit l’agglutination cellulaire) et digérer la solution pour le derme pendant 2 h à 37 °C en agitant continuellement (utiliser un incubateur rotatif/agitateur à 30-50 tr/min).
      REMARQUE : Vérifiez périodiquement pour identifier si la majeure partie du derme a été digérée. Si ce n’est pas le cas, augmentez le temps de digestion (1 h supplémentaire maximum) et la vitesse d’agitation, si possible.
    9. Enduire des plaques de culture tissulaire de 60 mm avec 2 ml de collagène de type I à 10 μg/mL dans de l’acide acétique 0,02 M pendant >20 min à 37 °C. Laver 2 fois avec du PBS stérile.
    10. Filtrer la suspension cellulaire à l’aide d’une crépine de 70 μm et centrifuger à 250 × g pendant 5 min. Jetez le surnageant.
    11. Mettre en suspension dans 10 mL de DMEM avec 1 solution antibiotique-antimycosique.
    12. Filtrer la suspension cellulaire à l’aide d’une crépine de 40 μm et centrifuger à 250 × g pendant 5 min. Jetez le surnageant.
    13. Mettre en suspension dans 1 mL de milieu LEC complet (milieu de base de croissance cellulaire endothéliale avec supplément).
    14. Plaquez les cellules dans la plaque de culture tissulaire de 60 mm recouverte de collagène dans un milieu LEC complet. Ce sera le jour 0 de la culture cellulaire.
    15. Remplacez le support tous les 2 jours en lavant deux fois les cellules avec 1x PBS et en ajoutant un nouveau support LEC.
    16. Répétez l’étape 2.1.15 jusqu’à ce que les cellules soient confluentes à 80-90 %.
      REMARQUE : Si la purification est effectuée avant que les cellules ne soient confluentes à 80-90%, moins de cellules endothéliales lymphatiques seront isolées. Ce processus prend environ 7 à 10 jours.

3. Revêtement de billes magnétiques avec anticorps LYVE-1

REMARQUE : Un jour avant l’étape de purification, préparez les matériaux et équipements suivants : réfrigérateur à 4 °C, rotor, séparateur magnétique, PBS, billes magnétiques IgG anti-lapin, tubes de microcentrifugation, filtres de seringue de 0,2 μm, solution de revêtement de billes magnétiques, anticorps LYVE-1.

  1. Préparez la solution de revêtement à billes magnétiques : 20 mL de PBS avec 0,1 % de BSA et 2 mM d’EDTA et stérilisez-la par filtre. Conservez-le à 4 °C.
    REMARQUE : Plus de quelques jours de stockage n’est pas recommandé ; Vérifiez la présence de précipités ou de contamination avant utilisation.
  2. Pipeter 500 μL de billes magnétiques IgG anti-lapin dans un tube de microcentrifugation et ajouter 1 mL de solution de revêtement de billes magnétiques glacée.
  3. Utilisez un séparateur magnétique pour laver les billes.
  4. Répétez les lavages 2 fois avec 1 mL de la solution glacée de revêtement à billes magnétiques.
  5. Remettre les billes en suspension dans 500 μL de solution de revêtement de billes magnétiques et faire des aliquotes de 150 μL dans des tubes de microcentrifugation.
  6. Ajouter 15 μg de l’anticorps LYVE-1 dans chaque tube (15 μL à partir d’une concentration d’anticorps de 1 mg/mL).
  7. Incuber toute la nuit à 4 °C en agitant continuellement.

4. Purification des cellules endothéliales lymphatiques

REMARQUE : Préparez le matériel et l’équipement suivants : incubateur de CO2 , agitateur, minuterie, parafilm, DMEM, 1x solution antibiotique-antimycosique, BSA, PBS, solution d’enrobage de billes magnétiques, trypsine-EDTA, plaques de culture tissulaire de 100 mm ou 60 mm, filtres de seringue de 0,2 μm, collagène de type I, acide acétique, milieu LEC.

  1. Préparez 50 ml de DMEM avec 1 solution antibiotique-antimycosique et 0,1 % de BSA et stérilisez-le par filtre.
  2. Enduire des plaques de culture tissulaire de 60 mm avec 10 μg/mL de collagène de type I dans de l’acide acétique 0,02 m pendant >20 min à 37 °C. Laver 2 fois avec du PBS stérile.
  3. Lavez les billes pré-enduites avec 1 ml de solution d’enrobage de billes magnétiques, à l’aide d’un séparateur magnétique.
  4. Remettre les billes en suspension dans 150 μL de DMEM avec 0,1 % de BSA.
    REMARQUE : Les billes peuvent désormais être stockées à 4 °C jusqu’à 1 mois.
  5. Lavez les cellules 2 fois avec du PBS.
  6. Ajouter 3 mL de DMEM avec 0,1 % de BSA (pour une plaque de culture tissulaire de 60 mm) et 50 μL de billes conjuguées aux anticorps dans les cellules.
    REMARQUE : Si les cellules de deux souris ou plus sont regroupées, utilisez une plaque de culture tissulaire de 100 mm et ajoutez 6 ml de DMEM avec 0,1 % de BSA.
  7. Fermez le plat avec du parafilm.
  8. Placez le plat sur un shaker en agitant à 10 tr/min à RT et incubez pendant exactement 10 min.
    REMARQUE : Une incubation plus longue entraînera une liaison non spécifique. Pour vous assurer que les billes interagissent avec toute la surface de la plaque, faites pivoter manuellement la plaque toutes les quelques minutes pendant qu’elle continue de trembler.
  9. Jetez le milieu et lavez les cellules une fois avec du PBS. Inspectez rapidement les cellules pour vérifier la présence de colonies de LEC sur la plaque.
  10. Trypsiniser les cellules : utiliser 1 mL de trypsine-EDTA et incuber 3 min à 37 °C. Inspectez les cellules pour vous assurer que le détachement des cellules est réussi.
  11. Neutraliser la solution avec 2 mL de milieu LEC complet et transférer la solution dans un tube stérile en polypropylène de 5 mL.
  12. À l’aide d’un séparateur magnétique, laver les cellules 4 x 3 mL de DMEM avec 0,1 % de BSA pour éliminer les cellules non liées.
  13. Remettez en suspension les cellules restantes liées aux billes dans un milieu LEC complet et la plaque sur les plaques de culture tissulaire de 60 mm préalablement recouvertes de collagène.
  14. Incuber les cellules à 37 °C et changer de média tous les deux jours après deux lavages PBS à chaque fois.
  15. Cultivez les cellules jusqu’à ce qu’elles atteignent la confluence (cela prend normalement 7 à 10 jours).
  16. À ce stade, vérifiez la confluence des cellules au microscope et procédez à la préparation des cellules pour la cytométrie en flux. Si un pourcentage élevé de F4/80+ est identifié, répétez l’étape de purification avec LYVE-1 (Étape 4 : Purification des cellules endothéliales lymphatiques) à nouveau ou, idéalement, un autre marqueur lymphatique (c’est-à-dire la podoplanine14).
    REMARQUE : L’expression élevée de la protéine ciblée par l’anticorps sur la population cellulaire purifiée par billes magnétiques a été démontrée15,16. Cependant, pour LYVE-1, il est important d’effectuer un contrôle par cytométrie en flux pour l’identification du pourcentage d’autres cellules LYVE-1+, principalement des macrophages. LYVE-1 n’est exprimé que dans des sous-ensembles de macrophages associés à des tumeurs et des plaies, tandis que dans une peau saine, l’expression de LYVE-1 est plus restreinte aux cellules endothéliales lymphatiques17. Ainsi, le dépistage F4/80 n’est pas obligatoire, mais dépend plutôt du contexte expérimental. Les souris utilisées pour la démonstration ne portaient pas de tumeurs ou de blessures, mais seulement une inflammation potentielle due à l’épilation, mais nous avons inclus la coloration F4/80 comme référence du pourcentage de macrophages LYVE-1+.

5. Cytométrie en flux

REMARQUE : Préparez le matériel et l’équipement suivants : centrifugeuse, incubateur de CO2 , minuterie, hémocytomètre, solution EDTA, 1x solution antibiotique-antimycosique, BSA, PBS, trypsine-EDTA, tubes en polypropylène, filtres à seringue de 0,2 μm, éthanol à 70 %, anticorps conjugués F4/80 FITC.

  1. Préparez du PBS contenant 0,1 % de BSA et stérilisez-le par filtre.
  2. Préparer une solution de 1 mM d’EDTA dans le PBS.
  3. Trypsiniser les cellules : incuber les cellules avec 1 mL de solution d’EDTA 1 mM pendant 5 min à 37 °C.
    REMARQUE : L’incubation avec une solution d’EDTA est une méthode plus douce de détachement cellulaire, qui préserve mieux les protéines transmembranaires et est préférée, mais elle nécessite des périodes d’incubation plus longues. Alternativement, la solution trypsine-EDTA peut être utilisée pour une incubation de 1 minute à 37 °C, mais cela peut affecter l’affinité des anticorps pour les applications de cytométrie en flux.
  4. Neutraliser la solution avec 2 mL de milieu LEC complet et transférer la solution dans un tube stérile en polypropylène de 5 mL.
  5. Centrifuger les échantillons à 250 × g pendant 5 min.
  6. Laver avec du PBS.
  7. Répétez la centrifugation et le lavage PBS.
  8. Remettez en suspension les cellules dans un PBS contenant 0,1 % de BSA et comptez-les à l’aide d’un hémocytomètre ou d’une autre méthode. Aliquote ~1 × 106 cellules dans des tubes en polypropylène d’un volume final de 100 μl. À partir de cette étape, effectuez toutes les étapes à 4 °C.
    REMARQUE : Les cellules peuvent être fixées avant la coloration ou colorées vivantes. La fixation peut être sous-optimale pour la cytométrie en flux, car certains anticorps peuvent ne pas détecter les antigènes après la fixation ; Par conséquent, nous vous recommandons d’exécuter la cytométrie en flux immédiatement après l’étape précédente et de sauter l’étape de fixation. Si cela n’est pas possible, une fixation préalable à l’expérience de cytométrie en flux permettra un retard dans l’étape de cytométrie en flux. Si la fixation doit être effectuée, la performance des anticorps dans le contexte des cellules fixes doit être évaluée à l’avance.
  9. Effectuer la fixation (étape facultative ; si les cellules ne sont pas à fixer, procéder à l’immunomarquage) : remettre les cellules en suspension dans de l’éthanol glacé à 70% et mélanger doucement pendant 10 min sur de la glace.
    REMARQUE : La fixation à l’éthanol peut perméabiliser les cellules et entraîner la libération de GFP ; Cependant, la fixation à base de paraformaldéhyde peut détruire les colorants utilisés pour la cytométrie en flux et, idéalement, peut être évitée.
  10. Incuber 15 min à température ambiante.
  11. Laver les cellules 2x par centrifugation à 250 × g pendant 5 min dans 1x PBS.
  12. Passez à l’étape suivante ou mettez les cellules en suspension dans 0,5 à 1 mL de 1x PBS et conservez-les à 4 °C.

6. Immunocoloration

REMARQUE : Manipulez les cellules avec précaution et évitez le pipetage prolongé, si possible, afin de maintenir l’intégrité de la membrane cellulaire et de minimiser la mort cellulaire, en veillant à ce que les cellules ne forment pas d’amas. À partir des cellules endothéliales isolées, préparez les groupes suivants : cellules non colorées et cellules colorées avec un autre marqueur de cellules endothéliales (c.-à-d. VEGFR3, podoplanine), F4/80, et les deux. Inclure les cellules endothéliales lymphatiques et les macrophages de souris disponibles dans le commerce, le cas échéant, en tant que témoins positifs. À des fins de démonstration, et en raison de la fluorescence endogène tdTomato (PE+), nous avons utilisé la coloration F4/80 conjuguée FITC.

  1. Diluer l’anticorps primaire dans le PBS avec 0,1 % de BSA selon la dilution recommandée ou optimisée. Ajouter 0,5 μg (1 μL de solution d’anticorps) de l’anticorps conjugué F4/80 FITC aux 100 μL de suspension cellulaire.
  2. Remettre les cellules en suspension après l’ajout de l’anticorps conjugué fluorescent dilué. Mélangez en effleurant le tube de polypropylène pour vous assurer qu’il n’y a pas d’amas et que toutes les cellules sont correctement revêtues.
  3. Incuber 1 h à température ambiante (cellules fixes) ou 30 min sur glace (cellules vivantes) dans l’obscurité.
  4. Laver les cellules 2 fois en les centrifugeant à 250 × g pendant 5 min à 4 °C (pour les cellules vivantes) ou à température ambiante (pour les cellules fixes), en utilisant du PBS avec 0,1 % de BSA dans l’obscurité.
  5. Pour les anticorps non conjugués par fluorescence
    1. Diluer l’anticorps secondaire conjugué au fluorochrome dans le tampon d’incubation. Pour les anticorps Alexa Flour, utilisez une dilution de 1:500.
    2. Ajouter l’anticorps secondaire à 100 μL de solution de suspension cellulaire.
    3. Incuber pendant 30 min à température ambiante (cellules fixes) ou sur glace (cellules vivantes).
    4. Laver deux fois par centrifugation à 250 × g pendant 5 min à 4 °C (pour les cellules vivantes) ou à température ambiante (pour les cellules fixes) dans le tampon d’incubation.
  6. Remettre les cellules en suspension dans 0,5 mL de 1x PBS et les analyser à l’aide d’un cytomètre en flux.
  7. Suivez ces étapes de stratégie de contrôle pour identifier la population de macrophages dans les cellules exprimant LYVE-1 :
    1. Tenez compte de la diffusion vers l’avant et sur les côtés pour distinguer la population cellulaire.
    2. Envisagez une diffusion vers l’avant pour la taille, l’aire et la hauteur des cellules afin de distinguer les cellules individuelles (singlets).
    3. Prendre en compte l’expression de F4/80 (FITC) et l’expression de RFP (PE) pour identifier les macrophages (F4/80+) dans les cellules murines isolées exprimant tdTomato (PE) (en raison de la présence d’un rapporteur tdTomato fluorescent chez les souris spécifiques, décrites ci-dessous).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La méthode a été développée pour identifier l’expression protéique d’une petite GTPase, RhoA, dont le gène codant a été floxé dans les deux allèles et supprimé sous l’effet du promoteur endothélial lymphatique spécifique induit par le tamoxifène, Prox1-CreERT2 18. Les LEC isolés peuvent être cultivés jusqu’à quatre générations, après quoi ils deviennent sénescents. Ils ont été congelés, décongelés et stimulés avec succès avec de l’angiopoïétine-2. En raison du nombre limité de ...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le système lymphatique est un régulateur important de la fonction homéostatique du corps, les fonctions les plus importantes étant le maintien du plasma liquide, l’élimination des sous-produits du métabolisme cellulaire et des molécules toxiques, l’absorption des lipides et le trafic des cellules immunitaires 1,19. L’identification de marqueurs appropriés a provoqué une explosion de nouvelles données dans le domaine lymphatique, révélant de nouvelles fonctions du...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce travail a été soutenu par la Fondation hellénique pour la recherche et l’innovation (00376), les National Institutes of Health, le National Cancer Institute (NCI) [Grant R15CA231339], la subvention de l’école de pharmacie du Texas Tech University Sciences Center (TTUHSC) School of the Sciences Office of the Sciences (à C.M.M.), et par le College of Pharmacy, University of Louisiana Monroe start-up, les National Institutes of Health (NIH) par l’intermédiaire du National Institute of General Medical Science [Subvention P20 GM103424-21] et le Research Competitiveness Subprogram (RCS) du Louisiana Board of Regents par l’intermédiaire du Board of Regents Support Fund (LEQSF(2021-24)-RD-A-23) (à G.M.). L’équipement TTUHSC commun utilisé a été obtenu grâce aux subventions RP190524 et RP200572 de l’Institut de recherche sur la prévention du cancer du Texas (CPRIT). Les bailleurs de fonds n’ont joué aucun rôle dans la conception de l’étude, la décision d’écrire ou la préparation du manuscrit. Le résumé graphique de la figure 1A a été créé avec BioRender.com.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0,2 &mu ; m Filtres à seringueFisher Scientific09-719C
Boîtes de culture tissulaire 100 mmFisher ScientificFB012924
60 mm Boîtes de culture tissulaireFisher ScientificFB012921
Tondeuse à poils d’animauxWahl
Solution antibiotique-antimycosique 100xFisher Scientific15240-062
Pince émousséeOutils scientifiques fins11992-20
Albumine sérique bovineSigma-AldrichA4919
Passoire cellulaire 40 &mu ; mFisher Scientific542040
Filtre à cellules 70 &mu ; mFisher Scientific542070
Incubateur
Collagène I, haute concentration Queue de ratCorning354249diluer dans 0,02 M Acide acétique dans H2O
Collagénase Type IILife Technologies17101-015
DispaseLife Technologies17105-041
DMEMFisher Scientific11-995-073
Solution d’ADN I (2 500 U/mL)Thermo Scientific90083
Dynal MPC-L Concentrateur de particulesmagnétiques Invitrogen120-21D
EDTASigma-Aldrich3690
Base de croissance des cellules endothéliales Medium & Supplément (moyen LEC)R& D SystemsCCM027
Chambre d’euthanasieEuthanex Corporation
ForcepsOutils scientifiquesfins 11255-20
Ciseaux fins-Outils scientifiques fins tranchants14060-10
FITC anti-souris F4/80 Anticorps Biolegend123107
Perles magnétiques IgG anti-lapin de chèvreNew England BiolabsS1432S
LARC-A E-Z Chambre d’induction d’anesthésieEuthanex Corporation
MagnaBind Goat Anti-Rabbit IgG BeadsThermo Scientific21356
Paraformaldehyde Solution 4 % dans PBSFisher ScientificAAJ19943K2
Phosphate Buffered Saline (PBS)Fisher ScientificSH30256FS
Rabbit Anti-souris LYVE-1ReliaTech GmbH103-PA50
rotatif/secouant
Tubes en polypropylène à fond rondCorning352063
Filtres à seringue w 0.2 &mu ; m PoresFisher Scientific09-719C
Trypsine-EDTAFisher Scientific25-300-120
de CO2 fins Incubateur

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Oliver, G., Kipnis, J., Randolph, G. J., Harvey, N. L. The lymphatic vasculature in the 21(st) century: novel functional roles in homeostasis and disease. Cell. 182 (2), 270-296 (2020).
  2. Liu, X., et al. Lymphoangiocrine signals promote cardiac growth and repair. Nature. 588 (7839), 705-711 (2020).
  3. Biswas, L., et al. Lymphatic vessels in bone support regeneration after injury. Cell. 186 (2), 382-397 (2023).
  4. Tammela, T., Alitalo, K. Lymphangiogenesis: molecular mechanisms and future promise. Cell. 140 (4), 460-476 (2010).
  5. Ji, R. C. The role of lymphangiogenesis in cardiovascular diseases and heart transplantation. Heart Failure Reviews. 27 (5), 1837-1856 (2022).
  6. Patnam, M., et al. Lymphangiogenesis guidance mechanisms and therapeutic implications in pathological states of the cornea. Cells. 12 (2), 319(2023).
  7. Lokmic, Z., et al. Isolation of human lymphatic endothelial cells by multi-parameter fluorescence-activated cell sorting. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (99), e52691(2015).
  8. Jackson, D. G. Biology of the lymphatic marker LYVE-1 and applications in research into lymphatic trafficking and lymphangiogenesis. APMIS: Acta Pathologica, Microbiologica, et Immunologica Scandinavica. 112 (7-8), 526-538 (2004).
  9. Makinen, T., et al. PDZ interaction site in ephrinB2 is required for the remodeling of lymphatic vasculature. Genes and Development. 19 (3), 397-410 (2005).
  10. Wolters, G. H., Vos-Scheperkeuter, G. H., Lin, H. C., van Schilfgaarde, R. Different roles of class I and class II Clostridium histolyticum collagenase in rat pancreatic islet isolation. Diabetes. 44 (2), 227-233 (1995).
  11. Kubo, A., Aoki, S., Fujita, H. Whole-mount preparation and microscopic analysis of epidermis. Current Protocols. 2 (7), e464(2022).
  12. Thiele, W., Rothley, M., Schmaus, A., Plaumann, D., Sleeman, J. Flow cytometry-based isolation of dermal lymphatic endothelial cells from newborn rats. Lymphology. 47 (4), 177-186 (2014).
  13. Kazenwadel, J., Michael, M. Z., Harvey, N. L. Prox1 expression is negatively regulated by miR-181 in endothelial cells. Blood. 116 (13), 2395-2401 (2010).
  14. Lapinski, P. E., King, P. D. Isolation and culture of mouse lymphatic endothelial cells from lung tissue. Methods in Molecular Biology. 2319, 69-75 (2021).
  15. Choi, E. Y., et al. Del-1, an endogenous leukocyte-endothelial adhesion inhibitor, limits inflammatory cell recruitment. Science. 322 (5904), 1101-1104 (2008).
  16. Mikelis, C. M., et al. RhoA and ROCK mediate histamine-induced vascular leakage and anaphylactic shock. Nature Communications. 6, 6725(2015).
  17. Schledzewski, K., et al. Lymphatic endothelium-specific hyaluronan receptor LYVE-1 is expressed by stabilin-1+, F4/80+, CD11b+ macrophages in malignant tumours and wound healing tissue in vivo and in bone marrow cultures in vitro: implications for the assessment of lymphangiogenesis. Journal of Pathology. 209 (1), 67-77 (2006).
  18. Akwii, R. G., et al. Angiopoietin-2-induced lymphatic endothelial cell migration drives lymphangiogenesis via the beta1 integrin-RhoA-formin axis. Angiogenesis. 25 (3), 373-396 (2022).
  19. Petrova, T. V., Koh, G. Y. Biological functions of lymphatic vessels. Science. 369 (6500), eaax4063(2020).
  20. Fidler, I. J. The pathogenesis of cancer metastasis: the 'seed and soil' hypothesis revisited. Nature Reviews. Cancer. 3 (6), 453-458 (2003).
  21. Mellor, R. H., et al. Lymphatic dysfunction, not aplasia, underlies Milroy disease. Microcirculation. 17 (4), 281-296 (2010).
  22. Connell, F., Brice, G., Mortimer, P. Phenotypic characterization of primary lymphedema. Annals of the New York Academy of Sciences. 1131, 140-146 (2008).
  23. Croteau, S. E., et al. Kaposiform lymphangiomatosis: a distinct aggressive lymphatic anomaly. Journal of Pediatris. 164 (2), 383-388 (2014).
  24. Ji, Y., Chen, S., Peng, S., Xia, C., Li, L. Kaposiform lymphangiomatosis and kaposiform hemangioendothelioma: similarities and differences. Orphanet Journal of Rare Diseases. 14 (1), 165(2019).
  25. Kriehuber, E., et al. Isolation and characterization of dermal lymphatic and blood endothelial cells reveal stable and functionally specialized cell lineages. Journal of Experimental Medicine. 194 (6), 797-808 (2001).
  26. Podgrabinska, S., et al. Molecular characterization of lymphatic endothelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (25), 16069-16074 (2002).
  27. Garrafa, E., et al. Isolation, purification, and heterogeneity of human lymphatic endothelial cells from different tissues. Lymphology. 38 (4), 159-166 (2005).
  28. Kazenwadel, J., Secker, G. A., Betterman, K. L., Harvey, N. L. In vitro assays using primary embryonic mouse lymphatic endothelial cells uncover key roles for FGFR1 signalling in lymphangiogenesis. PLoS One. 7 (7), e40497(2012).
  29. Steele, M. M., et al. T cell egress via lymphatic vessels is tuned by antigen encounter and limits tumor control. Nature Immunology. 24 (4), 664-675 (2023).
  30. Mammoto, T., et al. Effects of age-dependent changes in cell size on endothelial cell proliferation and senescence through YAP1. Aging. 11 (17), 7051-7069 (2019).
  31. Regina, C., et al. Vascular ageing and endothelial cell senescence: Molecular mechanisms of physiology and diseases. Mechanisms of Ageing and Development. 159, 14-21 (2016).
  32. Muhleder, S., Fernandez-Chacon, M., Garcia-Gonzalez, I., Benedito, R. Endothelial sprouting, proliferation, or senescence: tipping the balance from physiology to pathology. Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 78 (4), 1329-1354 (2021).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Demander l’autorisation de réutiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demander une autorisation

Mots-clés

Cellules endoth liales lymphatiquesIsolation du derme murinPurification par billes magn tiquesExpression de LYVE1Capillaires lymphatiques dermiquesDigestion la collag nasePlaque de culture cellulaireSouris transg niquesFiltration sur tamis cellulaireTrypsinisation

Articles connexes