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Article de méthode

Criblage de modification des histones par chromatographie liquide, spectrométrie de mobilité des ions piégés et spectrométrie de masse à temps de vol

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DOI :

10.3791/65589

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12 janvier 2024

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1Department of Chemistry and Biochemistry, Florida International University, 2Bruker Daltonics Inc., 3Department of Biochemistry and Molecular Biophysics, Washington University School of Medicine, 4Biomolecular Sciences Institute, Florida International University

Dans cet article

Résumé

Un flux de travail analytique basé sur la chromatographie liquide, la spectrométrie de mobilité des ions piégés et la spectrométrie de masse à temps de vol (LC-TIMS-TOF MS/MS) pour une analyse ascendante hautement fiable et hautement reproductible des modifications et de l’identification des histones en fonction des principaux paramètres (temps de rétention [RT], section efficace de collision [CCS] et rapport masse/charge précis [m/z]).

Résumé

Les protéines d’histones sont très abondantes et conservées chez les eucaryotes et jouent un rôle important dans la régulation des gènes grâce à des structures connues sous le nom de modifications post-traductionnelles (PTM). L’identification de la position et de la nature de chaque PTM ou modèle de PTM par rapport à des facteurs externes ou génétiques permet de corréler statistiquement cette information avec des réponses biologiques telles que la transcription, la réplication ou la réparation de l’ADN. Dans le présent travail, un protocole analytique à haut débit pour la détection des PTM d’histones à partir d’échantillons biologiques est décrit. L’utilisation de la chromatographie liquide complémentaire, de la spectrométrie de mobilité des ions piégés et de la spectrométrie de masse à temps de vol (LC-TIMS-TOF MS/MS) permet de séparer et d’attribuer PTM les modifications les plus pertinentes sur le plan biologique en une seule analyse. L’approche décrite tire parti des développements récents de l’acquisition de données dépendantes (DDA) en utilisant l’accumulation parallèle dans le piège de mobilité, suivie d’une fragmentation séquentielle et d’une dissociation induite par la collision. Les PTM d’Histones sont attribués en toute confiance en fonction de leur temps de rétention, de leur mobilité et de leur modèle de fragmentation.

Introduction

Dans les cellules eucaryotes, l’ADN est emballé sous forme de chromatine dans des unités fonctionnelles appelées nucléosomes. Ces unités sont composées d’un octamère de quatre histones centrales (deux de chacune des catégories H2A, H2B, H3 et H4)1,2,3,4. Les histones sont parmi les protéines les plus abondantes et les mieux conservées chez les eucaryotes, qui sont en grande partie responsables de la régulation des gènes5. Les modifications post-traductionnelles des histones (PTM) jouent un rôle important dans la régulation de la dynamique de la chromatine et truquent divers processus biologiques tels que la transcription, la réplication et la réparation de l’ADN6. Les PTM se produisent principalement sur la surface accessible des régions N-terminales des histones qui sont en contact avec l’ADN 3,7. Cependant, les modifications de la queue et du noyau influencent la structure de la chromatine, modifiant les interactions internucléosomiques et recrutant des protéines spécifiques 3,8.

Un défi actuel de la protéomique basée sur la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse (LC-MS) est la coélution potentielle d’analytes d’intérêt. Dans le cas des analyses dépendantes des données (DDA), cela se traduit par la perte potentielle de plusieurs ions précurseurs au cours du processus d’acquisition MS/MS9. Les instruments à temps de vol (ToF) acquièrent des spectres à très haute fréquence 9,10 (jusqu’à des dizaines de kHz)11 ; cela les rend capables de balayer rapidement les ions précurseurs totaux dans un échantillon complexe (MS1), promettant ainsi une sensibilité et des taux de séquençage MS/MS optimaux (jusqu’à 100 Hz)9 et les rendant idéaux pour l’analyse d’échantillons biologiques10. Néanmoins, la sensibilité disponible à ces vitesses de balayage élevées est limitée par le taux MS/MS9. L’ajout de la spectrométrie de mobilité des ions piégés (TIMS) en combinaison avec un spectromètre de masse orthogonal quadripolaire à temps de vol (qToF) a été utilisé pour atténuer ces limitations. Dans TIMS, tous les ions précurseurs sont accumulés en tandem et élués en fonction de leur mobilité, plutôt que de sélectionner des masses précurseurs uniques avec unquadripôle 9. La fragmentation en série par accumulation parallèle (PASEF) permet des centaines d’événements MS/MS par seconde sans aucune perte de sensibilité9.

L’objectif principal de ce travail était de montrer les développements récents de la DDA en utilisant une accumulation parallèle dans le piège de mobilité suivie d’une fragmentation séquentielle et d’une dissociation induite par collision (CID). Les PTM d’Histones ont été attribués en toute confiance en fonction de leurs temps de rétention (RT), de leurs mobilités et de leurs modèles de fragmentation.

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Protocole

REMARQUE : Les échantillons d’histones ont été extraits à l’aide d’une méthode adaptée de Bhanu et al. (2020)12.

1. Préparation des échantillons

  1. Récolte de cellules cultivées
    1. Lorsque les cellules sont confluentes à 80 %, assurez-vous qu’elles sont viables en excluant le bleu trypan.
      REMARQUE : Une lignée cellulaire HeLa S3 a été utilisée pour ces expériences, mais cette méthode peut être appliquée à n’importe quelle cellule cultivée.
    2. Aspirer le milieu, puis appliquer 5 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) sur chaque plaque.
    3. Faites tourner la ou les plaques pour rincer tous les résidus de milieu, puis aspirez le PBS et appliquez 5 mL de 1x PBS.
    4. Séparez délicatement les cellules de la plaque en les grattant avec un lève-cellule jetable.
    5. Transférer chaque suspension cellulaire dans un tube conique de 15 ml.
    6. Granuler les cellules par centrifugation à 800 x g pendant 5 min.
    7. Aspirez le PBS de la pastille cellulaire.
    8. Procédez à l’extraction des histones.
      REMARQUE : Congelez rapidement la pastille de cellule dans de l’azote liquide si elle ne peut pas être traitée immédiatement. Conservez les granulés à -80 °C jusqu’au moment de continuer.
  2. Extraction d’histones
    1. Estimez le volume de chaque pastille cellulaire et marquez le ménisque avec un marqueur permanent.
    2. Préparez suffisamment de tampon d’isolement nucléaire (NIB ; 15 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 15 mM de NaCl, 60 mM de KCl, 5 mM de MgCl2, 1 mM de CaCl2 et 250 mM de saccharose) pour tous les échantillons. Alternativement, si de nombreux échantillons doivent être traités au fil du temps, préparez le tampon en vrac et stockez-le à 2-8 °C jusqu’à 6 mois, ou aliquotez-le et congelez-le indéfiniment à -15 °C à -25 °C en décongelant uniquement la quantité nécessaire pour chaque extraction.
      REMARQUE : La mémoire tampon doit rester dégagée pendant le stockage. Si le tampon prend un aspect trouble ou anormal à tout moment, jetez-le et préparez un nouveau tampon.
    3. Préparer 50 fois le volume des pastilles cellulaires du tampon de lavage et ajouter les inhibiteurs comme suit (environ 10 ml de tampon de lavage pour 2 échantillons).
      1. Pour préparer 10 mL de tampon de lavage, mélanger 10 mL de NIB, 30 μL de 200 mM de chlorhydrate de fluorure de 4-(2-aminoéthyl)benzènesulfonyle [AEBSF], 10 μL de 1 M de dithiothréitol [DTT], 20 μL de microcystine 5 μM, 20 μL de 5 M de butyrate de sodium.
    4. Retirez 1/5 du tampon de lavage pour préparer le tampon de lyse (1/5 du volume du tampon de lavage, 0,3 % de NP-40 ou NP-40).
      REMARQUE : N’utilisez pas Triton-X 100 à la place du NP-40 ou de l’alternative NP-40, car il peut être trop abrasif pour certains types de cellules.
    5. Lavez soigneusement la pastille cellulaire en la suspendant dans 5 colonnes de tampon de lavage et en la centrifugant à 800 x g pendant 5 min à 4 °C. Effectuez cette étape deux fois, en aspirant et en jetant le surnageant entre les lavages.
    6. Assurez-vous que le volume de la pastille de cellule est toujours marqué avec un marqueur permanent. Remettre en suspension dans 10 volumes de tampon de lyse.
    7. Mélangez soigneusement chaque pastille à la pipette pour la remettre en suspension, puis incubez pendant 15 minutes sur de la glace.
    8. Après 15 min, centrifuger à 800 x g pendant 5 min à 4 °C.
    9. Aspirer et jeter le surnageant.
      REMARQUE : Le plomb doit réduire à ≤ 1/2 la taille du plomb d’origine (comme indiqué par la ligne de marqueur). Si la pastille n’a pas suffisamment réduit, répétez la procédure de lyse et incluez une étape d’homogénéisation douce à l’aide d’un pilon pour ouvrir les cellules.
    10. Une fois la lyse terminée, remettre la pastille en suspension dans 500 μL de tampon de lavage, puis centrifuger à 800 x g pendant 5 min à 4 °C. Aspirez et jetez le surnageant, puis répétez l’étape de lavage une fois de plus pour éliminer toute trace de NP-40.
      REMARQUE : À ce stade, la pastille est constituée de chromatine, qui contient des histones.
    11. Remettre le granulé en suspension dans 5 volumes (de la taille de la pastille cellulaire d’origine) de 0,4 N H2SO4.
    12. Incuber pendant 2 h dans une chambre froide ou un réfrigérateur à l’aide d’un agitateur.
    13. Après 2 h, centrifuger le ou les échantillons à 3400 x g pendant 5 min à 4 °C. Ne jetez pas le surnageant.
    14. Transférez le surnageant dans de nouveaux tubes et augmentez l’acide trichloracétique (TCA) à 100 % pour atteindre 1/3 du volume du contenu (la concentration finale de TCA sera d’environ 20 %).
    15. Retournez doucement le tube et observez que la solution claire et incolore devient blanche et/ou trouble, indiquant une précipitation de protéines.
      REMARQUE : Pour les solutions à faible concentration d’histones, la précipitation des protéines peut ne pas être immédiatement perceptible, mais le précipité doit être visible après l’incubation pendant la nuit.
    16. Incuber sans perturbation pendant la nuit (12-18 h) à 4 °C pour précipiter complètement les protéines des histones.
    17. Le lendemain, centrifuger à 3400 x g pendant 5 min à 4 °C.
    18. Aspirer le surnageant en faisant attention de ne pas toucher les côtés du tube avec la pointe de la pipette. À ce stade, les histones sont déposées principalement sous forme de film sur les côtés du ou des tubes.
    19. Ajouter 500 μL d’acétone glacée + 0,1 % de HCl (acétone acide) dans chaque tube, à l’aide d’une pipette Pasteur en verre, puis retourner doucement le(s) tube(s) plusieurs fois. Disposez les échantillons dans l’ordre (1, 2, 3, etc.) en faisant cela, car toute acétone errante peut enlever les marques sur les tubes. Centrifuger à 3400 x g pendant 5 min à 4 °C et décanter doucement le surnageant.
    20. Répétez cette étape de rinçage avec 500 μL d’acétone 100 % glacée, également avec une pipette Pasteur en verre. Centrifuger à 3400 x g pendant 5 min à 4 °C et décanter doucement le surnageant.
    21. Laissez les tubes sécher à température ambiante jusqu’à ce que l’acétone restante se soit évaporée.
    22. Une fois sec, ajoutez 100 μL d’eau de qualité spectrométrie de masse (MS) dans chaque tube. Utilisez cette gouttelette pour écouvillonner tous les côtés du récipient afin de remettre en suspension l’ensemble du film d’histones. Pour ce faire, pipetez la gouttelette sur le côté du tube et faites-la tourner tout en pipetant de haut en bas ou en distribuant la moitié des 100 μL et en utilisant la pointe pour la remuer tout autour. Une combinaison des deux méthodes fonctionne mieux. Les histones sont facilement solubles dans l’eau et seront dans la solution.
    23. Après avoir remis tous les échantillons en suspension, s’il reste du solide blanc, sonicer dans un bain à température ambiante pendant 5 min.
    24. Centrifuger à 800 x g pendant 5 min à 4 °C. Transférer la solution claire dans des tubes frais. Jeter toute pastille insoluble restante.
    25. Exécutez une SDS-PAGE dans des conditions réductrices pour vérifier que l’extraction est propre.
      REMARQUE : Les gels peuvent être utilisés en utilisant n’importe quelle concentration appropriée de polyacrylamide tant qu’il peut différencier les protéines dans la gamme de 10 à 20 kDa. Voir le tableau des matériaux pour les gels utilisés dans ce protocole.
    26. Effectuer un test de concentration de protéines (c.-à-d. Bradford ou BCA) pour déterminer la concentration totale de protéines.
  3. Dérivation chimique (propionylation) des résidus de lysine
    1. Transférez 20 μg d’histones (déterminées par le dosage des protéines) dans un tube propre. Sécher cet échantillon à <5 μL à l’aide d’un concentrateur sous vide, puis remettre en suspension avec 20 μL de bicarbonate d’ammonium à 100 mM (NH4CO3) (~1 μg/μL de solution). Ajustez le pH à ~8 en utilisant de l’hydroxyde d’ammonium si nécessaire.
      ATTENTION : N’utilisez pas d’hydroxyde d’ammonium (NH4OH) pour remettre en suspension, uniquement pour ajuster le pH si nécessaire. Sinon, les protéines se dénatureront et précipiteront.
      REMARQUE : Pour vérifier le pH avec une perte d’échantillon minimale, utilisez une pointe de pipette pour tremper l’échantillon et tamponnez sur une bandelette de pH. Cette procédure de test sera utile tout au long des étapes restantes de la préparation des échantillons.
    2. Préparez le réactif de propionation en ajoutant de l’anhydride propionique à l’acétonitrile (ACN) dans un rapport de 1 :3 (v/v) (c.-à-d. pour obtenir 40 μL de réactif, combinez 10 μL d’anhydride propionique avec 30 μL d’ACN).
      REMARQUE : Traditionnellement, le méthanol ou l’isopropanol ont été utilisés dans la préparation d’un réactif de propionylation. Comme la propionylation est une réaction de formation d’amides, un solvant non protonique, comme l’acétonitrile, est nécessaire pour prévenir les produits secondaires et les réactions indésirables, tels que l’ester méthylpropionylique, qui résulte de l’utilisation du méthanol. Ne préparez suffisamment de réactif de propionylation que pour un maximum de 4 échantillons à la fois afin que le réactif reste frais. Utilisez le réactif dans les 1 à 2 minutes suivant la préparation. Au fur et à mesure que le réactif repose, l’anhydride propionique réagit avec l’humidité ambiante et l’acide acétique commence à se former, ce qui peut modifier l’efficacité du réactif et modifier le pH de la solution d’histones une fois le réactif ajouté.
    3. Ajouter le réactif de propionylation à chaque échantillon dans un 1 :4 (v/v) (c.-à-d. pour 20 μL d’histones, ajouter 5 μL de réactif de propionylation).
    4. Ajouter rapidement 1 :5 (v/v) NH4OH (c.-à-d. ajouter 4 μL pour 20 μL de solution d’histones) pour rétablir le pH de la solution à ~8. Si le pH est encore trop bas, ajoutez 1 à 2 μL de NH4OH à la fois jusqu’à ce qu’un pH de 8 soit atteint. En règle générale, un rapport de 1 :5 (v/v) est suffisant.
    5. Incuber les échantillons à température ambiante pendant 15 min sans perturbation.
    6. Répétez la réaction de propionylation pour un maximum de 3 à 4 échantillons par lot de réactif de propionylation afin d’assurer une formation minimale d’acide.
    7. Répétez les étapes 1.3.2 à 1.3.5 de la procédure de propionylation. Un deuxième cycle de propionylation garantit que >95 % des lysines disponibles sont dérivées.
    8. Sécher les échantillons à <5 μL à l’aide d’un concentrateur sous vide. Cela évaporera tout réactif de proponylation n’ayant pas réagi, les produits acides et l’ammoniac gazeux libérés par le NH4OH. Si les échantillons sèchent complètement, ce n’est pas grave, car il n’y a pas de pertes d’échantillons significatives.
      REMARQUE : Déplacer l’air dans la bouteille d’anhydride propionique avec du gaz argon avant le stockage pour éviter la formation d’acide acétique due au contact de l’humidité ambiante restant dans la bouteille.
  4. Digestion protéolytique à la trypsine
    1. Remettre en suspension les histones dans 100 mM de NH4HCO3 pour obtenir un volume de 20 μL, atteignant une concentration optimale de 1 μg/μL.
      REMARQUE : Les solutions d’échantillons avec des concentrations inférieures à 1 μg/μL entraîneront une diminution de l’efficacité de la trypsine.
    2. Ajouter de la trypsine aux échantillons d’histones dans un rapport de 1 :10 (poids/poids) (c.-à-d. ajouter 2 μL de solution de trypsine à 1 μg/μL à 20 μg d’histones).
    3. Incuber les réactions à 37 °C pendant 6 à 8 h. Vous pouvez également incuber pendant une nuit (12 à 18 h) à température ambiante.
    4. Arrêter la digestion en congelant à -80 °C pendant au moins 1 h.
      REMARQUE : N’utilisez pas d’acide pour éteindre la réaction de digestion, car cela provoquerait une baisse indésirable du pH à ce stade de la procédure. L’échantillon peut être stocké à -80 °C jusqu’à ce qu’il soit prêt à partir (point d’arrêt intermédiaire).
  5. Dérivation chimique (propionylation) de N-terminaux peptidiques
    1. Sécher les échantillons à <5 μL à l’aide d’un concentrateur sous vide.
    2. Remettre les échantillons en suspension jusqu’à 20 μL (1 μg/μL) en utilisant 100 mM de NH4HCO3.
    3. Répétez la propionylation comme précédemment (étape 1.3).
      REMARQUE : Il est normal que les échantillons mettent plus de temps à sécher à cette étape en raison d’un rapport phase aqueuse/organique plus élevé.
  6. Dessalage d’échantillons avec des pointes de scène
    1. Mettre les échantillons en suspension ou diluer avec 50 μL d’eau de qualité MS + 0,1 % d’AGT.
    2. À l’aide d’un carottier d’échantillon 11-G, perforez 5 disques de matériau C18 à partir d’un disque d’extraction en phase solide (perforez les 5 disques avant de les transférer à la pointe de la pipette). Insérez et assurez-vous que les disques sont solidement et uniformément calés au bas d’une pointe de pipette de 200 μL (Figure 1).
      REMARQUE : Utiliser un carottier de 15 g si vous dessalez plus de 25 μg d’échantillon à travers une pointe à un étage.
    3. Utilisez un adaptateur de centrifugeuse pour maintenir les pointes de la platine en place dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 ml ou 2 ml.
      REMARQUE : Pour les étapes de centrifugation suivantes, utiliser une révolution lente (400-500 x g) à 4 °C, pendant 1 à 2 minutes à la fois ; les solvants traversent normalement la résine en moins de 1 minute, selon le degré d’étanchéité du matériau C18 dans les pointes.
    4. Rincer la résine par centrifugation avec 50 μL d’acétonitrile à 100 % pour activer le matériauC18 et éliminer les contaminants potentiels.
      REMARQUE : Il peut être plus facile de charger des solutions sur les pointes de la platine à l’aide des pointes de pipette à chargement de gel. Une fois le matériau C18 activé, il est important de ne pas laisser la résine sécher pendant la durée de la procédure de dessalage.
    5. Équilibrer le matériau du disque avec 80 μL d’eau de qualité MS + 0,1 % d’AGT par centrifugation.
    6. Acidifiez l’échantillon à pH 4 ou moins à l’aide d’acide acétique glacial. Vérifiez le pH avec des bandelettes de pH comme avant pour minimiser la perte d’échantillon.
    7. Chargez l’intégralité de l’échantillon sur le disque de résine par centrifugation lente.
    8. Laver l’échantillon avec 80 μL d’eau de qualité MS + 0,1 % de TFA par centrifugation.
    9. Éluer l’échantillon dans un tube propre de 1,5 mL en rinçant 70 μL d’acétonitrile à 75 % et d’acide acétique à 0,5 % par centrifugation lente. Un temps de centrifugation supplémentaire peut être utilisé pour s’assurer que le volume d’échantillon complet est élué de la pointe de la scène. Il n’y a pas de problème si la résine sèche avec le temps de centrifugation supplémentaire, car elle n’est plus nécessaire après l’élution de l’échantillon.
    10. Séchez complètement chaque échantillon dans un concentrateur sous vide.
      REMARQUE : Les échantillons peuvent être stockés à -80 °C jusqu’à ce qu’ils soient prêts à continuer (point d’arrêt provisoire).
    11. Pour l’analyse LC-MS/MS, reconstituer les échantillons dans un volume de solvant A (acide formique à 0,1 %) du protocole de chromatographie en phase liquide (LC) qui donne la concentration finale de 0,4 μg/μL (c.-à-d. dissoudre 20 μg d’histones dans 50 μL de solvant A).

2. Interface du logiciel TIMS

  1. Sélectionnez l’onglet Instrument et passez à Operate (vérifiez que le nom de l’instrument est surligné en vert) (Figure 2).
  2. Vérifiez les paramètres TIMS (Figure 2).
  3. Vérifiez les paramètres MS (début de la numérisation, fin de la numérisation, polarité ionique, mode de numérisation) (Figure 2).
  4. Vérifiez les paramètres TIMS (mode, début de la mobilité, fin de la mobilité, temps de rampe, temps d’accumulation, cycle de service, taux de rampe, taux MS, moyenne MS et autocalibration) (Figure 2).
  5. Accédez à l’onglet Source et activez l’option seringue (Hamilton 500 μL) uniquement pour l’étape d’étalonnage TuneMix (Figure 3)13.
  6. Accédez à l’onglet Calibration , cliquez sur m/z, sélectionnez Mode d’étalonnage et choisissez le mode (Enhanced Q, généralement), zoomez (+0,01 %) STD Dev (0,24) et cliquez sur Calibrate ; lorsqu’un score de 100 % est atteint, accepter (Figure 4).
  7. Allez dans l’onglet mobilité et répétez le processus de calibrage (mode linéaire, généralement), la plage de détection (+5%), la largeur (0,1 Da), le développement standard (0,1855), puis cliquez sur calibrer ; lorsque vous obtenez un score ≥ 98,5 %, acceptez (figure 5).
  8. Accédez à la méthode et sélectionnez la méthode à utiliser ; pour cet exemple, Proteomic_/2023-01-19-CF/20230119-Hela Control histone_prep_pasefDIA_1-24_1_451.d/451.m-TimsControl a été sélectionné (Figure 5).

3. LC-TIMS-PASEF-TOF MS/MS

  1. Utilisez les conditions de fonctionnement typiques de nESI : tension capillaire de 4500 V, décalage de la plaque d’extrémité de 800 V, pression de nébulisation de 3,0 bars, gaz sec de 10,0 L/min, chauffage sec de 200 °C et débit d’injection de 50 μL/min.
  2. Utilisez les paramètres MS typiques : énergie de collision de 6 eV, RF de collision de 1200 Vpp, temps de transfert de 75 μs, stockage de préimpulsions de 5 μs.
  3. Déterminez le débit de gaz de dérive en utilisant la différence de pression entre l’entonnoir d’entrée P1 et l’entonnoir de sortie P2. L’accumulation parallèle et la fragmentation en série (PASEF) se produisent dans la cellule TIMS, accumulant tous les ions précurseurs simultanément plutôt qu’individuellement. Les ions précurseurs sont ensuite libérés en pics d’ions étroits par rapport aux pics normalement beaucoup plus larges (environ 50 fois plus courts), ce qui augmente le rapport signal/bruit tout en séparant les peptides co-élués via la mobilité14.
  4. Développer une méthode LC-TIMS-ToF MS/MS pour analyser les peptides d’histones protéolytiques. Couplez un chromatographe liquide haute performance (HPLC) équipé d’une colonne C18 (300 Å, 5 μm, 4,6 mm x 250 mm) avec un instrument commercial TIMS-TOF MS doté de la technologie exclusive PASEF.
    NOTE : Cette taille de colonne a été déterminée pour fournir une bonne séparation à pH élevé et faible pour les mélanges peptidiques, sur la base de travaux publiés précédemment 15,16,17.
    1. Régler le volume d’injection à 20 μL (8 μg) d’échantillon et un débit de 0,4 mL/min.
    2. Exécutez un gradient de LC non linéaire de 60 minutes en utilisant de l’eau contenant de l’acide formique à 0,1 % (solvant A) et de l’acétonitrile contenant de l’acide formique à 0,1 % (solvant B). Réglez la pente : 10 % B pendant 2,7 min, puis à 20 % B en 5,3 min, 28 % B en 4 min, 35 % B en 18 min supplémentaires, à 40 % B en 13 min et 100 % B en 2 min supplémentaires. Après avoir maintenu 100 % B pendant 5 minutes, abaissez la concentration à 10 % B pendant 5 minutes et maintenez pendant les 5 dernières minutes.
  5. Vérifier l’élution de l’échantillon de la HPLC dans le TIMS-TOF via l’ionisation par nano-électronébulisation (nESI) en mode d’ionisation positive.

4. Analyse des données

  1. Identifier les séquences peptidiques et les sites de modification.
    1. Préparez une liste théorique de peptides à l’aide de ProteinProspector [https://prospector.ucsf.edu/prospector/cgi-bin/msform.cgi?form=msdigest] sous l’outil MS-digest.
      1. Effectuer une digestion théorique en tenant compte des conditions de la digestion (enzyme utilisée), des types de PTM recherchés (par exemple, mono-, di- ou triméthylation), de la gamme de tailles des peptides recherchés, ainsi que de la plage de détection de masse et du nombre potentiel de clivages manqués.
  2. Analyser manuellement les données acquises sur la base de peptides théoriques (Figure 6)12.
    1. Recherche des masses à plusieurs états de charge (+1 à +4) pour chaque peptide théorique.
    2. Après l’identification initiale de chaque m/z, sélectionnez le pic et confirmez la MS/MS à l’aide d’une liste théorique d’ions de fragmentation basée sur la séquence peptidique, y compris les PTM.
      REMARQUE : Si la mobilité du peptide identifié était connue auparavant, cela est également confirmé.
  3. Calculez les abondances relatives des différents PTM et rapportez chaque modification en pourcentage de la séquence peptidique spécifiée.
    1. L’abondance relative de chaque PTM détectée est calculée à l’aide de l’équation suivante :
      Abondance relative = Superficie de PTM/Superficie totale de PTM non modifiés et PTM pour un peptide donné

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Résultats

Un flux de travail protéomique ascendant (Figure 7) implique généralement les éléments suivants : extraction de la ou des protéines cibles à partir d’un échantillon brut, suivie de la quantification de la concentration de la ou des protéines, puis fractionnement, généralement par électrophorèse sur gel ou chromatographie liquide. Après fractionnement, les protéines sont digérées à l’aide d’une enzyme protéolytique (souvent la trypsine), et enfin, analyse spectrométrique de masse des peptides...

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Discussion

Les histones sont des protéines de base qui régulent la structure de la chromatine en interagissant avec l’ADN sous forme d’octamères constitués des quatre histones centrales (deux de chacune des H2A, H2B, H3 et H4)20. Les histones contiennent de nombreux résidus de lysine et d’arginine, qui sont facilement modifiés, ce qui conduit à des PTM étendus qui modifient la chimie de la chromatine en influençant la fonction des histones ou en se liant à d’autres protéines cellulaires21

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Déclarations de divulgation

Melvin A. Park et Matthew Willetts sont des employés de Bruker Daltonics Inc., le fabricant de l’instrument timsTOF.

Remerciements

Ce matériel est basé sur des travaux soutenus par la National Science Foundation dans le cadre de la subvention No. HRD-1547798 et Grant No. HRD-2111661. Ces subventions NSF ont été accordées à la Florida International University dans le cadre du programme Centers of Research Excellence in Science and Technology (CREST). Il s’agit de la contribution numéro 1672 de l’Institut de l’environnement, un programme prééminent de l’Université internationale de Floride. Un soutien supplémentaire a été fourni par l’Institut national de la santé dans le cadre de la subvention n°. R21AI135469 à Francisco Fernandez-Lima et Grant No. R01HD106051 à Benjamin A. Garcia, ainsi que par la National Science Foundation sous la subvention No. CHE-2127882 à Benjamin A. Garcia. Les auteurs tiennent à remercier le Dr Mario Gomez Hernandez pour son soutien initial lors du développement initial de la méthode.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
-80 ° ; C Congélateur
1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS), pH 7,4Thermo Fisher Scientific10010023sans origine animale
1 mL Pointes de pipetteThermo Fisher Scientific94060710Finntip Flex 1000 &mu ; L, non stériles, non filtrés, embouts à crémaillère
1,5 mL Tubes de microcentrifugationThermo Fisher Scientific14-282-300Utilisez ces tubes pour le traitement simple et sûr de volumes d’échantillons allant jusqu’à 1,5 mL
10 µ ; L Pointes de pipetteThermo Fisher Scientific94060100Finntip Flex, 10 &mu ; L, non stérile, non filtré, en rack
10 % NP-40Thermo Fisher Scientific28324NP-40 Surfact-Amps Solution détergente
10x Dulbecco' s PBS sans Ca2+/Mg2+(Mediatech)MT21031CM
15 mL Tubes coniquesCorning352196Falcon Tubes coniques à centrifuger
200 µ ; L pointes de pipette à chargement de gelThermo Fisher Scientific02-707-138Fisherbrand  ; Embouts de chargement de gel, 1&ndash ; 200 &mu ; L
200 et micro ; L Pointes de pipetteThermo Fisher Scientific94060310Finntip Flex 200&mu ; L, non stérile, non filtré, pointes à soutirage
2x tampon d’échantillon LaemmliBio-Rad1610737Tampon d’échantillon de protéines prémélangé pour SDS-PAGE
50 mL Tubes coniquesCorning352070Falcon Tubes à centrifuger coniques Plaque
fond plat à 96 puitsThermo Fisher Scientific12565501
Plaque à 96 puits, V-Bottom 600 &mu ; LAxygenP-DW-500-C-S
Réactif d’acétoneSigma Aldrich179124ACS, &ge ; 99,5 %
d’acétonitrile (ACN)Thermo Fisher ScientificA998HPLC, Fisher Chemical
acétonitrile avec 0,1 % d’acide formique (v/v), LC/MS GradeThermo Fisher ScientificLS120Optima LC/MS, Thermo Scientific
AEBSFThermo Fisher Scientific328110500chlorhydrate AEBSF, 98 %
bicarbonate d’ammonium, NH4HCO3Sigma Aldrich09830BioUltra, &ge ; Solution
d’hydroxyde d’ammonium à 99,5 %, NH4OHSigma AldrichAX1303Conforme aux spécifications ACS, Répond aux spécifications des réactifs pour tester les monographies USP/NF GR ACS
Argon (Ar)AirgasAR HP 300
BEH C18 Colonne HPLCWaters186003625XBridge Peptide BEH C18 Colonne, 300 Å ;, 5 et micro ; m, 4,6 mm X 250 mm, 1K&ndash ; Albumine
sérique bovine 15K (BSA)Sigma AldrichA7906Fraction de choc thermique, pH 7, &ge ; 98 %
Chlorure de calcium, CaCl2Sigma AldrichC4901Anhydre, poudre, &ge ; 97 %
Tampon de dissociation cellulaireThermo Fisher Scientific13151014
Ceramic scoring waferRestek20116
Compass DataAnalysis 6.0Bruker Datonics
Compass HyStar 6.2Bruker Daltonics
Compass IsotopePatternBruker Daltonics
Compass timsControl 4.1Bruker Daltonics
Coomassie Brilliant Blue R-250Bio-Rad1610436
puits profond, microplaque à 96 puits, 2,0 mLThermo Fisher Scientific89237526
Élévateurs de cellules jetablesThermo Fisher Scientific  ; 08100240Fisherbrand Cell Lifters ; Les élévateurs jetables enlèvent rapidement les couches cellulaires
Pilons à granulés jetablesThermo Fisher Scientific12-141-363Fisherbrand  ; pilons en granulés ; Remettre en suspension des granules de protéines et d’ADN ou broyer des tissus mous dans des tubes de microcentrifugation
Dithiothréitol (DTT)Thermo Fisher ScientificP23251 M
Acide formique (FA)Sigma Aldrich695076réactif ACS, &ge ; 96 %
silice fondue capillaire 75 &mu ; m ID x 363 &mu ; m OD(Molex (Polymicro)TSP075375
Acide acétique glacialThermo Fisher ScientificA38SAcide acétique, Glacial (certifié ACS), Fisher Chemical
Glass Pasteur PipettesSigma AldrichBR747725-1000EA
Chromatographe liquide haute performance  ; ShimadzuShimadzu Prominence 20 HPLC UFLC Système
Acide chlorhydrique, HClSigma Aldrich258148réactif ACS, 37 %
Hypercarb 30-40 &mu ; m Carbone 150&ndash ; 300 et Aring ;Thermo Fisher Scientific60106-402
Cartouche HypersepThermo Fisher Scientific60109-404
Étalon LC/MS, pour ESI-ToFAgilentG1969-85000TuningMix
Chlorure de magnésium, MgCl2Sigma AldrichM8266Anhydre, &ge ; 98 %
de méthanol, pour HPLCThermo Fisher ScientificA454Optima pour HPLC, Fisher Chemical  ;   ;
Adaptateurs de tubes de microcentrifugationGL Sciences501021514
MicrocystinThermo Fisher Scientific50-200-8727Enzo Life Sciences  ; Flacon d’échantillon Microcystin-LA
MS, LaPhaPack, Snap, 12 mm x 32 mmPièces LEAP PALLAP.11190933
NanodropThermo Fisher Modèle scientifique: ND3300
Azote (N2)AirgasNI UHP300
PEAKS Studio X+Bioinformatic Solutions
Bandelettes indicatrices de pH, InstachekMicro Essential Modèle de laboratoireJR-113: chlorure d’hydrion
de potassium, réactif KClSigma AldrichP3911ACS, 99,0 %&ndash ; Cellule
d’injection de pressionNext Advance  ; modèle : PC77
Anhydride propioniqueSigma Aldrich8.00608Pour la synthèse
Centrifugeuse réfrigérée (700&ndash ; 18 000 x g)NuAire, modèle : NuwindNU-C200V
Reprosil-Pur 120 C18-AQ 3 &mu ; m, 3 gESI Source Solutionsr13.aq.0003
SDS-PAGE GelsBio-Rad4569035Tout gel préfabriqué de polyacrylamide, 8,6 cm & times ; 6,7 cm (W × ; L), pour une utilisation avec les cellules d’électrophorèse Mini-PROTEAN
Butyrate de sodiumThermo Fisher ScientificA11079.0698+ %
Chlorure de sodium, NaClSigma AldrichS9888réactif ACS, &ge ; Disque SPE 99,0 %,
C18VWR76333-134Disque SPE Epore, C18, CDS Analytique, 90 mm x 0,5 mm, 12 & micro ; Pompe
vide m SpeedVac+ et rotor à plaquesModèle Savant: SC210A
SaccharoseMillipore1.07651adapté à la microbiologie
Acide sulfurique, H2SO4  ;Sigma Aldrich33974199,999 %
Spectromètre de masse TIMS-ToFBruker Daltonicsmodèle Tims tof ms Solution d’acide
trichloracétique, TCASigma AldrichT06996.1  ;
N Acide trifluoroacétique (TFA)Sigma Aldrich302031Convient pour la HPLC, &ge ; 99,0 %
Triversa NanomateAdvionmodèle : TR263
TrypsineProtéase, MS GradeThermo Fisher Scientific90057
Rotateur de tubeThermo Fisher Scientific88881001
Mélangeur VortexThermo Fisher Scientific88880017
Eau avec 0,1 % d’acide formique (v/v), LC/MS GradeThermo Fisher ScientificLS118Optima LC/MS Grade, Thermo Scientific  ;
à 100,5 % à

Références

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