Caractérisation de la morphologie vasculaire de la dégénérescence maculaire néovasculaire liée à l’âge par angiographie au vert d’indocyanine

La dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA) est une affection répandue qui entraîne une perte de vision sévère chez les personnes âgées¹. Rien qu’aux États-Unis, le nombre de patients atteints de DMLA devrait doubler, atteignant près de 22 millions d’ici 2050, contre 11 millions actuellement. À l’échelle mondiale, le nombre estimé de cas de DMLA devrait atteindre 288 millions d’ici 2040².

La néovascularisation choroïdienne (NVC), également connue sous le nom de DMLA « humide » ou néovasculaire, peut avoir des effets dévastateurs sur la vision en raison de la formation de vaisseaux sanguins anormaux sous la rétine centrale. Cela entraîne une hémorragie, une exsudation rétinienne et une perte de vision importante. L’introduction de thérapies anti-facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGF), qui ciblent le VEGF extracellulaire, a révolutionné le traitement par CNV. Cependant, malgré ces progrès, jusqu’à 50 % des patients présentent des réponses sous-optimales à ces thérapies, avec une activité continue de la maladie telle qu’une accumulation de liquide et des hémorragies non résolues ou nouvelles 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14.

Des études cliniques ont indiqué que la résistance aux anti-VEGF chez les patients atteints de CNV correspond souvent à la présence d’une CNV artériolaire, caractérisée par des artérioles ramifiées de gros calibre, des anses vasculaires et des connexions anastomotiques⁹. Un traitement anti-VEGF répété peut contribuer à l’anomalie des vaisseaux, au développement de la CNV artériolaire et, en fin de compte, à la résistance aux traitements anti-VEGF^14,15. Dans les cas de CNV artériolaire, une fuite de liquide persistante est probablement due à une exsudation accrue causée par des jonctions serrées insuffisamment formées au niveau des anses anastomotiques artérioveineuses, en particulier dans des conditions de flux sanguin élevé⁹. À l’inverse, les personnes qui répondent bien au traitement anti-VEGF ont tendance à présenter une CNV capillaire.

Dans nos études utilisant des modèles animaux, nous avons démontré que la CNV induite par laser chez les souris âgées développe une CNV artériolaire et montre une résistance au traitement anti-VEGF^16,17. À l’inverse, la CNV induite par laser chez les souris plus jeunes conduit au développement d’une CNV capillaire et à une grande réactivité au traitement anti-VEGF. Il est donc crucial de différencier les types vasculaires CNV pour les investigations mécanistes et thérapeutiques.

En milieu clinique, la CNV est généralement classée en fonction des profils de fuite de l’angiographie à la fluorescéine (FA) (par exemple, type 1, type 2), qui utilise un colorant à la fluorescéine pour suivre l’exsudation et identifier les zones de fuite pathologique. Dans la recherche sur la DMLA, la CNV est principalement étudiée à l’aide de l’AF dans des modèles animaux. Cependant, l’AF ne parvient pas à révéler la morphologie vasculaire de la CNV. De plus, l’AF ne capture que des images dans le spectre de la lumière visible et ne peut pas visualiser le système vasculaire choroïdien sous l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR). En revanche, le vert d’indocyanine (ICG), qui présente une forte affinité pour les protéines plasmatiques, facilite la rétention intravasculaire prédominante et permet de visualiser la structure vasculaire et le flux sanguin⁹. En utilisant la propriété de fluorescence proche infrarouge de l’ICG, il devient possible d’imager le pigment rétinien et choroïdien à l’aide de l’angiographie ICG (ICGA). Dans ce contexte, un protocole est présenté qui combine l’AF et l’ICGA pour étudier la fuite et la morphologie vasculaire de la néovascularisation choroïdienne induite par laser (CNV) chez des souris jeunes et âgées, où des CNV capillaires et artériolaires sont observés.

Les expériences sur les animaux menées dans le cadre de cette étude ont reçu l’approbation des comités institutionnels de protection et d’utilisation des animaux (IACUC) du Baylor College of Medicine. Toutes les procédures ont été effectuées conformément aux directives décrites dans la déclaration de l’Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) pour l’utilisation d’animaux dans la recherche ophtalmique et visuelle. Des souris mâles et femelles C57BL/6J jeunes (7 à 9 semaines) et âgées (12 à 16 mois) ont été utilisées pour la présente étude. Les animaux ont été obtenus d’une source commerciale (voir la Table des matières).

1. Préparation du système d’imagerie

1. Placez un coussin chauffant sur la plate-forme d’imagerie (voir la table des matériaux) pour vous assurer que la température corporelle de la souris est maintenue pendant l’imagerie. Activez le coussin chauffant et réglez la température à 35 °C.
2. Retirez le couvercle anti-poussière et allumez l’ophtalmoscope à balayage laser. Placez un objectif de 55° sur la machine.
3. Configurez le logiciel d’imagerie (voir Tableau des matériaux) et saisissez les informations essentielles, notamment le génotype, le sexe, l’âge, etc. Lorsque la session d’imagerie commence, sélectionnez l’IR (canal infrarouge) pour capturer les images ICGA.

2. Préparation des animaux avant l’ICGA et la FA

1. Pesez la souris pour déterminer la quantité d’anesthésie (kétamine/xylazine 70-100/2,5-10 mg/kg, voir le tableau des matériaux) nécessaire.
   REMARQUE : L’optimisation du dosage est cruciale car le profil métabolique varie selon les différentes souches de souris. Il est essentiel de déterminer le dosage approprié pour éviter que la souris ne se réveille avant de terminer l’imagerie ou le risque de surdosage et de mortalité animale potentielle.
2. Utiliser une seringue stérile de 1 mL avec une aiguille de 30 à 32 G pour administrer l’anesthésie par injection intrapéritonéale. Pincez doucement l’une des pattes de la souris pour vérifier si la souris est correctement anesthésiée. Si l’animal présente une réponse ou un mouvement, il est conseillé d’attendre plus de temps avant de passer à l’étape suivante. Cela permet à l’animal de s’installer et assure des conditions optimales pour les procédures ultérieures.
3. Administrer des gouttes de solution ophtalmique de tropicamide à 1 % pour dilater les deux yeux de la souris. Attendez au moins 30 s avant d’utiliser des gouttes de chlorhydrate de proparacaïne à 0,5 % (voir le tableau des matériaux) sur les deux yeux pour réduire les mouvements oculaires et le clignement des yeux. Poursuivez avec des gouttes de gel lubrifiant pour les yeux.
   REMARQUE : Pendant toute la durée de l’anesthésie, il est important d’aborder le problème de la sécheresse extrême des yeux de la souris, qui peut entraîner une opacité cornéenne. Cette opacité rend l’imagerie ultérieure difficile en raison de la visibilité entravée. Pour éviter cela, il est crucial d’appliquer des gouttes de gel lubrifiant pour les yeux en continu pour garder les yeux de la souris hydratés.
4. Placez la souris sur un coussin d’eau chauffant.
   REMARQUE : Les souris possèdent un rapport surface/volume élevé, ce qui entraîne une perte de chaleur accrue dans l’environnement. Lorsqu’il est combiné à la baisse de température induite par l’anesthésie, cela peut présenter un risque important pour la souris, pouvant entraîner la mort par hypothermie. Il est crucial de prendre les précautions nécessaires pour prévenir l’hypothermie et assurer le bien-être de la souris pendant la procédure.
5. Préparez un mélange de 2 mg/mL d’ICG et de 20 mg/mL de colorant fluorescéine (voir le tableau des matériaux). Administrer 250 μL du mélange par injection intrapéritonéale à l’aide d’une seringue de 1 mL et d’une aiguille de 32 G.
   1. Insérez l’aiguille dans le quadrant inférieur gauche de l’abdomen de la souris près des pattes arrière à un angle parallèle à la peau de la souris pour éviter de perforer les organes.
   2. Retirez délicatement le piston et vérifiez qu’aucun sang n’a pénétré dans le capuchon de la seringue. Procédez à l’injection du colorant lentement et régulièrement, en maintenant un rythme constant.
      REMARQUE : Le colorant ICG doit être filtré avec un filtre à seringue de 0,22 μm avant utilisation.

3. ICGA et FA

1. Placez la souris sur le coussin chauffant de la plate-forme d’imagerie pour commencer l’imagerie.
2. Positionnez le corps de la souris à un angle de 45 degrés par rapport à la caméra et faites pivoter légèrement sa tête vers le bas. Cela permet au nerf optique d’être au centre de la mise au point de l’appareil photo.
3. À l’aide d’un coton-tige, essuyez délicatement l’œil pour enlever la couche de gouttes ou de gels lubrifiants sur l’œil imagé en premier. Assurez-vous d’appliquer les gouttes de gel lubrifiant immédiatement après avoir terminé la procédure d’imagerie.
   REMARQUE : Il n’est pas recommandé de laisser l’œil sans lubrification pendant plus de 1 minute sous anesthésie.
4. Déplacez la caméra vers l’œil de la souris. Sélectionnez le canal FA dans le module d’acquisition. La luminescence émise par le canal FA peut être utilisée pour se positionner au centre de la cornée de la souris pour un placement plus rapide.
5. Positionnez la tête de la souris de manière à ce que le nerf optique soit centré sur l’écran, évitant ainsi d’incliner l’ophtalmoscope à balayage laser en biais. Effectuez des ajustements mineurs à la position de la tête de la souris pour obtenir l’alignement souhaité.
6. Dans le module d’acquisition, sélectionnez le canal ICGA. Assurez-vous que l’intensité du laser est réglée à 100 % et sélectionnez l’option 55° pour correspondre à la lentille appropriée. Cela garantit des réglages optimaux pour l’ophtalmoscope à balayage laser.
   REMARQUE : Pour éviter la sursaturation, il peut être nécessaire d’utiliser une intensité laser plus faible, généralement autour de 25 % à 50 %, lors de l’imagerie du stade précoce. Le réglage de l’intensité laser dans cette plage peut aider à capturer des images claires et précises sans provoquer de sursaturation.
7. Lorsque l’œil occupe tout l’écran du logiciel d’imagerie, ajustez les paramètres de sensibilité et de mise au point pour obtenir l’image la plus claire de la membrane CNV.
   1. Tournez le bouton rond noir du module d’acquisition pour régler la sensibilité de l’image.
   2. Tournez le bouton de l’ophtalmoscope pour régler la mise au point. La focalisation optimale pour visualiser le système vasculaire rétinien à l’aide de l’AF se situe généralement dans la plage de 35 à 45 D (dioptries). D’autre part, la focalisation idéale pour visualiser la choroïde à l’aide de l’ICGA se situe généralement entre 10 et 15 D.
      REMARQUE : En raison des différentes tailles de membrane CNV, il peut être nécessaire d’ajuster la mise au point en 10-30 D pour obtenir une imagerie optimale de la morphologie vasculaire.
8. Une fois la mise au point et la sensibilité réglées pour obtenir la meilleure image possible, appuyez sur le bouton rond noir du module d’acquisition pour normaliser l’image. Une fois la normalisation terminée (toutes les images capturées), cliquez sur le bouton d’acquisition sur le panneau tactile pour enregistrer l’image. Il peut être nécessaire de déplacer la caméra pour imager la CNV sous différents angles. La souris peut également être orientée dans différentes positions pour fournir la meilleure image de la lésion CNV.
   REMARQUE : Il peut être nécessaire de réajuster la mise au point ou le positionnement de l’ophtalmoscope à balayage laser lors de la visualisation d’un système vasculaire plus éloigné du nerf optique.
9. Revenez au canal FA à l’aide du module d’acquisition. Effectuez les mêmes étapes que celles énumérées aux étapes 3.6-3.7 pour ajuster la sensibilité et la mise au point de chaque image afin de capturer la fuite de la lésion CNV.
   REMARQUE : Assurez-vous que la sensibilité correcte est sélectionnée pour éviter la sursaturation de la fuite de CNV et augmenter artificiellement la zone de fuite.
10. Imaginez la « phase précoce » de l’ICGA et de l’AF 3 à 4 minutes après l’injection.
    NOTE : La « phase précoce » est le moment où le système vasculaire choroïdien peut être vu clairement et distinctement. Pendant la phase intermédiaire, qui se produit généralement entre 4 et 8 minutes, les vaisseaux rétiniens et choroïdiens sont beaucoup plus estompés et diffus. Au fur et à mesure que la phase tardive (>8-10 min) s’installe, les vaisseaux choroïdiens et rétiniens deviennent indiscernables. Les lésions de CNV hyperfluorescentes, cependant, présentent un contraste maximal par rapport au fond diminué. Ces délais mentionnés sont variables et dépendent de la concentration et de la quantité de colorant ICG injecté. Une plus grande quantité de colorant ICG a tendance à augmenter la chronologie de chaque phase et à fournir des vaisseaux plus distincts. Une phase doit être définie en fonction des caractéristiques clés énumérées ci-dessus plutôt que d’un temps absolu.
11. Une fois toutes les images acquises, appliquez un gel, un lubrifiant ou une pommade sur l’œil de la souris et surveillez attentivement la souris sur le coussin chauffant pour la récupérer. Il faut généralement 1,5 h pour que la souris récupère complètement.
12. Replacez les souris dans leurs cages et dans la zone d’attente désignée une fois qu’elles se sont complètement remises de l’anesthésie et qu’elles sont réveillées.
13. Avant d’arrêter le système d’imagerie et le laser, exportez les images sous forme de fichiers TIFF ou JPEG pour une analyse ultérieure.

4. Montage plat et coloration RPE/choroïde

1. Fixez les yeux avec du paraformaldéhyde à 4% pendant la nuit. Lavez les yeux avec PBS trois fois. Retirez le cristallin et la cornée.
2. Incuber les yeux dans une solution bloquante (10 % d’albumine sérique bovine, 0,6 % de Triton X-100 dans du PBS) pendant 1 h à température ambiante. Répétez le lavage PBS trois fois.
3. Incuber les yeux avec l’isolectine GS-IB4, le conjugué Alexa-flour 568 et l’anticorps anti-actine musculaire α-lisse (voir le tableau des matériaux) pendant la nuit dans la solution de blocage.
4. Lavez trois fois avec PBS. Incuber les échantillons avec un anticorps secondaire anti-lapin Alexa Fluor 488 (voir tableau des matériaux) pendant 2 h à température ambiante.
5. Effectuez 4 coupes radiales du bord à l’équateur. Retirez délicatement la rétine¹⁷.
   REMARQUE : Des précautions doivent être prises pour s’assurer que la membrane néovasculaire n’est pas détachée accidentellement.
6. Montez la choroïde montée à plat sur une lame de verre. Visualisez la CNV à l’aide de la microscopie confocale.

Conformément au protocole, l’ICGA et l’AF ont été réalisées sur la CNV induite par laser chez des souris C57BL/6J jeunes (7 à 9 semaines) et âgées (12 à 16 mois). L’AF fournit des informations sur l’emplacement et la fuite des lésions du CNV (Figure 1, panneaux de gauche), tandis que l’ICGA révèle la morphologie vasculaire des lésions du CNV (Figure 1, panneaux de droite). Chez les jeunes souris, la CNV capillaire domine les lésions de CNV. En revanche, les souris âgées présentent une CNV artériolaire caractérisée par des vaisseaux de gros calibre, des anses vasculaires et des connexions anastomotiques. Les souris jeunes et âgées montrent une visibilité claire du système vasculaire rétinien en FA (Figure 1, panneaux de gauche). Dans les images ICGA de jeunes souris, le système vasculaire rétinien n’est pas visible et les vaisseaux choroïdiens semblent estompés, indiquant la phase médiane de l’ICGA avec l’accent mis sur le système vasculaire choroïdien. Sur les images ICGA de souris âgées, une vascularisation partielle de la rétine peut être observée tandis que les vaisseaux choroïdiens semblent estompés, suggérant la phase médiane avec la focalisation entre la rétine et la choroïde en raison de la plus grande taille de la CNV artériolaire chez les souris âgées. La CNV artériolaire chez les souris âgées présente une taille de CNV plus grande (Figure 2) et beaucoup plus de fuites par rapport à la CNV capillaire chez les jeunes souris. L’immunomarquage avec un anticorps anti-actine musculaire lisse marque largement le système vasculaire CNV chez les souris âgées, confirmant la morphologie artériolaire (Figure 3). En revanche, une coloration minimale avec l’actine musculaire α-lisse est observée dans le système vasculaire du site lésionnel des jeunes souris, ce qui correspond à la morphologie capillaire.

Figure 1 : Comparaison des images FA et ICGA illustrant la CNV induite par laser chez des souris jeunes et âgées. Les images FA montrent la fuite des lésions CNV, tandis que l’ICGA permet de visualiser la morphologie vasculaire. Barres d’échelle : 200 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Quantification de la taille des lésions de CNV chez les souris jeunes et âgées sur la base d’images ICGA. Les zones CNV ont été mesurées, avec un total de 26 et 14 points laser analysés chez des souris jeunes et âgées, respectivement. Les barres d’erreur représentent la moyenne ±écart-type. L’analyse statistique a été effectuée à l’aide d’un test t non apparié. P < 0,0001. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Images représentatives des lésions de CNV chez des souris jeunes et âgées, co-marquées avec l’isolectine Alexa 568 et l’anticorps anti-actine musculaire α-lisse sur des supports plats RPE/choroïdes. La couleur rouge représente l’isolectine Alexa 568, tandis que la couleur verte représente l’actine musculaire α-lisse (SMA). Barres d’échelle : 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Les auteurs n’ont rien à divulguer.