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Article de méthode

Génération de modèles de lésions rétiniennes chez les têtards Xénope

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DOI :

10.3791/65771

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13 octobre 2023

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1Paris-Saclay Institute of Neuroscience, CNRS, Université Paris-Saclay

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Nous avons développé plusieurs protocoles pour induire des lésions rétiniennes ou une dégénérescence rétinienne chez les têtards de Xenopus laevis . Ces modèles offrent la possibilité d’étudier les mécanismes de régénération rétinienne.

Résumé

Les maladies neurodégénératives de la rétine sont les principales causes de cécité. Parmi les nombreuses stratégies thérapeutiques explorées, la stimulation de l’autoréparation s’est récemment révélée particulièrement attrayante. Une source cellulaire d’intérêt pour la réparation de la rétine est la cellule gliale de Müller, qui abrite un potentiel de cellules souches et une capacité de régénération extraordinaire chez les anamniotes. Ce potentiel est cependant très limité chez les mammifères. L’étude des mécanismes moléculaires sous-jacents à la régénération rétinienne dans des modèles animaux dotés de capacités de régénération devrait permettre de mieux comprendre comment libérer la capacité latente des cellules de Müller chez les mammifères à régénérer la rétine. Il s’agit d’une étape clé pour le développement de stratégies thérapeutiques en médecine régénérative. Dans ce but, nous avons développé plusieurs paradigmes de lésions rétiniennes dans Xenopus : une lésion mécanique de la rétine, une lignée transgénique permettant l’ablation conditionnelle des photorécepteurs médiée par la nitroréductase, un modèle de rétinite pigmentaire basé sur le knock-out de la rhodopsine médié par CRISPR/Cas9, et un modèle cytotoxique piloté par des injections intraoculaires de CoCl2 . En mettant en évidence leurs avantages et leurs inconvénients, nous décrivons ici cette série de protocoles qui génèrent diverses conditions dégénératives et permettent l’étude de la régénération rétinienne chez Xenopus.

Introduction

Des millions de personnes dans le monde sont atteintes de diverses maladies dégénératives de la rétine conduisant à la cécité, telles que la rétinite pigmentaire, la rétinopathie diabétique ou la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA). À ce jour, ces affections restent en grande partie incurables. Les approches thérapeutiques actuellement à l’étude comprennent la thérapie génique, les transplantations de cellules ou de tissus, les traitements neuroprotecteurs, l’optogénétique et les prothèses. Une autre stratégie émergente est basée sur l’auto-régénération par l’activation de cellules endogènes ayant un potentiel de cellules souches. Les cellules gliales de Müller, le principal type de cellules gliales de la rétine, font partie des sources cellulaires d’intérêt dans ce contexte. En cas de blessure, ils peuvent se dédifférencier, proliférer et générer des neurones 1,2,3. Bien que ce processus soit très efficace chez le poisson-zèbre ou le Xénope, il est largement inefficace chez les mammifères.

Néanmoins, il a été démontré que des traitements appropriés avec des protéines mitogènes ou une surexpression de divers facteurs peuvent induire la réentrée dans le cycle des cellules gliales de Müller chez les mammifères et, dans certains cas, déclencher leur engagement neurogénique ultérieur 1,2,3,4,5. Cela reste cependant largement insuffisant pour les traitements. Par conséquent, il est nécessaire d’accroître nos connaissances sur les mécanismes moléculaires sous-jacents à la régénération afin d’identifier des molécules capables de transformer efficacement les propriétés des cellules souches de Müller en nouvelles stratégies thérapeutiques cellulaires.

Dans ce but, nous avons développé plusieurs paradigmes de lésions dans Xenopus qui déclenchent la dégénérescence des cellules rétiniennes. Ici, nous présentons (1) une lésion mécanique de la rétine qui n’est pas spécifique à un type de cellule, (2) un modèle d’ablation cellulaire conditionnelle et réversible utilisant le système NTR-MTZ qui cible les cellules en bâtonnets, (3) un knock-out de la rhodopsine médié par CRISPR/Cas9, un modèle de rétinite pigmentaire qui déclenche une dégénérescence progressive des cellules en bâtonnet, et (4) un CoCl2-modèle cytotoxique induit qui, selon la dose, peut cibler spécifiquement les cônes ou conduire à une dégénérescence plus large des cellules rétiniennes. Nous mettons en évidence les particularités, les avantages et les inconvénients de chaque paradigme.

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Protocole

Les soins aux animaux et l’expérimentation ont été menés conformément aux lignes directrices de l’établissement, en vertu de la licence de l’établissement A91272108. Les protocoles d’étude ont été approuvés par le comité institutionnel de protection animale CEEA #59 et ont reçu l’autorisation de la Direction Départementale de la Protection des Populations sous les numéros de référence APAFIS #32589-2021072719047904 v4 et APAFIS #21474-2019071210549691 v2. Reportez-vous au tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux, instruments et réactifs utilisés dans ces protocoles.

1. Lésion mécanique de la rétine

REMARQUE : Le protocole paradigmatique de blessure décrit ici consiste en une ponction mécanique de la rétine d’un têtard à partir du stade 45. Il ne cible donc aucun type particulier de cellules rétiniennes, mais endommage toute l’épaisseur de la rétine au site de ponction.

  1. Préparation de l’anesthésique pour les têtards
    1. Préparez une solution mère à 10 % de benzocaïne. Pour un volume total de 10 mL, ajouter 1 g de benzocaïne, 2 mL de diméthylsulfoxyde (DMSO) et 8 mL de propylène glycol. Conserver la solution mère pendant plusieurs mois à 4 °C à l’abri de la lumière avec du papier aluminium.
    2. Préparer une solution de benzocaïne à 0,005 % au moment de l’utilisation en ajoutant 25 μL de solution mère de benzocaïne à 10 % à 50 mL d’eau d’élevage de têtards (eau du robinet filtrée et déchlorée). Bien mélanger.
      REMARQUE : La concentration de benzocaïne est particulièrement faible car les têtards sont très sensibles à l’anesthésie par rapport aux adultes.
  2. Préparation des épingles
    1. Fixez une broche stérile de 0,2 mm de diamètre à un porte-goupille stérilisé (Figure 1A).
  3. Anesthésie têtard
    1. Utilisez une épuisette pour attraper les têtards dans leurs bassins. Transférez-les dans un nouveau réservoir contenant la solution de benzocaïne à 0,005 %. Attendez quelques minutes jusqu’à ce que les têtards cessent de réagir aux stimuli (tapotement du réservoir ou contact direct).
      REMARQUE : Plusieurs têtards peuvent être anesthésiés simultanément, mais le temps passé dans la solution anesthésique doit être inférieur à 30 minutes.
  4. Ponction rétinienne
    1. À l’aide d’une cuillère, attrapez un têtard et placez-le soigneusement sur une petite boîte de Pétri (55 mm de diamètre) contenant un mouchoir humide. Placez le têtard face dorsale vers le haut au milieu de la boîte de Pétri.
    2. À l’aide d’un stéréomicroscope, ponctionnez la rétine en insérant doucement la broche sur la face dorsale de l’œil, jusqu’à ce qu’elle traverse la rétine (Figure 1A). Si plusieurs piqûres sont nécessaires, répétez cette procédure à différents endroits. Après avoir perforé l’œil droit, tournez la boîte de Pétri de 180° pour percer l’œil gauche.
    3. Transvaser le têtard lésionné dans un grand réservoir contenant 1 L d’eau d’élevage en immergeant délicatement la boîte de Pétri. Surveillez les têtards jusqu’à ce qu’ils soient complètement réveillés.

2. Ablation conditionnelle des cellules en bâtonnets à l’aide du système NTR-MTZ

Le protocole vise à induire une ablation spécifique des bâtonnets dans la lignée transgénique6 du Xénope Tg(rho :GFP-NTR), disponible au service zootechnique de TEFOR Paris-Saclay, qui héberge le centre de ressources français Xénope. Ce système chimiogénétique utilise la capacité de l’enzyme nitroréductase (NTR) à convertir le métronidazole (MTZ) en un agent de réticulation cytotoxique de l’ADN, afin d’ablater spécifiquement les bâtonnets exprimant NTR (Figure 1B). Deux protocoles détaillés pour rendre les animaux transgéniques Tg(rho :GFP-NTR) ou Tg(rho :NTR) et induire la dégénérescence ont été publiés précédemment 7,8. Ici, nous détaillons simplement l’induction de la dégénérescence rétinienne et comment surveiller le processus de dégénérescence in vivo.

  1. Préparation d’une solution de métronidazole
    1. Préparer 10 mM de solution MTZ au moment de l’utilisation en dissolvant 1,67 g de poudre de MTZ dans un flacon foncé dans 1 L d’eau d’élevage de têtards contenant 0,1 % de DMSO, à l’aide d’une barre d’agitation magnétique et d’un agitateur magnétique.
      REMARQUE : MTZ est sensible à la lumière. La dissolution complète peut prendre jusqu’à 10 minutes.
  2. Génération de têtards transgéniques par accouplement naturel à partir de la lignée Tg(rho :GFP-NTR)
    NOTE : Les mâles transgéniques représentant un stock précieux, nous préférons générer des embryons par accouplement naturel pour ne pas sacrifier le mâle et l’utiliser à plusieurs reprises.
    1. Administration d’hormones
      1. Injecter 600 UI d’hormone gonadotrophine chorionique humaine (hCG) avec des aiguilles de 25G dans le sac lymphatique dorsal des femelles sauvages de Xenopus laevis . Injecter aux mâles transgéniques 100 à 200 UI d’hCG dans le sac lymphatique dorsal. Pour la surveillance en direct de la dégénérescence des bâtonnets (étape 2.4), utilisez des xénobus albinos plutôt que des xénopes pigmentés, afin de mieux visualiser les variations de fluorescence à travers l’œil des têtards transgéniques générés.
        REMARQUE : Les femelles Xénope peuvent être amorcées avec 50 UI d’hCG 1 à 7 jours avant l’ovulation prévue, mais cela est facultatif.
    2. Accouplement et collecte des œufs
      1. Immédiatement après l’injection d’hCG, mettre dans un réservoir un mâle transgénique Tg(rho :GFP-NTR) avec une femelle injectée d’hCG à 20 °C jusqu’au lendemain. Utilisez un grand volume (au moins 10 L) et ajoutez de petits objets auxquels les œufs peuvent adhérer, afin que les œufs ne soient pas endommagés par les mouvements des adultes. Le lendemain, lorsque les grenouilles ne sont plus dans l’amplexus, retirez les adultes du bac et prélevez les embryons.
    3. Élevage d’embryons et de têtards
      1. Stade embryonnaire et têtard selon le tableau normal du développement du xénope 9.
      2. Élevez les embryons dans un réservoir rempli d’eau d’élevage de têtards. À partir de l’étape 45, nourrissez les têtards avec de la nourriture pour alevins en poudre et oxygénez l’eau avec un barboteur. Ajoutez de l’eau tous les jours si nécessaire pour compenser l’évaporation et changez l’eau de tout le réservoir chaque semaine.
        REMARQUE : Alternativement, il est également possible d’échanger 50% du volume deux fois par semaine. Un protocole détaillé se trouve dans10.
    4. Tri d’embryons transgéniques
      1. À partir des stades 37/38, trier et sélectionner les embryons transgéniques sous un stéréomicroscope à fluorescence en visualisant directement la GFP (Figure 1C).
  3. Traitement Tadpole MTZ
    1. Transférer les têtards transgéniques Tg(rho :GFP-NTR) dans un réservoir contenant 10 mM de solution MTZ et les élever à 20 °C dans l’obscurité pendant 1 semaine. Utiliser des frères et sœurs transgéniques élevés dans de l’eau d’élevage de têtards contenant 0,1 % de DMSO comme témoins.
    2. Changez la MTZ et la solution de contrôle tous les deux jours pendant la période de traitement. Nourrissez les têtards comme d’habitude pendant le traitement MTZ.
    3. Pour la surveillance individuelle de la fluorescence (étape 2.4), placer chaque têtard dans son petit récipient contenant 30 mL de MTZ ou de solution témoin à partir de l’étape 2.3.1.
      REMARQUE : Le traitement MTZ peut être effectué à tout moment à partir du stade 45.
  4. Surveillance en direct de la dégénérescence des bâtonnets
    REMARQUE : La dégénérescence progressive des tiges peut être surveillée en temps réel. Par conséquent, effectuez les étapes 2.4.1. à 2.4.4. avant le traitement MTZ, puis régulièrement après le traitement.
    1. Suivez les étapes 1.1 et 1.3 pour la préparation de l’anesthésique et de l’anesthésie têtarde, respectivement.
    2. À l’aide d’une cuillère, attrapez un têtard et placez-le soigneusement sur un mouchoir humide dans une petite boîte de Pétri (55 mm de diamètre). Observer la fluorescence GFP sous un stéréomicroscope à fluorescence (longueur d’onde d’excitation = 488 nm et longueur d’onde d’émission = 509 nm) et prendre des photos de l’œil. Une diminution de l’intensité de la fluorescence reflète la dégradation des bâtonnets.
      REMARQUE : Pour effectuer des comparaisons quantitatives, les mêmes paramètres doivent être conservés pour l’imagerie de tous les têtards.
    3. Transférez le têtard illustré dans un grand réservoir contenant 1 L d’eau d’élevage en immergeant soigneusement la boîte de Pétri. Surveillez les têtards jusqu’à ce qu’ils soient complètement réveillés.
    4. Comparez l’intensité de fluorescence entre les yeux de têtard traités par MTZ et les yeux de têtard témoins pour surveiller et évaluer l’efficacité du processus de dégénérescence.

3. Dégénérescence des cellules en bâtonnets par knock-out de la rhodopsine médiée par CRISPR/Cas9

NOTE : Ce protocole est établi pour générer un modèle de rétinite pigmentaire chez Xenopus laevis en induisant une dégénérescence spécifique des cellules en bâtonnets à l’aide du knock-out de la rhodopsine médié par CRISPR/Cas9. Le % d’insertion-délétion (indels) dans F0 est fourni en11 et est de ~75%. Un tel knock-out de la rhodopsine médié par CRISPR/Cas9 peut également être effectué chez les têtards de Xenopus tropicalis 11.

  1. Préparation des solutions et des réactifs
    1. Ordonnancement de l’ARNcr et de l’ARNtracr
      1. Achetez l’ARN synthétique CRISPR (ARNcr) ciblant le gène de la rhodopsine (rho) et l’ARNcr trans-activateur standard (ARNtracr). L’ARNcr est composé d’une région spécifique à la cible rho (GCUCUGCUAAGUAAUACUGA) et d’une autre (GUUUUAGAGCUAUGCU) qui s’hybride à l’ARNtracr.
    2. ARNcr : duplex d’ARNtracr (duplex d’ARNg rho )
      1. Remettre en suspension l’ARNcr et l’ARNtracr à 100 μM dans le tampon duplex sans nucléase.
      2. Préparez l’ARNg duplex en mélangeant 3 μL d’ARNcr rho de 100 μM, 3 μL d’ARNtracr de 100 μM et 94 μL de tampon duplex. Les concentrations finales sont de 36 ng/μL d’ARNcr rho et de 67 ng/μL d’ARNtracr.
      3. Recuire les oligos en les chauffant à 95 °C pendant 5 min et les refroidir lentement à température ambiante. Préparez des aliquotes et conservez-les à -20 °C.
    3. Complexe ribonucléoprotéique CRISPR-Cas9 (c.-à-d. ARNg duplex/protéine Cas9)
      1. Au moment de l’utilisation, préparez le mélange de rho gRNA duplex et de la protéine Cas9. Pour 20 μL, ajouter 10 μL de solution duplex d’ARNg rho , 2 μL de protéine Cas9 (bouillon à 5 mg/mL), 2 μL de fluorescéine lysine dextran (bouillon à 10 mg/mL) et 6 μL d’eau exempte de RNase.
      2. Pour former le complexe ribonucléoprotéique, incuber pendant 10 min à 37 °C et laisser refroidir la solution à température ambiante.
      3. Pour 20 μL de la solution témoin, mélanger 2 μL de protéine Cas9, 2 μL de fluorescéine lysine dextran et 16 μL d’eau exempte de RNase.
    4. Préparation de solutions MBS 10x, 1x et 0,1x
      1. Préparer la solution mère saline de Barth modifiée (10x MBS) en ajoutant 11,92 g de HEPES, 51,43 g de chlorure de sodium (NaCl), 0,75 g de chlorure de potassium (KCl), 2,1 g de bicarbonate de sodium (NaHCO3) et 2,46 g de sulfate de magnésium heptahydraté (MgSO4, 7 H2O) dans 800 mL d’eau de type II. Ajustez le pH à 7,8 avec de l’hydroxyde de sodium (NaOH) à 30 %. Ajouter de l’eau de type II jusqu’à ce que le volume atteigne 1 L et stériliser à l’autoclave. Conserver à température ambiante.
      2. Préparer 1 L de solution de MBS 1x en diluant 100 mL de solution saline de 10x MBS et 7 mL de chlorure de calcium dihydraté 0,1 M (CaCl 2, 2H2 O) dans de l’eaude type II. Conserver à température ambiante.
      3. Préparez 0,1x solution de MBS en diluant 1x solution de MBS dans de l’eau de type II. Conserver à température ambiante.
    5. Solution de benzocaïne pour adultes
      1. Préparer une solution de benzocaïne à 0,05 % en ajoutant 5 mL de solution mère de benzocaïne à 10 % (voir l’étape 1.1.1.) à 1 L d’eau d’élevage de têtards. Bien mélanger.
        REMARQUE : Conserver cette solution pendant plusieurs mois à 4 °C à l’abri de la lumière avec du papier d’aluminium. Amenez la solution à température ambiante avant de l’utiliser sur les animaux.
    6. Solution de L-cystéine
      1. Préparez la solution de dégraissage au moment de l’utilisation en ajoutant 2 g de L-cystéine chlorhydrique monohydratée à 100 mL de solution 0,1x MBS. Ajustez le pH à 7,8 avec 30 % de NaOH.
    7. Solution de polysaccharose
      1. Préparez la solution dense de polysaccharose en ajoutant 3 g de polysaccharose à 100 mL de solution 0,1x MBS. Conservez cette solution pendant quelques semaines à 4 °C.
  2. Fécondation in vitro et dégélification
    REMARQUE : Plus de détails sur la fécondation in vitro de Xénope peuvent être trouvés dans un protocole dédié détaillé dans12.
    1. Administration d’hormones aux femelles Xenopus laevis pour induire l’ovulation
      1. Environ 15 h avant le prélèvement de l’ovocyte, injecter 600 UI d’hCG dans le sac lymphatique dorsal de la femelle et le conserver toute la nuit à 18 °C.
    2. Dissection testiculaire
      1. Euthanasier le mâle Xénope avec une dose létale de solution de benzocaïne à 0,05 % pendant 10 à 15 minutes. Comme méthode complémentaire d’euthanasie, sectionnez la colonne vertébrale immédiatement postérieure au crâne avec des ciseaux tranchants et robustes. Ouvrez la cavité abdominale avec des ciseaux de dissection, coupez les testicules et coupez la graisse et les capillaires attachés. Placez immédiatement chaque testicule sur de la glace dans 1 mL de 1x MBS.
    3. Préparation du sperme
      1. Écraser un testicule à l’aide d’un pilon pour tubes de microcentrifugation et diluer la suspension dans un tube de 15 mL contenant 9 mL de MBS 1x. Ajouter 10 μg/mL de gentamicine dans le deuxième tube testiculaire et le maintenir à 4 °C pendant quelques jours pour d’autres expériences de fécondation.
    4. Fécondation in vitro
      1. Massez doucement le dos de la femme à qui l’on a injecté des hormones et prélevez les ovocytes dans une boîte de Pétri (100 mm de diamètre). Étalez quelques gouttes de la solution de sperme dans les ovocytes. Attendez 5 min et couvrez-les avec 0,1x MBS. Attendez 10 min avant de procéder au dégélage.
    5. Dégélification d’oeufs fécondés
      1. Remplacez la solution de MBS 0,1x par la solution de dégelage pour enlever la couche de gelée des œufs fécondés (~5 min). Rincez abondamment les embryons 5 à 6 fois avec 0,1x MBS et transférez-les dans une nouvelle boîte de Pétri de 100 mm remplie de 0,1x MBS.
  3. Préparation du système de micro-injection
    1. Affûter les capillaires en verre à l’aide d’un extracteur de micropipette13.
    2. Remplissez un capillaire aiguisé avec 2 à 10 μL de complexe ribonucléoprotéique CRISPR-Cas9 ou la solution de contrôle à l’aide d’une pointe de microchargeur et placez le capillaire dans le manipulateur de micro-injecteurs.
    3. Au grossissement le plus élevé d’un stéréomicroscope, cassez l’extrémité capillaire à l’aide d’une pince fine et ajustez le temps d’injection (~400 ms) pour obtenir un volume d’éjection de 10 nL par impulsion. Réglez la pression d’éjection à environ 40 PSI.
  4. Micro-injection d’embryons unicellulaires avec le complexe ribonucléoprotéique CRISPR-Cas9
    1. Placer les embryons unicellulaires sur une grille (tissu de nylon de 1 mm) collés dans une boîte de Pétri de 100 mm remplie d’une solution de polysaccharose à 3 % (Figure 1D).
    2. À l’aide du micro-injecteur et sous stéréomicroscope, injecter 10 nL du complexe ribonucléoprotéique CRISPR-Cas9 (ce qui correspond à 500 pg d’ARNg duplex + 5 ng de protéine Cas9 par embryon) ou une solution témoin au niveau du pôle animal, dans la région corticale, juste sous la membrane cytoplasmique.
      REMARQUE : La fluorescéine lysine dextran contenue dans la solution permet un tri ultérieur des embryons injectés.
    3. Transférez les embryons injectés dans une nouvelle boîte de Pétri de 100 mm contenant une solution propre de polysaccharose et placez-les à 21 °C.
    4. Le premier jour, triez régulièrement les embryons bien développés et remplacez la solution de polysaccharose par 0,1x MBS environ 5 h après la micro-injection.
    5. Attendre 24 h après l’injection pour trier et sélectionner les embryons rho crispant bien injectés sous un stéréomicroscope fluorescent en visualisant la fluorescéine lysine dextran (Figure 1E).
      REMARQUE : Plus la micro-injection est précoce après la fécondation, plus le knock-out est efficace.
  5. Élevage d’embryons et de têtards
    1. Élever des embryons rho crispant dans 0,1x MBS dans des boîtes de Pétri jusqu’au stade 37/38. Retirez les embryons morts tous les jours et changez la solution MBS 0,1x. À partir du stade 37/38, élever les embryons dans un réservoir rempli d’eau d’élevage de têtards, et à partir du stade 45, procéder comme à l’étape 2.2.3.

4. Dégénérescence des cellules rétiniennes par injections intraoculaires cytotoxiques de CoCl 2

NOTE : Ce protocole est établi pour induire la dégénérescence des cellules rétiniennes par injections intraoculaires de chlorure de cobalt (CoCl2) chez les têtards de Xenopus laevis . Selon la dose, il peut déclencher une dégénérescence spécifique du cône ou une dégénérescence plus large14. Nous utilisons ce protocole chez les têtards de Xenopus laevis âgés à partir du stade 48. Il peut également être utilisé chez les têtards de Xenopus tropicalis .

  1. Préparation du tampon et des réactifs
    1. Préparer une solution de benzocaïne à 0,005 % au moment de l’utilisation comme à l’étape 1.1.
    2. Préparer 100 mM de solution mère de CoCl2 en ajoutant 118,5 mg à 5 mL de MBS 0,1x (voir l’étape 3.1.4 pour préparer 0,1x MBS). Conservez cette solution mère pendant plusieurs mois à 4 °C, à l’abri de la lumière avec une feuille d’aluminium.
      ATTENTION : Le CoCl2 est classé comme un composé toxique pour la vie humaine et animale. Suivez attentivement les instructions de manipulation, de stockage et d’élimination des déchets figurant sur la fiche de données de sécurité.
    3. Pour la dégénérescence spécifique du cône, préparer une solution de CoCl2 à 10 mM au moment de l’utilisation à partir de la solution mère à 100 mM diluée dans 0,1x MBS. Pour une dégénérescence plus large des cellules rétiniennes, préparez une solution de CoCl2 à 25 mM.
  2. Préparation du système d’injection
    1. Affûter les capillaires en verre à l’aide d’un extracteur de micropipette 13.
    2. Remplir un capillaire aiguisé avec 2 à 10 μL de solution de CoCl2 à 10 ou 25 mM ou la solution de contrôle (0,1x MBS) à l’aide d’une pointe de microchargeur et placer le capillaire dans le manipulateur de micro-injecteurs.
    3. Au grossissement le plus élevé d’un stéréomicroscope, rompre l’extrémité capillaire à l’aide d’une pince fine et ajuster le temps d’injection (environ 100 ms) pour obtenir un volume d’éjection de 15 à 40 nL par impulsion. Réglez la pression d’éjection sur ~40 PSI.
      REMARQUE : La taille de la goutte doit être adaptée au stade des têtards et à la taille de leur œil. Par exemple, aux stades 48 et 49, la taille des gouttes est de ~15 à 20 nL, tandis qu’elle est de 30 à 40 nL aux stades 52 à 56. Visuellement, la taille de la goutte est un peu plus grande que la taille de l’objectif.
  3. Injections intraoculaires de CoCl2
    1. Utilisez une épuisette pour attraper les têtards dans leurs bassins. Transférez-les dans 50 mL de solution de benzocaïne à 0,005 %. Attendez quelques minutes jusqu’à ce que les têtards cessent de réagir aux stimuli.
      REMARQUE : Plusieurs têtards peuvent être anesthésiés en même temps, mais le temps passé dans l’anesthésie doit être inférieur à 30 minutes.
    2. À l’aide d’une cuillère, attrapez un têtard et mettez-le soigneusement dans une petite boîte de Pétri (55 mm de diamètre) contenant un mouchoir humide. Placez le têtard, côté dorsal vers le haut, au milieu de la boîte de Pétri (Figure 1F,G).
    3. Utiliser le micro-injecteur sous stéréomicroscope pour injecter par voie intraoculaire la solution de CoCl2 . Insérez doucement le capillaire dans l’œil par-dessus la lentille. Lorsque l’embout capillaire est à l’intérieur de l’œil, éjectez deux gouttes par œil. Après l’injection de l’œil droit, tournez manuellement la boîte de Pétri de 180° pour injecter l’œil gauche.
      REMARQUE : Assurez-vous que l’injection est faite à l’intérieur de l’œil, de sorte qu’un léger gonflement de l’œil doit être vu après chaque éjection de la solution. Le têtard doit rester le moins possible hors de l’eau. L’injection des deux yeux devrait prendre moins de 1 min.
    4. Transvaser le têtard injecté dans un grand réservoir contenant 1 L d’eau d’élevage en l’immergeant soigneusement dans la boîte de Pétri (Figure 1H). Surveillez les têtards jusqu’à ce qu’ils soient complètement réveillés.

5. Coloration pour évaluer les lésions rétiniennes ou la dégénérescence rétinienne

  1. Fixation des têtards et déshydratation
    1. Préparer une solution de paraformaldéhyde (PFA) à 4 % en diluant 100 mL de solution de PFA à 32 % dans 700 mL de PBS 1x. Ajustez le pH à 7,4 avec du NaOH. Aliquez cette solution mère et conservez-la plusieurs mois à -20 °C.
    2. Euthanasier les têtards dans de la benzocaïne à 0,01 % et les transférer dans un flacon contenant 4 % de PFA pendant 2 h à température ambiante avec agitation ou toute la nuit à 4 °C. Rincez 3 x 5 min dans 1x PBS.
    3. Déshydrater progressivement les têtards par incubations successives de 30 minutes dans de l’éthanol à 70 % et à 95 % (dilué dans de l’eau de type II), suivies de trois autres incubations de 1 h dans de l’éthanol à 100 %. Conservez les têtes de têtard à cette étape à -20 °C ou transférez-les directement sur du butanol à 100 % pendant la nuit pour les étapes suivantes.
  2. Sectionnement de la paraffine
    1. Remplacer le butanol à 100 % par de la paraffine fondue pendant 2 h à 62 °C. Remplacer la paraffine pendant 2 x 2 h d’incubations supplémentaires à 62 °C.
    2. Transférez les têtes de têtard dans des moules jetables à enrobage de paraffine et orientez-les de manière à ce que leurs yeux soient bien alignés, puis laissez la paraffine durcir. Conservez les blocs à température ambiante.
    3. Coupez l’excédent de paraffine et montez le bloc avec le(s) têtard(s) intégré(s) sur le support du microtome.
    4. Sectionnez le bloc à l’aide d’un microtome à l’épaisseur appropriée (10-12 μm). Transférez les rubans avec des sections sur une lame préalablement recouverte d’albumine glycérine à 3 % (diluée dans de l’eau).
    5. Placez la lame sur un chauffe-lame à 42 °C pendant quelques minutes, puis retirez l’excès de glycérine albumine. Laissez sécher les lames pendant une nuit dans un four à 37 °C.
    6. Dépatisser en immergeant les lames pendant 2 x 15 min dans un bocal Coplin rempli à 100% de xylène. Réhydrater les sections avec des séries d’éthanol graduées : 100 % deux fois, 70 %, 50 % (diluées dans de l’eau de type II), ~5 min chacune, suivies de 2 x 5 min dans l’eau.
  3. Marquage par immunofluorescence
    1. Préparer 100 mM de solution mère de citrate de sodium (CiNa) en ajoutant 29,4 g de sel trisodique de citrate de sodium dihydraté (C6H5Na3O7, 2H2O) à 1 L d’eau de type II ; ajustez le pH à 6 avec de l’acide chlorhydrique (HCl). Stériliser à l’autoclavage et conserver à température ambiante pendant plusieurs mois. Préparer la solution de démasquage au moment de l’utilisation en ajoutant 25 mL de solution mère CiNa à 100 mM à 225 mL d’eau de type II. Ajouter 125 μL de Tween-20 et bien mélanger (la concentration finale est de 10 mM de CiNa, 0,05 % de Tween-20).
    2. Préparer la solution mère de Hoechst à 10 mg/mL en ajoutant 100 mg de bisbenzimide H 33258 à 10 mL d’eau de type I. Conservez cette solution mère pendant plusieurs mois à 4 °C, à l’abri de la lumière avec une feuille d’aluminium. Préparer la solution de Hoechst à 7,5 μg/mL en ajoutant 300 μL de solution mère de Hoechst à 400 mL de PBS 1x.
      REMARQUE : Cette solution peut être utilisée jusqu’à 10 fois et conservée pendant environ 6 mois à 4 °C, à l’abri de la lumière avec du papier d’aluminium.
    3. Après le déparaffinage des sections, effectuez la récupération de l’antigène en faisant bouillir les sections dans la solution de démasquage pendant 9 min. Laisser refroidir la solution pendant 20 min.
    4. Rincer une fois dans de l’eau de type II et une fois dans 1x PBS. Placez les lames à plat dans une chambre humide et ajoutez 400 à 600 μL de solution de blocage par lame (diluant d’anticorps + 0,2 % de Triton X100) pendant 30 min.
    5. Remplacer la solution bloquante par 200 μL par lame de l’anticorps primaire dilué dans la solution bloquante. Utilisez une lamelle pour étaler la solution sur les sections, en évitant la formation de bulles. Incuber une nuit à 4 °C dans une chambre humide.
    6. Transférez les lames dans un bocal Coplin et rincez-les pendant 3 x 10 min dans 1x PBS complété par 0,1 % de Triton X100. Mettez les lames à plat, ajoutez 400 μL par lame de l’anticorps secondaire dilué dans une solution de blocage, et laissez reposer 2 h à température ambiante dans une chambre humide.
    7. Transférez les lames dans un bocal Coplin et rincez pendant 3 x 5 min avec 1x PBS complété par 0,1% de Triton X100.
    8. Contre-colorer les noyaux cellulaires avec la solution de Hoechst pendant 10 min et rincer 3 x 5 min avec 1x PBS.
    9. Placez les lamelles sur les lames dans un milieu de montage aqueux spécialement conçu pour préserver la fluorescence. Laissez sécher les lames pendant 1 h à température ambiante et conservez-les à 4 °C.
    10. Imagez les lames à l’aide d’un microscope à fluorescence.
  4. Coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (H&E) pour évaluer les lésions rétiniennes
    REMARQUE : Au lieu de marquer un type de cellule particulier par immunomarquage, l’histologie rétinienne générale peut être évaluée avec une coloration H & E.
    1. Après le déparaffinage des sections, effectuer le marquage des acides nucléiques en immergeant les lames dans une solution d’hématoxyline pendant 2 min. Rincez abondamment à l’eau du robinet.
    2. Effectuer le marquage du cytoplasme en immergeant les lames dans une solution d’éosine à 1 % pendant 1 min. Rincez rapidement à l’eau.
      REMARQUE : L’éosine est très soluble ; Si les lames sont laissées trop longtemps dans l’eau, tout le colorant disparaît.
    3. Rincer 2 x 5 min dans de l’éthanol à 100 % et 2 x 5 min dans du xylène.
    4. Sous le capot, placez des lamelles sur les lames en 4 à 5 gouttes d’un support de montage. Laissez sécher les lames sous un capot et imagez-les le lendemain au microscope.
  5. Détection de cellules apoptotiques
    1. Après les sections de déparaffinage (voir section 5.2.6), suivez le protocole du fabricant du kit pour détecter la fragmentation apoptotique de l’ADN.
    2. Effectuer la coloration des noyaux en immergeant les lames dans une solution de Hoechst (voir section 5.3.8) et les monter avec un milieu de montage aqueux spécialement conçu pour préserver la fluorescence. Laissez sécher les lames pendant 1 h à température ambiante et conservez-les à 4 °C.
    3. Imagez les lames à l’aide d’un microscope à fluorescence.

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Résultats

Lésion mécanique de la rétine
Des coupes rétiniennes de têtards soumis à la lésion mécanique décrite dans la section 1 du protocole montrent que la lésion rétinienne englobe toutes les couches du tissu tout en restant limitée au site de ponction (Figure 2A,B).

Ablation conditionnelle des cellules en bâtonnets à l’aide du système NTR-MTZ
Les yeux de têtards transgéniques Tg(rho :GFP-NTR) anesthésiés ...

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Discussion

Avantages et inconvénients de divers paradigmes de lésions rétiniennes chez les têtards de Xénope

Lésion mécanique de la rétine
Diverses lésions chirurgicales de la rétine neurale ont été développées chez les têtards de Xénope. La rétine neurale peut être soit entièrement enlevée 15,16, soit partiellement excisée 16,17. La ...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

Cette recherche a été soutenue par des subventions à M.P. de l’Association Retina France, de la Fondation de France, de la FMR (Fondation Maladies Rares), de la BBS (Association du syndrome de Bardet-Biedl) et de l’UNADEV (Union Nationale des Aveugles et Déficients Visuels) en partenariat avec l’ITMO NNP (Institut Thématique Multi-Organisme Neurosciences, sciences cognitives, neurologie, psychiatrie) / AVIESAN (Alliance Nationale pour les sciences de la vie et de la santé).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
1,2-Propanediol (propyleè ; Ne glycol)Sigma-Aldrich398039
Éthanol absolu &ge ; 99,8 %Produits chimiques VWR20821-365
Anticorps anti-caspase 3 clivé (lapin)Signalisation cellulaire9661SDilution 1/300
Anticorps anti-GFP (poulet)AveslabsGFP-1020Dilution 1/500
Anticorps anti-M-Opsine (lapin)Sigma-AldrichAB5405Dilution 1/500
Anticorps secondaire anti-souris, Alexa Fluor 594 (chèvre)Invitrogen Thermo ScientificA11005Dilution 1/1 000
Anticorps anti-Otx2 (lapin)AbcamAb183951Dilution 1/100
Anticorps secondaire anti-lapin, Alexa Fluor 488 (chèvre)Invitrogen Thermo ScientificA11008Dilution 1/1 000
Anticorps secondaire anti-lapin, Alexa Fluor 594 (chèvre)Invitrogen Thermo ScientificA11012Dilution 1/1 000
Anticorps anti-Recoverin (lapin)Sigma-AldrichAB5585Dilution 1/500
Anticorps anti-Rhodopsine (souris)Sigma-AldrichMABN15Dilution 1/1 000
Anticorps anti-S-Opsin (lapin)Sigma-AldrichAB5407Dilution 1/500
Kit de détection de l’apoptote (système TUNEL fluorimétrique sans issue)PromegaG3250
Benzocaïne  ;Sigma-AldrichE1501Solution mère 10 %
bisBenzimide H 33258 (Hoechst)Sigma-AldrichB2883Solution mère 10 mg/mL
Butanol-1 &ge ; 99,5 %Produits chimiques VWR20810.298
Chlorure de calcium dihydraté (CaCl2, 2H2O)Sigma-Aldrich (Supelco)1.02382Utilisation à 0,1 M
Cas9 (EnGen Spy Cas9 NLS)New England BiolabsM0646T
Clark Capillary Glass modèle GC100TF-10Warner Instruments (Harvard Apparatus)30-0038
Chlorure de cobalt(II) hexahydraté (CoCl2, 6H2O)Sigma-AldrichC8661Solution mère 100 mM
Lamelle 24 x 60 mmVWR631-1575
Dako REAL ab diluant  ;AgilentS202230-2
Diméthyl sulfoxyde (DMSO)Sigma-AldrichD8418
Microtome rotatif électroniqueThermo ScientificMicrom HM 340E  ;
Éosine 1 % aqueuseRAL Diagnostics312740
Fluorescéine lysine dextran  ;   ;Invitrogen Thermo ScientificD1822
Stéréomicroscope fluorescentOlympusSZX 200
GentamycineEuromedexEU0410-B
Glycérine albumine selon MalloryDiapathE0012Utilisation à 3 % dans
l’eau Hématoxyline (Mayer’s Hemalun)RAL Diagnostics320550
HEPES selde potassiumSigma-AldrichH0527
Hormone gonadotrophine chorionique humaineMSD Santé animaleChorulon 1500
Acide chlorhydrique fumant, 37 % (HCl)Sigma-Aldrich (SAFC)1.00314
Chlorhydrate de L-cystéine monohydratéSigma-AldrichC7880Utilisation à 2 % dans 0,1x MBS (pH 7,8 - 8,0)
Sulfate de magnésium heptahydraté (MgSO4, 7H< sub>2O)Sigma-Aldrich (Supelco)1.05886
Métronidazole  ;Sigma-Aldrich (Supelco)M3761Utilisation à 10 mM
Pointes de microchargeurEppendorf5242956003
Extracteur de micropipette (P-97 Flaming/Brown)Sutter Instrument Co.Modèle P-97Programme : Heat 700 / Pull 100 / Vel 75 / Time 90 / Unlocked p = 500
Support de montage pour préserver la fluorescence, FluorSave ReagentMillipore345789
Medium de montage, EukittChem-LabCL04.0503.0500
MX35 Ultra MicrotomeEpredia3053835
Needle Agani 25 G x 5/8''TerumoAN*2516R1
Porte-goupille nickeléOutils de science fine26016-12
Tissu de filtration en nylon (tissu de tamisage) NITEX, ouverture de maille 1 000 & micro ; mSefar06-1000/44
Paraffine histowax sans DMSOHistolab00403
Solution de paraformaldéhyde (32 %)Microscopie électronique SciencesEM-15714-SUtilisation à 4 % dans 1x PBS pH 7.4
Peel-A-Way Moules d’enrobage jetablesEpredia2219
PilonVWR431-0094
Boîte de Pétri 100 mmCorning GosselinSB93-101
Boîte de Pétri 55 mmCorning GosselinBP53-06
Tampon phosphate solution saline (PBS) 10xEuromedexET330-A
PicoSpritzer Système de micro-injectionParker Instrumentation ProductsPicoSpritzer III
Pins  ;Fine Science Tools26002-20
Polysaccharose (Ficoll PM 400 )Sigma-AldrichF4375Utilisation à 3 % dans 0,1x MBS
Chlorure de potassium (KCl)Sigma-AldrichP3911
Poudre d’alevinage : sera Micron Naturesera45475 (00720)
Dissection des ciseauxOutils de science fine14090-09
Slide Superfrost  ;  ; KNITTEL GlassVS11171076FKA  ;
Chauffe-lamesKunz instrumentsHP-3
Chlorure de sodium (NaCl)Sigma-AldrichS7653
Citrate de sodium sel trisodique dihydraté (C6H5Na3O7, 2H2O)VWRchemicals 27833.294
Hydrogénocarbonate de sodium (NaHCO3)Sigma-Aldrich (Supelco)1.06329
Hydroxyde de sodium 30 % solution aqueuse (NaOH)Produits chimiques VWR28217-292
StéréomicroscopeZeissStemi 2000
Seringues Omnifix-F Solo 1 mLB-BRAUN9161406V
ARNcr trans-activateur (tracrRNA)Technologiesd’ADN intégrées
Triton X-100Sigma-AldrichX-100
Tween-20Sigma-AldrichP9416
X-Cite 200DC Illuminateur à fluorescenceX-Cite  ;200DC
Xylène &ge ; 98,5 %  ;Produits chimiques VWR28975-325
blade 1072533

Références

  1. Goldman, D. Müller glial cell reprogramming and retina regeneration. Nature reviews. Neuroscience. 15 (7), 431-442 (2014).
  2. Hamon, A., Roger, J. E., Yang, X. -J., Perron, M. Müller glial cell-dependent regeneration of the neural retina: An overview across vertebrate model systems. Developmental Dynamics. 245 (7), 727-738 (2016).
  3. García-García, D., Locker, M., Perron, M. Update on Müller glia regenerative potential for retinal repair. Current Opinion in Genetics & Development. 64, 52-59 (2020).
  4. Todd, L., et al. Efficient stimulation of retinal regeneration from Müller glia in adult mice using combinations of proneural bHLH transcription factors. Cell Reports. 37 (3), 109857(2021).
  5. Hoang, T., et al. Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration. Science. 370 (6519), (2020).
  6. Langhe, R., et al. Müller glial cell reactivation in Xenopus models of retinal degeneration. Glia. 65 (8), 1333-1349 (2017).
  7. Chesneau, A., Bronchain, O., Perron, M. Conditional chemogenetic ablation of photoreceptor cells in Xenopus retina. Methods in Molecular Biology. 1865, 133-146 (2018).
  8. Martinez-De Luna, R. I., Zuber, M. E. Rod-specific ablation using the nitroreductase/metronidazole system to investigate regeneration in Xenopus. Cold Spring Harbor protocols. 2018 (12), (2018).
  9. Zahn, N., et al. Normal Table of Xenopus development: a new graphical resource. Development. 149 (14), (2022).
  10. McNamara, S., Wlizla, M., Horb, M. E. Husbandry, general care, and transportation of Xenopus laevis and Xenopus tropicalis. Methods in Molecular Biology. 1865, 1-17 (2018).
  11. Parain, K., et al. CRISPR/Cas9-mediated models of retinitis pigmentosa reveal differential proliferative response of Müller cells between Xenopus laevis and Xenopus tropicalis. Cells. 11 (5), 807(2022).
  12. Wlizla, M., McNamara, S., Horb, M. E. Generation and care of Xenopus laevis and Xenopus tropicalis embryos. Methods in Molecular Biology. 1865, 19-32 (2018).
  13. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. Journal of Visualized Experiments JoVE. (27), (2009).
  14. Parain, K., Chesneau, A., Locker, M., Borday, C., Perron, M. Regeneration from three cellular sources and ectopic mini-retina formation upon neurotoxic retinal degeneration in Xenopus. bioRxiv. , (2023).
  15. Vergara, M. N., Del Rio-Tsonis, K. Retinal regeneration in the Xenopus laevis tadpole: a new model system. Molecular Vision. 15, 1000-1013 (2009).
  16. Lee, D. C., Hamm, L. M., Moritz, O. L. Xenopus laevis tadpoles can regenerate neural retina lost after physical excision but cannot regenerate photoreceptors lost through targeted ablation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (3), 1859-1867 (2013).
  17. Martinez-De Luna, R. I., Kelly, L. E., El-Hodiri, H. M. The retinal homeobox (Rx) gene is necessary for retinal regeneration. Developmental Biology. 353 (1), 10-18 (2011).
  18. Choi, R. Y., et al. Cone degeneration following rod ablation in a reversible model of retinal degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (1), 364-373 (2011).

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