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Modélisation de la sclérose en plaques chez les deux sexes : encéphalomyélite auto-immune expérimentale induite par MOG35-55

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DOI :

10.3791/65778

⸱

13 octobre 2023

 ,  ,  , 
1Neuroscience Institute Cavalieri Ottolenghi (NICO), 2Department of Neuroscience “Rita Levi-Montalcini”, University of Turin, 3School of Pharmacy, Pharmacology Unit, University of Camerino, 4Koelliker Hospital

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Résumé

L’encéphalomyélite auto-immune expérimentale est l’un des modèles murins les plus utilisés de la sclérose en plaques. Dans le protocole actuel, les souris C57BL/6J des deux sexes sont immunisées avec le peptide glycoprotéique oligodendrocytaire de myéline, ce qui entraîne principalement une parésie ascendante de la queue et des membres. Nous discutons ici du protocole d’induction et d’évaluation de l’EAE.

Résumé

La sclérose en plaques (SEP) est une maladie inflammatoire auto-immune chronique qui affecte le système nerveux central (SNC). Elle se caractérise par une prévalence différente chez les sexes, touchant plus de femmes que d’hommes, et des résultats différents, montrant des formes plus agressives chez les hommes que chez les femmes. De plus, la SEP est très hétérogène en termes d’aspects cliniques, de caractéristiques radiologiques et pathologiques. Ainsi, il est nécessaire de tirer parti de modèles animaux expérimentaux qui permettent d’étudier autant d’aspects de la pathologie que possible. L’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) représente l’un des modèles les plus utilisés de la SEP chez la souris, modélisant différentes caractéristiques de la maladie, de l’activation du système immunitaire aux lésions du SNC. Nous décrivons ici un protocole pour l’induction de l’EAE chez les souris mâles et femelles C57BL/6J en utilisant l’immunisation par le peptide glycoprotéique de l’oligodendrocyte de myéline 35-55 (MOG35-55), ce qui conduit au développement d’une forme chronique de la maladie. Nous rapportons également l’évaluation du score clinique quotidien et des performances motrices de ces souris pendant 28 jours après l’immunisation (28 dpi). Enfin, nous illustrons quelques analyses histologiques de base au niveau du SNC, en nous concentrant sur la moelle épinière en tant que site principal des lésions induites par la maladie.

Introduction

La sclérose en plaques (SEP) est une maladie inflammatoire auto-immune chronique qui affecte le système nerveux central (SNC). Il montre la présence d’une infiltration périvasculaire de cellules inflammatoires, d’une démyélinisation, d’une perte axonale et d’une gliose1. Son étiologie reste inconnue, et ses aspects cliniques, radiographiques et pathologiques suggèrent une remarquable hétérogénéité de la maladie2.

En raison de son étiologie et de sa complexité inconnues, aucun modèle animal ne récapitule actuellement toutes les caractéristiques cliniques et radiologiques présentées dans la SEPhumaine 3,4. Cependant, divers modèles animaux sont utilisés pour étudier différents aspects de MS 3,4. Dans ces modèles, l’initiation de la maladie est généralement extrêmement artificielle et le délai d’apparition des signes cliniques est différent entre les humains et les souris. Par exemple, chez l’homme, les processus physiopathologiques sous-jacents à la maladie ne sont pas détectés pendant des années avant l’apparition des manifestations cliniques. À l’inverse, les expérimentateurs peuvent détecter des symptômes dans des modèles animaux dans les semaines, voire les jours qui suivent l’induction de la SEP4.

Trois modèles animaux de base produisent les caractéristiques de la démyélinisation caractéristiques de la SEP : ceux qui sont induits par le virus (par exemple, le virus de l’encéphalomyélite murine de Theiler), ceux qui sont induits par des agents toxiques (par exemple, la cuprizone, la lysolécithine) et les différentes variantes de l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE)5. Chaque modèle permet d’étudier certaines facettes spécifiques de la maladie, mais aucun ne reproduit toutes les caractéristiques de la SEP6. Il est donc essentiel de choisir le bon modèle en tenant compte des besoins expérimentaux spécifiques et des questions scientifiques à aborder.

Grâce aux procédures d’immunisation contre les antigènes dérivés de la myéline, l’EAE est induite par le déclenchement d’une réponse auto-immune aux composants du SNC chez les souris sensibles. L’interaction entre un large éventail de mécanismes immunopathologiques et neuropathologiques provoque le développement des principaux traits pathologiques de la SEP (c’est-à-dire l’inflammation, la démyélinisation, la perte axonale et la gliose) chez les souris immunisées 7,8. Les souris commencent à présenter des symptômes cliniques vers la deuxième semaine après l’immunisation et présentent généralement une paralysie ascendante de la queue au membre et au membre antérieur. Le score clinique (c’est-à-dire la quantification de l’accumulation des déficits liés à la maladie) est généralement évalué à l’aide d’une échelle de 5 points7.

L’immunisation active avec une protéine ou un peptide ou le transfert passif de lymphocytes T encéphalitogènes peuvent être utilisés pour induire l’EAE chez des souris ayant des antécédents génétiques différents (par exemple, SJL/J, C57BL/6 et souris non obèses-diabétiques (NOD)). La protéine protéolipide de myéline (PLP), la protéine basique de myéline (MBP) et la glycoprotéine oligodendrocytaire de myéline (MOG) sont des exemples de protéines auto-SNC à partir desquelles des immunogènes sont généralement produits. En particulier, les souris SJL/J immunisées avec l’épitope immunodominant de PLP (PLP139−151) développent une évolution de la maladie cyclique (RR), tandis que les souris C57BL/6J immunisées avec le peptide immunodominant MOG35-55 présentent une EAE de nature chronique1. Malgré certaines limites, telles que le peu d’informations sur l’évolution de la SEP, le rôle des lymphocytes B dans la maladie, les mécanismes de l’intérieur vers l’extérieur ou les difficultés à étudier la remyélinisation, les modèles EAE ont énormément contribué à la compréhension des processus auto-immuns et neuro-inflammatoires, augmentant les connaissances dans le domaine de la SEP et permettant ainsi le développement de nouvelles approches thérapeutiques pour cette maladie4, 6. Le

Dans le présent travail, nous nous sommes concentrés sur une forme particulière d’EAE active, la forme 9,10,11,12 induite par le peptide glycoprotéique 35-55 de l’oligodendrocyte de myéline (MOG35-55). L’EAE induite par MOG35-55 modélise une forme chronique de SEP. Après l’immunisation, les souris subissent une phase asymptomatique au cours de la première semaine suivant l’immunisation, puis la maladie survient généralement au cours de la deuxième semaine après l’immunisation, tandis qu’entre la troisième et la quatrième semaine après l’immunisation, la maladie devient chronique, sans possibilité de guérison complète des déficits accumulés 7,8,13. Il est intéressant de noter qu’aucune différence entre les hommes et les femmes en termes d’incidence, d’apparition, d’évolution ou de progression de la maladie n’est observée dans la plupart des études présentes dans la littérature14, même si moins d’études comparent la maladie chez les hommes et les femmes.

En revanche, chez l’homme, ces paramètres sont connus pour être fortement dimorphiques sexuellement2. La SP touche plus de femmes que d’hommes ; Cependant, les hommes développent généralement une forme plus agressive de la maladie2. Ces preuves ont suggéré un rôle essentiel, ainsi que complexe, des hormones gonadiques15 ; Néanmoins, le rôle et le mécanisme d’action des hormones sexuelles dans la pathologie restent flous. De plus, les données provenant de modèles animaux soutiennent l’idée que les œstrogènes et les androgènes exercent des effets positifs sur différentes parties de la pathologie d’une manière spécifique au sexe16,17.

Certaines études suggèrent également des effets neuroprotecteurs, promyélinisants et anti-inflammatoires de la progestérone18 et, bien que les preuves chez les patients atteints de SEP soient rares18, les stéroïdes neuroactifs (c’est-à-dire les stéroïdes synthétisés de novo par le système nerveux, tels que la prégnénolone, la tétrahydroprogestérone et la dihydroprogestérone) pourraient également affecter l’évolution pathologique19. Collectivement, ces données soutiennent l’idée que les hormones sexuelles produites à la fois en périphérie et à l’intérieur du SNC jouent un rôle important et spécifique au sexe dans l’apparition et la progression de la maladie. Par conséquent, dans le présent travail, nous préconisons la collecte de données distinctes sur les animaux mâles et femelles.

Du point de vue histopathologique, la substance blanche de la moelle épinière est le principal site de lésion du SNC dans ce modèle, qui est caractérisé par des régions multifocales et confluentes d’infiltration inflammatoire mononucléaire et de démyélinisation8. Ainsi, en décrivant ce protocole pour l’induction de l’EAE induite par MOG35-55 chez les souris C57BL/6J, nous prendrons en compte l’évolution de la maladie chez les deux sexes et fournirons quelques informations histopathologiques concernant la moelle épinière.

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Protocole

Les soins et la manipulation des animaux dans le cadre du présent travail ont été effectués conformément à la directive du Conseil de l’Union européenne du 22septembre 2010 (2010/63/UE) ; toutes les procédures rapportées dans la présente étude ont été approuvées par le ministère italien de la Santé (407/2018-PR) et par le Comité d’éthique de l’Université de Turin (projet n° 360384). Nous suggérons de se conformer au plan expérimental aux lignes directrices ARRIVE publiées à l’origine par Kilkenny et al. en 201020. Avant de commencer, assurez-vous que le matériel nécessaire est disponible (voir le tableau des matériaux). Stériliser toute la verrerie et les ustensiles utilisés pour la préparation de l’émulsion MOG35-55 dans un autoclave. Un résumé des procédures expérimentales est représenté à la figure 1.

1. Préparation de l’émulsion MOG35-55

REMARQUE : Pour préparer l’émulsion, MOG35-55, un adjuvant de Freud incomplet (IFA), la souche H37Ra de Mycobacterium Tuberculosis (MT) et une solution physiologique sont nécessaires (voir le tableau des matériaux).

ATTENTION : La MT tuée par la chaleur peut stimuler la réponse immunitaire innée. Évitez l’inhalation, l’ingestion et le contact avec la peau et les yeux en utilisant un équipement de protection individuelle approprié et en pesant la magnétoscopie dans une balance de précision couverte sous le capot.

SolutionCompositionNotes
2 mg/mL de solution peptidique MOG35-55 Peptide MOG35-55 lyophilisé dilué dans une solution physiologique à une concentration de 2 mg/mLConservez la solution déjà diluée à -80 °C.
Solution de ressuage à 5 μg/mLPT lyophilisé dilué dans une solution physiologique à une concentration de 5 μg/mL.Conservez la solution déjà diluée à -80 °C.
ÉmulsionLe volume total d’émulsion nécessaire pour chaque souris à immuniser est de 300 μL répartis comme suit :Pour éviter les altérations ou la contamination, préparez l’émulsion le jour de l’immunisation.
200 μg/souris de MOG35-55 , soit 100 μL de MOG35-55 solution à 2 mg/mL.
50 μL de solution physiologique
150 μL d’IFA
4 mg/mL MT, soit 1,2 mg/souris
Solution physiologiqueChlorure de sodium 0,9% dilué dans de l’eau distillée.

Tableau 1 : Composition des solutions utilisées pour la procédure d’immunisation.

  1. Préparez la solution dans un bécher en verre, en ajoutant d’abord le composant liquide et enfin le MT.
    REMARQUE : Le volume total d’émulsion nécessaire pour chaque souris à immuniser est de 300 μL, divisé comme indiqué dans le tableau 1. L’émulsion est très visqueuse et épaisse, donc pendant la procédure de préparation et d’injection, il peut y avoir une certaine perte, en particulier lors de la préparation de la solution pour quelques souris. Nous suggérons de calculer le volume final d’émulsion nécessaire en surestimant le nombre de souris à immuniser d’au moins 1,5 à 2 fois.
  2. Placez le bécher dans de la glace et utilisez la seringue en verre avec une aiguille de 18 G pour commencer à émulsionner la solution.
    REMARQUE : L’émulsion peut également être préparée en utilisant d’autres stratégies, par exemple, en connectant les deux seringues en verre sans air avec un robinet d’arrêt à trois voies et en mélangeant la solution en poussant les pistons d’avant en arrière21,22.
  3. Émulsionner la solution pendant au moins 15 min ; Généralement, 30 min d’émulsification suffisent. Pour vérifier la qualité de l’émulsion, ajoutez une goutte d’émulsion dans un récipient transparent rempli d’eau : si la goutte conserve sa structure et reste intacte, l’émulsion est prête.
  4. Placez l’émulsion directement à l’intérieur des seringues de 1 mL qui seront utilisées pour l’immunisation et conservez-les à +4 °C jusqu’à utilisation pour préserver l’épaisseur de l’émulsion et éviter les altérations ou les contaminations.

2. Sélection et immunisation des animaux

  1. Sélection des animaux
    1. Sélectionnez des souris C57BL/6J adultes des deux sexes à l’âge de 8 à 10 semaines avec un poids corporel optimal de ~20 g. Assurez-vous de sélectionner des souris appariées selon l’âge et le sexe pour différents groupes expérimentaux, car la susceptibilité à la maladie peut varier avec l’âge et le sexe.
      REMARQUE : Les souris doivent avoir un poids corporel comparable le jour de l’immunisation, car la procédure actuelle est optimisée pour une certaine fourchette de poids corporel (17 à 25 g).
    2. Héberger des animaux de même sexe en groupe (n = 4-5/cage) pour éviter l’isolement social dans des conditions standard dans des cages à souris en polypropylène de 45 cm x 25 cm x 15 cm à 22 ± 2 °C, sous un cycle lumière/obscurité de 12h12 (lumières allumées à 08h00). Fournir de la nourriture et de l’eau ad libitum.
      NOTE : Éventuellement, pour limiter davantage la variabilité potentielle de l’évolution de la maladie chez les animaux immunisés, nous suggérons également de former des groupes expérimentaux suffisamment nombreux. Il existe également des études 8,23 qui décrivent le moment de l’immunisation comme une condition qui détermine la variation des résultats de l’EAE. Ainsi, nous suggérons d’effectuer l’immunisation à peu près à la même heure chez tous les animaux, de préférence pendant les heures de lumière du cycle quotidien lumière/obscurité23. Pour limiter le stress, il est préférable de manipuler les animaux avant le jour de l’immunisation et de les marquer pour les identifier facilement en vue d’une évaluation quotidienne, par exemple en coupant les oreilles ou en les étiquetant.
  2. La procédure d’immunisation
    REMARQUE : S’assurer que l’intervention est effectuée par un investigateur expérimenté afin de minimiser le stress des animaux et d’optimiser l’immunisation. Avant de commencer l’immunisation, choisissez la méthode d’anesthésie conformément aux lignes directrices du comité d’éthique et de soins aux animaux de l’établissement. Notre laboratoire utilise une anesthésie brève à l’isoflurane.
    1. Anesthésier la souris : 4 % d’isoflurane pour l’induction de l’anesthésie et 1,5 à 2 % d’isoflurane pour l’entretien de l’anesthésie. Attendez que l’anesthésie soit efficace et pincez l’orteil à l’arrière et à l’avant du pied pour évaluer le niveau d’anesthésie. Pour prévenir la sécheresse des yeux pendant que la souris est sous anesthésie, utilisez une pommade oculaire approuvée par un vétérinaire.
    2. Injection intraveineuse PT dans la veine caudale latérale : bouchez doucement la queue de la souris avec une solution d’éthanol, qui agit comme un vasodilatateur, pour montrer les veines. Se concentrer sur l’une des deux nervures latérales de la queue et, à l’aide d’une seringue de 0,5 mL munie d’une aiguille de 30 G, injecter 500 ng de PT (soit 100 μL de PT dilué dans une solution physiologique à la concentration de 5 μg/mL).
    3. Injection sous-cutanée de l’émulsion MOG35-55 : à l’aide de la seringue de 1 mL munie d’une aiguille de 26 G, effectuer trois injections sous-cutanées de l’émulsion préalablement préparée : deux sous la partie rostrale des flancs et une à la base de la queue. Le volume d’émulsion injecté dans chaque site est de 100 μL, pour un volume total de 300 μL d’émulsion injectée dans chaque souris.
      REMARQUE : Le jour de l’immunisation est enregistré comme le jour 0 après l’immunisation (dpi) ; 48 h plus tard (c’est-à-dire à 2 dpi), il est nécessaire d’effectuer une autre injection intraveineuse de PT égale à celle effectuée précédemment. Il est possible de réaliser l’injection sans anesthésie, à l’aide d’un dispositif de contention de souris. La procédure décrite ici vise à induire et à maintenir l’anesthésie des souris pendant la procédure d’immunisation afin d’éviter d’éventuels malaises et mouvements des animaux ou des risques pour les souris et les investigateurs. Ainsi, il n’y a pas d’interventions chirurgicales. Cependant, pour optimiser les processus expérimentaux, il est important de maintenir des conditions de stérilité appropriées pendant ces étapes et de surveiller l’état de la souris après ces procédures.
    4. Pour vérifier que la souris s’est remise des injections, placez-la dans une cage propre après les procédures et attendez qu’elle ait retrouvé suffisamment conscience pour maintenir le décubitus sternal. Une fois que la souris s’est complètement rétablie, remettez-la dans la cage d’origine avec d’autres animaux.

3. Suivi de l’EAE

  1. Poids corporel et apport alimentaire
    1. Surveiller quotidiennement le poids corporel des animaux à l’aide d’une balance électronique de précision, car la diminution de la poids corporel est un indicateur de la progression de la maladie.
      NOTE : Cette diminution ne doit pas dépasser un certain pourcentage, selon les lignes directrices du comité institutionnel et d’éthique pour les soins aux animaux. Habituellement, si un animal perd plus de 20 % de son poids corporel initial (c’est-à-dire le poids enregistré à 0 ppp), il doit être sacrifié en application du critère d’évaluation sans cruauté. Les méthodes d’euthanasie impliquent une anesthésie profonde irréversible pour inhalation (p. ex., isoflurane à 5 %) suivie d’une décapitation.
    2. Surveillez l’apport alimentaire (FI), c’est-à-dire la nourriture consommée par un animal au cours d’une journée (g∙jour-1∙animal-1), en pesant la quantité de nourriture dans le récipient spécifique au moins une fois par semaine et en divisant la quantité de nourriture consommée pour les jours passés entre deux mesures séquentielles et le nombre d’animaux présents dans la cage.
      NOTE : Cette mesure permet d’estimer l’apport alimentaire moyen. En raison de l’apparition et de l’accumulation de signes cliniques de la maladie, qui impliquent la paralysie des membres, nous suggérons de placer de la nourriture abreuvée sur le sol de la cage lorsque les animaux ne sont pas capables de se tenir fermement sur leurs membres postérieurs et d’atteindre le récipient de nourriture ou la bouteille d’eau. Afin d’évaluer le plus précisément possible l’apport alimentaire au cours de la période de suivi, nous avons également mesuré le poids sec de cet aliment avant de le mouiller pour les souris.
  2. Évaluation de la cyclicité œstrale au cours de l’EAE
    1. Vérifier le cycle œstral pendant au moins deux cycles, en évaluant les frottis de cytologie vaginale tels que décrits par McLean et al.24. Classer la phase du cycle œstral en fonction de la présence de trois types cellulaires primaires - cellules épithéliales nucléées, cellules épithéliales épithéliales épithéliales cornées et leucocytes - dans les échantillons de frottis vaginal, comme suit :
      1. Classer comme proestrus sur la base d’une présence presque exclusive d’amas de cellules épithéliales nucléées rondes et bien formées.
      2. Classer comme œstrus en fonction de la présence prédominante d’amas densément emballés de cellules épithéliales épithéliales pavimenteuses cornées.
      3. Classer comme metestrus en fonction de la présence prédominante de petits leucocytes de couleur foncée et de la présence mineure de cellules épithéliales épithéliales squameuses cornées.
      4. Classer comme diestrus en fonction de la présence très prédominante de petits leucocytes de couleur foncée et de rares cellules épithéliales épithéliales cornées cornées, ainsi que de l’apparition possible de cellules épithéliales nucléées.
        REMARQUE : Lors de l’évaluation de la maladie chez les deux sexes, il est important de vérifier la variabilité chez les femelles en raison du cycle œstral. Nous suggérons de mettre l’accent sur l’évaluation du cycle œstral, en particulier entre la première et la deuxième semaine après l’immunisation (c’est-à-dire pendant la phase aiguë de l’EAE). Il a déjà été démontré que la procédure d’immunisation provoque les altérations les plus prononcées du cycle œstral au cours de cette phase25. De plus, il est important de considérer que la réalisation du frottis lorsque l’animal atteint un score clinique élevé (en particulier >3) est difficile en raison de la parésie postérieure et du manque de tonus des membres postérieurs.
  3. Score clinique
    1. Demandez à un investigateur en aveugle d’évaluer quotidiennement le score clinique des animaux. Attribuer à chaque animal une note de 0 à 5 (voir le tableau 2) pour évaluer l’évolution de la maladie26 telle que décrite par Racke7.
      REMARQUE : À l’instar de la diminution du poids corporel, un critère d’évaluation sans cruauté est également nécessaire pour l’augmentation des scores cliniques, conformément aux lignes directrices du comité institutionnel et éthique pour les soins aux animaux. En règle générale, si un animal n’est plus capable de se nourrir de manière autonome (cela se produit généralement lorsqu’un animal atteint au moins le score de 4, selon l’échelle que nous utilisons), il doit être sacrifié en tant qu’application du critère d’évaluation sans cruauté.
  4. Évaluation des performances du moteur par test rotarod
    REMARQUE : L’évaluation de la progression de l’EAE est généralement effectuée en attribuant le score clinique quotidiennement, ce qui est fait par un investigateur en aveugle entièrement formé. Cependant, il pourrait être utile de l’accompagner d’une évaluation plus quantitative et objective de l’évolution de la maladie. Dans une étude précédente26, le test rotarod a été utilisé pour mesurer les performances motrices des animaux immunisés. Comme l’ont décrit van den Berg et al.27, pour avoir une évaluation clinique plus quantitative et précise de l’évolution de la maladie, l’évaluation de la performance motrice par le test rotarod peut soutenir l’évaluation du score clinique. Pour une description détaillée, voir van den Berg et al.27.
    1. Laissez les souris subir des séances de rotarod quotidiennement, à partir de 1 dpi jusqu’au sacrifice (c’est-à-dire 28 dpi). Chaque séance consiste en une seule séance de 300 s au cours de laquelle la vitesse de la tige doit être augmentée linéairement de 4 à 40 tr/min.
    2. Enregistrez le score de l’animal. Lorsque la souris n’est pas capable de maintenir son équilibre et tombe de l’appareil, elle tombe au sol et déclenche un capteur, et le ou les temps sont enregistrés. Ainsi, la performance est notée comme latence à la chute (s).

GradeSigne cliniqueDescription
0SainAucun signe clinique observé. L’animal présente un tonus et un mouvement de queue normaux. Il marche sans trébucher.
0.5Portail endommagéL’animal trébuche en marchant sur un gril.
1Queue molleLorsque l’animal est ramassé par la base de la queue, la queue s’affaisse (queue flasque).
1.5Queue molle et barrière affaiblieL’animal montre une queue flasque et il trébuche en marchant sur un gril.
2AtaxieL’animal présente des difficultés à se tenir debout une fois qu’il a été retourné sur le dos.
2.5Ataxie et parésie des membres postérieursL’animal ne peut pas se tenir debout une fois qu’il a été retourné sur le dos, et il perd le tonus de l’un de ses membres postérieurs.
3Paralysie des membres postérieursL’animal perd le tonus des deux membres postérieurs.
3.5Paralysie des membres postérieurs et/ou parésie des membres antérieursL’animal perd le tonus des deux membres postérieurs et partiellement des membres antérieurs. En fait, il montre une perte de force dans la préhension des membres antérieurs.
4TétraparésieL’animal perd complètement le tonus de ses membres.
4.5Tétraparésie et diminution de la température corporelleL’animal perd complètement le tonus de ses membres, et il montre une diminution de la température corporelle (il fait froid).
5Mourant ou mortL’animal est mourant (il ne répond à aucun stimulus) ou mort.

Tableau 2 : Système de notation clinique utilisé pour évaluer la progression de l’EAE.

4. Évaluation des signes histopathologiques induits par l’EAE au niveau de la moelle épinière

REMARQUE : Ici, nous rapportons brièvement la procédure pour sacrifier les animaux et prélever la moelle épinière pour effectuer une analyse histopathologique ; Pour une description détaillée, voir ces références 10,26,28,29.

  1. Fixation et prélèvement de tissus
    REMARQUE : Pour une description détaillée, voir les références10,26.
    1. Sacrifiez les animaux à 28 dpi pendant la phase chronique de la maladie.
      1. Anesthésier les souris par anesthésie profonde irréversible (injection intrapéritonéale de Zolazépam et Tilétamine 80 mg/kg / Xylazine 10 mg/kg).
      2. Perfuser par voie transcardique les souris avec une solution saline suivie d’une solution de paraformaldéhyde (PFA) à 4 %.
        REMARQUE : Faites attention lors de l’utilisation de PFA : comme il est toxique, évitez l’inhalation, l’ingestion et le contact avec la peau et les yeux en utilisant un équipement de protection individuelle approprié. Pesez la poudre, préparez la solution et effectuez la perfusion sous le capot.
    2. Retirez la moelle épinière de la colonne vertébrale30.
    3. Conservez la moelle épinière dans une solution de PFA à 4 % pendant 24 h.
    4. Effectuer plusieurs lavages dans un tampon salin de phosphate (PBS) de 0,01 M.
    5. Incorporer la moelle épinière dans des blocs de paraffine30.
  2. Procédures histologiques
    NOTE : Pour une description détaillée, voir Montarolo et al.10.
    1. À l’aide d’un microtome, découper des sections transversales de moelle épinière de 10 μm d’épaisseur et les recueillir sur des lames recouvertes de gélatine. Orientez le plan de coupe pour qu’il corresponde aux dessins correspondant aux coupes transversales de l’atlas de la moelle épinière de souris31.
    2. Effectuer la déparaffinisation des sections32.
    3. Teindre la section avec de l’hématoxyline et de l’éosine32.
    4. Déshydrater les sections32.
    5. Recouvrez les sections d’un support de montage et laissez-les sécher à température ambiante sous une hotte chimique.
      REMARQUE : La coloration à l’hématoxyline-éosine permet de détecter la présence d’infiltrats inflammatoires périvasculaires (PvII)26, qui est évaluée comme un signe de la maladie28.
  3. Analyse quantitative de sections de moelle épinière
    1. Acquérir des images des coupes colorées à l’aide d’un microscope optique relié à un appareil photo numérique doté d’un objectif 20x29.
    2. Analysez l’image acquise pour obtenir le nombre de PvIIs, exprimé en nombre d’infiltrats par mm2.
      REMARQUE : Pour l’analyse des images acquises, il est utile de tirer parti d’un logiciel d’analyse d’images. Les résultats neuropathologiques présentés dans ce travail sont quantifiés en 10 coupes transversales complètes de la moelle épinière par souris (n = 8/groupe) représentatives des niveaux de la moelle épinière entière.

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Résultats

Suivi de l’EAE après l’immunisation
Cette évaluation a été faite de la manière décrite ci-dessous.

Poids corporel et apport alimentaire
L’analyse bifactorielle de la variance (ANOVA) (le sexe et le temps en tant que variables indépendantes) montre une diminution de la poids corporel des animaux EAE des deux sexes, en particulier au cours de la deuxième semaine suivant l’induction (F(1,57) = 4,952, p < 0,001 ;

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Discussion

Le protocole EAE induit par MOG35-55 que nous avons décrit a conduit au développement d’une forme chronique de SEP chez les souris C57BL/6J 7,8,13. Dans ces résultats représentatifs, nous avons rapporté que les animaux des deux sexes qui ont subi la procédure d’immunisation ont développé une forme chronique de la maladie (c’est-à-dire qu’ils ne se rétablissent pas complètement après l’apparition de la maladie, qu’ils ...

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Déclarations de divulgation

Aucun des auteurs n’a de conflit d’intérêts à déclarer en ce qui concerne la recherche, la paternité et/ou la publication de cet article.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par le Ministero dell’Istruzione, dell’Università e della Ricerca - MIUR projet Dipartimenti di Eccellenza 2018-2022 et 2023-2027 au Département de neurosciences Rita Levi Montalcini ; Fondation Cavalieri-Ottolenghi, Orbassano, Italie. BB a été fellow de l’INFRA-P, Région du Piémont (n.378-35) (2022-2023) et du PRIN 2020 - 20203AMKTW. Nous remercions la Fondazione per la Ricerca Biomedica Onlus (FORB) pour son soutien. Les frais de publication ont été financés par le don de Distretto Rotaract 2031, et en particulier du Rotaract Club Torino Nord-Est. Nous remercions Elaine Miller pour la relecture de notre manuscrit.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
18 g x 1 & frac12 ; “ Aiguille 1,2 x 40 mm pour la seringue en verre  ;TerumoTER-HYP-18G-112-PIN
Appareil photo numérique connecté au microscope optiqueAppareil photo
Balance électronique de précisionMerckMod. Kern-440-47N, résolution 0,1 g
Eosin YSigma-AldrichHT110216
Pipette seringue en verre " ultra asept" 10 mlde système Sacco  ;
Verrerie (c’est-à-dire becker pour préparer l’émulsion)VWR213-1170, 213-1172
Hématoxyline (Mayer' s)Filtre Sigma-AldrichMHS32avant de l’utiliser.  ;
Logiciel d’analyse d’imagesFidji
Incomplet Freund' s adjuvant (IFA)Sigma-AldrichF5506Se conserve à +4 ° ;C.  ;
IsofluraneWellona PharmaCe médicament est utilisé comme anesthésique par inhalation.
Souris C57BL/6J mâles et femellesJackson Laboratory, EnvigoAge 8-10 semaines, poids corporel optimal de ~20 g.
MicrotomeLeica HistoCore BIOCUT R
Support de montage  ;Merck107961
Souris RotarodUgo Basile  ;#47600
Mycobacterium tuberculosis (MT), souche H37Ra  ;Laboratoires Difco Inc.  ;231141Boutique à +4 ° ;C.
Peptide de glycoprotéine d’oligodendrocytes de myéline 35-55 (MOG35-55)EspikemEPK1Conserver à -80 ° ; C dilué (2 mg/mL) dans une solution physiologique ; Préparez-le le jour de la vaccination pour éviter, autant que possible, les altérations ou contaminations.
Microscope optiqueNIKON eclipse 90i
Paraformaldéhyde (PFA)Sigma-Aldrich158127Stocker à +4 ° ; C une fois dilué (4 %) dans un tampon phosphate
Toxine coqueluche (PT)Duotech  ;PT.181Stocker à -80° ; C dilué (concentration 5 & micro ; g/mL) en solution physiologique
Solution physiologique (solution de chlorure de sodium à 0,9 %)B. EurospitalA 032182038Conserver à +4 ° ; C une fois ouvert.
Tampon salin phosphate (PBS)Thermo ScientificJ61196.
pour l’acquisition d’images  ; NIS-Element AR 2.10
Seringues U-100 0,5 mL avec 30 G x 5/16" (0,30 x 8 mm) en aiguille fixe  ; NiproSYMS-0.5U100-3008B-EC
Seringues U-100 1 mL avec 26G x ½ ; ” (0,45 x 12,7 mm) dans l’aiguillePIC20,71,26,03,00,354
Pommade vétérinaire pour les yeuxLacrilube, Lacrigel Europhta
XylazineRompunCe mélange de médicament est utilisé comme anesthésique injectable et sédatif.
Zolazépam et tiletamineZoletil  ; 100Ce médicament est utilisé comme anesthésique injectable, sédatif, relaxant musculaire et analgésique
numérique NIKON DS-U1L003465.Logiciel AP

Références

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Formal Correction: Erratum: Modeling Multiple Sclerosis in the Two Sexes: MOG35-55-Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis
Posted by JoVE Editors on 2/16/2024. Citeable Link.

An erratum was issued for: Modeling Multiple Sclerosis in the Two Sexes: MOG35-55-Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. The Authors section was updated. An additional affiliation (School of Pharmacy, Pharmacology Unit, University of Camerino) was added for author Antonino Casile.

Mots-clés

Mod le de scl rose en plaquesimmunisation MOG 35 55diff rences sexuelles dans la scl rose en plaquessouris C57BL 6Jvaluation du score cliniquetest du rotarodprocessus neuro inflammatoireshistologie de la moelle pini remaladie d my linisante

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