Modélisation de la sclérose en plaques chez les deux sexes : encéphalomyélite auto-immune expérimentale induite par MOG_35-55

La sclérose en plaques (SEP) est une maladie inflammatoire auto-immune chronique qui affecte le système nerveux central (SNC). Il montre la présence d’une infiltration périvasculaire de cellules inflammatoires, d’une démyélinisation, d’une perte axonale et d’une gliose¹. Son étiologie reste inconnue, et ses aspects cliniques, radiographiques et pathologiques suggèrent une remarquable hétérogénéité de la maladie².

En raison de son étiologie et de sa complexité inconnues, aucun modèle animal ne récapitule actuellement toutes les caractéristiques cliniques et radiologiques présentées dans la SEP^{humaine 3,4}. Cependant, divers modèles animaux sont utilisés pour étudier différents aspects de MS ^3,4. Dans ces modèles, l’initiation de la maladie est généralement extrêmement artificielle et le délai d’apparition des signes cliniques est différent entre les humains et les souris. Par exemple, chez l’homme, les processus physiopathologiques sous-jacents à la maladie ne sont pas détectés pendant des années avant l’apparition des manifestations cliniques. À l’inverse, les expérimentateurs peuvent détecter des symptômes dans des modèles animaux dans les semaines, voire les jours qui suivent l’induction de la SEP⁴.

Trois modèles animaux de base produisent les caractéristiques de la démyélinisation caractéristiques de la SEP : ceux qui sont induits par le virus (par exemple, le virus de l’encéphalomyélite murine de Theiler), ceux qui sont induits par des agents toxiques (par exemple, la cuprizone, la lysolécithine) et les différentes variantes de l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE)⁵. Chaque modèle permet d’étudier certaines facettes spécifiques de la maladie, mais aucun ne reproduit toutes les caractéristiques de la SEP⁶. Il est donc essentiel de choisir le bon modèle en tenant compte des besoins expérimentaux spécifiques et des questions scientifiques à aborder.

Grâce aux procédures d’immunisation contre les antigènes dérivés de la myéline, l’EAE est induite par le déclenchement d’une réponse auto-immune aux composants du SNC chez les souris sensibles. L’interaction entre un large éventail de mécanismes immunopathologiques et neuropathologiques provoque le développement des principaux traits pathologiques de la SEP (c’est-à-dire l’inflammation, la démyélinisation, la perte axonale et la gliose) chez les souris immunisées ^7,8. Les souris commencent à présenter des symptômes cliniques vers la deuxième semaine après l’immunisation et présentent généralement une paralysie ascendante de la queue au membre et au membre antérieur. Le score clinique (c’est-à-dire la quantification de l’accumulation des déficits liés à la maladie) est généralement évalué à l’aide d’une échelle de 5 points⁷.

L’immunisation active avec une protéine ou un peptide ou le transfert passif de lymphocytes T encéphalitogènes peuvent être utilisés pour induire l’EAE chez des souris ayant des antécédents génétiques différents (par exemple, SJL/J, C57BL/6 et souris non obèses-diabétiques (NOD)). La protéine protéolipide de myéline (PLP), la protéine basique de myéline (MBP) et la glycoprotéine oligodendrocytaire de myéline (MOG) sont des exemples de protéines auto-SNC à partir desquelles des immunogènes sont généralement produits. En particulier, les souris SJL/J immunisées avec l’épitope immunodominant de PLP (PLP_139−151) développent une évolution de la maladie cyclique (RR), tandis que les souris C57BL/6J immunisées avec le peptide immunodominant MOG_35-55 présentent une EAE de nature chronique¹. Malgré certaines limites, telles que le peu d’informations sur l’évolution de la SEP, le rôle des lymphocytes B dans la maladie, les mécanismes de l’intérieur vers l’extérieur ou les difficultés à étudier la remyélinisation, les modèles EAE ont énormément contribué à la compréhension des processus auto-immuns et neuro-inflammatoires, augmentant les connaissances dans le domaine de la SEP et permettant ainsi le développement de nouvelles approches thérapeutiques pour cette maladie^{4, 6}. Le

Dans le présent travail, nous nous sommes concentrés sur une forme particulière d’EAE active, la forme 9,10,11,12 induite par le peptide glycoprotéique 35-55 de l’oligodendrocyte de myéline (MOG_35-55). L’EAE induite par MOG_35-55 modélise une forme chronique de SEP. Après l’immunisation, les souris subissent une phase asymptomatique au cours de la première semaine suivant l’immunisation, puis la maladie survient généralement au cours de la deuxième semaine après l’immunisation, tandis qu’entre la troisième et la quatrième semaine après l’immunisation, la maladie devient chronique, sans possibilité de guérison complète des déficits accumulés ^7,8,13. Il est intéressant de noter qu’aucune différence entre les hommes et les femmes en termes d’incidence, d’apparition, d’évolution ou de progression de la maladie n’est observée dans la plupart des études présentes dans la littérature¹⁴, même si moins d’études comparent la maladie chez les hommes et les femmes.

En revanche, chez l’homme, ces paramètres sont connus pour être fortement dimorphiques sexuellement². La SP touche plus de femmes que d’hommes ; Cependant, les hommes développent généralement une forme plus agressive de la maladie². Ces preuves ont suggéré un rôle essentiel, ainsi que complexe, des hormones gonadiques¹⁵ ; Néanmoins, le rôle et le mécanisme d’action des hormones sexuelles dans la pathologie restent flous. De plus, les données provenant de modèles animaux soutiennent l’idée que les œstrogènes et les androgènes exercent des effets positifs sur différentes parties de la pathologie d’une manière spécifique au sexe^16,17.

Certaines études suggèrent également des effets neuroprotecteurs, promyélinisants et anti-inflammatoires de la progestérone¹⁸ et, bien que les preuves chez les patients atteints de SEP soient rares¹⁸, les stéroïdes neuroactifs (c’est-à-dire les stéroïdes synthétisés de novo par le système nerveux, tels que la prégnénolone, la tétrahydroprogestérone et la dihydroprogestérone) pourraient également affecter l’évolution pathologique¹⁹. Collectivement, ces données soutiennent l’idée que les hormones sexuelles produites à la fois en périphérie et à l’intérieur du SNC jouent un rôle important et spécifique au sexe dans l’apparition et la progression de la maladie. Par conséquent, dans le présent travail, nous préconisons la collecte de données distinctes sur les animaux mâles et femelles.

Du point de vue histopathologique, la substance blanche de la moelle épinière est le principal site de lésion du SNC dans ce modèle, qui est caractérisé par des régions multifocales et confluentes d’infiltration inflammatoire mononucléaire et de démyélinisation⁸. Ainsi, en décrivant ce protocole pour l’induction de l’EAE induite par MOG_35-55 chez les souris C57BL/6J, nous prendrons en compte l’évolution de la maladie chez les deux sexes et fournirons quelques informations histopathologiques concernant la moelle épinière.

Les soins et la manipulation des animaux dans le cadre du présent travail ont été effectués conformément à la directive du Conseil de l’Union européenne du 22^septembre 2010 (2010/63/UE) ; toutes les procédures rapportées dans la présente étude ont été approuvées par le ministère italien de la Santé (407/2018-PR) et par le Comité d’éthique de l’Université de Turin (projet n° 360384). Nous suggérons de se conformer au plan expérimental aux lignes directrices ARRIVE publiées à l’origine par Kilkenny et al. en 2010²⁰. Avant de commencer, assurez-vous que le matériel nécessaire est disponible (voir le tableau des matériaux). Stériliser toute la verrerie et les ustensiles utilisés pour la préparation de l’émulsion MOG_35-55 dans un autoclave. Un résumé des procédures expérimentales est représenté à la figure 1.

1. Préparation de l’émulsion MOG_35-55

REMARQUE : Pour préparer l’émulsion, MOG_35-55, un adjuvant de Freud incomplet (IFA), la souche H37Ra de Mycobacterium Tuberculosis (MT) et une solution physiologique sont nécessaires (voir le tableau des matériaux).

ATTENTION : La MT tuée par la chaleur peut stimuler la réponse immunitaire innée. Évitez l’inhalation, l’ingestion et le contact avec la peau et les yeux en utilisant un équipement de protection individuelle approprié et en pesant la magnétoscopie dans une balance de précision couverte sous le capot.

Tableau 1 : Composition des solutions utilisées pour la procédure d’immunisation.

1. Préparez la solution dans un bécher en verre, en ajoutant d’abord le composant liquide et enfin le MT.
   REMARQUE : Le volume total d’émulsion nécessaire pour chaque souris à immuniser est de 300 μL, divisé comme indiqué dans le tableau 1. L’émulsion est très visqueuse et épaisse, donc pendant la procédure de préparation et d’injection, il peut y avoir une certaine perte, en particulier lors de la préparation de la solution pour quelques souris. Nous suggérons de calculer le volume final d’émulsion nécessaire en surestimant le nombre de souris à immuniser d’au moins 1,5 à 2 fois.
2. Placez le bécher dans de la glace et utilisez la seringue en verre avec une aiguille de 18 G pour commencer à émulsionner la solution.
   REMARQUE : L’émulsion peut également être préparée en utilisant d’autres stratégies, par exemple, en connectant les deux seringues en verre sans air avec un robinet d’arrêt à trois voies et en mélangeant la solution en poussant les pistons d’avant en arrière^21,22.
3. Émulsionner la solution pendant au moins 15 min ; Généralement, 30 min d’émulsification suffisent. Pour vérifier la qualité de l’émulsion, ajoutez une goutte d’émulsion dans un récipient transparent rempli d’eau : si la goutte conserve sa structure et reste intacte, l’émulsion est prête.
4. Placez l’émulsion directement à l’intérieur des seringues de 1 mL qui seront utilisées pour l’immunisation et conservez-les à +4 °C jusqu’à utilisation pour préserver l’épaisseur de l’émulsion et éviter les altérations ou les contaminations.

2. Sélection et immunisation des animaux

1. Sélection des animaux
   1. Sélectionnez des souris C57BL/6J adultes des deux sexes à l’âge de 8 à 10 semaines avec un poids corporel optimal de ~20 g. Assurez-vous de sélectionner des souris appariées selon l’âge et le sexe pour différents groupes expérimentaux, car la susceptibilité à la maladie peut varier avec l’âge et le sexe.
      REMARQUE : Les souris doivent avoir un poids corporel comparable le jour de l’immunisation, car la procédure actuelle est optimisée pour une certaine fourchette de poids corporel (17 à 25 g).
   2. Héberger des animaux de même sexe en groupe (n = 4-5/cage) pour éviter l’isolement social dans des conditions standard dans des cages à souris en polypropylène de 45 cm x 25 cm x 15 cm à 22 ± 2 °C, sous un cycle lumière/obscurité de 12h12 (lumières allumées à 08h00). Fournir de la nourriture et de l’eau ad libitum.
      NOTE : Éventuellement, pour limiter davantage la variabilité potentielle de l’évolution de la maladie chez les animaux immunisés, nous suggérons également de former des groupes expérimentaux suffisamment nombreux. Il existe également des études ^8,23 qui décrivent le moment de l’immunisation comme une condition qui détermine la variation des résultats de l’EAE. Ainsi, nous suggérons d’effectuer l’immunisation à peu près à la même heure chez tous les animaux, de préférence pendant les heures de lumière du cycle quotidien lumière/obscurité²³. Pour limiter le stress, il est préférable de manipuler les animaux avant le jour de l’immunisation et de les marquer pour les identifier facilement en vue d’une évaluation quotidienne, par exemple en coupant les oreilles ou en les étiquetant.
2. La procédure d’immunisation
   REMARQUE : S’assurer que l’intervention est effectuée par un investigateur expérimenté afin de minimiser le stress des animaux et d’optimiser l’immunisation. Avant de commencer l’immunisation, choisissez la méthode d’anesthésie conformément aux lignes directrices du comité d’éthique et de soins aux animaux de l’établissement. Notre laboratoire utilise une anesthésie brève à l’isoflurane.
   1. Anesthésier la souris : 4 % d’isoflurane pour l’induction de l’anesthésie et 1,5 à 2 % d’isoflurane pour l’entretien de l’anesthésie. Attendez que l’anesthésie soit efficace et pincez l’orteil à l’arrière et à l’avant du pied pour évaluer le niveau d’anesthésie. Pour prévenir la sécheresse des yeux pendant que la souris est sous anesthésie, utilisez une pommade oculaire approuvée par un vétérinaire.
   2. Injection intraveineuse PT dans la veine caudale latérale : bouchez doucement la queue de la souris avec une solution d’éthanol, qui agit comme un vasodilatateur, pour montrer les veines. Se concentrer sur l’une des deux nervures latérales de la queue et, à l’aide d’une seringue de 0,5 mL munie d’une aiguille de 30 G, injecter 500 ng de PT (soit 100 μL de PT dilué dans une solution physiologique à la concentration de 5 μg/mL).
   3. Injection sous-cutanée de l’émulsion MOG_35-55 : à l’aide de la seringue de 1 mL munie d’une aiguille de 26 G, effectuer trois injections sous-cutanées de l’émulsion préalablement préparée : deux sous la partie rostrale des flancs et une à la base de la queue. Le volume d’émulsion injecté dans chaque site est de 100 μL, pour un volume total de 300 μL d’émulsion injectée dans chaque souris.
      REMARQUE : Le jour de l’immunisation est enregistré comme le jour 0 après l’immunisation (dpi) ; 48 h plus tard (c’est-à-dire à 2 dpi), il est nécessaire d’effectuer une autre injection intraveineuse de PT égale à celle effectuée précédemment. Il est possible de réaliser l’injection sans anesthésie, à l’aide d’un dispositif de contention de souris. La procédure décrite ici vise à induire et à maintenir l’anesthésie des souris pendant la procédure d’immunisation afin d’éviter d’éventuels malaises et mouvements des animaux ou des risques pour les souris et les investigateurs. Ainsi, il n’y a pas d’interventions chirurgicales. Cependant, pour optimiser les processus expérimentaux, il est important de maintenir des conditions de stérilité appropriées pendant ces étapes et de surveiller l’état de la souris après ces procédures.
   4. Pour vérifier que la souris s’est remise des injections, placez-la dans une cage propre après les procédures et attendez qu’elle ait retrouvé suffisamment conscience pour maintenir le décubitus sternal. Une fois que la souris s’est complètement rétablie, remettez-la dans la cage d’origine avec d’autres animaux.

3. Suivi de l’EAE

1. Poids corporel et apport alimentaire
   1. Surveiller quotidiennement le poids corporel des animaux à l’aide d’une balance électronique de précision, car la diminution de la poids corporel est un indicateur de la progression de la maladie.
      NOTE : Cette diminution ne doit pas dépasser un certain pourcentage, selon les lignes directrices du comité institutionnel et d’éthique pour les soins aux animaux. Habituellement, si un animal perd plus de 20 % de son poids corporel initial (c’est-à-dire le poids enregistré à 0 ppp), il doit être sacrifié en application du critère d’évaluation sans cruauté. Les méthodes d’euthanasie impliquent une anesthésie profonde irréversible pour inhalation (p. ex., isoflurane à 5 %) suivie d’une décapitation.
   2. Surveillez l’apport alimentaire (FI), ^{c’est-à-dire} la nourriture consommée par un animal au cours d’une journée (g∙jour-1∙^animal-1), en pesant la quantité de nourriture dans le récipient spécifique au moins une fois par semaine et en divisant la quantité de nourriture consommée pour les jours passés entre deux mesures séquentielles et le nombre d’animaux présents dans la cage.
      NOTE : Cette mesure permet d’estimer l’apport alimentaire moyen. En raison de l’apparition et de l’accumulation de signes cliniques de la maladie, qui impliquent la paralysie des membres, nous suggérons de placer de la nourriture abreuvée sur le sol de la cage lorsque les animaux ne sont pas capables de se tenir fermement sur leurs membres postérieurs et d’atteindre le récipient de nourriture ou la bouteille d’eau. Afin d’évaluer le plus précisément possible l’apport alimentaire au cours de la période de suivi, nous avons également mesuré le poids sec de cet aliment avant de le mouiller pour les souris.
2. Évaluation de la cyclicité œstrale au cours de l’EAE
   1. Vérifier le cycle œstral pendant au moins deux cycles, en évaluant les frottis de cytologie vaginale tels que décrits par McLean et ^al.24. Classer la phase du cycle œstral en fonction de la présence de trois types cellulaires primaires - cellules épithéliales nucléées, cellules épithéliales épithéliales épithéliales cornées et leucocytes - dans les échantillons de frottis vaginal, comme suit :
      1. Classer comme proestrus sur la base d’une présence presque exclusive d’amas de cellules épithéliales nucléées rondes et bien formées.
      2. Classer comme œstrus en fonction de la présence prédominante d’amas densément emballés de cellules épithéliales épithéliales pavimenteuses cornées.
      3. Classer comme metestrus en fonction de la présence prédominante de petits leucocytes de couleur foncée et de la présence mineure de cellules épithéliales épithéliales squameuses cornées.
      4. Classer comme diestrus en fonction de la présence très prédominante de petits leucocytes de couleur foncée et de rares cellules épithéliales épithéliales cornées cornées, ainsi que de l’apparition possible de cellules épithéliales nucléées.
         REMARQUE : Lors de l’évaluation de la maladie chez les deux sexes, il est important de vérifier la variabilité chez les femelles en raison du cycle œstral. Nous suggérons de mettre l’accent sur l’évaluation du cycle œstral, en particulier entre la première et la deuxième semaine après l’immunisation (c’est-à-dire pendant la phase aiguë de l’EAE). Il a déjà été démontré que la procédure d’immunisation provoque les altérations les plus prononcées du cycle œstral au cours de cette phase²⁵. De plus, il est important de considérer que la réalisation du frottis lorsque l’animal atteint un score clinique élevé (en particulier >3) est difficile en raison de la parésie postérieure et du manque de tonus des membres postérieurs.
3. Score clinique
   1. Demandez à un investigateur en aveugle d’évaluer quotidiennement le score clinique des animaux. Attribuer à chaque animal une note de 0 à 5 (voir le tableau 2) pour évaluer l’évolution de la maladie²⁶ telle que décrite par Racke⁷.
      REMARQUE : À l’instar de la diminution du poids corporel, un critère d’évaluation sans cruauté est également nécessaire pour l’augmentation des scores cliniques, conformément aux lignes directrices du comité institutionnel et éthique pour les soins aux animaux. En règle générale, si un animal n’est plus capable de se nourrir de manière autonome (cela se produit généralement lorsqu’un animal atteint au moins le score de 4, selon l’échelle que nous utilisons), il doit être sacrifié en tant qu’application du critère d’évaluation sans cruauté.
4. Évaluation des performances du moteur par test rotarod
   REMARQUE : L’évaluation de la progression de l’EAE est généralement effectuée en attribuant le score clinique quotidiennement, ce qui est fait par un investigateur en aveugle entièrement formé. Cependant, il pourrait être utile de l’accompagner d’une évaluation plus quantitative et objective de l’évolution de la maladie. Dans une étude précédente²⁶, le test rotarod a été utilisé pour mesurer les performances motrices des animaux immunisés. Comme l’ont décrit van den Berg et ^al.27, pour avoir une évaluation clinique plus quantitative et précise de l’évolution de la maladie, l’évaluation de la performance motrice par le test rotarod peut soutenir l’évaluation du score clinique. Pour une description détaillée, voir van den Berg et ^al.27.
   1. Laissez les souris subir des séances de rotarod quotidiennement, à partir de 1 dpi jusqu’au sacrifice (c’est-à-dire 28 dpi). Chaque séance consiste en une seule séance de 300 s au cours de laquelle la vitesse de la tige doit être augmentée linéairement de 4 à 40 tr/min.
   2. Enregistrez le score de l’animal. Lorsque la souris n’est pas capable de maintenir son équilibre et tombe de l’appareil, elle tombe au sol et déclenche un capteur, et le ou les temps sont enregistrés. Ainsi, la performance est notée comme latence à la chute (s).

Tableau 2 : Système de notation clinique utilisé pour évaluer la progression de l’EAE.

4. Évaluation des signes histopathologiques induits par l’EAE au niveau de la moelle épinière

REMARQUE : Ici, nous rapportons brièvement la procédure pour sacrifier les animaux et prélever la moelle épinière pour effectuer une analyse histopathologique ; Pour une description détaillée, voir ces références 10,26,28,29.

1. Fixation et prélèvement de tissus
   REMARQUE : Pour une description détaillée, voir les références^10,26.
   1. Sacrifiez les animaux à 28 dpi pendant la phase chronique de la maladie.
      1. Anesthésier les souris par anesthésie profonde irréversible (injection intrapéritonéale de Zolazépam et Tilétamine 80 mg/kg / Xylazine 10 mg/kg).
      2. Perfuser par voie transcardique les souris avec une solution saline suivie d’une solution de paraformaldéhyde (PFA) à 4 %.
         REMARQUE : Faites attention lors de l’utilisation de PFA : comme il est toxique, évitez l’inhalation, l’ingestion et le contact avec la peau et les yeux en utilisant un équipement de protection individuelle approprié. Pesez la poudre, préparez la solution et effectuez la perfusion sous le capot.
   2. Retirez la moelle épinière de la colonne vertébrale³⁰.
   3. Conservez la moelle épinière dans une solution de PFA à 4 % pendant 24 h.
   4. Effectuer plusieurs lavages dans un tampon salin de phosphate (PBS) de 0,01 M.
   5. Incorporer la moelle épinière dans des blocs de paraffine³⁰.
2. Procédures histologiques
   NOTE : Pour une description détaillée, voir Montarolo et ^al.10.
   1. À l’aide d’un microtome, découper des sections transversales de moelle épinière de 10 μm d’épaisseur et les recueillir sur des lames recouvertes de gélatine. Orientez le plan de coupe pour qu’il corresponde aux dessins correspondant aux coupes transversales de l’atlas de la moelle épinière de souris³¹.
   2. Effectuer la déparaffinisation des sections³².
   3. Teindre la section avec de l’hématoxyline et de l’éosine³².
   4. Déshydrater les sections³².
   5. Recouvrez les sections d’un support de montage et laissez-les sécher à température ambiante sous une hotte chimique.
      REMARQUE : La coloration à l’hématoxyline-éosine permet de détecter la présence d’infiltrats inflammatoires périvasculaires (PvII)²⁶, qui est évaluée comme un signe de la maladie²⁸.
3. Analyse quantitative de sections de moelle épinière
   1. Acquérir des images des coupes colorées à l’aide d’un microscope optique relié à un appareil photo numérique doté d’un objectif 20x²⁹.
   2. Analysez l’image acquise pour obtenir le nombre de PvIIs, exprimé en nombre d’infiltrats par mm².
      REMARQUE : Pour l’analyse des images acquises, il est utile de tirer parti d’un logiciel d’analyse d’images. Les résultats neuropathologiques présentés dans ce travail sont quantifiés en 10 coupes transversales complètes de la moelle épinière par souris (n = 8/groupe) représentatives des niveaux de la moelle épinière entière.

Suivi de l’EAE après l’immunisation
Cette évaluation a été faite de la manière décrite ci-dessous.

Poids corporel et apport alimentaire
L’analyse bifactorielle de la variance (ANOVA) (le sexe et le temps en tant que variables indépendantes) montre une diminution de la poids corporel des animaux EAE des deux sexes, en particulier au cours de la deuxième semaine suivant l’induction (F(1,57) = 4,952, p < 0,001 ; Graphique 2A). Cependant, le dimorphisme sexuel dans l’eau chaude est toujours maintenu (figure 2A). En ce qui concerne le pourcentage de BW (F(1,57) = 23,935, p < 0,001 ; Figure 2B), les mâles et les femelles présentent une perte énorme entre le 12 ppp et le 17 ppp (p < 0,001) par rapport au BW initial, mais ne dépassent jamais une perte totale de 20 % (Figure 2B). Ainsi, bien que la perte de BW commence avant l’apparition de la maladie, elle atteint son maximum pendant la phase aiguë de l’EAE (Figure 2A,B). Il n’y a pas de différences entre les sexes en ce qui concerne la perte de BW. Cependant, les femmes ont tendance à perdre plus de poids plus tôt et à moins récupérer pendant la phase chronique (troisième-quatrième semaine après l’induction) (Figure 2B).

De plus, l’ANOVA bidirectionnelle (sexe et temps comme variables indépendantes) montre également une diminution significative de l’IF (F(9, 39) = 6,682, p < 0,001 ; Graphique 2C) chez les deux sexes, en particulier au cours de la deuxième semaine suivant la vaccination, en raison de la gravité accrue de l’EAE, ce qui a rendu plus difficile pour l’animal d’accéder à la nourriture placée dans le récipient supérieur de la cage. Comme nous l’avons suggéré, la nourriture a ensuite été placée sur le sol de la cage pour réduire le stress supplémentaire des animaux. Cela a permis à l’IF de revenir aux niveaux initiaux (figure 2C) et au BW de se rétablir partiellement (figure 2A,B).

Évaluation du cycle œstral chez les femelles
La comparaison entre le temps passé dans les différentes phases de l’œstrus a été réalisée à l’aide du test t de Student. L’analyse montre des différences dans le temps passé dans les phases estrales (c’est-à-dire le proœstrus et l’œstrus) par rapport à celui passé dans la phase non estrale (c’est-à-dire le métestrus et le diestrus) entre la phase asymptomatique (avant l’apparition de l’EAE) et la phase symptomatique (après l’apparition de l’EAE) (p = 0,042 ; Figure 2D), principalement en raison d’une augmentation du temps passé en œstrus pendant les phases symptomatiques (p = 0,017) et d’une tendance à la réduction du temps passé en proœstrus (p = 0,08).

Il a déjà été décrit que la procédure d’induction entraîne une altération du cycle œstral chez la femme, affectant particulièrement l’œstrus25. Au cours de cette phase, des niveaux croissants d’œstrogènes sont connus pour exercer des effets anti-inflammatoires et neuroprotecteurs16 et sont donc peut-être responsables du rôle protecteur de ces hormones pendant la phase présymptomatique. Cependant, lorsque le niveau d’œstrogènes diminue, comme nous le voyons dans la phase post-apparition, leurs effets protecteurs cessent également.

Score clinique et performance du rotarod
L’ANOVA bidirectionnelle (sexe et temps en tant que variables indépendantes) montre une augmentation significative du temps dans le score clinique (CS) des hommes et des femmes (F(56-813) = 27,951, p < 0,001 ; Graphique 3A). En particulier, à partir de 10 dpi, les deux sexes montrent une augmentation significative de la CS (p < 0,001), qui se maintient jusqu’au point final (28 dpi) (Figure 3A). Les femelles présentent, même si ce n’est pas significativement (p = 0,156), un CS plus élevé que les mâles (figure 3A). En ce qui concerne l’apparition de la maladie, elle se produit généralement autour de 10 dpi, avec une tendance à se manifester plus tôt chez les femmes que chez les hommes (figure 3B). De plus, les femmes présentent un CS cumulatif significativement plus élevé que les hommes (p = 0,017 ; Graphique 3C).

Le cours de performance du rotarod ressemble aux évaluations cliniques (Figure 2D). À partir de l’apparition de la maladie, il diminue, atteignant la performance minimale au cours de la deuxième semaine suivant la vaccination, dans la phase aiguë de l’EAE. L’ANOVA bidirectionnelle (sexe et temps comme variables indépendantes) montre une diminution significative dans le temps de la performance du rotarod des mâles et des femelles (F(46-673) = 5,365, p < 0,001 ; Graphique 3D). En particulier, les mâles affichent la performance minimale à 16 dpi (p = 0,022) tandis que les femelles à 17 dpi (p < 0,001). Les mâles ont tendance à obtenir de meilleurs résultats que les femelles, en particulier pendant la phase chronique de la maladie (21-28 dpi), peut-être en raison d’une CS plus faible (Figure 3A,D).

Évaluation histopathologique de la moelle épinière
L’ANOVA à un facteur (sexe comme variable indépendante) des PvII dans les coupes de moelle épinière met en évidence une nette différence entre les hommes et les femmes (Figure 4A). Les femmes présentent un nombre significativement plus élevé de PvII que les hommes (F(1,14)= 63,107, p < 0,001 ; Graphique 4B). Ces données reflètent peut-être le CS cumulatif plus élevé, la moins bonne performance du rotarod et la maladie plus agressive observée chez les femelles, en particulier pendant la phase chronique de l’EAE.

Ces données reflètent également le fait que les souris femelles présentent une plus grande susceptibilité au développement d’EAE plus agressives que les mâles14, ce qui est l’une des principales différences entre ce modèle de maladie et la SEP qui survient chez l’homme. Les femmes présentent une apparition précoce de la maladie, ont une prévalence modérément plus faible des formes progressives primaires et présentent globalement moins de progression de l’incapacité que les hommes 2,33,34.

Figure 1 : Représentation temporelle schématique des procédures expérimentales. Créé avec BioRender.com. Abréviations : i.v. = intraveineuse ; s.c. = sous-cutanée ; MOG35-55 = peptide glycoprotéique oligodendrocytaire de myéline 35-55 ; = ppp = jour après l’immunisation. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Évaluation des effets de l’EAE sur le poids corporel, l’apport alimentaire chez les souris mâles et femelles et le cycle œstral chez les souris femelles. Du jour de l’immunisation (0 dpi) jusqu’au jour du sacrifice (28 dpi), les graphiques montrent (A) le poids corporel quotidien, (B) le pourcentage du poids corporel et (C) l’évaluation de l’apport alimentaire hebdomadaire chez les animaux des deux sexes (n = 15/groupe). (D) Temps passé (exprimé en pourcentage moyen de temps) dans les différentes phases du cycle œstral, évalué par frottis cytologique vaginal, pendant la phase asymptomatique (pré-apparition, colonne de gauche du graphique) ou la phase symptomatique (post-apparition, colonne de droite du graphique) chez la souris femelle. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± MEB. L’analyse statistique a révélé un effet significatif pour p≤ 0,05 (# = hommes vs femmes ; * = comparaison entre différents points de temps). Abréviations : EAE = encéphalomyélite auto-immune expérimentale ; BW = poids corporel ; FI = apport alimentaire ; DPI = Jour après l’immunisation. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Évaluation du score clinique et de la performance du rotarod chez les souris mâles et femelles affectées par l’EAE. (A) Évaluation du score clinique quotidien (de 0 à 28 dpi) chez les animaux des deux sexes (n = 15/groupe). (B) Jour d’apparition de la maladie (ppp moyen) chez les souris mâles (colonne de gauche) et femelles (colonne de droite) affectées par l’EAE. (C) Score clinique cumulatif moyen atteint par les souris mâles (colonne de gauche) et femelles (colonne de droite) affectées par l’EAE. (D) Évaluation de la performance quotidienne du rotarod (mesurée par la latence de chute) de 6 à 28 dpi (le 0 représente les valeurs de référence obtenues au cours des 5 premiers jours de l’essai) chez les animaux des deux sexes. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± MEB. L’analyse statistique a révélé un effet significatif pour p≤ 0,05 (# = hommes vs femmes ; * = comparaison entre différents points de temps). Abréviations : EAE = encéphalomyélite auto-immune expérimentale ; CS = score clinique ; Cum CS = score clinique cumulatif ; DPI = Jour après l’immunisation. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Analyse de l’inflammation de la moelle épinière chez des souris des deux sexes affectées par l’EAE. (A) Des images représentatives de coupes transversales de la moelle épinière colorées à l’hématoxyline-éosine mettent en évidence la présence de PvII (flèches) chez les souris mâles (image du haut) et femelles (image du bas). (B) Mesure de la présence de PvII dans la moelle épinière de souris des deux sexes affectées par l’EAE (n = 8/groupe). Les données sont présentées sous forme de moyenne ± MEB. L’analyse statistique a révélé un effet significatif pour p ≤ 0,05 (# = hommes vs femmes). Barre d’échelle = 200 μm (grossissement 10x). Abréviations : EAE = encéphalomyélite auto-immune expérimentale ; * = canal central ; PvIIs = infiltrats inflammatoires périvasculaires. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Aucun des auteurs n’a de conflit d’intérêts à déclarer en ce qui concerne la recherche, la paternité et/ou la publication de cet article.