Application du pseudovirus Ha-CoV-2 pour la quantification rapide des variants du SRAS-CoV-2 et des anticorps neutralisants

En mai 2023, il y avait maintenant plus de 766 millions de cas de COVID-19¹. Malgré les campagnes de vaccination mondiales, le SRAS-CoV-2 circule et infecte continuellement les gens, en grande partie en raison de l’émergence de nouveaux variants tels que Delta (B.1.617.2) et Omicron (B.1.1.529) qui entraînent de nouvelles vagues d’infection ^2,3,4. Étant donné que le SRAS-CoV-2 évolue constamment, il est important de mettre au point des tests rapides capables de mesurer avec précision l’infectiosité des variants émergents et l’efficacité des anticorps neutralisants induits par le vaccin contre ces variants. Ces tests sont essentiels pour la surveillance de la pandémie et pour déterminer l’efficacité des vaccins et de leurs rappels spécifiques aux variants.

En raison de la nature hautement contagieuse du SRAS-CoV-2, le Center for Disease Control and Prevention (CDC) exige que l’étude du SRAS-CoV-2 et de ses variants soit menée dans des installations de niveau de biosécurité (BSL) 3 ^5,6. Cette exigence BSL-3 limite l’utilisation de virus vivants pour quantifier l’infectiosité des variants viraux et de leurs anticorps neutralisants dans les laboratoires de recherche et cliniques courants. De plus, les tests traditionnels de neutralisation du SRAS-CoV-2, tels que les tests basés sur les effets sur les plaques ou les cytopathies utilisant des virus vivants compétents pour la réplication, prennent du temps et nécessitent de longues périodes d’incubation⁷. Plusieurs pseudovirus du SRAS-CoV-2 pseudotypés à protéine de pointe (S) ont été développés pour quantifier l’efficacité des anticorps neutralisants 8,9,10,11,12. Dans le cas du SRAS-CoV-2, la protéine S est la principale protéine qui médie l’entrée virale¹³ et est le principal antigène utilisé dans les vaccins contre le SRAS-CoV-2 9,10,14,15,16. Les virions pseudotypés par la protéine S, tels que ceux du virus de la stomatite vésiculeuse (VSV-G) ou du lentivirus, ont été utilisés pour la quantification des anticorps neutralisants 17,18,19. Néanmoins, le pseudovirus à base de lentivirus nécessite normalement 2 à 3 jours d’infection afin de quantifier les signaux rapporteurs. Les systèmes de pseudovirus basés sur VSV contiennent souvent des virus VSV résiduels, ce qui peut entraîner des taux élevés de résultats faussement positifs et nécessite généralement 24 heures d’infection²⁰.

Un nouveau système de pseudovirus du SRAS-CoV-2, le pseudovirus hybride alphavirus-SARS-CoV-2 (Ha-CoV-2), a été récemment développé par Hetrick et al¹². Ha-CoV-2 fournit un nouvel outil pour la quantification rapide de l’infectiosité du virus et de la sensibilité du virus aux anticorps neutralisants dans les laboratoires BSL-2 courants. Structurellement, Ha-CoV-2 ressemble à la particule de virion du SRAS-CoV-2, constituée de protéines structurelles du SRAS-CoV-2, notamment la protéine S (S), la membrane (M), la nucléocapside (N) et l’enveloppe (E), et il n’y a pas de protéine structurelle d’autres virus. De plus, la particule Ha-CoV-2 contient un génome d’ARN à expression rapide provenant d’un alphavirus pour une expression rapporteure rapide dans les cellules. Il a été démontré que le Ha-CoV-2 mesure rapidement l’activité neutralisante des anticorps dans le sérum des personnes vaccinées et convalescentes¹². Comme l’ont démontré Hetrick et coll., lorsqu’on le compare au pseudovirus du SRAS-CoV-2 à base de lentivirus dans un essai temporel, le Ha-CoV-2 exprimait le rapporteur de Luc dès 2 à 4 heures après l’infection, tandis que le pseudovirus lentivirus exprimait Luc après 24 h¹². En outre, l’application potentielle des variants Ha-CoV-2 pour quantifier les anticorps neutralisants est démontrée en utilisant un anticorps neutralisant monoclonal standard, 27BV (voir figure supplémentaire 1)¹². Ce travail détaille l’utilisation de la plateforme Ha-CoV-2 pour la quantification rapide de l’infectiosité des variants du SARS-CoV-2, en utilisant les variants Delta (B.1.617.2) et Omicron (B.1.1.529) comme exemples. En outre, l’application potentielle des variants Ha-CoV-2 pour quantifier les anticorps neutralisants est démontrée en utilisant un anticorps neutralisant monoclonal standard, 27BV¹².

1. Assemblage de virus et de particules virales

1. Vecteurs : Achetez commercialement des vecteurs d’expression pour le SARS-CoV-2 M, E ou N ainsi que pour le SARS-CoV-2 S (type sauvage, Wt), Delta (B.1.617.2) et Omicron (B.1.1.529).
   NOTA : Les séquences protéiques des vecteurs d’expression sont fournies dans le fichier supplémentaire 1. Le fournisseur de ces vecteurs d’expression peut également être trouvé sous la table des matériaux.
2. Cellules et culture cellulaire : Conserver HEK293T cellules dans le milieu d’aigle modifié de Dulbecco (DMEM) contenant 10 % de sérum fœtal bovin (FBS) inactivé par la chaleur, 50 unités/mL de pénicilline et 50 μg/mL de streptomycine.
   REMARQUE : Tous les travaux de culture cellulaire doivent être effectués dans une enceinte de biosécurité à flux d’air laminaire. La transfection de la polyéthylèneimine (PEI) nécessite généralement 5 à 6 heures d’incubation. Les heures de début doivent être soigneusement réfléchies au préalable.
3. Assemblage de virus et cotransfection basée sur l’IPE : Assembler des particules de Ha-CoV-2 par cotransfection de HEK293T cellules. Semez les cellules dans une boîte de Pétri de culture cellulaire de 10 cm (4-5 x 10,⁶ cellules par boîte) dans 10 mL de milieu DMEM complet la veille de la cotransfection. Pour cette étude, trois boîtes de Pétri sont utilisées pour ensemencer les cellules pour l’assemblage de Ha-CoV-2 de type sauvage, Delta et Omicron, respectivement.
4. Incuber des boîtes de Pétri pendant une nuit dans un incubateur de_CO2 à 37 °C. Vérifiez les plats le lendemain matin pour vous assurer que les cellules sont confluentes à 80 %. Retirer le milieu complet et le remplacer par 9 ml de milieu sans sérum DMEM.
5. Pour chaque plat, préparer un mélange de cotransfection avec 2,5 μg de chacun des vecteurs d’expression des protéines structurelles du SRAS-CoV-2 (N, E, M), 10 μg de pAlphaPro-Luc-GFP-PreΨ (génome HaCoV2) et 2,5 μg du vecteur d’expression de la protéine S, soit les variants Delta ou Omicron S, et 45 μL de réactif de transfection à base d’IPE. Laisser le mélange de cotransfection former des complexes en incubant pendant 13 min (ne pas incuber plus de 30 min).
6. Après l’incubation, ajoutez lentement le mélange de cotransfection dans chaque boîte de Pétri, goutte à goutte. Placez les plats dans un incubateur de CO₂ à 37 °C pendant 6 h. Après 6 h, retirez le DMEM sans sérum et remplacez-le par un milieu DMEM complet. Récoltez le virus 48-60 h après la cotransfection.
7. Récolte et entreposage des virus : Récolter les particules 48 h après la cotransfection. Détacher les cellules en les pipetant à plusieurs reprises sur la surface de la monocouche et prélever les cellules de chaque boîte, les placer dans des tubes à centrifuger de 15 mL et centrifuger à 400 x g pendant 5 min. Prélever le surnageant et le faire passer à travers un filtre de 0,22 μM. Conservez le pseudovirus Ha-CoV-2 à -80 °C.

2. Essai d’infectiosité virale

1. Cellules et culture cellulaire : Conserver les cellules HEK293T(ACE2/TMPRSS2) dans le milieu d’Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) contenant 10 % de FBS inactivé par la chaleur, 50 unités/mL de pénicilline et 50 μg/mL de streptomycine.
2. Ensemencement de cellules HEK293T(ACE2/TMPRSS2) : La veille du test d’infectiosité virale, ensemencer des cellules HEK293T(ACE2/TMPRSS2) dans une plaque de 96 puits dans 50 μL de milieu DMEM complet. Pour chaque plaque de 96 puits, ensemencer 2,5 x 10⁴ cellules dans chaque puits, et un total de 2,5 x 10⁶ cellules sont nécessaires pour une plaque. Placer la plaque à 96 puits dans un incubateur de CO₂ à 37 °C pendant la nuit.
3. Infection de HEK293T(ACE2/TMPRSS2) : Utilisez des particules variantes du Ha-CoV-2 pour infecter les cellules HEK293T(ACE2/TMPRSS2). Le matin de l’infection, prélever 50 μL de DMEM de la plaque pré-ensemencée à 96 puits. Remplacer le milieu par 50 μL de Ha-CoV-2 de type sauvage, Delta ou Omicron pendant 18 h à 37 °C.
   REMARQUE : Le protocole peut être arrêté ici jusqu’à ce que l’infection ait atteint 18 h d’incubation et que la plaque soit prête à être analysée par dosage de la luciférase. Le succès de l’infection est déterminé par le test de la luciférase résultant du gène rapporteur de la luciférase exprimé dans les cellules infectées, donc plus le signal est produit, plus l’infection du variant Ha-CoV-2 est réussie.
4. Dosage de la luciférase : Après 18 h d’incubation, ajouter 7,5 μL de tampon de lyse cellulaire directement dans chaque puits et mélanger par agitation orbitale pendant 2 min. Lyser les cellules dans un tampon de lyse pendant au moins 5 minutes à température ambiante.
5. Préparez la solution de test de luciférase Firefly en mélangeant la solution de D-luciférine avec la solution de test de luciférase Firefly dans un rapport de 1 :50. Pour une plaque entière à 96 puits, combiner 3 mL de solution de substrat de luciférase avec 60 μL de solution de D-luciférine avec 2940 μL de solution tampon de luciférase Firefly.
6. Ajouter 25 μL de la solution de test de luciférase Firefly aux lysats cellulaires et mélanger la plaque en agitant orbitalement pendant 1 min. Analysez l’activité de la luciférase à l’aide d’un lecteur de microplaques de luciférase commercial.

3. Extraction de l’ARN de Ha-CoV-2 et PCR quantitative par transcriptase inverse (RT-qPCR)

1. Extraction de l’ARN viral : Extraire l’ARN viral des particules de type sauvage Ha-CoV-2 et des variants Delta et Omicron du Ha-CoV-2 à l’aide d’un kit d’extraction d’ARN viral commercial, en suivant les instructions du fabricant. Conservez l’ARN viral extrait à -80 °C ou utilisez-le immédiatement pour la RT-qPCR.
2. RT-qPCR : Effectuez une RT-qPCR sur l’ARN viral à l’aide d’un master mix en une étape. Effectuez la réaction dans un appareil PCR commercial. Veuillez noter que la cible de l’amplification est l’ARN génomique de Ha-CoV-2. Utilisez l’ADN du vecteur Ha-CoV-2 comme norme pour créer une courbe standard et calculer le nombre de copies d’ARN de chaque variant.

4. Test d’anticorps neutralisants

1. Ensemencement de cellules HEK293T(ACE2/TMPRSS2) : La veille de l’essai, ensemencer des cellules HEK293T(ACE2/TMPRSS2) dans une plaque de 96 puits dans 50 μL de milieu DMEM complet. HEK293T(ACE2/TMPRSS2) sont achetés dans le commerce.
2. Pour le comptage des cellules, obtenir 20 μL de cellules d’une fiole T75 contenant des cellules HEK293T(ACE2/TMPRSS2) et mélanger avec 20 μL de solution de bleu trypan. Ajouter 20 μL de ce mélange dans la chambre de comptage des cellules et compter le nombre de cellules par ml. Pour ensemencer une plaque de 96 puits pour l’infection, utilisez 2,5 x 10⁴ cellules par puits, et 2,5 x 10⁶ cellules seront nécessaires au total. Placer la plaque à 96 puits dans un incubateur de CO₂ à 37 °C pendant la nuit.
3. Test d’anticorps neutralisants : Dans une plaque stérile en polypropylène à 96 puits, préparer le mélange standard d’anticorps neutralisants 27BV et de Ha-CoV-2. Ajouter 8 μL de 27BV (45 mg/mL) dans la plaque et effectuer des dilutions en série de l’anticorps avec 6 μL de DMEM sans sérum.
   REMARQUE : Assurez-vous d’échanger les pointes de pipette entre les transferts de puits et assurez-vous que l’anticorps et le milieu sans sérum sont bien mélangés pour produire des résultats précis.
4. À l’anticorps dilué en série, ajoutez 54 μL de particules Ha-CoV-2 et mélangez le virus et l’anticorps. Pré-incuber des particules de Ha-CoV-2 avec du 27BV dilué en série pendant 1 h à 37 °C à 5 % de CO₂. Après 1 h d’incubation, appliquer 50 μL du mélange d’anticorps et de Ha-CoV-2 sur la plaque de 96 puits contenant les cellules HEK293T(ACE2/TMPRSS2) (2,5 x 10⁴ cellules par puits) ensemencées la veille.
5. Pour les témoins, laissez au moins trois puits contenant uniquement les cellules HEK293T(ACE2/TMPRSS2). Ajouter 50 μL de milieu complet à ces puits pour servir de puits non infectés pour le signal de fond des lectures de l’essai de luciférase.
   NOTE : Le protocole peut être arrêté ici jusqu’à ce que l’infection ait atteint 18 h d’incubation à 37 °C, puis la plaque est prête à être analysée par dosage de luciférase.
6. Dosage de la luciférase : Après 18 h d’incubation, ajouter 7,5 μL de tampon de lyse directement dans chaque puits et mélanger en agitant orbitalement pendant 2 min. Lyser les cellules dans un tampon de lyse pendant au moins 5 minutes à température ambiante.
7. Préparez la solution de test de luciférase Firefly en mélangeant la solution de D-luciférine avec la solution de test de luciférase Firefly dans un rapport de 1 :50. Pour une plaque entière de 96 puits, combiner 3 mL de la solution de substrat de luciférase avec 60 μL de solution de D-luciférine avec 2940 μL de solution tampon de luciférase de luciférase.
8. Ajouter 25 μL de la solution de test de luciférase Firefly aux lysats cellulaires et mélanger la plaque en agitant orbitalement pendant 1 min. Analysez l’activité de la luciférase à l’aide d’un lecteur de microplaques de luciférase commercial.

5. Quantification et analyse statistique

1. Collecte des données : Effectuer des tests d’infection et de luciférase en trois exemplaires comme indiqué (Figure 1). Quantifiez l’expression de la luciférase avec les lectures du test de luciférase. La moyenne est la valeur moyenne des trois lectures du test de luciférase. Les lectures du signal de fond des puits non infectés sont soustraites de cette valeur moyenne. L’écart-type (ET) est déterminé à partir de la valeur moyenne des lectures du test de luciférase.
2. Analyse des données : Tracez l’activité de neutralisation des anticorps et calculez les valeurs ID₅₀ (dose d’inhibition de 50 %) à l’aide d’un logiciel graphique commercial. La valeur ID₅₀ est définie comme les dilutions inhibitrices d’anticorps auxquelles une réduction de 50 % de l’infection des cellules HEK293T(ACE2/TMPRSS2) (sur la base des lectures du test de luciférase) est atteinte.

Les particules de Ha-CoV-2 ont été assemblées à l’aide de cinq vecteurs d’ADN différents qui expriment le génome de l’ARN Ha-CoV-2 et les protéines structurelles (M, N, E et S) du SRAS-CoV-2 dans HEK293T cellules. Le vecteur protéique S varie en fonction de la variante S. La protéine S de la souche originale Ha-CoV-2 de Wuhan (type sauvage, Wt) a été utilisée comme témoin positif, et elle a été assemblée avec la protéine S de chacun des deux autres variants : le Delta (B.1.617.2) ou l’Omicron (B.1.1.529). Les mêmes M, N, E ont été utilisés dans toutes les variantes. Ha-CoV-2(Wt) et les particules variantes ont été collectés 48 heures après la cotransfection, puis utilisés pour infecter les cellules HEK293T(ACE2/TMPRSS2). L’infectiosité a été mesurée par l’expression de la luciférase 18 heures après l’infection. Dans ce système, des niveaux d’expression plus élevés du signal de la luciférase reflètent une infection plus élevée des cellules par Ha-CoV-2. Le signal de la luciférase a été normalisé avec des copies d’ARN génomique par RT-qPCR pour chaque variant. Comme le montre la figure 1, le variant Ha-CoV-2 Omicron a généré un signal 4 à 10 fois plus élevé que le Ha-CoV-2(Wt) original, ce qui suggère une infectiosité plus élevée.

En outre, la capacité du 27BV à neutraliser les variants HaCoV-2(Wt), Delta et Omicron a été quantifiée. 27BV est un anticorps monoclonal de lapin qui a été développé contre le domaine RBD de la protéine S1 du SRAS-COV-2. Pour les tests de neutralisation, des dilutions en série de 27BV ont été effectuées dans une plaque de 96 puits, pré-incubées avec Ha-CoV-2, puis ajoutées à des cellules cibles HEK293T(ACE2/TMPRSS2). Les résultats ont démontré que le 27BV avait une activité neutralisante contre tous les variants testés (Figure 2). Il est intéressant de noter que l’ID50 du 27VB pour Omicron était environ 10 fois moins puissant que l’ID50 pour Ha-CoV-2(WT) et Ha-CoV-2(Delta ; Figure 2). Ces résultats démontrent que la plateforme Ha-COV-2 peut être utilisée comme méthode rapide pour quantifier les anticorps neutralisants induits par le vaccin dans les variants émergents.

Graphique 1. Assemblage et quantification des variants du Ha-CoV-2. (A) Illustration de l’assemblage du Ha-CoV-2 et des particules variantes. Les vecteurs exprimant le génome rapporteur de Ha-CoV-2 et les protéines structurelles (M, S, N et E) sont cotransfectés dans HEK293T cellules. Les particules ont été récoltées 48 h après la cotransfection (l’imagerie des particules de virion et des cellules HEK293T a été créée avec Biorender.com). (B) Quantification de l’infectiosité des variants Ha-CoV-2. L’infectiosité relative des deux variants (Delta et Omicron) est quantifiée et normalisée à l’aide de copies d’ARN génomique de variants individuels du Ha-CoV-2 (Luc). Le type sauvage est le Ha-COV-2 (Wt), qui est utilisé comme contrôle pour la comparaison. Des tests d’infection et de luciférase ont été effectués 3x. RU, unité relative. La moyenne et l’écart-type (ET) sont indiqués. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Graphique 2. Quantification de l’activité de neutralisation du 27BV contre les variants Ha-CoV-2(Luc) L’activité de neutralisation du 27BV a été analysée 18 heures après l’infection des cellules HEK293T(ACE2/TMPRSS2). L’ID50 a été calculé en utilisant le taux d’infection relatif (activité de la luciférase) par rapport à la concentration de 27BV. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Graphique 3. Infection de HEK293T(ACE2/TMPRSS2) par Ha-CoV-2(GFP). Les particules de Ha-CoV-2(GFP) ont été assemblées puis utilisées pour infecter les cellules HEK293T(ACE2/TMPRSS2). L’expression de la GFP a été observée 48 heures après l’infection par microscopie fluorescente. Le champ blanc des cellules infectées est montré à gauche et l’imagerie GFP est montrée à droite. La barre blanche représente 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure supplémentaire 1. Résumé graphique. La structure et l’application du pseudovirus Ha-CoV-2. Image créée avec Biorender.com. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Dossier supplémentaire 1. Séquences de protéines. Liste des séquences des protéines S, M, N et E du SARS-CoV-2. Les séquences de la protéine S comprennent également les variants du SRAS-CoV-2 Omicron (B.1.1.529) et Delta (B.1.617.2). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Un brevet a été déposé par l’Université George Mason et concédé sous licence à Virongy Biosciences Inc. pour le développement de produits. Y.W. est fondateur et membre du conseil consultatif de Virongy Biosciences. B. H est actuellement PDG et directeur scientifique de Virongy Biosciences. Les auteurs n’ont pas d’autres conflits d’intérêts.