A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Research Article
Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.
Ici, un protocole est présenté dans lequel de multiples outils bioinformatiques sont combinés pour étudier les fonctions biologiques de TMEM200A dans le cancer. De plus, nous validons également expérimentalement les prédictions bioinformatiques.
La protéine transmembranaire, TMEM200A, est connue pour être associée aux cancers humains et à l’infiltration immunitaire. Ici, nous avons évalué la fonction de TMEM200A dans les cancers courants par analyse multiomique et utilisé des cultures cellulaires in vitro de cellules gastriques pour vérifier les résultats. L’expression de TMEM200A dans plusieurs types de cancer humain a été évaluée à l’aide des données de séquençage de l’ARN de la base de données Xena de l’UCSC. L’analyse bioinformatique a révélé un rôle potentiel de TMEM200A en tant que biomarqueur diagnostique et pronostique.
Des cultures de lignées cellulaires gastriques et cancéreuses normales ont été cultivées et TMEM200A a été abattue. Les niveaux d’expression de TMEM200A ont été mesurés à l’aide d’une réaction en chaîne par polymérase quantitative en temps réel et d’un transfert Western. Des études in vitro de perte de fonction ont ensuite été utilisées pour déterminer les rôles de la TMEM200A dans le comportement malin et la formation tumorale des cellules cancéreuses gastriques (GC). Des Western blots ont été utilisés pour évaluer l’effet de l’inhibition sur la transition épithélio-mésenchymateuse (EMT) et la voie de signalisation PI3K/AKT dans la GC. L’analyse bioinformatique a montré que TMEM200A était exprimée à des niveaux élevés dans la GC.
La prolifération des cellules GC a été inhibée par TMEM200A knockdown, qui a également diminué la vimentine, la N-cadhérine et les protéines Snai, et a inhibé la phosphorylation de l’AKT. La voie de signalisation PI3K/AKT semble également être impliquée dans la régulation médiée par TMEM200A du développement de la GC. Les résultats présentés ici suggèrent que TMEM200A régule le microenvironnement tumoral en affectant l’EMT. TMEM200A peut également affecter l’EMT par le biais de la signalisation PI3K/AKT, influençant ainsi le microenvironnement tumoral. Par conséquent, dans les pan-cancers, en particulier la GC, TMEM200A peut être un biomarqueur et un oncogène potentiel.
Le cancer est devenu un problème de santé publique persistant mettant en danger la santé humaine dans le monde1en raison de ses taux élevés de morbidité et de mortalité dans le monde, ce qui représente un lourd fardeau financier et médical pour la société2. Des progrès significatifs dans le traitement du cancer ont été réalisés ces dernières années grâce à la découverte de marqueurs du cancer3, et les chercheurs ont mis au point de nouvelles méthodes de diagnostic et de nouveaux médicaments pour traiter le cancer. Cependant, certains patients atteints de cancer ont encore un mauvais pronostic en raison de facteurs tels que la résistance aux médicaments, les effets secondaires des médicaments et la sensibilité chimique4. Par conséquent, il est urgent d’identifier de nouveaux biomarqueurs pour le dépistage et le traitement des cancers à un stade précoce5.
Les protéines membranaires sont des protéines qui peuvent se lier et s’intégrer dans les cellules et les membranes des organites6. Celles-ci peuvent être regroupées en trois catégories en fonction de la force de liaison à la membrane et de leur emplacement : les protéines ancrées dans les lipides, les protéines intégrales et les protéines membranaires périphériques 7,8. Une protéine transmembranaire (TMEM) est une protéine membranaire intégrale constituée d’au moins un segment transmembranaire9, qui traverse complètement ou partiellement la membrane biologique.
Bien que les mécanismes d’action des protéines appartenant à la famille des TMEM ne soient pas bien compris, ces protéines sont connues pour être impliquées dans plusieurs types de cancers10. Plusieurs protéines TMEM sont associées à des phénotypes migratoires, prolifératifs et invasifs, et leur expression est souvent associée au pronostic11 du patient. Par conséquent, les membres de la famille TMEM sont devenus la cible de la recherche. Un examen complet des rapports existants sur le TMEM a révélé qu’ils sont principalement associés à la signalisation inter- et intracellulaire12, aux maladies liées au système immunitaire et à la tumorigenèse10. De nombreux TMEM possèdent également des fonctions physiologiques importantes, par exemple, les canaux ioniques dans la membrane plasmique, l’activation des voies de transduction du signal, ainsi que la médiation de la chimiotaxie cellulaire, de l’adhésion, de l’apoptose et de l’autophagie10. Par conséquent, nous avons émis l’hypothèse que les protéines TMEM pourraient être des marqueurs pronostiques importants dans la détection et le traitement des tumeurs.
TMEM200A expression est significativement élevée dans le cancer gastrique (GC). L’expression plus élevée de TMEM200A13, qui a huit exons et une longueur totale de 77,536 kb sur le chromosome 6q23.1, a été liée à un mauvais pronostic de survie globale (SG) dans les cas de GC. Pourtant, les changements dans son expression ont rarement été rapportés dans les études en oncologie. Cet article compare et analyse l’utilité de l’TMEM200A en tant que cible thérapeutique et marqueur diagnostique de tumeur dans diverses études sur le cancer à l’aide de différents ensembles de données accessibles au public. Nous avons évalué l’efficacité de TMEM200A en tant que biomarqueur diagnostique et pronostique pancancéreux ainsi que ses niveaux d’expression dans divers types de cancer humain à l’aide de données de séquençage de l’ARN provenant des bases de données UCSC Xena et TCGA, ainsi que par réaction en chaîne par polymérase quantitative en temps réel (qRT-PCR) et Western blot.
L’effet des niveaux d’expression de TMEM200A sur les taux de mutation, les processus de régulation, le diagnostic et le pronostic tumoral, l’infiltration immunitaire et l’immunothérapie a été étudié plus en détail à l’aide d’un mélange d’outils informatiques et de sites Web de données. Les bases de données CBioPortal et COSMIC (Catalog of Somatic Mutations in Cancer Cells) ont été utilisées pour examiner les mutations dans TMEM200A. Les sites Web Sangerbox et TISIDB ont été utilisés pour comprendre comment TMEM200A influence l’infiltration immunitaire. L’outil en ligne TISCH (Tumor Immune Single Cell Center) et la base de données CancerSEA ont été utilisés pour étudier la fonction de TMEM200A. Enfin, pour évaluer l’impact de la TMEM200A sur le comportement malin et la fonction de développement tumoral des cellules GC, une expérience de perte de fonction a été menée dans un essai in vitro . De plus, un transfert Western a été effectué pour évaluer comment TMEM200A knockdown affectait la voie de signalisation PI3K/AKT et la transition épithélio-mésenchymateuse (EMT) dans la GC.
1. La base de données de l’Atlas du génome du cancer (TCGA)
NOTE : La base de données de l’Atlas du génome du cancer (TCGA) contient les données de séquençage des gènes dans différents tissus tumoraux14. Les données de séquençage de l’ARN dans TCGA pour l’étude des formats de transcrits TMEM200A par partie par million (TPM) ont été extraites du site Web Xena de l’UCSC Xena 15 (https://xenabrowser. net/datapages/) et log2 transformées pour comparer les expressions entre les échantillons.
2. La base de données TIMER2.0
3. Atlas des protéines humaines (HPA)
4. Le réseau de plate-forme de méthylation de l’ADN HumanMethylation450 Illumina Infinium
REMARQUE : Le réseau de plate-forme de méthylation de l’ADN HumanMethylation450 Illumina Infinium a été utilisé pour collecter des données sur la méthylation. Nous avons pu évaluer les niveaux de méthylation de l’ADN TMEM200A à l’aide de la base de données SMART (http://www.bioinfo-zs.com/smartapp/)18.
5. La base de données UALCAN
6. La base de données du Catalogue des mutations somatiques dans les cellules cancéreuses (COSMIC)
7. Portail CBioPortail
8. Outil Sangerbox 3.0
9. Base de données TISIDB
10. La base de données TIDE
11. La base de données CancerSEA
12. L’outil de réseau de centre unicellulaire immunitaire tumoral (TISCH)
13. GeneMANIA (en anglais seulement)
14. Analyse de l’enrichissement fonctionnel
15. Analyse des différences dans l’activité des gènes
NOTA : TMEM200A score dans chaque échantillon de cancer a été calculé à l’aide de ssGSEA (analyse d’enrichissement de l’ensemble des gènes à échantillon unique)27, et l’analyse différentielle de TMEM200A l’activité des gènes dans les tissus cancéreux et sains a été effectuée pour divers cancers.
16. Analyse de la corrélation clinicopathologique et du pronostic de survie
17. Analyses de régression de Cox univariées et multivariées avec construction de parcelles forestières
18. Modèle pronostique du cancer gastrique basé sur l’expression TMEM200A et les caractéristiques cliniques
19. Culture cellulaire et transfection de siRNA de TMEM200A
NOTE : Des cellules HGC-27 STAD humaines, des cellules SGC-7901 et des cellules GES-1 de l’épithélium de la muqueuse gastrique humaine ont été obtenues commercialement (voir le tableau des matériaux), réanimées, inoculées dans un milieu complet 1640 du Roswell Park Memorial Institute (RPMI) (contenant 10 % de sérum de veau fœtal néonatal et 1 % de mélange de pénicilline) et cultivées à 37 °C dans un mélange de CO2 à 5 % incubateur de culture cellulaire. Le milieu de culture a été changé tous les 2-3 jours. Les cellules en bon état de croissance ont été inoculées dans des plaques à six puits selon (2-3) × 10à 5 cellules par puits.
20. Réaction en chaîne par polymérase quantitative en temps réel
21. Détection par transfert Western de l’expression des protéines pertinentes
22. Dosage CCK-8
Expression de TMEM200A dans divers cancers
Comme l’illustre la figure 1, nous avons d’abord analysé les niveaux d’expression différentiels de TMEM200A dans divers cancers à l’aide de différentes bases de données. TMEM200A expression était élevée dans le cholangiocarcinome (CHOL), le carcinome épidermoïde de la tête et du cou (HNSC), le carcinome rénal à cellules claires (KIRC), le carcinome papillaire rénal (KIRP), le carcinome hépatocellulaire (LIHC), le STAD et le carcinome thyroïdien (THCA) par rapport aux tissus normaux adjacents uniquement sur la base des données TCGA. Cependant, l’expression de TMEM200A a diminué dans le carcinome uroépithélial de la vessie (BLCA), le carcinome épidermoïde cervical et l’adénocarcinome cervical (CESC), le glioblastome multiforme (GBM), le chromophobe du rein (KICH), le carcinome pavimenteux du poumon (LUSC), le phéochromocytome et le paragangliome (PCPG), l’adénocarcinome rectal (READ) et le carcinome de l’endomètre à corps utérin (UCEC) (Figure 2A). Dans la base de données TIMER2.0, l’expression de TMEM200A a augmenté dans CHOL, HNSC, KIRC, KIRP, LIHC et STAD. De plus, l’expression de TMEM200A a augmenté dans le BLCA, CESC, GBM, KICH, LUSC, PCPG, READ, le mélanome cutané cutané (SKCM) et l’UCEC (Figure 2B).
En comparant les résultats des deux bases de données, nous avons constaté que l’expression pancancéreuse de TMEM200A était la même dans chaque base de données. Nous avons obtenu les données de suivi clinique et les données de séquençage de l’ARN de 33 patients atteints de cancer à partir de la base de données TCGA, calculé le score TMEM200A dans chaque échantillon de cancer à l’aide de l’analyse ssGSEA, puis calculé TMEM200A l’activité des gènes dans la tumeur et les tissus normaux dans de nombreuses tumeurs. Nous avons découvert que TMEM200A était fortement exprimé dans le GBM, le HNSC, le KIRC rénal et le THCA (Figure 2C) ; Par conséquent, l’activité génique de TMEM200A a été classée dans chaque tissu tumoral. Il a été constaté que l’activité génique de TMEM200A était la plus élevée dans le KIRC et la plus faible dans le mélanome uvéal (UVM) (Figure 2D). L’évaluation subséquente des niveaux d’expression de TMEM200A dans les tissus humains dans la base de données HPA a montré que les niveaux d’expression de TMEM200A étaient faibles dans la plupart des tissus normaux, mais élevés dans le cortex surrénalien, le rectum, l’endomètre et les muscles lisses (Figure 2E).
Dans les lignées cellulaires tissulaires normales, quelques lignées cellulaires telles que les cellules de la granulosa, les cellules bipolaires, les cellules musculaires squelettiques, les cellules stromales de l’endomètre et les lymphocytes T ont montré une expression élevée de TMEM200A, alors que l’expression de TMEM200A était faible dans la plupart des autres lignées cellulaires (Figure 2F). Nous avons également examiné les données d’immunohistochimie (IHC) dans la base de données HPA pour examiner l’expression de TMEM200A au niveau des protéines. Les données concernant la coloration et l’intensité ont révélé des niveaux d’expression beaucoup plus élevés et plus prononcés de TMEM200A dans les tissus du cancer colorectal (CCR), du poumon (LUAD), du cancer du foie (LIHC), du cancer du sein (BRCA) et du cancer de la prostate (PRAD) par rapport aux tissus normaux (Figure 2G). Ces résultats suggèrent que TMEM200A était largement exprimée dans différents cancers et affectait le développement du cancer via différents mécanismes dans différentes tumeurs.
Relation clinicopathologique et pronostic de survie
Pour 33 tumeurs malignes humaines, nous avons recueilli des informations et des données cliniques dans la cohorte pancancéreuse TCGA (PanCan) à partir du site Web de la base de données Xena de l’UCSC et étudié la corrélation entre l’expression de TMEM200A dans PanCan et l’âge, le grade pathologique, le stade clinicopathologique et l’état de survie du patient. Cette étude a révélé que, dans six cancers, l’expression de TMEM200A était associée au stade clinicopathologique, y compris le BLCA, le carcinome invasif du sein (BRCA), le carcinome de l’œsophage (ESCA), KIRP, SKCM et le carcinome testiculaire (TGCT) (Figure 3A). L’âge était corrélé à six tumeurs, dont les BRCA invasives, le GBM, la leucémie myéloïde aiguë (LAML), le SKCM, le carcinome thymique (THYM) et le cancer de l’endomètre (UCEC) (Figure 3B). Le grade pathologique était associé à six tumeurs, dont le carcinome de l’œsophage (ESCA), HNSC, KIRC, le gliome cérébral de bas grade (LGG), l’adénocarcinome pancréatique (PAAD) et le carcinome de l’endomètre (UCEC) (Figure 3C). L’état de survie était associé à cinq tumeurs, dont le carcinome corticosurrénalien (ACC), BLCA, KIRC, PCPG et le mélanome uvéal (UVM) (Figure 3D).
Nous avons mené des études pour différents cancers sur OS, DSS, PFI et DFI en utilisant une analyse de régression de Cox à un facteur avec un seuil de groupe médian pour en savoir plus sur la corrélation entre l’expression de TMEM200A et le pronostic. Les résultats de l’analyse de la SG ont révélé que, parmi les quatre tumeurs, une expression plus élevée de TMEM200A avait un impact plus important sur le pronostic de la SG dans quatre tumeurs, y compris le carcinome corticosurrénalien (ACC) (P = 0,037), BLCA (P = 0,036), la leucémie myéloïde aiguë (LAML) (P = 0,011) et la GC (STAD) (P = 0,005). En revanche, une expression plus élevée de TMEM200A avait un meilleur pronostic pour la SG dans cinq tumeurs, dont KIRC (P < 0,001), KIRP (P = 0,020), gliome cérébral de bas grade (LGG) (P = 0,042), PCPG (P = 0,002) et mélanome cutané (SKCM) (P = 0,043) (Figure 3E,F). Pour le DSS, une expression élevée de TMEM200A avait un mauvais pronostic dans deux types de tumeurs, y compris le carcinome corticosurrénalien (ACC) (P = 0,026) et BLCA (P = 0,015). Une expression élevée de TMEM200A avait un meilleur pronostic dans quatre types de tumeurs, y compris KIRC (P < 0,001), KIRP (P = 0,001), gliome cérébral de bas grade (LGG) (P = 0,025) et PCPG (P = 0,007) (Figure 3G). De plus, pour l’IFP, une expression plus élevée de TMEM200A avait un mauvais pronostic dans trois types de tumeurs, y compris le carcinome corticosurrénalien (ACC) (P = 0,007), BLCA (P = 0,040) et le mélanome uvéal (UVM) (P = 0,020). Une expression plus élevée de TMEM200A avait un meilleur pronostic dans deux types de tumeurs, y compris le KIRC (P < 0,001) et le gliome de bas grade (LGG) (P = 0,044) du cerveau (Figure 3H). Dans l’IFD, une expression plus élevée de TMEM200A avait un pronostic plus sombre dans le carcinome corticosurrénalien (ACC) (P = 0,044) (Figure 3I).
Par la suite, nous avons sélectionné plusieurs tumeurs (KIRC et KIRP) pour une analyse de régression multi-COX. Les résultats ont montré que TMEM200A pouvaient affecter individuellement le taux de survie des patients atteints de cancer par rapport à d’autres facteurs cliniques (Figure 3J et K). Ces résultats ont montré que TMEM200A pouvait être utilisé comme marqueur biopronostique indépendant dans différents cancers pour influencer la survie des patients atteints de cancer.
Analyse de la méthylation de l’ADN
L’une des altérations épigénétiques qui a reçu le plus d’attention est la méthylation de l’ADN29. Il a été suggéré qu’un type de changement épigénétique, la méthylation de l’ADN, a un impact significatif sur la croissance tumorale30. Par conséquent, à l’aide de la base de données SMART, nous avons évalué les niveaux de méthylation de l’ADN des TMEM200A dans les tissus normaux et cancéreux. Les tissus PAAD et PRAD présentaient des niveaux plus élevés de méthylation de l’ADN de TMEM200A que les tissus normaux. Cependant, TMEM200A présentaient des niveaux de méthylation de l’ADN plus faibles dans les tissus COAD, KIRC, KIRP, LIHC, LUSC, READ, THCA et UCEC que dans les tissus normaux (Figure 4A). Les niveaux de méthylation de l’ADN de TMEM200A étaient considérablement plus élevés dans la base de données TCGA de KIRP, PRAD, PCPG et THYM d’après la base de données UALCAN (Figure 4B), mais pas dans BLCA, BRCA, CHOL, COAD, CESC, ESCA, GBM, HNSC, KIRC, LIHC, LUAD, LUSC, PAAD, READ, TGCT, STAD, THCA et UCEC. Le niveau de méthylation de TMEM200A diminué de manière significative dans les LUSC, PAAD, READ, TGCT, STAD, THCA et UCEC (Figure 4C). Afin d’explorer encore plus loin la relation entre le niveau d’expression de la TMEM200A et la méthylation de l’ADN et les facteurs clinicopathologiques, nous avons de nouveau utilisé la base de données SMART et constaté que le niveau de méthylation de l’ADN des TMEM200A dans BLCA, HNSC, LUAD et STAD changeait avec le stade pathologique (Figure 4D). Les facteurs cliniques influencent le niveau de méthylation de l’ADN des TMEM200A dans les tumeurs ci-dessus.
Analyse des mutations génétiques
L’une des raisons du développement des tumeurs est l’accumulation de mutations génétiques31. Par conséquent, la fréquence des mutations de TMEM200A somatiques a été analysée en estimant la fréquence des mutations TMEM200A dans des échantillons cliniques pancancéreux à l’aide de la base de données cBioPortal. TMEM200A est muté dans de nombreux cancers, tels que le cancer du poumon, le carcinome de l’endométrioïde utérin, le mélanome, le cancer de l’œsophagogastrique, le cancer des os, le cancer du col de l’utérus, le cancer hépatobiliaire, le lymphome mature à cellules B, le BRCA, le cancer de l’endomètre, le cancer de l’ovaire, la tumeur embryonnaire, le cancer du pancréas, le cancer de la tête et du cou, le CCR, le gliome, le cancer du poumon non à petites cellules, le sarcome des tissus mous et le cancer primitif inconnu (Figure 5A). De plus, les altérations de l’ADN peuvent entraîner des changements structurels ou d’acides aminés au niveau des protéines. La figure 5B montre la structure 3D de TMEM200A. À l’aide de la base de données cBioPortal, nous avons trouvé des sites de mutation dans les acides aminés de TMEM200A ; Les mutations faux-sens étaient la forme la plus répandue de mutations (figure 5C).
Nous avons analysé les données à l’aide de Sangerbox 3.0 pour vérifier l’exactitude des sites de mutation et avons obtenu les mêmes résultats que précédemment. Les mutations faux-sens sont la forme la plus fréquente de mutations chez TMEM200A et elles peuvent se produire jusqu’à 7,8 % chez le SKCM (Figure 5D). Une mutation faux-sens est une mutation dans laquelle un codon codant pour un acide aminé subit une substitution de base et devient un codon codant pour un autre acide aminé, ce qui entraîne un changement dans le type d’acide aminé et la séquence de la chaîne polypeptidique. Le résultat d’une mutation faux-sens est généralement que la chaîne polypeptidique perd sa fonction d’origine. De nombreuses anomalies protéiques sont causées par une mutation faux-sens, qui est un type courant de mutation tumorale. Il a été constaté que les mutations faux-sens jouent un rôle clé dans la stabilité des protéines, et que la présence de mutations peut avoir un effet significatif sur l’affinité de liaison entre les protéines32, modifiant les interactions entre les protéines et les macromolécules corrélatives environnantes33.
Ainsi, les mutations faux-sens affectent très probablement la fonction biologique de la protéine transmembranaire 200A dans différents cancers. La corrélation entre TMEM200A mutation génétique et le pronostic de survie clinique des patients atteints de cancer a également été examinée. La probabilité de SG a augmenté par rapport à celle du groupe TMEM200A muté, mais pas dans le groupe exempt de maladie (Figure 5E). L’étude des corrélations génétiques a révélé que TP53, AKAP7, TAAR5, TAAR1, MOXD1, THEMIS, VNN2, ENPP3, TMEM244 et SLC18B1 faisaient partie des gènes qui comutaient avec TMEM200A (Figure 5F). Nous avons pu identifier plusieurs types de mutations et variations mononucléotidiques (SNV) grâce à la base de données COSMIC pour en savoir plus sur TMEM200A mutations dans la GC. La fréquence des substitutions faux-sens était la plus élevée (38,86 %) (figure 5G), et les données sur les VNS ont montré que les VNS les plus courantes dans le STAD étaient G>A (31,73 %), suivies de C>T (26,35 %) et G>T (11,73 %) (figure 5H).
Analyse unicellulaire de la TMEM200A dans le cancer
Nous avons analysé TMEM200A niveaux d’expression dans différentes cellules individuelles à l’aide du site Web TISCH (Tumor Immunology Single Cell Center). L’outil en ligne TISCH a affiché l’expression des TMEM200A pour 65 ensembles de données et 28 types de cellules dans la carte thermique illustrée à la figure 6A. Les résultats ont montré que TMEM200A était principalement exprimée dans les lymphocytes T CD8+ et les fibroblastes. L’ensemble de données GSE72056, qui comprend des cellules de patients atteints d’un mélanome cutané métastatique (SKCM), est remarquable à cet égard. TMEM200A était largement fortement exprimée dans les lymphocytes B, les lymphocytes T CD4+, les lymphocytes T CD8+ appauvris, les cellules endothéliales, les fibroblastes et d’autres types de cellules dans le microenvironnement SKCM (Figure 6B,C). Dans l’ensemble de données GSE146771, qui contient des cellules de patients atteints de CCR, TMEM200A était largement fortement exprimé dans les lymphocytes B, les lymphocytes T CD4+, les lymphocytes T CD8+, les lymphocytes T CD8+ appauvris, les cellules endothéliales, les fibroblastes et d’autres types de cellules dans le microenvironnement du CCR (Figure 6D,E). À l’aide de la base de données CancerSEA, les niveaux d’expression et l’état fonctionnel des TMEM200A dans des cellules tumorales spécifiques ont été déterminés (Figure 6G). TMEM200A expression était fortement corrélée à l’état fonctionnel cellulaire dans une gamme de cancers, y compris le glioblastome (GBM), l’adénocarcinome pulmonaire (LUAD), la leucémie granulocytaire chronique (LMC), le CCR, le rétinoblastome (RB) et le mélanome uvéal (UM). L’angiogenèse, l’apoptose, la différenciation et l’inflammation étaient toutes positivement corrélées à l’expression de TMEM200A dans la majorité des cellules tumorales, tandis que les dommages à l’ADN, la réparation de l’ADN, l’invasion et le métabolisme étaient négativement corrélés à l’expression de TMEM200A (Figure 6F).
Analyse fonctionnelle et d’enrichissement des voies de TMEM200A dans divers cancers
Nous avons examiné le lien entre le TMEM200A et des protéines ayant des fonctions similaires à l’aide du réseau GGI pour explorer la fonction de TMEM200A dans différents cancers (Figure 7A). Les informations génomiques et protéomiques sont analysées par GeneMANIA à l’aide d’une liste de requêtes de gènes cibles. En localisant des gènes qui fonctionnent de la même manière que TMEM200A, les 40 protéines qui interagissent directement avec ce gène ont été découvertes. La corrélation de ces gènes est mise en évidence par le réseau PPI (Figure 7B). Par la suite, les analyses d’enrichissement GO et KEGG de ces 20 gènes étroitement liés à TMEM200A ont révélé que ces gènes adjacents étaient principalement impliqués dans la régulation négative de l’ARN du silençage génique. L’analyse de KEGG a révélé que TMEM200A était abondante dans les voies, y compris la voie de signalisation Wnt et la sénescence cellulaire (Figure 7C). L’analyse d’enrichissement GO a montré que, dans la fonction moléculaire, TMEM200A était principalement abondante dans les canaux calciques et la régulation négative du silençage génique par l’ARN (Figure 7D).
Analyse des corrélations entre l’TMEM200A et l’infiltration immunitaire
Nous avons étudié la corrélation entre l’expression de TMEM200A et l’infiltration des cellules immunitaires afin de démontrer la corrélation entre l’immunité contre le TMEM200A et le cancer. Nous avons effectué une analyse d’infiltration immunitaire CIBERSORT à l’aide des données pan-cancer de Sangerbox 3.0. Les résultats ont montré que l’expression pancancéreuse des TMEM200A était corrélée avec les lymphocytes T CD8+, les lymphocytes T CD4+, les lymphocytes B, les lymphocytes T auxiliaires, les cellules tueuses naturelles, les lymphocytes T régulateurs, les monocytes, les macrophages, les cellules dendritiques, les éosinophiles, les basophiles et les granulocytes (Figure 8A). Par la suite, nous avons examiné la corrélation entre l’expression de TMEM200A et les TIL (Tumor Infiltrating Lymphocytes) à l’aide de la base de données TISIDB, montrant une corrélation étroite entre l’expression de TMEM200A et l’abondance de 28 TIL dans différents types de cancer (Figure 8B). Nous avons utilisé la base de données TISIDB pour évaluer la corrélation entre l’expression de TMEM200A et les médicaments immunosuppresseurs dans les tumeurs malignes humaines afin d’étudier plus en profondeur comment les immunomodulateurs et l’expression de TMEM200A étaient liés. Les résultats ont montré que les niveaux d’expression de TMEM200A étaient significativement corrélés avec les agents immunosuppresseurs dans une variété de cancers (Figure 8C). Des corrélations significatives entre l’expression de TMEM200A et certains agents immunosuppresseurs ont été observées dans le cancer du testicule et l’UM (Figure 8D-F). Nous avons ensuite effectué une analyse de corrélation de l’expression de TMEM200A avec les facteurs immunostimulants et les molécules du CMH à l’aide de la base de données TISIDB (Figure 8G,H). Les résultats ont montré que l’expression de TMEM200A était corrélée à certaines immunostimulants et molécules du CMH dans le carcinome urothélial de la vessie, le carcinome testiculaire, le carcinome corticosurrénalien et l’UM (Figure 8I-L). L’étape suivante a consisté à étudier la corrélation entre l’expression de TMEM200A et les sous-types immunologiques ou moléculaires dans la cohorte PanCan de TCGA dans la base de données TISIDB. Nous avons constaté que les sous-groupes immunologiques de neuf types de cancer distincts exprimaient TMEM200A différemment, y compris BLCA, UVM, KIRC, LIHC, LUAD, LUSC, PRAD, TGCT et BRCA (Figure 8M). De plus, six formes différentes de cancer avec divers sous-groupes moléculaires, y compris HNSC, KIRP, LIHC, PCPG, OV et LUSC, ont montré une expression variable de TMEM200A (Figure 8N).
Analyse de la réponse à l’TMEM200A et à l’immunothérapie
L’efficacité des inhibiteurs de-1/-L1 est fortement corrélée à la TMB, et certains patients atteints de tumeurs peuvent être prédits en utilisant des marqueurs TMB pour l’efficacité de l’immunothérapie34. L’instabilité des microsatellites (MSI) est le terme utilisé pour décrire la fonction de réparation des mésappariements d’ADN (MMR) défectueuse lorsque les erreurs de réplication des microsatellites ne sont pas corrigées et s’accumulent, modifiant la longueur ou la composition de la base des microsatellites35. Le MSI est un marqueur tumoral d’importance clinique 36. Nous avons ainsi évalué l’impact de l’expression de TMEM200A sur l’immunothérapie en étudiant la corrélation entre l’expression de TMEM200A et la TMB ou la MSI. Les résultats ont démontré une corrélation positive substantielle entre l’expression de TMEM200A et le TMB dans THYM, PRAD, OV, LAML, KIRP et KIRC, mais TMEM200A’expression était négativement corrélée avec UCEC, PAAD, LUSC, LUAD, LIHC, LGG, HNSC, GBM et BRCA (Figure 9A). L’expression de MSI et de TMEM200A était fortement et favorablement liée dans le TGCT, tandis que l’expression de TMEM200A était significativement et négativement corrélée avec le MSI dans UCEC, STAD, SKCM, LUSC, LUAD, HNSC et CHOL (Figure 9B). Nous avons également évalué le potentiel de TMEM200A en tant que biomarqueur pour examiner l’efficacité de l’ICB. Les résultats ont montré que TMEM200A seuls prédisaient les réponses de l’ICB avec une précision de l’aire sous la courbe (ASC) > 0,5 dans 7 des 25 sous-populations de l’ICB. TMEM200A ont montré une valeur prédictive plus élevée que les clones de cellules T et B, qui avaient tous deux une valeur de 5. Cependant, la valeur de TMEM200A était inférieure à celle de TIDE (ASC > 0,5 dans 11 sous-populations de l’ICB), du score MSI (ASC > 0,5 dans 11 sous-populations de l’ICB), du CD274 (ASC > 0,5 dans 15 sous-populations de l’ICB), du CD8 (ASC > 0,5 dans 17 sous-populations de l’ICB), de l’IFNG (ASC > 0,5 dans 16 sous-populations de l’ICB) et du Merck18 (ASC > 0,5 dans 17 sous-groupes de l’ICB) (figure 9C). Un mauvais pronostic de survie dans les cohortes ICB_Ria 2017_PD1 Ipi_Naïve, ICB_Gide 2019_PD1 et ICB_Hugo 2016_PD1 était corrélé à une expression élevée de TMEM200A . Cependant, TMEM200A knockdown a augmenté la puissance tumorale médiée par les lymphocytes dans la cohorte moyenne de Kearney 2018 T_PD1 et Pan 2018 OT1 (Figure 9D).
Analyse de l’enrichissement GSEA des TMEM200A dans différents cancers
Nous avons utilisé des DEG entre TMEM200A sous-groupes à forte expression et TMEM200A sous-groupes à faible expression dans 32 tumeurs malignes pour explorer les caractéristiques du cancer liées à la TMEM200A. Nous avons découvert une corrélation substantielle entre l’immunodéficience primaire, la voie de signalisation du récepteur de type I du gène inductible par l’acide rétinoïque (RIG) et l’expression de TMEM200A dans le pan-cancer, en particulier dans BLCA, COAD, KICH, GBM, LUSC, LUAD, MESO, READ, SARC et SKCM (Figure 10). L’acide ribonucléique de la protéine cytoplasmique virale est détecté par la voie de signalisation du récepteur de type RIG-I. Les récepteurs de type RIG-I peuvent influencer la production d’une variété de cytokines inflammatoires dans le corps en activant la voie de signalisation NF-kB en engageant certaines protéines de jonction intracellulaire. En conséquence, la protéine transmembranaire 200A (TMEM200A) pourrait jouer un rôle crucial dans le recrutement des protéines intracellulaires par le récepteur de type RIG-I. Ces résultats impliquent une forte corrélation entre l’expression de TMEM200A et l’infiltration immunologique. De plus, l’analyse d’enrichissement GSEA a montré que l’expression de TMEM200A pancancéreux était corrélée à la signalisation des chimiokines, à l’adhésion cellulaire, aux connexions des récepteurs des cytokines, aux voies de détection de la membrane cellulaire et au contrôle de l’autophagie (Figure 10). Les protéines transmembranaires peuvent fonctionner comme des molécules d’adhésion pour affecter le microenvironnement tumoral en plus de jouer un rôle essentiel dans le contrôle de l’entrée des ions calcium dans la cellule à partir des réservoirs de calcium 36. Par conséquent, les résultats obtenus à partir de l’analyse d’enrichissement GSEA peuvent être dus à l’implication de TMEM200A dans de nombreux processus physiologiques, notamment l’activation des voies de transduction du signal, la formation de canaux ioniques de la membrane plasmique et la régulation de la chimiotaxie cellulaire, de l’adhésion, de l’apoptose et de l’autophagie9.
Nous avons identifié les 50 principaux gènes STAD à la fois positivement et négativement corrélés avec TMEM200A de la base de données LinkedOmics, qui ont été co-exprimés dans STAD, sous forme de cartes thermiques (Figure 11A,B). Nous avons évalué positivement les 5 principaux gènes et les 5 principaux gènes négativement associés à la TMEM200A dans la GC (Figure 11C). Nos résultats ont montré que l’expression de TMEM200A était corrélée avec la co-expression de SPON1 (r = 0,51), CDH11 (r = 0,50), EPB41L2 (r = 0,49), LUM (r = 0,49), SAMD3 (r = 0,49), OVOL2 (r = -0,37), RASAL1 (r = -0,36), IRX5 (r = -0,35), SLC4A11 (r = -0,34) et SYTL1 (r = -0,33). Nous avons analysé les résultats de la visualisation des seuils pour mieux comprendre le rôle de la TMEM200A dans le STAD. Les critères suivants ont été utilisés pour le criblage : variation log2 fois (FC) > 2,0 et valeur P ajustée 0,05. Nous avons trouvé 483 EG, dont 385 étaient régulés à la hausse et 98 à la baisse, et nous avons choisi 100 d’entre eux à visualiser pour créer une carte thermique (Figure 11D). Ensuite, pour les DEG qui répondaient aux critères de sélection, nous avons effectué des analyses d’enrichissement GO et KEGG. Les résultats de l’analyse d’enrichissement GO ont montré que l’enrichissement de BP (processus biologique) était principalement associé à la matrice extracellulaire et aux tissus structurels, l’enrichissement en CC (composant cellulaire) était principalement associé à la matrice extracellulaire et à la membrane basale contenant du collagène, et la MF (fonction moléculaire) était principalement enrichie en structure de matrice extracellulaire et en liaison glycosaminoglycane (Figure 11E et Figure 11G). L’enrichissement de l’analyse KEGG a montré que TMEM200A était principalement enrichi dans la voie d’interactions entre les récepteurs de la matrice extracellulaire, le cytochrome P450 et le système rénine-angiotensine (Figure 11F et Figure 11H).
Modèle pronostique basé sur TMEM200A et caractéristiques cliniques du cancer de l’estomac
Nous avons étudié la corrélation entre les TMEM200A et les données cliniques des patients atteints de STAD et avons donc analysé les caractéristiques clinicopathologiques des patients de la cohorte TCGA-STAD par analyse de régression logistique et en nous basant sur les niveaux d’expression de TMEM200A (Figure 12A). L’âge, le stade clinique et l’expression de TMEM200A étaient tous substantiellement corrélés à la SG chez les patients atteints de STAD, selon une analyse de régression de Cox univariée (Figure 12B). L’analyse de régression multivariée de Cox a montré que l’expression de TMEM200A pourrait être un facteur prédictif autonome de la SG chez les patients atteints de STAD (HR = 1,282, IC à 95 % = 1,066-1,541, P = 0,008) (Figure 12C). Nous avons examiné le potentiel de ces caractéristiques clinicopathologiques pour prédire la SG après 1, 3 et 5 ans dans le STAD en utilisant le modèle standard de tracé linéaire en conjonction avec plusieurs paramètres cliniques (Figure 12D). Les courbes d’étalonnage pour les probabilités de survie à 1 an étaient très cohérentes avec les probabilités prédites par les diagrammes linéaires (figure 12E).
TMEM200A régulation positive dans les cellules STAD et amélioration de la prolifération cellulaire
En passant en revue la littérature relative à la TMEM200A, nous avons découvert que l’expression élevée de TMEM200A indiquait un mauvais pronostic 13 et que le microenvironnement immunitaire de la GC pourrait être influencé par la TMEM200A agissant comme une molécule d’adhésion37, favorisant ainsi l’invasion et la métastase des cellules GC. Nous avons examiné les niveaux de protéines et les niveaux de transcription de l’ARNm de TMEM200A dans les lignées cellulaires STAD pour confirmer les résultats de l’étude susmentionnée. La lignée cellulaire GC HGC-27 a considérablement surexprimé TMEM200A par rapport à la lignée cellulaire épithéliale de la muqueuse gastrique saine GES-1 à la fois au niveau de la protéine et du transcrit de l’ARNm (Figure 13A,B), ce qui indique que TMEM200A était surexprimé dans les cellules HGC-27. Les tests suivants ont donc été effectués à l’aide de cellules HGC-27. Pendant ce temps, pour prouver l’exactitude des résultats expérimentaux, nous avons utilisé la qRT-PCR pour comparer l’expression différentielle de l’ARNm de l’TMEM200A dans les cellules GC humaines SGC-7901 et les cellules épithéliales de la muqueuse gastrique GES-1, et les résultats ont montré que TMEM200A était fortement exprimé dans les cellules SGC-7901 (Figure 13B). TMEM200A a été abattu dans des cellules HGC-27 afin d’examiner l’implication possible de TMEM200A dans le STAD (Figure 13C). Sur la base des résultats de l’exploration de la base de données et de notre analyse de corrélation des TMEM200A, il a été constaté que TMEM200A était principalement impliqué dans la voie d’interactions entre les récepteurs de la matrice extracellulaire, qui était associée à la prolifération et à l’invasion du cancer. Nous avons donc utilisé des tests CCK-8 pour déterminer comment TMEM200A expression affectait la croissance cellulaire. Les tests CCK-8 ont montré que TMEM200A groupes d’inactivation (Si-RNA2 et Si-RNA3) présentaient une baisse notable de la viabilité cellulaire par rapport au groupe NC (Figure 13D). Ces résultats suggèrent que TMEM200A était régulé à la hausse dans STAD et que son niveau d’expression pourrait affecter la prolifération des cellules GC. Sur la base des résultats de l’analyse d’enrichissement de KEGG dans la figure 11F, nous avons constaté que TMEM200A était associée à la voie de signalisation PI3K/AKT dans la GC, et TMEM200A, en tant que facteur d’adhésion cellulaire, peut influencer le mécanisme de la cancérogenèse gastrique en affectant l’EMT. Par conséquent, nous avons utilisé le transfert Western pour vérifier les effets de TMEM200A knockdown sur l’EMT et la voie de signalisation PI3K/AKT avant et après le knockdown. Les résultats ont montré que l’expression de la protéine P-AKT était diminuée dans le groupe TMEM200A knockdown (TMEM200A-SiRNA2) par rapport au groupe témoin négatif (NC), tandis que les niveaux de protéines N-cadhérine, Vimentine et Snai étaient également diminués et que l’expression de la protéine E-cadhérine était augmentée (Figure 13E). Tous ces résultats suggèrent que TMEM200A peuvent affecter l’EMT par la voie de signalisation PI3K/AKT et donc jouer un rôle dans la GC.
Figure 1 : Déroulement de l’étude. Abréviations : TCGA = Base de données de l’Atlas du génome du cancer ; TIMER2.0 = La base de données TIMER2.0 ; OS = survie globale ; PFS = Temps de survie sans progression ; DSS = Survie spécifique à la maladie ; DFS = Survie sans maladie ; TMB = charge mutationnelle tumorale ; MSI = Instabilité des microsatellites ; PPI = Interaction protéine-protéine ; GGI = Interaction gène-gène ; KEGG = Encyclopédie des gènes et des génomes de Kyoto ; GO = Ontologie des gènes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Niveaux d’expression de TMEM200A dans différents cancers. (A) Expression régulée à la hausse ou à la baisse de TMEM200A à partir de l’ensemble de données TCGA dans différentes tumeurs malignes humaines. (B) Analyse des niveaux d’expression de TMEM200A dans les tissus tumoraux et normaux à l’aide de la base de données TIMER2.0. (C) Analyse différentielle de l’activité des gènes TMEM200A dans divers cancers humains à partir de l’ensemble de données TCGA. (D) Classement des niveaux d’activité génique de TMEM200A dans divers cancers humains sur la base du score ssGSEA. (E) TMEM200A niveaux d’expression de la base de données HPA dans les tissus sains. (F) Les niveaux d’expression TMEM200A de la base de données HPA dans les lignées cellulaires normales. (G) Résultats de l’IHC pour l’expression des protéines TMEM200A dans le cancer à partir de la base de données HPA. Abréviations : TCGA = Atlas du génome du cancer ; ssGSEA = Analyse d’enrichissement d’un ensemble de gènes d’un seul échantillon ; HPA = Atlas des protéines humaines ; IHC = Immunohistochimie. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Corrélation de l’expression de TMEM200A avec les caractéristiques clinicopathologiques et le pronostic des différentes tumeurs. (A) La corrélation de l’expression de TMEM200A dans la cohorte pancancéreuse TCGA (PanCan) avec la stadification clinicopathologique dans chaque tumeur a été analysée à l’aide de la base de données UCSC Xena. (B) Corrélation de l’expression de TMEM200A dans la cohorte TCGA PANCAN avec l’âge du patient dans chaque tumeur. (C) Corrélation de l’expression de TMEM200A dans la cohorte TCGA PANCAN avec le grade pathologique tumoral dans chaque tumeur. (D) Corrélation de l’expression de TMEM200A dans la cohorte TCGA PanCan avec le statut de survie des patients dans chaque tumeur. (E) Analyse de corrélation de l’expression de TMEM200A avec la survie globale pancancéreuse dans divers cancers à l’aide du modèle de régression de Cox. (F) Corrélation entre l’expression de TMEM200A et le pronostic de la SG pancancéreuse dans la cohorte PanCan de TCGA. (G) Corrélation entre l’expression de TMEM200A et la survie spécifique à la maladie. (H) Corrélation entre l’expression de TMEM200A et le pronostic de l’intervalle sans progression dans la cohorte TCGA PanCan. (I) Corrélation entre l’expression de TMEM200A et l’intervalle sans maladie. (J) Une analyse de régression COX multifactorielle a été réalisée sur KIRC. (K) Une analyse de régression COX multifactorielle a été réalisée sur KIRP. Abréviations : TCGA = Atlas du génome du cancer ; KIRC : Carcinome rénal à cellules claires du rein ; KIRP : Carcinome papillaire rénal à cellules rénales ; OS = survie globale ; DSS = Survie spécifique à la maladie ; PFI = Intervalle sans progression ; DFI = Intervalle sans maladie. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Analyse de la méthylation de l’ADN des TMEM200A dans différents cancers. (A) Les niveaux de méthylation du promoteur de TMEM200A ont été examinés dans plusieurs types de cancer, selon la base de données SMART. (B) Des niveaux de méthylation du promoteur plus élevés de TMEM200A dans différents types de cancer que dans les tissus normaux ont été examinés conformément à la base de données UALCAN. (C) À l’aide de la base de données UALCAN, il a été déterminé que les tissus normaux présentaient des niveaux de méthylation du promoteur plus faibles de TMEM200A dans plusieurs types de cancer. (D) Le niveau de méthylation de l’ADN des TMEM200A dans BLCA, HNSC, LUAD et STAD changeait avec le stade pathologique. Abréviations : BLCA = carcinome urothélial de la vessie ; HNSC = carcinome épidermoïde de la tête et du cou ; LUAD = Adénocarcinome pulmonaire ; STAD = Adénocarcinome de l’estomac. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : TMEM200A mutations génétiques dans différents cancers. (A) Analyse de TMEM200A types de mutations génétiques dans différents cancers à l’aide de la base de données cBioPortal. (B) Structure protéique 3D de TMEM200A. La zone de reliure est indiquée par la partie colorée, tandis que les autres sections de TMEM200A sont représentées par la partie grise. (C) Isoformes et distribution des mutations somatiques TMEM200A. Axe des abscisses, sites d’acides aminés ; axe des ordonnées, nombre de mutations TMEM200A ; points verts, mutations faux-sens ; et des points gris, des mutations tronquées. (D) Validation des isoformes et de la distribution des mutations somatiques TMEM200A à l’aide des données de Sangerbox 3.0. (E) Pour toutes les tumeurs TCGA, la corrélation entre le statut de mutation et la prédiction de la survie globale des patients a été étudiée à l’aide de la base de données cBioPortal, avec des carrés rouges indiquant le groupe de mutation TMEM200A et des carrés bleus indiquant le groupe non muté. (F) Les gènes co-mutés avec TMEM200A ont été analysés à l’aide de l’outil cBioPortal : TP53, AKAP7, TAAR5, TAAR1, MOXD1, THEMIS, VNN2, ENPP3, TMEM244 et SLC18B1. (G) Analyse de TMEM200A types de mutations dans la GC à l’aide de la base de données COSMIC. (H) Une analyse de TMEM200A types de SNV dans GC a été effectuée à l’aide de la base de données COSMIC. Abréviations : TCGA = Atlas du génome du cancer ; OS = survie globale ; COSMIC = Catalogue des mutations somatiques dans les cellules cancéreuses ; GC = Cancer gastrique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Analyse de corrélation unicellulaire de l’expression de TMEM200A dans différents cancers. (A) Résumé de l’expression de TMEM200A sur le site web de TISCH. (B) Distribution de huit types cellulaires distincts dans l’ensemble de données GSE72056 mélanome cutané métastatique. (C) Niveaux d’expression de TMEM200A dans les cellules de mélanome métastatique cutané à partir de l’ensemble de données GSE72056. (D) Distribution de 13 types cellulaires distincts dans l’ensemble de données sur le cancer colorectal de GSE146771. (E) TMEM200A les niveaux d’expression dans les cellules cancéreuses colorectales à partir de l’ensemble de données GSE146771. (F) La corrélation de l’expression de TMEM200A avec le statut fonctionnel unicellulaire dans plusieurs tumeurs a été démontrée à l’aide de la base de données CancerSEA. (G) Cartes T-SNE illustrant les niveaux d’expression de TMEM200A dans les cellules tumorales individuelles, y compris GBM, LUAD, CML, CRC, RB et UM. Abréviations : GBM = glioblastome ; LUAD = Adénocarcinome pulmonaire ; LMC = leucémie granulocytaire chronique ; CCR = cancer colorectal ; RB = Rétinoblastome ; UM = mélanome uvéal. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 7 : Réseau de co-expression et analyse de l’enrichissement fonctionnel des TMEM200A au niveau des gènes. (A) Réseau de TMEM200A GGI et ses gènes co-exprimés. (B) Réseau PPI. (C,D) TMEM200A et les gènes co-exprimés ont été analysés pour l’enrichissement des voies GO et KEGG. Abréviations : PPI = Interaction protéine-protéine ; GGI = Interaction gène-gène ; KEGG = Encyclopédie des gènes et des génomes de Kyoto ; GO = Ontologie des gènes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 8 : Corrélation entre l’expression des cellules TMEM200A et immunitaires, des agents immunosuppresseurs, des substances immunostimulantes et des molécules du CMH dans différents types de cancer. (A) Carte thermique de Sangerbox 3.0 démontrant la corrélation entre l’expression de TMEM200A et les cellules immuno-infiltrantes. (B) Carte thermique montrant la corrélation entre les cellules infiltrantes immunitaires et l’expression de TMEM200A dans la base de données TISIDB. (C) Carte thermique montrant la corrélation entre les cellules immunosuppressives et l’expression de TMEM200A dans la base de données TISIDB. (D-F) Corrélation entre l’expression de TMEM200A et certains agents immunosuppresseurs dans le cancer du testicule et le mélanome uvéal. (G) Carte thermique montrant la corrélation entre les facteurs immunostimulants et l’expression de TMEM200A dans la base de données TISIDB. (H) Carte thermique de la corrélation entre l’expression de TMEM200A et les molécules du CMH dans la base de données TISIDB. (I-L) Corrélation entre l’expression de TMEM200A et certains facteurs immunostimulants et molécules du CMH dans le carcinome urothélial de la vessie, le carcinome testiculaire, le carcinome corticosurrénalien et le mélanome uvéal. (M) Corrélation entre les sous-groupes immunitaires pancancéreux et l’expression TMEM200A. (N) Corrélation entre les sous-groupes moléculaires pancancéreux et l’expression TMEM200A. Abréviations : CMH = Complexe majeur d’histocompatibilité. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 9 : Analyse de la réponse immunothérapeutique des TMEM200A dans la pancytopénie. (A) Corrélation de l’expression de TMEM200A dans différents cancers avec le TMB. (B) Corrélation entre le MSI dans le pan-cancer et l’expression TMEM200A. (C) TMEM200A potentiel en tant que biomarqueur pour prédire la réponse au blocage des points de contrôle immunitaires. (D) La moyenne pondérée de la corrélation de TMEM200A avec le résultat de survie de l’ICB et le changement de pli logarithmique (logFC) dans le criblage CRISPR ont été utilisées pour le classer. Abréviations : TMB = charge mutationnelle tumorale ; ICB = Blocage des points de contrôle immunitaires ; CRISPR = Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 10 : Analyse d’enrichissement GSEA des TMEM200A dans différents cancers. Les cinq principales voies dans lesquelles TMEM200A joué un rôle fonctionnel majeur dans la régulation de 32 cancers ont été identifiées par l’analyse d’enrichissement GSEA. Le panneau de gauche montre les résultats de l’analyse d’enrichissement GSEA pour les TMEM200A dans ACC, BLCA, BRCA, CESC, CHOL, COAD, ESCA, GBM, HNSC, KICH, KIRC, KIRP, LAML, LGG, LIHC, LUAD, LUSC, MESO, OV, PAAD, PCPG, PRAD, READ et SARC. Le panneau de droite montre les résultats de l’analyse d’enrichissement GSEA pour les TMEM200A en SKCM, STAD, TGCT, THCA, THYM, UCEC, UCS et UVM. Abréviations : GSEA = Analyse de l’enrichissement de l’ensemble des gènes ; ACC = carcinome corticosurrénalien ; BLCA = carcinome urothélial de la vessie ; BRCA = Carcinome invasif du sein ; CESC = Carcinome épidermoïde du col de l’utérus et adénocarcinome endocervical ; CHOL = Cholangiocarcinome ; COAD = Adénocarcinome du côlon ; ESCA = carcinome de l’œsophage ; GBM = glioblastome multiforme ; HNSC = carcinome épidermoïde de la tête et du cou ; KICH = Chromophobe du rein ; KIRC = Carcinome rénal à cellules claires ; KIRP = Carcinome papillaire rénal à cellules papillaires rénales ; LAML = leucémie myéloïde aiguë ; LGG = gliome cérébral de bas grade ; LIHC = Carcinome hépatocellulaire du foie ; LUAD = Adénocarcinome pulmonaire ; LUSC = Carcinome épidermoïde pulmonaire ; MESO = Mésothéliome ; OV = Cystadénocarcinome séreux ovarien ; PAAD = Adénocarcinome pancréatique ; PCPG = Phéochromocytome et paragangliome ; PRAD = Adénocarcinome de la prostate ; READ Adénocarcinome du rectum ; SARC = Sarcome ; SKCM = Mélanome cutané cutané ; STAD = Adénocarcinome de l’estomac ; TGCT = tumeurs germinales testiculaires ; THCA = Carcinome thyroïdien ; THYM = Thymome ; UCEC = Carcinome de l’endomètre à corps utérin ; SCU = Carcinosarcome utérin ; UVM = Mélanome uvéal. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 11 : TMEM200A dans STAD. (A) Top 50 des gènes trouvés avec une corrélation négative avec l’expression de TMEM200A dans STAD par la base de données LinkedOmics. (B) Les 50 principaux gènes de STAD qui étaient positivement liés à TMEM200A. (C) Les cinq principaux gènes corrélés positivement et les cinq gènes négatifs de TMEM200A dans STAD. (D) Carte thermique des DEG en STAD. (E-H) Etude des voies GO et KEGG enrichies à l’aide des DEG criblés. Abréviations : STAD = Adénocarcinome de l’estomac ; DEGs = Expression différentielle des gènes ; KEGG = Encyclopédie des gènes et des génomes de Kyoto ; GO = Ontologie des gènes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 12 : Corrélation entre les caractéristiques cliniques de STAD et TMEM200A niveau d’expression. (A) Analyse des niveaux d’expression de TMEM200A et des traits cliniques de STAD à l’aide d’une régression logistique. (B,C) Analyse de Cox de parcelles forestières STAD pour une ou plusieurs variables. (D) Diagrammes linéaires prédisant la SG chez les patients atteints de STAD en fonction du sexe, du grade pathologique, de l’âge, du stade pathologique et de l’expression TMEM200A. (E) Graphiques d’étalonnage montrant l’étalonnage du modèle de graphique linéaire à colonnes. Abréviations : STAD = Adénocarcinome de l’estomac ; OS = Survie globale. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 13 : L’expression de TMEM200A est régulée à la hausse dans le STAD et favorise la prolifération des cellules cancéreuses gastriques. (A) Détection de l’expression de TMEM200A dans les cellules cancéreuses gastriques HGC-27 et les cellules épithéliales de la muqueuse gastrique GES-1 par western blot. (B) Détection de l’expression de TMEM200A dans les cellules GC HGC-27 et SGC-7901, et dans les cellules épithéliales de la muqueuse gastrique GES-1 par qRT-PCR. (C) L’efficacité d’expression de TMEM200A a été considérablement réduite dans le groupe TMEM200A knockdown par rapport au groupe non knockdown dans les cellules GC HGC-27, comme l’a démontré la qRT-PCR. (D) TMEM200A knockdown a inhibé de manière significative la prolifération des cellules GC telle que mesurée par le test CCK8. (E) L’inhibition de TMEM200A inhibé de manière significative les protéines apparentées dans l’EMT et a affecté la phosphorylation de l’AKT dans la voie de signalisation PI3K/AKT. Abréviation : GC = cancer de l’estomac ; qRT-PCR : Réaction en chaîne par polymérase quantitative en temps réel ; EMT = transition épithélio-mésenchymateuse ; AKT = Protéine kinase B. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Les auteurs déclarent qu’il n’y a pas de conflits d’intérêts.
Ici, un protocole est présenté dans lequel de multiples outils bioinformatiques sont combinés pour étudier les fonctions biologiques de TMEM200A dans le cancer. De plus, nous validons également expérimentalement les prédictions bioinformatiques.
Ces travaux ont été soutenus par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (82160550).
| Anticorps anti-AKT | Proteintech Group, Inc | 60203-2-Ig | |
| Anticorps anti-E-cadhérine | Proteintech Group, Inc | 20874-1-AP | |
| Anticorps anti-glycéraldéhyde 3-phosphate déshydrogénase (GAPDH) | Proteintech Group, Inc | 10494-1-AP | |
| Anticorps anti-N-cadhérine | Proteintech Group, Inc | 22018-1-AP | |
| Anticorps anti-P-AKT | Proteintech Group, Inc | 66444-1-Ig | |
| Anticorps anti-escargot | Proteintech Group, Inc | 13099-1-AP | |
| Anticorps anti-vimentine | Proteintech Group, Inc | 10366-1-AP | |
| AxyPrepMultisourceTotalRNAMini- kit de préparation | Suzhou Youyi Landi Biotechnology Co., Ltd | UEL-UE-MN-MS-RNA-50G | |
| Kit de dosage des protéines BCA | Epizyme Biotech | ZJ101L | |
| CCK-8 réactif | MedChemExpress | HY-K0301-500T | |
| Sérum fœtal bovin (FBS) | CYAGEN BIOSCIENCES (GUANGZHOU) INC | FBSSR-01021 | |
| GAPDH primer | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | Amorce avant (5'-3') : TGACATCAAGAAGGTG GTGAAGCAG ; Amorce inverse (5'-3') : GTGTCGCTGTTGAAG TCAGAGGAG | |
| HighGene plus Réactif de transfection | ABclonal | RM09014P | |
| Affinipure Goat conjugué HRP Anti-Mouse lgG (H+L) | Proteintech Group, Inc | SA00001-1 | |
| HRP Affinipure Goat Anti-Rabbit lgG (H+L) | Proteintech Group, Inc | SA00001-2 | |
| Épithélium de la muqueuse gastrique humaine | Guangzhou Cellcook Biotech Co.,Ltd. | ||
| Cellules humaines STAD HGC-27 | Procell Life Science& Technology Co., Ltd | ||
| Cellules humaines STAD SGC-7901 | Procell Life Science& Technology Co.,Ltd | ||
| MonAmp SYBR Green qPCR Mix (Aucun ROX) | Mona (Suzhou) Biotechnology Co., Ltd | MQ10101S | |
| MonScript RTIII Mélange tout-en-un avec dsDNase ; ; | Mona (Suzhou) Biotechnology Co., Ltd | MR05101M | |
| Omni-ECL Femto Light Chemiluminescence | Kit Epizyme Biotech | SQ201 | |
| PAGE Gel Fast Preparationb Kit ; | Epizyme Biotech | PG111 | |
| Pénicilline-streptomycine (Pen-Streptocoque) | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd | P1400-100 | |
| Membrane de difluorure de polyvinylidène (PVDF) | Merck KGaA | IPVH00010-1 | |
| Tampon de blocage rapide sans protéines | Epizyme Biotech | PS108P | |
| RIPA solution de lyse | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd | R0010 | |
| RPMI 1640 milieu complet | Thermo Fisher Scientific | C11875500BT | |
| Lait écrémé | Campina : Elk | ||
| TBST solution tampon | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd | T1082 | |
| Le tampon de charge protéique | Epizyme Biotech | LT101S | |
| TMEM200A plasmide | knockdown Plasmid | ||
| TMEM200A primer | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | Amorce avant (5'-3') : AAGGCGGTGTGGTGGTGTTCG ; Amorce inverse (5'-3') : GATTTTGGTCTTTGTCACGGTT | |
| TMEM200A SiRNA1 | MiaoLing Plasmid | Amorce directe (5'-3') : ACAACTGATGATAAGACCAG ; Amorce inverse (5'-3') : TGTTGACTACTATTCTGGTC | |
| TMEM200A SiRNA2 | MiaoLing Plasmid | Amorce directe (5'-3') : CGTGTGAATGTCAATGACTG ; Amorce inverse (5'-3') : GCACACTTACAGTTACTGAC | |
| TMEM200A SiRNA3 | MiaoLing Plasmid | Amorce directe (5'-3') : ACAACCACAACATCTGCCCG ; Amorce inverse (5'-3') : TGTTGGTGTTGTAGACGGGC | |
| Protéine transmembranaire 200A Anticorps | Proteintech Group, Inc | 48081-1 | |
| Equipment | |||
| CO2 incubateur de culture cellulaire | Haier Group | PYXE-80IR | |
| Instrument d’électrophorèse | Bio-RAD | ||
| Instrument de PCR quantitative à fluorescence | Bio-RAD | ||
| Étiqueteur enzymatique multifonctionnel | Berthold |
