Lésion par congélation dans le muscle masséter de souris pour établir un modèle de fibrose musculaire orofaciale

Les muscles orofaciaux sont essentiels dans les activités physiologiques quotidiennes telles que la mastication, la parole, la respiration et l’expression faciale¹. Dans les malformations orofaciales congénitales, cependant, ces muscles présentent des altérations atrophiques et fibrotiques, entraînant une altération de la santé corporelle et de la cognition sociale². La chirurgie reconstructive faciale reste le traitement de première intention, mais jusqu’à 30 à 70 % des patients postopératoires souffrent encore de perte musculaire et de dysfonctionnement ^{musculaire3,4} L’échec de la régénération du muscle orofacial a été attribué à des facteurs intrinsèques, qui ne peuvent pas être corrigés par la chirurgie seule.

L’émergence des muscles orofaciaux est une nouveauté évolutive, accompagnant la tête complexe des vertébrés et le cœur chambré ^5,6. Contrairement à leurs homologues des membres dérivés du somite, les muscles orofaciaux proviennent de l’arc branchial⁷. Ces caractères phylogénétiques et ontogénétiques peuvent les prédisposer à des comportements de régénération distincts⁸. Il a été rapporté que le muscle masséter (MAS) a développé une fibrose sévère au moment où le muscle tibial antérieur (TA) s’est complètement régénéré après une exposition à la même étendue de blessure ^1,9. Cependant, le mécanisme sous-jacent de la régénération reste mal compris.

Dans cette étude, un modèle de lésion par congélation du muscle masséter de souris a été établi pour faciliter l’étude de la régénération du muscle orofacial. Nous avons choisi 14 jours après la blessure comme point de temps pour évaluer le phénotype de la fibrose, car c’était le point le plus précoce où une divergence perceptible était détectable entre deux muscles. La régénération complète du SAM après une blessure nécessite au moins 40 semaines¹. De manière constante, cette étude a révélé un dépôt remarquable de collagène après une lésion par congélation du MAS par rapport à la régénération régulière du TA 14 jours après la lésion. Avec l’aide de ce modèle, d’autres études mécanistes de l’atrophie musculaire et de la fibrose peuvent être effectuées, ce qui aidera à son tour à développer des voies thérapeutiques potentielles pour favoriser la régénération des muscles orofaciaux après la chirurgie.

Toutes les procédures animales de cette étude ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique de l’École de stomatologie de l’Ouest de la Chine de l’Université du Sichuan (WCHSIRB-D-2020-114). Les souris C57BL/6 mâles (âgées de 5 semaines) ont été élevées dans un établissement à humidité contrôlée (53 ± 2 %) et à température contrôlée (23 ± 2 °C) et ont suivi un cycle lumière/obscurité de 12 heures. Voir le Tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux, réactifs et instruments utilisés dans ce protocole.

1. Dommages causés par le gel

1. Anesthésie : Sédater les souris avec des boules de coton imbibées d’isoflurane et injecter de la tilétamine-zolazépam par voie intrapéritonéale à une dose de 50 mg/kg. L’analgésie pré et postopératoire a été fournie par injection intrapéritonéale de méloxicam à une dose de 1 mg/kg. Protégez leurs yeux avec une pommade vétérinaire. Un coussin chauffant maintenu à 38 °C a été placé sous le champ chirurgical pendant toute la durée de l’intervention afin de fournir un soutien thermique à l’animal. Fixez les souris avec du ruban adhésif après les avoir posées sur le côté sur une table d’opération (Figure 1). Évaluer la suffisance de l’anesthésie par la perte du réflexe de la paupière, du réflexe de redressement et du réflexe de retrait de la pédale.
   REMARQUE : Lors de l’application d’une anesthésie isofluorane, tenez la souris dans une main et la boule de coton imbibée d’isofluorane dans l’autre. Assurez-vous de garder la boule de coton à distance de l’animal pour éviter l’inconfort et l’irritation de la peau.
2. Épilation préopératoire : À l’aide d’un rasoir électrique, rasez les poils du mollet et du visage de la souris et appliquez la pâte dépilatoire à l’aide d’un coton-tige sur la peau, en recouvrant le muscle masséter et le muscle tibial antérieur. Après 1 à 2 min, lavez la pâte avec une lingette chirurgicale à base d’éthanol (Figure 2A et Figure 2G). Les sites chirurgicaux ont été désinfectés à l’aide de trois cycles d’un gommage à base d’iode et d’éthanol à 75 %.
   REMARQUE : Le rasoir électrique seul n’a pas suffi pour l’épilation, en particulier dans la zone du masséter. Lors de l’application de la pâte dépilatoire, il est important de ne pas utiliser de pâte excessive. Essuyez doucement la peau lorsque vous lavez la pâte pour éviter les brûlures de la peau.
3. Exposition au champ chirurgical : Couvrir avec des champs chirurgicaux avant l’intervention chirurgicale. Pour le muscle MAS, palper d’abord le long du bord inférieur de la mandibule. À 5 mm du bord, faites une incision de 7 mm le long de la ligne reliant la commissure buccale au tragus (la ligne pointillée indique l’emplacement de l’incision sur la figure 2B).
4. Pour le muscle TA, palper d’abord le long du mollet pour localiser le bord antérieur de l’os du tibia. Coupez 2 mm en arrière du bord à travers la peau à l’aide d’un scalpel, en commençant par le genou et en terminant par la cheville (la ligne pointillée indique l’emplacement de l’incision sur la figure 2H). Pour chaque souris, si le MAS et le muscle TA du côté gauche sont blessés, utilisez l’autre muscle du côté controlatéral comme contrôle.
   REMARQUE : Cette coupe est très superficielle pour s’assurer que les muscles ne seront pas blessés lors de l’incision. L’incision sur le visage ne doit pas être trop proche du tragus. Sinon, la glande parotide sera exposée, ce qui entraînera un saignement excessif lors du processus de congélation suivant.
5. Congélation cryogénique : Tenez un morceau de glace carbonique à l’aide d’une pince prérefroidie le long des axes longs des muscles MAS et TA (Figure 2C et Figure 2I, respectivement). Placez la glace carbonique directement sur la surface du muscle pendant 5 s. Confirmez que le muscle apparaît raide et blanc pâle immédiatement après avoir retiré la glace sèche (Figure 2D et Figure 2J), mais qu’il retrouve sa couleur et sa texture normales en 22 à 25 s, comme le muscle adjacent non blessé (Figure 2E et Figure 2K).
   REMARQUE : Les pinces qui maintiennent la glace carbonique doivent être pré-refroidies pour éviter une sublimation rapide de la glace carbonique. Une minuterie est obligatoire pour effectuer les 5 secondes de congélation des blessures et compter les 22-25 secondes de temps de récupération du muscle. Tout muscle dont le temps de récupération est inférieur à 22 s ou supérieur à 25 s doit être abandonné. Cette étape demande de la pratique.
6. Fermeture de la plaie : Après une récupération totale du muscle, fermez la plaie cutanée avec au moins trois sutures 7-0 (Figure 2F et Figure 2L).
7. Réanimation : Lorsque la suture est terminée, placez les souris dans la cage avec support thermique et surveillez-les en permanence jusqu’à ce que tous les réflexes de redressement aient été retrouvés.

2. Collecte musculaire

1. Euthanasier les souris avec une surdose d’isoflurane, suivie d’une luxation cervicale. Prélever les muscles MAS et TA des deux côtés pour une analyse histologique.
2. Dissection musculaire du SAM : Ouvrez la peau du visage de la souris et retirez la glande parotide pour exposer la partie postérieure du muscle MAS. Disséquez le MAS de son attache antérieure jusqu’à son attache postérieure sur la mandibule. La zone pointillée blanche indique la partie exposée de la MAS (Figure 3A).
   REMARQUE : Le muscle MAS est composé de compartiments profonds et superficiels, tous deux étroitement attachés à la surface de la mandibule. Assurez-vous d’appuyer les ciseaux sur la mandibule pendant la dissection pour assurer une isolation complète du SAM. Attention à bien distinguer le zygomatico-mandibulaire du MAS par ses limites entre le zygomatique et la mandibule.
3. Dissection musculaire TA : Ouvrez la peau de la cheville au genou et retirez le fascia pour exposer le muscle TA. Utilisez la pointe de la pince de micro-dissection pour isoler le tendon de l’AT et faites-le glisser jusqu’au genou pour casser les fibres attachées au tibia. Ensuite, coupez le tendon de la cheville (Figure 3B).
   REMARQUE : Pour le muscle TA, il y a quelques tendons musculaires autour de la cheville de la souris ; il faudrait de la pratique pour discerner le tendon de l’AT, qui est le plus grand et le plus proche du tibia.
4. Pré-refroidissement de l’isopentane : Préparez deux barils d’isolation ; Remplissez le petit baril d’isopentane et le grand baril d’azote liquide. Placez le petit canon à l’intérieur du grand canon 10 min avant la dissection musculaire (Figure 3D).
5. Préparation du moule d’enrobage : Fabriquez un moule cylindrique en feuille d’étain pour chaque échantillon et remplissez-le avec un composé à température de coupe optimale (OCT).
6. Frais congelé : Immergez le muscle dans l’OCT, en le tenant perpendiculairement au composé OCT (Figure 3C). À l’aide d’un porte-aiguille, transférez le moule dans l’isopentane pré-refroidi. Attendez 40 s pour que l’OCT devienne blanc et solide (Figure 3D).
   REMARQUE : Assurez-vous que la position du moule n’est pas trop basse. Sinon, l’isopentane se mélangera à l’OCT et altérera le processus de congélation musculaire. Le niveau d’OCT dans le moule doit être comparable à la hauteur de l’échantillon musculaire. Évitez une quantité excessive d’OCT pour assurer une congélation rapide et efficace.
7. Stockage des échantillons : Conservez les échantillons de muscle frais congelés dans des plaques à 24 puits clairement étiquetées. Sectionnez immédiatement les échantillons ou conservez-les à -80 °C pour une utilisation à long terme.

3. Analyse histologique

1. À l’aide d’un cryostat, découpez des sections de 10 m d’épaisseur de l’échantillon musculaire sur des lames traitées en surface.
2. Placez les lames dans de l’acétone glacée pendant 20 min et faites-les sécher à l’air libre dans la hotte pendant 20 min.
3. Lavez les lames pendant 3 x 5 min avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
   REMARQUE : À partir de cette étape, les lames ont été conservées dans une chambre d’humidité pour éviter le séchage.
4. Coloration rouge Sirius
   1. Préparez la solution de travail Sirius Red en dissolvant 0,5 g de poudre Sirius Red dans 500 mL d’acide picrique saturé.
   2. Teindre les lames avec la solution de travail Sirius Red pendant 1 h à température ambiante.
   3. Lavez les lames pendant 2 x 5 min avec de l’acide acétique à 0,5 %.
   4. Après le processus de coloration, les échantillons doivent d’abord être déshydratés dans de l’éthanol à 95 % pendant 15 s, puis déshydratés dans de l’éthanol anhydre pendant 1 min. La dernière étape consiste à monter la lame avec du baume neutre.
5. Coloration immunohistologique
   1. Perméabiliser les sections avec 0,3% de Triton dans du PBS pendant 20 min à température ambiante, suivi d’un lavage PBS.
   2. Pour la coloration Pax7, bloquez les sections avec le réactif fourni avec le kit référencé ; pour la coloration à la laminine et au Pdgfrα, bloquer avec 5 % d’albumine sérique bovine (BSA) et 5 % de sérum d’ânesse dans du PBS pendant 1 h à température ambiante.
   3. Incuber les sections avec des anticorps primaires contre Pax7, laminine et Pdgfrα pendant une nuit à 4 °C, puis les laver avec du PBS pendant 3 x 5 min.
   4. Incuber les sections avec des anticorps secondaires conjugués à un colorant fluorescent pendant 1 h à température ambiante, puis les laver avec du PBS pendant 3 x 5 min.
   5. Incuber avec du 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) pendant 3 minutes à température ambiante, suivi d’un lavage avec du PBS pendant 3 x 5 min.
   6. Placez le support de montage sur la section, placez la lamelle sur le dessus et utilisez du vernis à ongles pour sceller la lamelle.

La coloration de l’HE et du Sirius Red (figure 4 et figure supplémentaire S1) a révélé une régénération musculaire complète de l’AT dans ce modèle de congélation. En revanche, le SAM présentait une altération de la régénération des myofibres et un dépôt excessif de matrice extracellulaire. L’histologie des muscles MAS et TA intacts est illustrée sur la figure 4A, B, où les myofibres sont alignées et la zone fibrotique n’est apparue que dans l’espace interstitiel et entre différents faisceaux. Bien que le muscle TA soit demeuré en grande partie la même structure musculaire que son témoin intact 14 jours après la blessure (figure 4G-J), la structure du muscle MAS a été gravement perturbée (figure 4C-F). Des zones fibrotiques sont apparues à la place de presque toutes les fibres musculaires dans les sections transversales antérieures, moyennes et postérieures du muscle MAS (Figure 4C-F).

La coloration immunohistologique de Pax7 (figure supplémentaire S2) et de Pdgfrα a permis de poursuivre l’étude des cellules satellites musculaires (MuSC) et des progéniteurs fibro-adipogéniques (FAP), respectivement. Dans le muscle MAS, à 14 dpi, des noyaux densément peuplés sont apparus mais sans MuSCs proportionnellement augmentés (Figure 5A,B). Un grand nombre de myofibres à nucléation centrale (illustrées par la pointe de flèche bleue) ont été détectées dans l’AT à 14 dpi (Figure 5H), tandis que le contour des myofibres était à peine perceptible dans l’AS dans la zone lésée (Figure 5E,F). Au lieu de cela, l’infiltration de FAP Pdgfrα-positives et de myofibres de petit diamètre nouvellement formées (pointées par des flèches blanches) a été observée (Figure 5F).

Figure 1 : Vue d’ensemble de l’installation chirurgicale. (A) La souris a été anesthésiée et fixée sur la table d’opération. Des poils ont été enlevés du visage et de la jambe du côté gauche. Une minuterie a été utilisée pour surveiller le gel musculaire et le temps de récupération. (B) De la glace sèche, d’un diamètre de 3,5 mm et d’une hauteur de 6 à 12 mm, a été préparée dans un bécher en verre pour la congélation. Les pinces ont été pré-refroidies dans de la glace sèche pour une utilisation ultérieure. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Dossier peropératoire des lésions par congélation du SAM et du TA. (A) Épilation pour la congélation du SAM. (B) Ouvrez la peau pour exposer le muscle MAS. (C) Congelation à l’aide de glace carbonique le long de l’axe longitudinal de la MAS. (D) L’apparition du SAM immédiatement après 5 s de congélation. (E) L’apparition du SAM après 22-25 s de récupération. (F) Fermeture de la plaie faciale. (G) Épilation pour la congélation TA. (H) Ouvrez la peau pour exposer le muscle TA. (I) La congélation à l’aide de glace carbonique le long de l’axe longitudinal de l’AT. (J) L’apparition de TA juste après 5 s de congélation. (K) L’apparition de l’AT après 22 à 25 s de récupération. (L) Fermeture de la plaie de la jambe. Abréviations : MAS = masséter ; TA = tibial antérieur. Les lignes pointillées des figures 2B et 2H indiquent l’emplacement des incisions. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Prélèvement musculaire du MAS et de l’AT. (A) L’apparition du muscle du MAS 14 jours après l’accident de gel. L’ovale pointillé rouge indique le MAS ; le triangle pointillé blanc montre l’exposition du muscle MAS. (B) L’apparition du muscle TA 14 jours après la blessure par le gel. L’ovale pointillé rouge indique TA. (C) Immerger l’échantillon musculaire dans le composé OCT de manière perpendiculaire. (D) Transférer l’échantillon musculaire dans de l’isopentane refroidi à l’azote. Abréviations : MAS = masséter ; TA = tibial antérieur ; OCT = température de coupe optimale. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Analyse histologique des muscles MAS et TA. Coloration rouge Sirius de la section musculaire intacte (A-E) du MAS et des sections antérieures, moyennes et postérieures du MAS à 14 dpi. (F-J) Section musculaire intacte de l’AT et section antérieure, moyenne et postérieure de l’AT à 14 dpi. Barre d’échelle = 100 μm. Abréviations : MAS = masséter ; TA = tibial antérieur ; ppp = jours après la blessure. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Analyse immunofluorescente des muscles MAS et TA. Immunomarquage de Pax7 et DAPI (bleu) dans (A) MAS intact, (B) MAS 14 dpi, (C) TA intact et (D) TA 14 dpi. Immunocoloration de la laminine, du Pax7 et du DAPI (bleu) dans (E) le MAS intact, (F) le MAS 14 dpi, (G) le TA intact et (H) le TA 14 dpi. Barre d’échelle = 20 μm. Abréviations : MAS = masséter ; TA = tibial antérieur ; ppp = jours après la blessure ; DAPI = 4',6-diamidino-2-phénylindole. Les flèches blanches indiquent la fibre représentative de petit diamètre du MAS. La zone pointillée bleue et les flèches indiquent les myofibres régénératrices représentatives et les noyaux centraux de l’AT. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure supplémentaire S1 : Fibrose persistante pendant la régénération musculaire. (A) Illustration schématique de la régénération musculaire TA et MAS induite par les lésions dues au gel. (B-G) Images représentatives de la coloration à l’hématoxyline et à l’éosine dans les coupes transversales des muscles TA et MAS à différents moments après la blessure. Barres d’échelle = 100 μm. Cette figure est reproduite d’après Cheng et al.8. Abréviations : MAS = masséter ; TA = tibial antérieur ; ppp = jours après la blessure. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire S2 : Altération du processus de myogenèse. (A) Images d’immunofluorescence de Pax7 (vert) et DAPI (bleu) dans les muscles TA et MAS. (B) Quantification du pourcentage de noyaux positifs Pax7/DAPI. Barre d’échelle = 100 μm * Indique une différence significative par rapport au contrôle musculaire intact. # Indique significativement différent de l’autre muscle au même moment. **p < 0,01, ##p < 0,01. Cette figure est reproduite d’après Cheng et al.8. Abréviations : MAS = masséter ; TA = tibial antérieur ; ppp = jours après la blessure ; DAPI = 4',6-diamidino-2-phénylindole. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.