THÉRAPIE PHOTODYNAMIQUE ANTIMICROBIENNE MÉDIÉE PAR LES CURCUMINOÏDES SUR UN MODÈLE MURIN DE CANDIDOSE BUCCALE

La candidose buccale (CO) est la principale infection fongique de la cavité buccale ; elle est causée par la prolifération de Candida spp. Les facteurs prédisposant à la contraceptive orgueilleux comprennent le dysfonctionnement endocrinien, l’utilisation d’antibiotiques à large spectre, la radiothérapie et la chimiothérapie, les carences nutritionnelles, la xérostomie (faible débit salivaire), l’utilisation de prothèses dentaires, une mauvaise hygiène et, surtout, l’immunosuppression1. Parmi les espèces de Candida, Candida albicans est la plus répandue et la plus virulente ; On le trouve comme espèce commensale dans le corps humain et comme agent pathogène opportuniste. C. albicans a la capacité de changer sa morphologie de levures commensales (blastopores) en filaments pathogènes (hyphes et pseudohyphes)². Les formes filamenteuses, en particulier les hyphes, peuvent envahir l’épithélium de l’hôte par endocytose ou pénétration active, provoquant une infection³. Les autres facteurs de virulence de C. albicans comprennent l’adhésion, la formation de biofilm et la sécrétion d’enzymes et de toxines lipolytiques et hydrolytiques, telles que les lipases, les phospholipases, les protéinases et la candidalysine⁴.

Les traitements par CO impliquent l’utilisation d’agents antifongiques, en particulier des polyènes topiques et des azoles (nystatine et miconazole)⁵. Cependant, ils ne montrent qu’une efficacité à court terme et les récidives sont fréquentes. De plus, la surutilisation d’antifongiques a donné lieu au problème du développement et de la propagation de la résistance aux antifongiques⁶. Par conséquent, des thérapies alternatives sont nécessaires, telles que la thérapie photodynamique antimicrobienne (TPDa), qui combine un photosensibilisateur (PS) et une lumière à une longueur d’onde appropriée (la même que celle de l’absorption du PS) en présence d’oxygène. Les PS sont liées aux cellules ou absorbées par elles et, lorsqu’elles sont activées par la lumière, produisent des espèces réactives de l’oxygène (ROS) qui sont toxiques pour les cellules sensibilisées⁷.

Dans l’aPDT, l’un des photosensibilisants (PS) utilisés est la curcumine (CUR), un composé naturel extrait des rhizomes de la plante de curcuma (Curcuma longa L.). La curcumine possède de nombreux attributs thérapeutiques, notamment des capacités anti-inflammatoires, antioxydantes, anticancéreuses et antimicrobiennes ^8,9. Une étude antérieure a révélé que l’aPDT utilisant CUR diminuait efficacement C. albicans dans un modèle murin de candidose buccale sans causer de dommages aux tissus de l’hôte¹⁰. Le CUR est le principal curcuminoïde extrait du curcuma, mais d’autres polyphénols, tels que la déméthoxycurcumine et la bis-déméthoxycurcumine, se trouvent également dans cette plante. L’aPDT médiée par les curcuminoïdes a démontré une activité antibactérienne contre les biofilms de Staphylococcus aureus cultivés dans des cathéters¹¹. Cependant, à notre connaissance, son activité antifongique contre C. albicans reste incertaine. Par conséquent, dans cette étude, nous avons évalué l’aPDT médiée par un sel curcuminoïde contre C. albicans dans un modèle murin de CO.

Le protocole de recherche pour l’utilisation des souris a été approuvé par le Comité d’éthique de l’utilisation des animaux (numéros de cas 05/2008 et 09/2020) à l’École de médecine dentaire d’Araraquara, UNESP. C. albicans (ATCC 90028) a été utilisé comme souche de référence. Des souris suisses femelles de six semaines (n = 45), avec une masse corporelle comprise entre 20 et 30 g, ont été utilisées pour la présente étude. Les animaux ont été fournis par l’Université d’État de São Paulo, UNESP, Botucatu.

1. Préparation du PS et sélection de la source lumineuse pour l’aPDT

1. Préparer le PS selon les spécifications de la substance à tester.
   REMARQUE : Dans cette étude, un mélange hydrosoluble de curcuminoïdes (mélange de sels hydrosolubles à base de CUR¹²) a été utilisé comme PS (voir le tableau des matériaux et la figure 1). Des dilutions à 20 μM, 40 μM et 80 μM (15,6, 29,2 et 58,4 mg/L, respectivement) ont été préparées dans de l’eau ultra-pure immédiatement avant utilisation et maintenues à 5 °C.
2. Choisir un équipement lumineux avec une longueur d’onde appropriée (la même que celle de l’absorption du PS) capable d’éclairer l’ensemble de la cible photosensibilisée uniformément et simultanément sans chauffer le tissu.
   NOTE : Dans cette étude, une pièce à main contenant une diode électroluminescente (LED, voir Tableau des matériaux), qui a été conçue à l’Instituto de Física de São Carlos (Université de São Paulo, São Carlos, SP, Brésil), a été utilisée. La puissance de sortie délivrée par la lumière était de 89,2 mW/^cm2 à une longueur d’onde bleue d’environ 455 nm.

2. Préparation de l’inoculum de C. albicans

1. Conserver la souche de référence C. albicans (ATCC 90028) dans de la levure-peptone-glucose (YEPD, voir le tableau des matières) avec 50 % de glycérol à -80 °C jusqu’à l’utilisation.
2. Décongeler la souche congelée à température ambiante, étaler une aliquote de 100 μL sur une boîte de Pétri avec de la gélose au dextrose de Sabouraud (SDA) avec du chloramphénicol (voir le tableau des matières) et incuber à 37 °C pendant 48 h.
3. Transvaser cinq colonies dans 10 mL de bouillon d’azote de levure avec un milieu à 2 % de glucose (YNBg) et faire croître en aérobie à 37 °C pendant 16 h.
4. Diluer la culture de levure dans du YNBg frais (1 :10) et incuber en aérobie à 37 °C jusqu’à ce que la densité optique atteigne la phase de croissance moyenne logarithmique.
   REMARQUE : Normaliser la courbe de croissance microbienne pour chaque laboratoire au préalable. Dans la recherche actuelle, les cultures ont été laissées incuber pendant environ 8 h, jusqu’à ce qu’elles atteignent la phase de croissance mi-logarithmique indiquée par la densité optique à 540 nm (OD₅₄₀), avec une valeur moyenne de 0,536 ± 0,062 unités arbitraires (moyenne ±écart-type [ET]).
5. Centrifuger la culture à 5 000 x g à température ambiante pendant 5 min, jeter le surnageant et laver la pastille deux fois avec le même volume de solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS ; 0,136 M NaCl, 2 mM KCl, 1 mM KH₂PO₄, 10 mM Na₂HPO₄, pH 7,4).
6. Utiliser des aliquotes de 100 μL pour effectuer quatre dilutions en série de 10 fois dans du PBS, étaler les dilutions sur des plaques SDA et incuber à 37 °C pendant 48 h pour le comptage des colonies. En standard, les suspensions fongiques sont utilisées à des concentrations d’environ 4,5 × 10⁷ unités formant colonies par millilitre (UFC/mL)].

3. Induction du CO chez la souris

NOTE : La méthodologie suivante a été décrite précédemment par Takakura et ^al.13 et reproduite par notre groupe^10,14, avec quelques modifications.

1. Répartir aléatoirement les souris en neuf groupes (n = 5), correspondant au même nombre de traitements (fichier supplémentaire 1).
   REMARQUE : La cavité buccale des souris doit être négative pour la croissance de Candida . Cela doit être vérifié en écouvillonnant la cavité buccale et en plaquant l’échantillon sur SDA.
2. Conservez les animaux dans des boîtes à propylène¹⁰ (5 souris par boîte max.), avec des copeaux de bois pour le revêtement de sol, dans un vivarium à température contrôlée à 23 ± 2 °C sous un cycle lumière/obscurité de 12/12 h. Aucun enrichissement spécifique n’est nécessaire.
3. Maintenir les souris avec un régime de souris extrudé et de l’eau filtrée à volonté.
4. Injecter par voie sous-cutanée le médicament immunosuppresseur, la prednisolone (100 mg/kg de poids corporel, voir le tableau des matières), pour la première fois le premier jour à tous les membres des groupes C+L+ 20, C+L+ 40, C+L+ 80, C+L- 20 μM, C+L- 40, C+L- 80, C-L+ et C-L- (Fichier supplémentaire 1).
   REMARQUE : Gardez les souris du même groupe dans la même boîte et surveillez-les quotidiennement pour tout signe de stress et de perte de poids. Demandez l’avis d’un vétérinaire pour un analgésique ou une modification de la nourriture ou de l’eau si vous remarquez un stress ou une perte de poids.
5. Dès le premier jour et jusqu’à la fin de l’expérience, fournir du chlorhydrate de tétracycline dans l’eau potable à raison de 0,83 mg/mL¹³.
6. Inoculer des langues de souris le deuxième jour, y compris les groupes C+L+ 20, C+L+ 40, C+L+ 80, C+L- 20, C+L- 40, C+L- 80, C-L+ et C-L- (Fichier supplémentaire 1), avec l’inoculum de C. albicans . N’inoculez pas ces souris du groupe témoin négatif (NCtrl).
   1. Animaux sous sédatif par injection intramusculaire de chlorure de chlorpromazine 10 mg/kg (voir tableau des matières) sur chaque muscle de la cuisse avant de procéder à l’inoculation.
   2. Effectuer l’inoculation intrabuccale des souris en trempant un écouvillon stérile (un par animal) dans une suspension normalisée de C. albicans fraîchement préparée (c.-à-d. préparée immédiatement avant l’inoculation).
   3. Placez les souris sous sédation en position couchée. Retirez doucement leur langue de leur bouche à l’aide d’une pince stérile. Frottez la langue de chaque souris avec un tampon imbibé pendant 30 s. Surveillez les souris jusqu’à ce qu’elles se remettent de la sédation.
7. Le cinquième jour, administrer une injection sous-cutanée complémentaire de prednisolone (100 mg/kg de poids corporel) pour maintenir l’immunosuppression.
   REMARQUE : Ce protocole est adéquat pour maintenir l’infection pendant 7 jours après l’inoculation intraorale. La chronologie du protocole est illustrée à la figure 2.

4. Thérapie photodynamique antimicrobienne et récupération de C. albicans à partir de lésions buccales

1. Le septième jour, avant le traitement, anesthésier les animaux par injection intrapéritonéale de chlorhydrate de kétamine (100 mg/kg de poids corporel) combiné à de la xylazine (10 mg/kg de poids corporel) (voir le tableau des matières).
2. Placez chaque animal en position couchée sur un dispositif^de coussinets ^14,15 équipé de fils en acier inoxydable qui peuvent être enroulés autour des incisives pour garder la bouche ouverte.
   REMARQUE : Les coussinets isothermes sont recommandés pour réchauffer les souris pendant qu’elles sont sous sédation, prévenir l’hypothermie à température ambiante et éviter la mortalité liée à l’anesthésie¹⁵. Chaque animal anesthésié doit être surveillé en l’absence de réflexe de retrait lorsque les orteils sont pincés pour confirmer la profondeur de l’anesthésie. Une dose d’entretien de kétamine à 1/3 de la dose initiale (sans xylazine) peut être administrée si nécessaire.
3. Avec la mandibule et les joues rétractées, placez doucement la langue à l’extérieur de la bouche.
4. Pour les souris des groupes C+L+, pipeter 70 μL de PS sur le dos de la langue (à l’une des concentrations testées). Maintenez les souris dans un environnement sombre pendant une durée de 20 minutes en période de pré-irradiation. Assurez-vous que pendant ce temps, la langue de chaque animal reste positionnée à l’intérieur de la cavité buccale pour éviter l’ingestion du photosensibilisateur (PS).
5. Après la période de photosensibilisation, retirez la langue de la bouche pour l’éclairer. Placez le dispositif LED sur le dos de la langue et allumez-le à 37,5 J/cm² (7 min avec le présent appareil) (Figure 3).
6. Pour les animaux des groupes C+L-, pipeter 70 μL de PS à l’une des concentrations testées sur le dos de la langue, et garder ces souris dans l’obscurité pendant 27 min.
7. Pour les animaux du groupe C-L+ (traités à la lumière sans photosensibilisation préalable), pipeter 70 μL de solution saline stérile sur le dos de la langue. Gardez les souris dans l’obscurité pendant 20 min puis éclairez leur langue à 37,5 J/cm² (7 min avec le présent appareil).
8. Pour les souris du groupe C-L- (non traitées au PS ni à la lumière), pipeter 70 μL de solution saline stérile sur le dos de la langue et les maintenir dans l’obscurité pendant 27 min.
9. Récupérer C. albicans de la langue de toutes les souris immédiatement après le traitement. Écouvillonner le dos de la langue pendant 1 min avec un coton-tige stérile.
10. Placer chaque écouvillon dans un tube contenant 1 mL de solution saline stérile et agiter pendant 1 min pour remettre les cellules microbiennes en suspension.
11. Effectuer immédiatement des dilutions en série de 10 fois dans du PBS et des aliquotes de 25 μL sur des plaques SDA en double. Incuber les plaques en aérobie à 37 °C pendant 48 h.
12. Après 48 h, utilisez un compteur de colonies numérique (voir Tableau des matières) pour déterminer le nombre de colonies de levures. Calculer la charge de C. albicans (UFC/mL) pour chaque animal.
13. Transformer les valeurs UFC/mL en log₁₀ et analyser correctement selon le plan de l’expérience et les hypothèses de données.
    REMARQUE : Dans la présente étude, l’ANOVA à un facteur de Welch et le test post-hoc Games-Howell (α = 0,05)¹⁶ ont été utilisés.

5. Analyses histopathologiques

1. Le huitième jour, anesthésier les souris avec de la kétamine à 100 mg/kg combinée à de la xylazine à 10 mg/kg par injection intrapéritonienne et les euthanasier avec une surdose de kétamine (200 mg/kg administrée par voie intrapéritonienne). Confirmez le décès en vérifiant l’absence de mouvement respiratoire (apnée) et l’absence de battement cardiaque (asystole).
2. Pincez délicatement la langue et retirez-la de la bouche de l’animal. À l’aide d’un scalpel manuel, faites une incision avant les papilles circonvallées pour retirer chirurgicalement toute la langue sans causer de blessures aux régions antérieure et centrale.
3. Fixez la langue dans du formol tamponné à 10 % (pH 7,2-7,4) pendant 24 h et lavez-la à l’eau courante pendant 2 h.
4. Procéder à l’inclusion dans le processus de paraffine : déshydratation, clarification et imprégnation^10,14.
5. Couper des coupes en série (5 μm d’épaisseur) à l’aide d’un microtome, puis fixer les sections sur des lames de verre. Procéder à la coloration de ces coupes à l’aide d’acide Schiff périodique et d’hématoxyline (PAS-H) pour l’examen histopathologique et l’identification des champignons par observation au microscope optique.
6. Demandez à un pathologiste, de préférence aveugle aux groupes étudiés, d’examiner la réaction tissulaire due à une infection à C. albicans .
7. Décrire les caractéristiques histologiques du tissu (épithélium et tissu conjonctif), en particulier les réponses inflammatoires locales d’intensité variable.

Le modèle murin de CO a montré des taches blanches et des pseudomembranes typiques sur la langue de toutes les souris infectées (Figure 4A). Les C. albicans récupérés sur des animaux C-L- ont confirmé la colonisation tissulaire par ce microorganisme (les valeurs variaient de 1,62 x 104 à 4,80 x 105 UFC/mL). Comme prévu, les animaux du groupe NCtr n’ont montré aucune altération tissulaire ou croissance de la colonie après l’échantillonnage (figure 4B).

La TPa a diminué la viabilité de C. albicans lorsque les curcuminoïdes ont été utilisés à 80 μM pour la photosensibilisation (figure 5). La réduction moyenne du log10 obtenue avec l’aPDT médiée par le PS de 80 μM était de 2,47, par rapport à celle du groupe C-L- (p = 0,008).

Le nombre de colonies de C. albicans récupérées sur la langue des souris n’était pas significativement différent entre les souris traitées avec des curcuminoïdes sans éclairage (groupes C+L-), les souris traitées avec la lumière mais non photosensibilisées auparavant (groupes C-L+) et les souris non traitées (groupe C-L-) (p ≥ 0,210).

Les caractéristiques histologiques de la langue d’animaux non infectés (NCtr) ont montré des tissus normaux/sains, y compris une lamina propria, une membrane basale et des papilles filiformes intactes (Figure 6A). En revanche, lors de l’examen des images histopathologiques des langues des souris du groupe C-L-, il était évident que des levures et des filaments étaient présents dans la couche kératinisée de l’épithélium, bien qu’il n’y ait pas eu d’infiltration de champignons. Dans le tissu conjonctif sous-jacent, une légère réponse inflammatoire a été observée, principalement médiée par des cellules mononucléaires, et les papilles filiformes étaient remarquablement absentes (Figure 6B). L’analyse histologique des langues des souris des groupes C+L- et C-L+ a montré des caractéristiques similaires. En revanche, les sections de langue de souris traitées avec 80 μM d’aPDT médiée par curcuminoïde ont révélé un nombre réduit de cellules fongiques, principalement limitées à la couche kératinisée de l’épithélium (Figure 6C).

Figure 1 : Structure chimique du photosensibilisateur. Structure chimique du mélange de sels hydrosolubles utilisé comme photosensibilisant, comprenant 53,4 % de curcumine naturelle et 46,6 % d’autres curcuminoïdes (déméthoxycurcumine et bis-déméthoxycurcumine). La masse moléculaire moyenne finale est de 730,32 g/mol. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Chronologie du protocole pour le modèle murin de candidose buccale et de TPDa. Une chronologie décrivant le protocole pour le modèle murin de candidose buccale et la thérapie photodynamique antimicrobienne (TPDa). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Illumination de la langue de souris après photosensibilisation. Après la photosensibilisation (incubation du tissu infecté avec le photosensibilisateur), les langues ont été éclairées à 37,5 J/cm2 à l’aide d’une lumière LED bleue (~455 nm). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Lésions blanches dans le modèle murin de candidose buccale. (A) Images représentatives illustrant les lésions blanches observées dans le modèle murin de candidose buccale. (B) Contrôle négatif (non infecté). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Candida albicans récupéré sur la langue de souris. Les données représentent les valeurs moyennes ±écart-type de log10(UFC/mL) des groupes de traitement. L’ANOVA à un facteur de Welch a indiqué que les effets des traitements étaient statistiquement significativement différents entre les groupes (p < 0,001). Différentes lettres minuscules (a, b, c) à côté des moyennes indiquent des différences statistiquement significatives selon le test Games-Howell (p≤ 0,030). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6 : Images représentatives de coupes histologiques de langues de souris. Des coupes histologiques de langues de souris ont été colorées avec PAS-H, et les images ont été capturées à 200x. (A) Souris témoins négatives sans candidose buccale induite, photosensibilisation et illumination (groupe NCtr). (B) Souris atteintes de candidose buccale induite, non photosensibilisées ni exposées à l’éclairage LED (groupe C-L). (C) Animaux atteints de candidose buccale induite, exposés à des curcuminoïdes de 80 μM et à un éclairage LED de 37,5 J/cm2 (groupe C+L+ 80). Barres d’échelle = 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Fichier supplémentaire 1 : Groupes expérimentaux. Une liste des groupes expérimentaux utilisés dans la présente étude. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

C. albicans has been associated with oral and esophageal infections in individuals with an immunocompromised state, diabetes mellitus, prolonged use of antibiotics, and poor oral hygiene^1,3. The study of human infectious diseases requires both in vitro and in vivo investigations before clinical trials can be safely and accurately designed. The present study describes a method for establishing a murine model of OC, which can be used to evaluate the pathogenesis of oral infections by C. albicans and the efficacy of antifungal approaches^{15,16,17,18,19}.

The murine model of OC employed here was successfully established, as evidenced by the substantial fungal load recovery from lesions as well as by the characteristic infection features observed in the macroscopic and histopathological analyses of the tongues of infected mice. Many studies have used similar murine models of OC. In such models, female mice are immunosuppressed and inoculated with C. albicans, resulting in lesions on the tongue^{10,13,14,15,20,21}. Immunosuppression with prednisolone, a glucocorticoid, inhibits the activity of neutrophils against C. albicans²². In this study, female mice were immunosuppressed with two subcutaneous injections of prednisolone, one day prior to and three days after infection with C. albicans¹³. In addition, the administration of tetracycline in drinking water during the course of the experiment caused oral dysbiosis by disturbing oral bacteria and helping C. albicans to thrive^23,24. Furthermore, the sedation caused by the intramuscular injection of chlorpromazine chloride prevented the animals from drinking water and eating immediately after inoculation. Thus, fungal cells stayed in contact with the dorsum of the tongue for a longer time, enabling the development of germ tubes and the transition from yeasts to filaments (hyphae and pseudohyphae), which are the pathogenic morphologies of C. albicans that can invade the human epithelium. Teichert et al.²⁵ used an immunodeficiency protocol to induce OC in mice and recovered only 2 x 10² CFU/mL of C. albicans.

While Totti et al.²⁶ utilized sialoadenectomized mice and conducted four separate inoculations with a C. albicans suspension, it's noteworthy that, in their case, the infection was not sustained in most animals over the course of the experiment. In contrast, in the present study, the inoculation with fungal cells was carried out only once, and it resulted in the recovery of 10⁴ CFU/mL of C. albicans from the oral cavity. This study employed the murine model of candidiasis described by Takakura et al.¹³, who performed oral inoculation with a clinical strain isolated from a patient with cutaneous candidiasis (10⁶ CFU/mL). Three to seven days post-inoculation, 10⁵-10⁶ CFU/mL of C. albicans were recovered from the oral cavity of mice¹³. The differences between the method of Takakura et al.¹³ and this study include the use of different fungal concentrations in the inoculum (this study used 10⁷ CFU/mL of C. albicans) and different C. albicans strains for oral inoculation (the reference strain ATCC 90028 was used here). Carmello et al.²⁰ employed a similar protocol, which involved using immunosuppressed animals. However, they administered two additional subcutaneous injections of prednisolone to the animals on days 1, 5, 9, and 13 of the experiment. Their study revealed a positive correlation between the scores assigned to the oral lesions of the infected animals and the number of CFU/mL over a period ranging from 5 to 16 days post-infection. It has been well-established in previous research that it is crucial to closely monitor animals under anesthesia to prevent hypothermia. Additional maintenance doses of ketamine should be administered with discretion, only when necessary²⁷.

Regarding the efficacy of aPDT application, the results showed that the irradiation of tongues previously treated with an 80 µM curcuminoid salt mixture caused a significant reduction (2.47 log₁₀) in the viability of C. albicans. Histological analyses revealed that sections from tongues treated with 80 µM curcuminoid-mediated aPDT showed a reduced number of fungal cells, which were limited to the keratinized layer, and a low inflammatory response. It is worth emphasizing that an inflammatory response was detected in all mice that were infected with C. albicans. This observation implies that the inflammation observed in all the aPDT groups might be linked to Candida infection rather than being attributed to aPDT, a consistent finding in line with our prior investigations^10,13,14,15.

Previous investigations used CUR, methylene blue, and photodithazine (PDZ) as PSs and obtained promising results^{10,20,24,25,27}. In a similar study¹⁰, a combined exposure to CUR and LED light caused a significant reduction in the viability of C. albicans; however, the use of 80 µM CUR and light reduced fungal viability by 4.0 log₁₀. Dovigo et al.¹⁰ used only CUR as PS, whereas we used a salt containing the three main curcuminoids from C. longa. When CUR (260 µM) and LED light were used for five consecutive days in the treatment of oral candidiasis in mice, the authors observed a reduction of 1.11 log₁₀ in fungal viability²¹. When methylene blue was used as PS at 450 µg/mL and 500 µg/mL, aPDT totally eradicated C. albicans from the oral cavity of mice²⁵. Moreover, when aPDT was mediated by PDZ (100 mg/L), a 3.0 log₁₀ reduction and complete remission of oral lesions were observed²⁰. In addition, aPDT increased TNF-α expression in comparison with that in the untreated group²⁰. In a study where a fluconazole-resistant strain was used, aPDT mediated by PDZ (200 mg/L) promoted a reduction equivalent to 1.3 log₁₀²⁷. Moreover, the combination of aPDT with nystatin resulted in a substantial reduction in fungal viability, amounting to a decrease of 2.6 log₁₀, along with notable improvements in oral lesions and a reduction in the inflammatory response²⁷. Collectively, these studies provide compelling evidence for the effectiveness of aPDT in reducing fungal burden within the murine model of oral candidiasis, underscoring its potential as a clinical treatment option due to its antimicrobial efficacy without causing harm to host tissues.

In conclusion, the murine model of OC used in this study is appropriate for mimicking infection and evaluating aPDT efficacy. As a limitation, the OC model used here employed only one reference strain of C. albicans (other strains, clinical isolates, and non-albicans Candida species were not evaluated). In addition, the corticosteroid-induced immunosuppression used in mice to develop oral infection may not mimic other immunodeficiency states, such as that due to HIV infection. There may also be differences in the host conditions for developing OC, such as the oral microbiota of mice and humans. This protocol should be expanded further to evaluate mixed biofilms formed by more than one species or by different strains from the same species. Furthermore, keeping mice adequately sedated and preventing hypothermia while avoiding anesthesia-related mortality are the most difficult steps of the protocol.