Technique à haut débit en temps réel pour quantifier la formation de pièges extracellulaires à neutrophiles dans les neutrophiles humains

Les pièges extracellulaires neutrophiles (TNE) sont des structures chromatiniennes en forme de toile extrudées à partir de neutrophiles en réponse à divers stimuli inflammatoires. Les TNE sont composées d’ADN, d’histones et de diverses protéines/peptides antimicrobiens, qui piègent et tuent les agents pathogènes infectieux et provoquent des réponses inflammatoires¹.

Bien que les TNE soient bénéfiques pour la défense de l’hôte contre les agents pathogènes, elles ont attiré l’attention en tant que moteur potentiel de diverses maladies auto-immunes², thrombose³, maladies métaboliques⁴ et croissance métastatique des cancers⁵. En tant que tel, l’inhibition de la formation de TNE est une option thérapeutique potentielle pour ces maladies. Cependant, malgré certaines molécules prometteuses ciblant les TNE en développement⁶, il n’existe toujours pas de traitement approuvé qui affecte spécifiquement ce mécanisme. Cela est, au moins en partie, attribuable à l’absence de méthodes de quantification objectives, non biaisées, reproductibles et à haut débit pour la formation de TNE.

Nous avons établi et rapporté une nouvelle méthode utilisant une plateforme d’imagerie bicolore de cellules vivantes ^7,8. Des images en accéléré de neutrophiles colorés avec un colorant nucléaire perméable à la membrane et un colorant d’ADN imperméable à la membrane sont analysées par le logiciel, et le nombre de neutrophiles pré et post-formation de TNE est compté à plusieurs moments. Étant donné que l’intégrité de la membrane plasmique est perdue lors de la formation des TNE par la régulation de la lamine B médiée par PKCα et du désassemblage de la lamine A/C médiée par CDK4/6⁹, les neutrophiles formant des TNE sont colorés par un colorant d’ADN imperméable à la membrane, contrairement aux neutrophiles sains. Cette méthode surmonte les problèmes des techniques précédemment rapportées pour quantifier la formation de NET et fournit une quantification non biaisée, à haut débit, reproductible et précise de manière automatisée.

Les neutrophiles provenant de sujets humains sains ont été obtenus après consentement éclairé dans le cadre du protocole approuvé par le National Institutes of Health (NIH) Institutional Review Board (IRB). Le protocole suit les directives du comité d’éthique de la recherche humaine des NIH.

1. Coloration des neutrophiles et préparation de la plaque de dosage

1. Prélever du sang périphérique avec le consentement éclairé écrit approprié conformément aux directives de chaque institut et isoler les neutrophiles en utilisant la méthode souhaitée. Par exemple, la méthode Ficoll-dextran ^10,11 est une méthode couramment utilisée pour isoler les neutrophiles du sang périphérique humain.
   REMARQUE : Bien que la méthode décrite ici utilise des neutrophiles humains, les neutrophiles de souris peuvent également être analysés à l’aide d’un protocole similaire.
2. Remettre les neutrophiles en suspension dans le milieu Roswell Park Memorial Institute (RPMI ; voir la table des matériaux) 1640 à 2,0 x 10⁶ neutrophiles/mL et placer la suspension des neutrophiles dans un tube à centrifuger de 1,5 mL.
   REMARQUE : Nous n’ajoutons généralement pas de sérum de veau fœtal (FBS) au milieu de culture car l’albumine dans le FBS peut réduire la formation de TNE¹² et la nucléase thermostable dans le FBS peut dégrader les TNE¹³.
3. Ajouter un colorant d’ADN rouge perméable à la membrane (voir le tableau des matériaux) à raison de 1 μL par 1,5 mL de suspension de neutrophiles.
4. Incuber à température ambiante pendant 5 min à l’obscurité. Centrifuger à 2500 x g pendant 5 min à température ambiante et éliminer le surnageant.
5. Remettre les neutrophiles en suspension dans 1 mL d’IPPM, puis centrifuger à 2500 x g pendant 5 min à température ambiante et éliminer le surnageant. Répétez 2x (lavage total 3x).
6. Remettre les neutrophiles en suspension dans 1 mL d’IPPM et compter à l’aide d’un compteur de cellules. Diluer la suspension de neutrophiles à 1,5 x 10⁵ neutrophiles/mL.
7. Ajouter 4 μL de colorant d’ADN vert imperméable à la membrane pré-dilué 1 :100 (voir le tableau des matériaux) par 1 mL de suspension de neutrophiles.
8. Mettre 100 μL de suspension de neutrophiles par puits dans une plaque transparente traitée par culture tissulaire à 96 puits (voir le tableau des matériaux). Définissez chaque condition en trois exemplaires.
   NOTE : Nous avons précédemment montré⁷ qu’il n’y a pas de différence dans la formation et la quantification des TNE avec cette méthode si les neutrophiles sont placés dans des plaques avec ou sans revêtement en poly-L-lysine. Par conséquent, l’utilisation d’une plaque traitée par culture tissulaire est suffisante pour cette méthode.
9. Ajouter 100 μL de réactifs de stimulation contenant du RPMI avec ou sans inhibiteur, ou tout autre réactif d’intérêt dans les puits respectifs. Toujours utiliser des puits de contrôle positif en ajoutant 500 nM de phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA) ou 2,5 μM d’ionophore de calcium (A23187), un inhibiteur AKT de 30 μM a été utilisé ici.
10. Placer la plaque dans le système d’analyse des cellules vivantes (voir le tableau des matériaux) qui est logé dans un incubateur à 5 % de CO₂ .
    REMARQUE : De la condensation peut apparaître sur le haut et le bas de la plaque quelques minutes après cette étape. Cela peut inhiber une imagerie correcte. Essuyez et éliminez soigneusement la condensation avant le début de l’analyse. Placez la plaque dans la machine, démarrez le logiciel, entrez le protocole de numérisation, puis essuyez la plaque juste avant la première numérisation.

2. Plaque de balayage pour visualiser les neutrophiles formant des TNE

1. Démarrez le logiciel (voir la Table des matériaux pour plus de détails sur le logiciel). Lancez Ajouter un vaisseau en appuyant sur + dans le coin supérieur gauche.
2. Choisissez Analyser selon la planification. Choisissez Nouveau.
   REMARQUE : Une fois cette option créée, exécutez le même protocole d’analyse en choisissant Copier le précédent et en sélectionnant le protocole stocké sur l’écran suivant.
3. Choisissez Standard. Définissez les paramètres de numérisation comme suit : Options cellule par cellule : Aucune ; Canaux d’image : Phase, Vert (Temps d’acquisition : 200 ms), Rouge (Temps d’acquisition : 400 ms) ; Objectif : 20x.
4. Choisissez la plaque utilisée dans la liste. Sélectionnez l’emplacement du récipient où placer la plaque sur le plateau du système d’imagerie de cellules vivantes.
5. Sélectionnez les puits où des échantillons sont présents et décidez du nombre d’images à prendre par puits. En fonction du nombre d’images par puits, générez une estimation de la durée de balayage de la plaque. Habituellement, 4 images par puits suffisent ; cependant, cela peut varier en fonction des conditions et de la fréquence des examens.
6. Entrez les informations de chaque puits (par exemple, le type de cellule et le composé) en cliquant sur Créer une carte de plaque pour donner un nom à l’étude.
   REMARQUE : La carte de plaque peut être préparée et enregistrée à l’avance à l’aide de l’éditeur de carte de plaque dans le logiciel. Les données de carte de plaque enregistrées peuvent être importées au cours de cette étape. Si vous le souhaitez, la saisie des informations de la carte de plaque peut être ignorée et effectuée ultérieurement. Les données peuvent également être obtenues sans entrer d’informations sur la disposition des plaques. Cependant, il est recommandé de saisir les informations sur les plaques pour faciliter l’analyse ultérieure.
7. Sur l’écran suivant, sélectionnez Analyseur de base comme type d’analyse, puis choisissez Protocole d’analyse dans la liste déroulante, qui affiche les définitions d’analyse précédemment utilisées (et non les protocoles d’analyse). Le démélange spectral pour le vert et le rouge peut être laissé à 0,0 %.
   REMARQUE : Cette étape peut être ignorée, si vous le souhaitez.
8. Planifier l’analyse. Pour l’expérience ici, scannez toutes les 15-20 min pendant 8 h . Définissez l’heure de début de l’analyse en faisant glisser la barre blanche et grise en haut de l’écran.
   REMARQUE : Évitez de numériser trop fréquemment, sinon la machine pourrait ne pas fonctionner correctement en raison d’une surchauffe. Le temps de numérisation ne doit pas dépasser 12 h par 24 h. Vous pouvez voir une alerte si l’analyse est trop fréquente.
9. Vérifiez le paramètre de numérisation sur l’écran suivant et appuyez sur Ajouter à la planification pour lancer la numérisation. Attendez que l’ensemble initial d’images soit numérisé pour confirmer si tout fonctionne bien.
   1. Parfois, les cellules peuvent ne pas être correctement focalisées. Dans ce cas, vérifiez si de la condensation est présente (et essuyez en conséquence), si la plaque est correctement réglée sur le plateau, si la position de la plaque est correctement spécifiée, etc. Si les cellules flottent encore et ne se sont pas déposées au fond du puits, attendez environ 5 minutes avant de les scanner.

3. Définition de la définition de l’analyse pour quantifier les TNE

1. Ouvrez l’étude (récipient) à analyser dans l’onglet Affichage. Appuyez sur Lancer l’analyse à gauche de l’écran. Choisissez Créer une nouvelle définition d’analyse.
   1. Si une analyse a déjà été effectuée, utilisez la même définition d’analyse avec des modifications mineures en sélectionnant Copier la définition d’analyse existante. Dans ce cas, passez à l’étape 3.3. Si vous utilisez l’analyse sans aucune modification, sélectionnez Utiliser la définition d’analyse existante ; Cela n’est pas recommandé car le niveau de fluorescence peut varier d’un test à l’autre selon les jours et certaines corrections mineures sont généralement nécessaires.
2. Sélectionnez Analyseur de base. Utilisez tous les canaux d’image : Phase, Vert, Rouge et Chevauchement.
   REMARQUE : Bien que nous utilisions généralement des masques d’objets verts et rouges pour compter les TNE, le masque d’objets de chevauchement est utile lorsque les débris sont importants. Dans ce cas, le nombre d’objets qui se chevauchent sera utilisé comme numérateur au lieu du nombre d’objets verts (voir étape 3.9). Si le nombre d’objets de chevauchement est utilisé au lieu du nombre d’objets verts, tous les signaux rouges doivent être comptés correctement. Ajustez le réglage du signal rouge pour compter tous les objets rouges avec un signal rouge faible dans les images prises à des moments ultérieurs, mais pas pour compter les débris.
3. Choisissez 6 à 8 exemples d’images représentatives pour l’entraînement. Pour l’expérience ici, incluez les images suivantes :
   Images prises entre 0 et 20 min pour optimiser le réglage du signal vert afin de compenser les signaux verts subtils qui peuvent être générés dans les neutrophiles non formant des TNE
   Images des TNE maximales avec contrôle positif, prises entre 3 et 6 h (le temps varie en fonction de la stimulation utilisée) pour optimiser le réglage du signal vert pour définir les neutrophiles formant des TNE
   Images prises autour du point de 1 h pour compter le nombre total de cellules (colorées au colorant rouge) car le signal rouge nucléaire est le plus fort autour du point de 1 h (lorsque toutes les cellules se sont déposées au fond du puits) et diminue progressivement en raison de la mort cellulaire.
   Images contenant des débris, pour les exclure du comptage.
4. Définissez la définition de l’analyse. Les objets rouges et les objets verts correspondent respectivement aux noyaux de tous les neutrophiles et à ceux qui forment des TNE. Commencez par l’exemple suivant et appuyez sur Aperçu actuel ou Aperçu tout, puis modulez chaque paramètre pour optimiser les résultats :
   Pour le vert : Segmentation - Soustraction de l’arrière-plan : Haut-de-forme ; Rayon : 100 μM ; Seuil : 0,3 GCU ; Séparation des bords : Activé ; Sensibilité des bords : -20 ; Nettoyage -Remplissage des trous : 100 μm² ; Ajuster la taille 0 pixels ; Filtres- Surface : min 20 μm², max 500 μm² ; Excentricité : max 0,97 ; Intensité moyenne : min 1,00
   Pour le rouge : Segmentation - Soustraction d’arrière-plan : Haut-de-forme ; Rayon : 10 μM ; Seuil : 1,0 GCU ; Séparation des bords : ON ; Sensibilité des bords : -50 ; Remplissage du trou de nettoyage : 50 μm² ; Ajuster la taille 0 pixels ; Filtres- Surface : min 20 μm², max 400 μm² ; Intensité moyenne : min 1,5.
   1. Si un signal vert excessif apparaît dans les neutrophiles qui ne devraient pas former de TNE (par exemple, des neutrophiles non stimulés à 0 min qui ont des noyaux lobulés), cela peut être dû à un débordement du signal rouge détecté dans le canal vert. Dans ce cas, revenez à l’étape 3.1, ouvrez les calques d’image à gauche de l’écran et supprimez les signaux rouges du canal vert à l’aide de la démixage spectral.
   2. Une autre option consiste à bien en régler un pour une coloration unique avec un colorant rouge nucléaire afin de clarifier la quantité de signal rouge à éliminer du canal vert. D’autre part, le signal vert qui saigne généralement dans le canal rouge n’affecte pas les analyses.
      REMARQUE : Peu importe si la sensibilité au signal rouge est faible et que tous les signaux rouges ne sont pas capturés dans les images prises à des moments ultérieurs (par exemple, un point de temps de 6 h). Le nombre maximal d’objets rouges dans chaque image est considéré comme le nombre total de neutrophiles dans l’image et sera utilisé comme dénominateur à l’étape 3.9. Habituellement, les signaux rouges nucléaires atteignent un pic vers 1 h et diminuent progressivement en raison de la mort cellulaire (Figure 1B). Par conséquent, ajustez le réglage du signal rouge pour compter correctement les objets rouges dans les images avec un maximum de signaux rouges.
5. Sélectionnez les temps de balayage et les puits à analyser. Habituellement, tous les points temporels et puits doivent être analysés. Fournissez une étiquette à la définition de l’analyse.
6. Vérifiez le résumé et lancez l’analyse. Il faut quelques heures pour terminer l’analyse (la durée dépend du nombre de points temporels et de puits). Une fois lancée, le nom de la définition d’analyse sera affiché sous le nom de l’étude dans l’onglet Affichage, et la date complète sera affichée lorsqu’elle sera terminée.
7. Une fois terminé, ouvrez l’étude analysée en double-cliquant sur le nom de la définition d’analyse. Ouvrez Calques à gauche de l’écran et vérifiez si chaque cellule est correctement marquée. S’il n’est pas correctement marqué, revenez à l’étape 3.1 et répétez les étapes suivantes.
8. Cliquez sur Graphiques sur les métriques à gauche de l’écran pour exporter les données. Sélectionnez Nombre vert, Nombre rouge ou Nombre de chevauchements (par image), puis choisissez les points temporels et les puits à exporter. Pour sélectionner le regroupement, sélectionnez Répliquer la carte des plaques si tous les puits sont correctement spécifiés lors de la numérisation.
9. Exportez les données. Calculer le pourcentage de cellules formant des TNE pour chaque condition/point temporel à l’aide de l’équation suivante à l’aide d’un logiciel approprié.
   
   REMARQUE : La raison pour laquelle le dénominateur est le nombre maximal d’objets rouges est que le nombre d’objets rouges atteint un pic vers 1 h et diminue progressivement en raison de la mort cellulaire.

Cette méthode fournit des images à contraste de phase, fluorescentes rouges (colorant perméable à la membrane) et fluorescentes vertes (colorant imperméable à la membrane) prises à chaque point temporel. Parallèlement au processus de formation des NET, des changements morphologiques sont observés dans les images à contraste de phase et fluorescentes rouges, et une fois la membrane percée, une fluorescence verte peut être observée (Figure 1). Dans ce test, les neutrophiles formant des TNE sont généralement ronds, au lieu de former une structure en forme de toile. En effet, la résolution de la machine n’est pas assez élevée pour capturer une structure fine en forme de toile et un colorant vert imperméable à la membrane colore la chromatine avant qu’elle ne soit libérée une fois la membrane percée. Nous avons précédemment montré7 que les TNE peuvent être visualisées en utilisant l’imagerie confocale dans les plaques à 96 puits récupérées après 4 h d’incubation.

Lorsque la définition de l’analyse est correctement définie, tous les neutrophiles de l’image sont marqués comme un objet rouge et les neutrophiles formant des TNE sont marqués comme un objet vert (Figure 2). La machine compte le nombre d’objets rouges et verts à chaque point temporel. L’évolution temporelle de la formation des TNE est visualisée en traçant le pourcentage de neutrophiles formant des TNE à chaque point temporel (Figure 3). Les molécules potentielles qui ciblent la formation de TNE (par exemple, l’inhibiteur de l’AKT) peuvent être testées à haut débit en utilisant cette méthodologie.

Figure 1 : Changements morphologiques dans les neutrophiles en cours de formation de TNE. (A) Neutrophiles du sang périphérique humain stimulés avec un ionophore calcique de 2,5 μM pendant 3 h. (B) Vues unicellulaires représentatives de l’image à contraste de phase, du canal rouge (colorant nucléaire perméable à la membrane), du canal vert (colorant d’ADN imperméable à la membrane) et de l’image fusionnée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Images représentatives montrant la reconnaissance logicielle des neutrophiles et des TNE. Les neutrophiles de volontaires humains sains ont été stimulés avec 2,5 μM d’ionophore de calcium pendant 1 h. Des images superposées de l’imagerie à contraste de phase et de chaque signal ou masque sont affichées. Les noyaux ont été colorés avec un colorant rouge perméable à la membrane (A), et le logiciel a reconnu et compté (B) les noyaux marqués en bleu tandis que les TNE ont été colorés avec un colorant vert imperméable à la membrane (C) et le logiciel les a marqués en violet (D). Si (E) surdétection ou (F) sous-détection se produit, il peut être nécessaire de modifier le paramètre. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Évolution temporelle du pourcentage de neutrophiles formant des TNE. Les neutrophiles ont été stimulés par 25 nM de phorbol, 12-myristate, 13-acétate (PMA) ou 2,5 μM d’ionophore calcique pour induire des TNE ou laissés non stimulés dans RPMI. L’ajout d’un inhibiteur d’AKT de 30 μM a été effectué pour bloquer la formation de TNE. Les images ont été obtenues par le logiciel toutes les 20 min pendant 6 h. Le pourcentage de cellules formant des TNE a été calculé en divisant le nombre d’objets verts (= le nombre de cellules formant des TNE) par le nombre d’objets rouges (= le nombre de tous les neutrophiles). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Les auteurs n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.