Technique à haut débit en temps réel pour quantifier la formation de pièges extracellulaires à neutrophiles dans les neutrophiles humains

Résumé

Nous présentons une méthode automatisée à haut débit pour quantifier les pièges extracellulaires (TNE) de neutrophiles en utilisant le système d’analyse de cellules vivantes, couplée à une approche à double colorant dépendant de la perméabilité membranaire.

Résumé

Les neutrophiles sont des cellules de la lignée myéloïde qui constituent une partie cruciale du système immunitaire inné. La dernière décennie a révélé d’autres rôles clés que jouent les neutrophiles dans la pathogenèse du cancer, des maladies auto-immunes et de diverses affections inflammatoires aiguës et chroniques en contribuant à l’initiation et à la perpétuation de la dérégulation immunitaire par de multiples mécanismes, y compris la formation de pièges extracellulaires neutrophiles (TNE), qui sont des structures cruciales dans la défense antimicrobienne. Les limites des techniques de quantification de la formation de TNE de manière impartiale, reproductible et efficace ont limité notre capacité à mieux comprendre le rôle des neutrophiles dans la santé et les maladies. Nous décrivons une méthode automatisée, en temps réel et à haut débit pour quantifier les neutrophiles en cours de formation de TNE à l’aide d’une plateforme d’imagerie de cellules vivantes couplée à une approche à double colorant dépendant de la perméabilité membranaire utilisant deux colorants d’ADN différents pour imager l’ADN intracellulaire et extracellulaire. Cette méthodologie permet d’évaluer la physiologie des neutrophiles et de tester des molécules capables de cibler la formation de TNE.

Introduction

Les pièges extracellulaires neutrophiles (TNE) sont des structures chromatiniennes en forme de toile extrudées à partir de neutrophiles en réponse à divers stimuli inflammatoires. Les TNE sont composées d’ADN, d’histones et de diverses protéines/peptides antimicrobiens, qui piègent et tuent les agents pathogènes infectieux et provoquent des réponses inflammatoires¹.

Bien que les TNE soient bénéfiques pour la défense de l’hôte contre les agents pathogènes, elles ont attiré l’attention en tant que moteur potentiel de diverses maladies auto-immunes², thrombose³, maladies m....

Protocole

Les neutrophiles provenant de sujets humains sains ont été obtenus après consentement éclairé dans le cadre du protocole approuvé par le National Institutes of Health (NIH) Institutional Review Board (IRB). Le protocole suit les directives du comité d’éthique de la recherche humaine des NIH.

1. Coloration des neutrophiles et préparation de la plaque de dosage

1. Prélever du sang périphérique avec le consentement éclairé écrit approprié conformément aux directives de chaque institut et isoler les neutrophiles en utilisant la méthode souhaitée. Par exemple, la méthode Ficoll-dextran ^10,11

Résultats

Cette méthode fournit des images à contraste de phase, fluorescentes rouges (colorant perméable à la membrane) et fluorescentes vertes (colorant imperméable à la membrane) prises à chaque point temporel. Parallèlement au processus de formation des NET, des changements morphologiques sont observés dans les images à contraste de phase et fluorescentes rouges, et une fois la membrane percée, une fluorescence verte peut être observée (Figure 1). Dans ce test, les neutrophiles formant des TNE son.......

Discussion

Les méthodes actuelles de quantification des TNE ex vivo présentent plusieurs inconvénients qui limitent notre capacité à étudier les neutrophiles, les TNE et les cibles thérapeutiques potentielles de manière impartiale et à haut débit^10,14. Par exemple, le comptage direct des cellules formant des TNE après coloration immunofluorescente, considéré comme l’étalon-or pour la quantification des TNE, est à faible débit et dépend de la vision subjective de l’.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Inhibiteur d’AKT	Calbiochem	124028
Plaque transparente à 96 puits	Corning	3596
Système d’analyse de cellules vivantes	Sartorius	N/A	Logiciel d’incucytes (v2019B)
Colorant vert d’ADN imperméable à la membrane  ;	Thermo Fisher	Scientific S7020
Colorant rouge nucléaire	Enzo	ENZ-52406	pastille de neutrophile devient bleuâtre après coloration.
RPMI	Thermo Fisher Scientific	11835030	Le rouge de phénol contenant du RPMI peut être utilisé.