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Article de méthode

Fabrication et caractérisation d’organoïdes de cancer colorectal à partir de la lignée cellulaire SW1222 dans une matrice peptidique auto-assemblée ultracourte

1.9K vues

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DOI :

10.3791/66060

⸱

3 mai 2024

 ,  , 
1Laboratory for Nanomedicine, Biological & Environmental Science & Engineering, King Abdullah University of Science and Technology, 2Computational Bioscience Research Center, King Abdullah University of Science and Technology, 3Red Sea Research Center, King Abdullah University of Science and Technology

Dans cet article

Résumé

Ce protocole vise à évaluer les peptides biofonctionnels auto-assemblés pour l’adhésion cellulaire, la morphologie des organoïdes et l’expression génique par immunomarquage. Nous utiliserons une lignée cellulaire de cancer colorectal pour fournir un moyen rentable d’obtenir des organoïdes pour des tests intensifs.

Résumé

Les peptides ultracourts à s’assembler automatiquement (SAP) peuvent former spontanément des nanofibres qui ressemblent à la matrice extracellulaire. Ces fibres permettent la formation d’hydrogels biocompatibles, biodégradables et non immunogènes. Nous avons précédemment prouvé que les SAP, lorsqu’ils sont biofonctionnalisés avec des motifs dérivés de protéines, peuvent imiter les caractéristiques de la matrice extracellulaire qui soutiennent la formation d’organoïdes colorectaux. Ces hydrogels peptidiques biofonctionnels conservent les propriétés mécaniques, l’accordabilité et l’imprimabilité du peptide parent d’origine tout en incorporant des indices qui permettent aux interactions cellule-matrice d’augmenter l’adhésion cellulaire. Cet article présente les protocoles nécessaires pour évaluer et caractériser les effets de divers hydrogels peptidiques biofonctionnels sur l’adhésion cellulaire et la formation de lumière à l’aide d’une lignée cellulaire cancéreuse d’adénocarcinome capable de former des organoïdes de cancer colorectal de manière rentable. Ces protocoles permettront d’évaluer les effets de l’hydrogel peptidique biofonctionnel sur l’adhésion cellulaire et la formation luminale à l’aide de l’immunomarquage et de l’analyse d’images de fluorescence. La lignée cellulaire utilisée dans cette étude a déjà été utilisée pour générer des organoïdes dans des matrices dérivées d’animaux.

Introduction

Ces dernières années, les peptides auto-assemblés (SAP) sont apparus comme des biomatériaux prometteurs pour des applications d’ingénierie tissulaire. Les SAP possèdent des propriétés uniques, notamment la formation spontanée de nanofibres, la biocompatibilité, la biodégradabilité et la non-immunogénicité, ce qui en fait des candidats attrayants pour le développement d’échafaudages1. Les SAP ont déjà été utilisés avec divers types de cellules, et notamment, les SAP ultracourts ont facilité l’encapsulation des cellules souches tout en maintenant leur pluripotence sur des périodes prolongées englobant plus de 30 passages et avec une incidence minimale d’aberrations chromosomiques 2,3,4. Par conséquent, l’adaptation des PAS à leur utilisation en culture d’organoïdes a constitué une étape ultérieure rationnelle.

Les organoïdes sont des structures tridimensionnelles complexes qui résultent de cellules pluripotentes uniques. Ces structures donnent naissance à divers types de cellules, qui s’auto-organisent ensuite pour reproduire les processus de développement de la croissance embryonnaire et tissulaire in vitro5. Ce cadre innovant est devenu un formidable outil pour les investigations in vitro, conservant efficacement les attributs génétiques, phénotypiques et comportementaux caractéristiques des organes in vivo 6. Néanmoins, l’un des principaux obstacles à la transition du laboratoire au chevet des patients des résultats basés sur les organoïdes est la nécessité de reproductibilité7. Cette variation des résultats est principalement attribuée à la difficulté de différencier complètement les cellules souches pluripotentes humaines en lignées cellulaires spécialisées, aggravée par l’absence d’architecture tissulaire authentique et la complexité inhérente rencontrée dans les modèles organoïdes. Compte tenu de la popularité croissante des études basées sur des cellules souches et des organoïdes8, il y a eu une demande accrue de biomatériaux dotés de propriétés mécaniques dynamiques et de sites d’adhésion ou d’échafaudages similaires à ceux de l’intégrine à dégradabilité contrôlée 7,9. Ces attributs peuvent être ajustés efficacement grâce à l’utilisation stratégique de PAS biofonctionnalisés.

Les SAP sont de courtes séquences d’acides aminés ayant la capacité inhérente de s’organiser spontanément en structures bien définies10. Ces peptides contiennent souvent une alternance de résidus hydrophobes et hydrophiles, qui entraînent leur auto-assemblage par des interactions non covalentes, notamment les liaisons hydrogène, les interactions électrostatiques et les effets hydrophobes11,12. Le processus d’auto-assemblage de ces peptides est principalement motivé par la nécessité de minimiser l’énergie libre du système. Lorsqu’ils sont dans un environnement aqueux, les résidus hydrophobes ont tendance à se regrouper pour minimiser leur exposition à l’eau, tandis que les résidus hydrophiles interagissent avec les molécules d’eau environnantes. Ce phénomène conduit à la formation de diverses nanostructures. Dans ce cas, les peptides ultracourts auto-assemblés forment des nanofibres dont les caractéristiques dépendent de la séquence peptidique et des conditions environnementales 2,12,13,14,15,16. Ces peptides adoptent une conformation en β-tour, où les brins peptidiques individuels s’alignent parallèlement ou antiparallèlement les uns aux autres, stabilisés par des liaisons hydrogène (Figure 1). La présence d’ions positifs accélère les processus d’auto-assemblage qui conduisent à la formation de nanofibres.

Les nanofibres peptidiques ont été identifiées comme possédant une capacité innée à piéger des volumes importants d’eau. Cette caractéristique facilite la génération d’un hydrogel, qui se manifeste par la suite par un espace tridimensionnel biocompatible et biodégradable propice à la prolifération et à la croissance cellulaires. Ces nanofibres peptidiques auto-assemblées émulent de manière complexe les caractéristiques topographiques inhérentes à l’environnement de la matrice extracellulaire naturelle (MEC)1. Cette ressemblance dote les cellules d’un environnement qui imite leur habitat physiologique, favorisant ainsi des activités cellulaires optimales17. De plus, la polyvalence inhérente à ces peptides permet un degré considérable de réglage4. Une telle adaptabilité permet de modifier les propriétés de la matrice, telles que la rigidité, la cinétique de gélification et la porosité. Ces adaptations sont réalisées par des modifications de la séquence peptidique. Par conséquent, les peptides auto-assemblés (SAP) sont devenus des composants essentiels de la science contemporaine des biomatériaux, largement utilisés comme échafaudages pour la régénération des tissus et la culture cellulaire13,17.

L’un des avantages essentiels des peptides auto-assemblés est leur capacité à être facilement synthétisés et modifiés au niveau moléculaire. Cet avantage permet d’incorporer des groupes fonctionnels spécifiques ou des motifs bioactifs dans la séquence peptidique, ce qui permet de concevoir des peptides avec des propriétés et des fonctionnalités adaptées 18,19,20 (Figure 1B). Par exemple, les SAP biofonctionnalisés peuvent être conçus pour imiter l’ECM et favoriser la différenciation à l’aide du peptide RGD19,21. Il a également été rapporté que le peptide Ben-IKVAV augmente considérablement l’expression des marqueurs neuronaux spécifiques en raison de sa motiété spécifique au ligand22. Ces peptides peuvent également être modifiés pour afficher des molécules bioactives, telles que des peptides liant l’intégrine, afin d’améliorer la survie cellulaire23. Enfin, d’autres SAP biofonctionnalisés ont été développés pour favoriser l’angiogenèse en incluant les motifs IKVAV et YIGSR dans leurs structures24.

Les SAP biofonctionnalisés rapportés dans une publication antérieure montrent que l’auto-assemblage peut être davantage modifié en incluant le peptide naïf à partir duquel le SAP biofonctionnalisé a été dérivé25. Ces mélanges de SAP peuvent également fournir un large éventail de formulations de SAP dont l’activité biochimique et les propriétés physicochimiques varient. Par exemple, le peptide amphiphile IIFK est un SAP ultracourt qui peut résister à la biofonctionnalisation avec divers motifs, comme en témoigne l’incorporation du motif IKVAV (Figure 1B). Les deux peptides peuvent former des nanofibres, à la fois seules et combinées. Chaque formulation donne des hydrogels aux propriétés physiques variables (Figure 2)

Cependant, en raison de la vaste gamme de permutations et d’alternatives potentielles obtenues à partir de la biofonctionnalisation des PAS, il est nécessaire de fournir une option rapide et rentable pour les tests d’organoïdes. La lignée cellulaire SW1222, dérivée de l’adénocarcinome colorectal humain, est un candidat pour une évaluation aussi intensive et rentable des organoïdes26,27. Les cellules SW1222 possèdent des caractéristiques qui permettent leur agrégation en structures 3D ressemblant à des organoïdes, ce qui en fait un modèle idéal pour l’étude du développement tissulaire et des applications de la médecine régénérative. Les cellules SW1222 ont été identifiées comme capables de générer des organoïdes en raison de leur surexpression intrinsèque du gène LGR5 27. La création d’organoïdes à partir de cellules souches LGR5+ individuelles a déjà été démontrée de manière convaincante, ainsi que la propension des cellules SW1222 à obtenir les caractéristiques morphologiques d’un organoïde de cancer colorectal28.

Dans cet article méthodologique, nous présentons des protocoles détaillés pour évaluer et caractériser les effets de divers peptides biofonctionnels sur l’adhésion cellulaire et la formation de lumière à l’aide de cellules SW1222 (Figure 3). En fournissant des procédures étape par étape et des méthodes d’analyse d’imagerie, nous espérons offrir des informations précieuses sur la biofabrication des organoïdes et l’évaluation de matrices SAP simplistes pour la culture d’organoïdes.

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Protocole

1. Préparation du tampon et de la solution

REMARQUE : Toutes les concentrations indiquées sont des concentrations finales.

  1. Ajoutez du sérum fœtal bovin (FBS) et de la pénicilline-streptomycine à une concentration finale de 10 % et 1 %, respectivement, pour préparer le milieu Dulbecco’s modifié (IMDM) complet d’Iscove. Conserver à l’obscurité à 4 °C jusqu’à 1 mois.
  2. Mélangez du MgCl2 (3 mM), du saccharose (300 mM) et du Triton X-100 (0,5 %) dans une solution saline tampon phosphate (PBS) pour préparer le tampon de perméabilisation. Conservez cette solution à 4 °C jusqu’à 2 mois.
  3. Combinez l’albumine sérique bovine (BSA, 1%), la glycine (0,3 M) et le Tween-20 (0,1%) dans du PBS pour préparer un tampon de blocage. Conservez cette solution à 4 °C jusqu’à 2 mois.
  4. Diluer 10x à 2x PBS avec de l’eau ultra-pure dans des conditions stériles. Conservez cette solution à température ambiante pendant plus de 6 mois.
  5. Stérilisez 3 mg de poudre de peptide sous lumière ultraviolette pendant 30 min. Ajouter 500 μL d’eau ultrapure à dissoudre à l’aide d’un mélangeur vortex.
    REMARQUE : La concentration finale doit être le double de la concentration cible, c’est-à-dire 6 mg/mL, car la concentration 1x sera de 3 mg/mL.

2. Fabrication d’organoïdes du cancer colorectal à partir de SW1222 dans un peptide

  1. Décongelez une aliquote pendant la nuit à 4 °C et conservez-la dans de la glace jusqu’à ce qu’il soit nécessaire de préparer le contrôle de la matrice du sous-sol.
  2. Placez une gouttelette de 10 μL de solution peptidique 2x au centre de chaque puits dans une plaque à 24 puits. Laisser incuber la plaque à température ambiante pendant 10 min. Vous pouvez également déposer 8 à 10 gouttelettes par puits dans une plaque à 6 puits.
    REMARQUE : Les échantillons destinés à être utilisés en microscopie confocale et électronique sont plus accessibles à la manipulation s’ils sont ensemencés sur une lamelle stérile.
  3. Ajouter 10 μL de 2x PBS. Mélangez doucement la solution PBS à l’aide de l’embout. Laissez les gels se stabiliser pendant au moins 20 min, en veillant à ce que les gouttelettes restent presque intactes.
    REMARQUE : L’objectif de l’ajout de PBS et du mélange doux est de maintenir l’intégrité de la gouttelette et d’éviter de répandre l’hydrogel en une couche.
  4. Détachez les cellules SW1222 à l’aide d’une solution de trypsine-EDTA à 0,125 % (5 ml). Incuber les cellules avec de la trypsine à 37 °C pendant 5 à 10 minutes jusqu’à ce qu’elles se détachent du ballon. Abstenez-vous de tapoter le ballon pour éviter l’agglutination des cellules.
  5. Ajouter 5 mL de milieu complet pour inactiver la trypsine. Filtrez la suspension cellulaire à l’aide d’une crépine de 30 μm. Alternativement, utilisez une seringue avec une aiguille de 25 G pour perturber les agrégats.
  6. Préparez une suspension cellulaire de 0,4 × 106 cellules/mL et injectez 2 μL de la suspension cellulaire dans chaque gouttelette peptidique à l’aide d’une micropipette de 10 μL.
  7. Incuber les gouttelettes pendant 30 min à 37 °C, 5% CO2. Ajouter 0,5 mL de milieu supplémenté dans chaque puits après l’incubation.
  8. En attendant, préparer le contrôle de la matrice de la membrane basale en diluant le stock principal (8-12 mg/mL, selon le lot) jusqu’à une concentration finale de 3 mg/mL à l’aide du milieu supplémenté. Ajoutez des cellules à cette solution (800 cellules par 25 μL).
    REMARQUE : La manipulation de la membrane basale doit être effectuée sur de la glace en tout temps. Les pointes doivent être rincées dans du PBS glacé avant de toucher l’hydrogel. Sinon, la polymérisation se produira à l’intérieur des pointes.
  9. Déposer 20 gouttelettes de 20 μL de la solution de membrane basale dans chaque puits. Laisser les gouttelettes se gélifier en les laissant incuber pendant 20 minutes à 37 °C. Une fois le matériau gélifié, ajoutez 0,5 mL de milieu complet.
  10. Changez de milieu tous les 3-4 jours. Observez les cellules s’organiser et montrer des signaux de formation de lumière dès le jour 4.
  11. Imagez des cellules en fond clair les jours 1, 4 et 7 pour évaluer la croissance des organoïdes.

3. Viabilité et prolifération

  1. Préparez trois plaques à puits noirs pour l’essai de viabilité et trois plaques à puits noirs pour l’essai de prolifération. Ajouter 25 μL de solution peptidique 2x par puits et géler en utilisant le même volume de PBS 2x. Ensemencez les cellules comme décrit ci-dessus.
  2. Préparez trois puits pour chaque formulation d’hydrogel peptidique à utiliser comme blancs dans la plaque de prolifération. N’ensemencez pas de cellules sur ceux-ci.
  3. Retirez le milieu de la plaque de puits de viabilité et lavez avec 1x PBS pendant 3 x 5 min.
  4. Diluer le calcéin-AM et l’homodimère d’éthidium à 8 μM du kit de viabilité/cytotoxicité pour cellules de mammifères (voir la table des matériaux) dans le même tube conique protégé contre la lumière. Pour préparer 2 ml de cette solution à 2 ml de PBS dans un tube conique protégé contre la lumière, ajoutez 4 μL de la solution mère de Calcein-AM et 8 μL de la solution mère d’homodimère-1 d’Ethidium.
  5. Ajouter la solution d’homodimère de calcéine/éthidium préparée à l’étape 3.4 dans la plaque à 96 puits. Ajouter 100 μL par puits. Protéger de la lumière et incuber à température ambiante pendant 30 min.
  6. Laver pendant 3 x 5 min avec 1x PBS. Imagez un minimum de trois champs (centre, haut, bas) lors de l’utilisation d’un objectif 4x ou un minimum de cinq champs (centre, haut à gauche, haut à droite, bas à gauche, en bas à droite) lors de l’utilisation d’un objectif 10x et 20x sous un microscope à fluorescence.
  7. Retirer le fluide de la plaque de puits de prolifération pour obtenir un volume final de 90 μL.
  8. Ajouter 10 μL de solution d’Alamar Blue (voir tableau des matériaux) pour atteindre une concentration finale de 10 %.
  9. Protéger de la lumière et incuber pendant 2 à 4 h à 37 °C, 5% CO2
  10. Utilisez un lecteur de plaque à puits pour mesurer la fluorescence (Ex/Em = 530-560/590 nm/nm) ou l’absorbance (570 nm). Faites la moyenne des valeurs obtenues pour les blancs et soustrayez-les des valeurs de chaque puits contenant des cellules.
  11. Calculez les valeurs de prolifération en faisant la moyenne du signal de chaque condition et en soustrayant la moyenne de leurs flans respectifs. Créez des graphiques en générant une boîte à moustaches indexée du signal d’absorbance/fluorescence relatif en fonction du temps.

4. Dosage de l’adhérence des cellules à la matrice

  1. Préparez 100 μL d’hydrogels peptidiques dans deux plaques indépendantes de 96 puits.
  2. Ensemencez 20 000 cellules dans chaque puits et ajoutez 100 μL de milieu. Incuber les plaques pendant 90 min à 37 °C, 5% CO2.
  3. Après l’incubation, ne prélever qu’une seule plaque et remettre délicatement le milieu en suspension à l’aide d’une micropipette P200 pendant 20-30 s. Attention à ne pas perturber l’hydrogel en gardant l’embout du gel. Alternativement, si les propriétés mécaniques de l’hydrogel le permettent (G' > 8 000 Pa), tapotez les quatre côtés de la plaque du puits à l’aide d’un vortex en mouvement.
    REMARQUE : La remise en suspension du média (ou le tapotement de la plaque du puits avec le vortex) enlèvera à la fois les cellules non attachées et les cellules avec une adhérence ténue à la surface de la matrice. La fixation cellulaire se produira dans les 90 minutes, bien que la force de cette attache varie en fonction des hydrogels peptidiques spécifiques et de leurs propriétés adhésives et liantes. La croissance des organoïdes colorectaux est connue pour être favorisée dans les matrices avec des valeurs de rigidité inférieures à 2 000 Pa. Par conséquent, parce que les hydrogels présentés dans ce protocole sont mous et cassants, nous mettons un point d’honneur à utiliser une contrainte mécanique douce.
  4. Retirez 100 μL de milieu des deux plaques à puits et ajoutez une fois le lavage avec 1x PBS.
  5. Préparez une solution de DAPI de 1 μg/mL. Ajouter 100 μL de la solution DAPI dans tous les puits et incuber pendant 5 min à température ambiante.
  6. Imagez un nombre représentatif de champs au microscope à fluorescence. Assurez-vous que toutes les images sont obtenues en utilisant le même objectif pour maintenir le rapport pixel/distance constant.
    REMARQUE : Imaginez neuf trames pour un objectif 10x ou 15 trames avec un objectif 20x.
  7. Chargez les images de fluorescence sur un logiciel d’analyse d’images (par exemple, ImageJ) et analysez les particules sur toutes les images.
    1. Dans le menu Image , sélectionnez Type et cliquez sur 8 bits.
    2. Dans le menu Image , sélectionnez Ajuster et cliquez sur Luminosité/Contraste. Cliquez sur le bouton Auto | Postuler.
    3. Dans le menu Image , sélectionnez Ajuster et cliquez sur Seuil. Cliquez sur le bouton Auto et fermez la fenêtre.
    4. Dans le menu Analyser , cliquez sur Analyser les particules. Cochez l’option de résumé et cliquez sur OK.
    5. Dans la fenêtre Résumé , passez la souris sur le menu Fichier et cliquez sur Enregistrer pour enregistrer les valeurs récapitulatives.
  8. Exportez les résultats de toutes les images vers un logiciel de statistiques standard.
  9. Calculez le pourcentage de surface couverte par les cellules avant et après le stress. Faites une boîte à moustaches indexée du pourcentage de surface par rapport à chaque condition.

5. Immunomarquage d’organoïdes dans un hydrogel peptidique

  1. Ensemencez 800 cellules dans des gouttelettes de 20 μL d’hydrogel peptidique pendant 4 jours, comme décrit aux étapes 2.1 à 2.10.
  2. Le jour 4, retirez le milieu et lavez chaque puits 2x avec 1x PBS.
  3. Ajouter 400 μL d’une solution de formaldéhyde à 4 %. Incuber la plaque à puits pendant 30 min à température ambiante.
  4. Retirez la solution de formaldéhyde avec un P1000 et lavez une fois avec 1x PBS.
  5. Ajouter 1 mL de tampon de perméabilisation et incuber 5 min à température ambiante.
  6. Retirez le tampon de perméabilisation avec un P1000 et lavez-le une fois avec 1x PBS.
  7. Ajouter 0,5 mL de tampon de blocage et incuber pendant 30 minutes à température ambiante.
  8. Retirez le tampon de blocage avec un P1000 et lavez-le avec 1x PBS.
  9. Diluez l’anticorps primaire dans le tampon de blocage conformément aux instructions du fabricant (voir la table des matériaux). Ajouter 200 μL dans deux puits.
  10. Incuber toute la nuit à 4 °C.
  11. Retirez la solution de coloration avec un P200 et lavez une fois avec 1x PBS.
  12. Diluez l’anticorps secondaire dans un tampon bloquant, selon les instructions du fabricant (voir la table des matériaux). Ajouter le conjugué de la phalloïdine dans un rapport de 1:40 dans la solution d’anticorps secondaire.
  13. Protéger de la lumière et incuber à température ambiante pendant 3 h maximum. Retirez la solution de coloration avec un P200 et lavez une fois avec 1x PBS.
  14. Préparez une solution de DAPI de 1 μg/mL dans la mémoire tampon de blocage. Ajouter 300 μL de la solution DAPI dans chaque puits.
  15. Protéger de la lumière et incuber 5 min à température ambiante.
  16. Retirez la solution de coloration avec un P200 et lavez une fois avec 1x PBS.
  17. Protéger de la lumière et conserver à 4 °C jusqu’à 7 jours.

6. Imagerie et analyse d’images d’organoïdes dans la matrice

  1. Imagez les échantillons colorés à l’aide d’un microscope à épifluorescence à 10x. Utilisez uniquement les canaux phalloïdine et DAPI.
  2. Ouvrez le logiciel Cellopose et appuyez sur ctrl + L pour charger une image. Comme le logiciel aura accès à tous les fichiers à l’emplacement de l’image sélectionnée, assurez-vous d’enregistrer toutes les images de fluorescence à l’emplacement exact sans avoir de sous-dossiers.
  3. Entrez le diamètre moyen des colonies dans le panneau Segmentation et cliquez sur ENTRÉE.
  4. Sélectionnez un modèle personnalisé pour les organoïdes du côlon et cliquez sur le bouton Exécuter le modèle .
    REMARQUE : Ici, nous vous suggérons d’utiliser deux modèles à partir de zéro dans Cellpose2.029,30
  5. Appuyez sur ctrl + s pour enregistrer les masques sous forme de fichier .npy.
  6. Utilisez les flèches du clavier pour parcourir les images du dossier et exécutez le modèle d’organoïdes deux-points sur toutes les images du dossier.
  7. Faites une copie du dossier et répétez les étapes 6.2 à 6.6 en utilisant un modèle pour la lumière organoïde du côlon.
  8. Ouvrez ImageJ et cliquez sur Plugin | Macros | Courir... pour exécuter le fichier imagej_roi_converter.py disponible sur le site Github de Cellpose et attendre qu’une fenêtre apparaisse.
  9. Sélectionnez le premier fichier dans le dossier de l’organoïde deux-points et cliquez sur Ouvrir.
  10. Sélectionnez le fichier seg.npy correspondant au premier fichier et cliquez sur Ouvrir.
    REMARQUE : ImageJ convertira les masques en régions d’intérêt et les chevauchera avec les images de fluorescence correspondantes.
  11. Cliquez sur Sélectionner tout dans la fenêtre Gestionnaire de retour sur investissement , puis sur Mesurer.
  12. Cliquez sur Fichier | Enregistrer sous... dans la fenêtre Résultats et enregistrez les résultats.
    REMARQUE : Cela se traduira par un fichier .csv contenant toutes les propriétés de forme de chaque colonie dans le champ.
  13. Répétez les étapes 6.8 à 6.12 pour la même image dans le dossier de la lumière organoïde du côlon.
  14. Chargez OriginPro et appuyez sur ctrl + 3 pour ouvrir l’assistant d’importation. Cliquez sur le bouton des trois points et sélectionnez les deux fichiers .csv correspondant aux propriétés de forme de l’organoïde et de la lumière pour la même image.
  15. Copiez et collez les résultats des propriétés de la forme de la lumière dans une colonne à côté des résultats de la colonie pour vous assurer que chaque mesure de lumière est associée à sa colonie respective.
  16. Dans une nouvelle colonne, divisez les aires de la lumière et de la colonie pour obtenir la surface lumineuse relative de la colonie qui la contient.
  17. Sélectionnez la colonne correspondant à la circularité de chaque colonie et à la zone lumineuse. Cliquez sur Plot | 2D de base | Dispersez-vous.
  18. Faites un clic droit sur la fenêtre du tracé et sélectionnez Détails du tracé. Cliquez sur l’onglet Centroïde (PRO) et cochez les options Afficher le point centroïde pour le sous-ensemble, Se connecter aux points de données et Afficher l’ellipse.

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Résultats

Tout d’abord, nous avons évalué les cellules cultivées dans une plaque à 24 puits pendant 7 jours à l’aide de l’imagerie en fond clair. Nous avons identifié de petits groupes de cellules s’assemblant en organoïdes au cours de la semaine, comme le montre la figure 4. Une méthode de balayage contrôlé permet de suivre la mobilité des cellules et des organoïdes entre différents jours. En général, nous avons regardé l’évolution de la morphologie des cellules pendant toute la semaine. Les organoïd...

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Discussion

Le vaste potentiel des PAS dans la recherche biomédicale est souligné par leur malléabilité et leur adaptabilité par biofonctionnalisation. Avec un tel éventail de permutations, le défi se pose de tester et de déterminer efficacement les configurations les plus prometteuses pour des applications spécifiques, en particulier dans la recherche sur les organoïdes. Une solution rapide et rentable est primordiale. La lignée cellulaire SW1222, dérivée de l’adénocarcinome colorectal humain, apparaît comme un candidat pivot pour ...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu financièrement par l’Université des sciences et de la technologie du roi Abdallah. Les auteurs remercient la subvention du fonds d’amorçage de KAUST et le fonds d’innovation de KAUST décerné par l’innovation et le développement économique de KAUST. Les auteurs tiennent à remercier les laboratoires de biosciences et d’imagerie de KAUST pour leur soutien à la caractérisation biologique et aux analyses de microscopie.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
1x plaque PBSGibco14190144
6 puits, traitée pour culture tissulaireCorning07-200-83
10x PBS, sans calcium, sans magnésiumGibco70011044
16 % de formaldéhyde (w/v), sans méthanolThermo Scientific28906
24 puits, traitée pour culture tissulaireCorning09-761-146
Plaque noire à 96 puits, traitée par culture tissulaireCorning07-200-565
alamarBlue Cell Viability ReagentInvitrogenDAL1025
Anticorps anti-Ezrin, monoclonal de lapinAbcamab40839Utilisation secondaire : anti-lapin Dylight 633
Anticorps anti-pan cadhérine, polyclonal de lapinAbcamab16505Utilisation secondaire : anti-lapin Alexa 488
Anticorps anti-ZO1 à jonction serrée, chèvre polyclonaleAbcamab190085Utilisation secondaire : anti-chèvre Alexa 488
BSASigma-AldrichA9418
Cellpose 2.0NANAObtenu à partir d’https://github.com/MouseLand/cellpose
microscope confocal à balayage laser avec AiryscanZEISSLSM 880
DAPIInvitrogenD1306
Anticorps secondaire anti-IgG (H+L) d’âne, Alexa Fluor 488InvitrogenA-11055
GlycineCytivaGE17-1323-01
Anticorps secondaire anti-IgG (H+L) de chèvre, Alexa Fluor 488InvitrogenA-11008
Anticorps secondaire anti-IgG de lapin (H+L), DyLight 633Invitrogen35562
Sérum fœtal bovin inactivé par la chaleur (HI FBS)Gibco16140071
ImageJ 1.54fNIHNA
IMDMKit
LIVE/DEAD, pour cellules de mammifèresInvitrogenL3224
Chlorure de magnésium, hexahydraté (MgCl2 6 H2O)Sigma-AldrichM2393
Matrigel pour la culture organoïde, sans rouge de phénol356255Désigné dans le manuscrit sous le nom de Matrigel ou matrice de membrane basale.
Microscope, Microscope à fond
, EVOSThermo ScientificEVOS M7000
OriginPro 2023 (64 bits) 10.0.0.154OriginLab CorpNA
Pénicilline-Streptomycine (10 000 U/mL)Gibco15140122
Peptide P (Ac,Ile,Ile,Phe,Lys,NH2)en laboratoireNAPeut être fabriqué sur mesure par peptide fabricants tels que Bachem.
Peptide P1 (Ac, Ile, Ile, Phe, Lys, Gly, Gly, Gly, Arg, Gly, Asp, Ser, NH2)fabriquéen laboratoire Peut être fabriqué sur mesure par des fabricants de peptides tels que Bachem.
Peptide P2 (Ac, Ile, Ile, Phe, Lys, Gly, Gly, Gly, Ile, Lys, Val, Ala, Val, NH2)en laboratoireNA Peut être fabriqué sur mesure par des fabricants de peptides tels que Bachem.
Rhodamine PhalloidinInvitrogenR415
Round Cover Slip, diamètre 10 mmVWR631-0170
Microscope électronique à balayageThermo Fisher - FEITENEO VS
Sterile 30 &mu ; m passoireSysmex04-004-2326
saccharoseSigma-AldrichS1888
SW1222 lignée cellulaireECACC12022910
Triton x-100Thermo Scientific85111
Trypsine-EDTA 0.25 %Gibco25200056
Tween 20Sigma-AldrichP1379
Eau UltraPureInvitrogen10977015
de viabilité/cytotoxicité Gibco 12440079 clairFabriqué NA Fabriqué

Références

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