Article de méthode

Dispositif d’assemblage acoustique tridimensionnel pour la fabrication en série de sphéroïdes cellulaires

DOI :

10.3791/66078

⸱

13 octobre 2023

 ,  ,  , 
1School of Automation, Hangzhou Dianzi University, 2Key Laboratory of Medical Information and 3D Bioprinting of Zhejiang Province, Hangzhou Dianzi University

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les sphéroïdes cellulaires ont été considérés comme un modèle potentiel dans le domaine des applications biologiques. Cet article décrit les protocoles permettant de générer de manière évolutive des sphéroïdes cellulaires à l’aide d’un dispositif d’assemblage acoustique 3D, qui fournit une méthode efficace pour la fabrication robuste et rapide de sphéroïdes cellulaires uniformes.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les sphéroïdes cellulaires sont des modèles tridimensionnels (3D) prometteurs qui ont de nombreuses applications dans de nombreux domaines biologiques. Ce protocole présente une méthode de fabrication de sphéroïdes cellulaires de haute qualité et à haut débit à l’aide d’un dispositif d’assemblage acoustique 3D par des procédures manœuvrables. Le dispositif d’assemblage acoustique se compose de trois transducteurs en titanate de zirconate de plomb (PZT), chacun disposé dans le plan X/Y/Z d’une chambre carrée en polyméthacrylate de méthyle (PMMA). Cette configuration permet la génération d’un réseau de points 3D de nœuds acoustiques en lévitation (LAN) lorsque trois signaux sont appliqués. En conséquence, les cellules de la solution de gélatine méthacryloyl (GelMA) peuvent être conduites vers les réseaux locaux, formant des agrégats cellulaires uniformes en trois dimensions. La solution GelMA est ensuite photopolymérisée par UV et réticulée pour servir d’échafaudage qui soutient la croissance des agrégats cellulaires. Enfin, des masses de sphéroïdes matures sont obtenues et récupérées en dissolvant ensuite les échafaudages GelMA dans des conditions douces. Le nouveau dispositif d’assemblage de cellules acoustiques 3D proposé permettra la fabrication à grande échelle de sphéroïdes cellulaires, et même d’organoïdes, offrant ainsi un grand potentiel technologique dans le domaine biologique.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les modèles de culture in vitro 3D, qui offrent des caractéristiques structurelles et morphologiques plus proches de celles de l’in vivo que les modèles de culture 2D conventionnels, ont été reconnus comme des systèmes prometteurs dans diverses applications biomédicales telles que l’ingénierie tissulaire, la modélisation des maladies et le criblage de médicaments 1,2,3. En tant que type de modèle de culture 3D, les sphéroïdes cellulaires font généralement référence à l’agrégation cellulaire, créant des structures sphéroïdales 3D caractérisées par des interactions cellule-cellule et cellule-matriceaméliorées 4,5,6. Par conséquent, la fabrication de sphéroïdes cellulaires est devenue un outil puissant pour permettre diverses études biologiques.

Diverses techniques, dont la goutte suspendue7, les plaques non adhésives8 ou les dispositifs à micropuits9, ont été développées pour obtenir des sphéroïdes. En principe, ces méthodes facilitent généralement l’assemblage des cellules en utilisant des forces physiques telles que la force gravitationnelle tout en minimisant les interactions entre les cellules et le substrat. Cependant, ils impliquent souvent des processus à forte intensité de main-d’œuvre, ont une faible productivité et posent des défis pour le contrôle de la taille des sphéroïdes10,11. Il est important de noter que la production de sphéroïdes de la taille et de l’uniformité souhaitées en quantité suffisante est de la plus haute importance pour satisfaire des applications biologiques spécifiques. Contrairement aux méthodes mentionnées ci-dessus, les ondes acoustiques, en tant que type de technique pilotée par des forces externes 12,13,14, ont montré un potentiel pour la fabrication en série de sphéroïdes cellulaires de haute qualité et de haut débit, sur la base du principe de l’amélioration de l’agrégation cellulaire par des forces externes 15,16,17,18. Contrairement aux forces électromagnétiques ou magnétiques, les techniques de manipulation cellulaire acoustiques sont non invasives et sans marquage, ce qui permet la formation de sphéroïdes avec une excellente biocompatibilité19,20.

Généralement, des dispositifs à base d’ondes acoustiques de surface stationnaires (SAW) et d’ondes acoustiques de masse (BAW) ont été développés pour générer des sphéroïdes, en utilisant les nœuds acoustiques (AN) produits par les champs acoustiques stationnaires correspondants 21,22,23. En particulier, les dispositifs d’assemblage acoustique à base de BAW, avec les mérites d’une fabrication pratique, d’une utilisation facile et d’une excellente évolutivité, ont attiré l’attention pour la fabrication de sphéroïdes cellulaires24,25. Nous avons récemment développé un dispositif d’assemblage acoustique simple à base de BAW avec la capacité de générer des sphéroïdes à haut débit26. Le dispositif proposé se compose d’une chambre carrée en polyméthacrylate de méthyle (PMMA) avec trois transducteurs en titanate de zirconate de plomb (PZT) disposés respectivement dans le plan X/Y/Z. Cette disposition permet la création d’un réseau de points 3D de nœuds acoustiques en lévitation (LAN) pour l’assemblage de cellules de pilotage. Par rapport aux dispositifs à base de BAW ou de SAW précédemment signalés, qui ne peuvent créer qu’un réseau 1D ou 2D d’ANs 27,28,29, le dispositif actuel permet un réseau de points 3D de LAN pour la formation rapide d’agrégats cellulaires dans la solution de gélatine méthacryloyl (GelMA). Par la suite, les agrégats cellulaires ont mûri en sphéroïdes à haute viabilité dans les échafaudages photopolymérisés de GelMA après trois jours de culture. Enfin, un grand nombre de sphéroïdes de taille uniforme ont été facilement obtenus à partir des échafaudages GelMA pour des applications en aval.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Fabrication du dispositif d’assemblage acoustique 3D

  1. Commencez par préparer quatre feuilles de PMMA de 1 mm d’épaisseur par découpe laser30, puis collez-les ensemble pour former une chambre carrée d’une largeur intérieure de 21 mm et d’une hauteur de 10 mm.
  2. Ensuite, fixez une autre feuille de PMMA de 1 mm d’épaisseur au fond de la chambre pour servir de support à la bio-encre.
  3. Fixez soigneusement trois transducteurs en titanate de zirconate de plomb (PZT) (chacun mesurant 20 mm de longueur, 10 mm de largeur, 0,7 mm d’épaisseur et avec une fréquence de résonance primaire de 3 MHz, voir le tableau des matériaux) à l’extérieur des trois parois orthogonales de la chambre, respectivement. Assurez-vous que le transducteur PZT inférieur est centré sous la chambre.
  4. Soudez les fils aux deux zones conductrices de chaque transducteur PZT.
  5. Enfin, fixez l’appareil sur une base creuse pour éviter que le PZT inférieur n’entre en contact avec d’autres comptoirs.

2. Mise en place du système d’assemblage acoustique

  1. Commencez par monter l’appareil acoustique sur une platine de microscope, ce qui permet d’observer l’intérieur de la chambre en vue de dessus.
  2. Placez un microscope numérique sur le côté de l’appareil qui est exempt de transducteurs PZT, ce qui permet d’observer l’intérieur de la chambre en vue latérale.
  3. Connectez indépendamment les fils des trois transducteurs PZT en série à trois amplificateurs de puissance et à trois canaux de sortie des générateurs de fonctions (voir tableau des matériaux).
  4. Programmez les paramètres sur les générateurs de fonctions pour chaque transducteur PZT, en spécifiant des paramètres tels que la forme d’onde sinusoïdale, la fréquence et l’amplitude.
  5. Pour assurer la stérilisation, remplissez la chambre du dispositif acoustique avec de l’alcool à 75% pendant 5 min, suivi d’un nettoyage en profondeur avec une solution stérile de PBS. Par la suite, irradiez la chambre avec de la lumière UV dans un banc propre pendant au moins 1 h.

3. Procédure de culture cellulaire et de récolte

  1. Commencez par cultiver des cellules C3A, une lignée cellulaire de carcinome hépatocellulaire humain, dans un flacon de culture cellulaire T25 en utilisant le milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco complété par 10 % de sérum de veau fœtal et 1 % de pénicilline-streptomycine (voir le tableau des matériaux).
  2. Lorsque les cellules C3A atteignent environ 80 % de confluence, effectuez le passage cellulaire comme suit : tout d’abord, lavez le fond du flacon de culture deux fois avec du PBS. Ensuite, ajouter 2 mL de trypsine-EDTA à 0,05 % dans le flacon de culture cellulaire et incuber à 37 °C pour faciliter le détachement cellulaire. Arrêtez le processus de trypsinisation en ajoutant 2 mL de milieu de culture complet.
  3. Transvaser la solution cellulaire dans un tube de 15 mL et la centrifuger à 200 × g pendant 5 min à température ambiante pour obtenir une pastille cellulaire.

4. Préparation de la bio-encre

  1. Préparer une solution de GelMA à 6 % (p/v) contenant 0,5 % (p/v) de phényl-2,4,6-triméthylbenzoylphosphinate de lithium (LAP) en dissolvant 0,3 g de GelMA et 0,025 g de LAP (voir le tableau des matériaux) dans 5 mL de solution tampon de phosphate (PBS). Laisser reposer le mélange dans un bain-marie à 47 °C pendant 1 h.
  2. Avant de mélanger avec les cellules, passer la solution de GelMA à travers un filtre de 0,22 μm (voir le tableau des matériaux) pour la stérilisation.
  3. Remettre en suspension la pastille cellulaire mentionnée ci-dessus (étape 3.3) dans un milieu de culture cellulaire. Colorez un petit volume de cellules avec une solution de bleu de trypan à 0,4 %, puis utilisez un hémocytomètre propre pour le comptage des cellules.
  4. Mélangez une quantité appropriée de cellules C3A, calculée sur la base de la densité cellulaire obtenue ci-dessus, avec la solution stérilisée de GelMA pour préparer la bio-encre avec une densité cellulaire de 2 × 106 cellules/mL.
  5. Pour visualiser les sphéroïdes cellulaires assemblés, pré-colorer les cellules C3A en les incubant avec un tracker cellulaire de 2 μM (colorant DiO, voir tableau des matériaux) à 37 °C pendant 20 min. Par la suite, lavez les cellules marquées avec un milieu de culture cellulaire frais trois fois avant utilisation.

5. Assemblage des sphéroïdes cellulaires à l’aide du dispositif acoustique

  1. Pipeter plus de 1 mL de bio-encre dans la chambre stérilisée. Assurez-vous que la distance face à face entre la surface du liquide et le fond de la chambre est un multiple entier de la moitié de la longueur d’onde acoustique.
    REMARQUE : On peut contrôler cette distance en ajustant le volume de bioencre ajoutée. La longueur d’onde acoustique (λ) peut être estimée à l’aide de la formule λ = c/f, où c représente la vitesse du son dans le milieu et f est la fréquence du transducteur PZT.
  2. Allumez le générateur de fonction et l’amplificateur de puissance pour lancer l’actionnement de chaque transducteur PZT.
    REMARQUE : Il est recommandé d’actionner d’abord individuellement chaque transducteur PZT pour obtenir le modèle cellulaire de ligne parallèle optimal. Ceci peut être réalisé en effectuant un balayage de fréquence avec une taille de pas de 0,001 MHz près de la fréquence de résonance primaire pour chaque transducteur PZT. Ensuite, appliquez simultanément ces signaux optimaux aux trois transducteurs PZT pour obtenir le motif cellulaire 3D attendu. Avant d’appliquer chaque signal d’entrée, assurez-vous que les cellules sont uniformément dispersées dans la bio-encre en agitant doucement.
  3. Réticulation de la bio-encre à l’aide de la lumière bleue (405 nm, 60 mW/cm2, 30 s) pour créer un échafaudage d’hydrogel 3D qui encapsule les agrégats cellulaires assemblés acoustiquement. Ensuite, éteignez le générateur de fonctions et l’amplificateur de puissance.
  4. Transférez soigneusement l’échafaudage en hydrogel 3D de la chambre dans une boîte de Pétri et coupez-le en petits morceaux (par exemple, 2 mm × 2 mm × 2 mm) à l’aide d’un rasoir propre.
  5. Ajouter un milieu de culture cellulaire pour la culture.
    REMARQUE : N’oubliez pas de changer le milieu de culture tous les jours.

6. Récupération des sphéroïdes cellulaires

  1. Commencez par observer la formation de sphéroïdes à différentes couches des échafaudages à l’aide d’un microscope inversé.
  2. Après 3 jours de culture, retirez le milieu de culture et lavez soigneusement les échafaudages en hydrogel deux fois avec du PBS.
  3. Incuber les échafaudages avec plus de 2 mL de tampon de lyse GelMA à une dilution de 1 :200 avec un milieu de culture cellulaire pendant 30 min dans un incubateur cellulaire. Cette étape vise à dissoudre les échafaudages en hydrogel.
  4. Transvaser la solution de l’étape précédente dans un tube puis la centrifuger à 200 × g pendant 5 min à température ambiante pour obtenir la pastille sphéroïde cellulaire.
  5. Jeter le surnageant et remettre la pastille en suspension dans un milieu de culture frais pour les applications en aval.

7. Analyse de la viabilité des sphéroïdes

  1. Évaluer la viabilité des sphéroïdes cellulaires soit dans les échafaudages d’hydrogel, soit dans les sphéroïdes récupérés à l’aide d’une trousse de coloration vivante ou morte (voir le tableau des matériaux).
  2. Incuber les échantillons à différents moments de culture avec 1 mL de solution de PBS contenant 1 μL de calcéine-AM et 2 μL d’iodure de propidium (PI) pendant 15 min à 37 °C.
  3. Pour les échantillons à l’intérieur des échafaudages en hydrogel, lavez-les directement avec du PBS deux fois. Pour les sphéroïdes prélevés, centrifuger à 200 × g pendant 5 min à température ambiante pour obtenir une pastille sphéroïde, et la laver deux fois avant l’observation.
  4. Observez les échantillons à l’aide d’un microscope à fluorescence et capturez les images de fluorescence.
  5. Calculez le rapport entre la surface colorée avec Calcein-AM et la surface totale colorée avec Calcein-AM et PI à l’aide d’ImageJ pour déterminer la viabilité du sphéroïde.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cette étude a permis de concevoir un dispositif d’assemblage acoustique 3D pour la fabrication en série de sphéroïdes cellulaires. Le dispositif acoustique se composait d’une chambre carrée avec deux transducteurs PZT fixés au plan X et au plan Y sur la surface extérieure de la chambre et un transducteur PZT au fond de la chambre (Figure 1A,B). Trois canaux de sortie de deux générateurs de fonctions ont été connectés à trois amplificateurs de puissance pour générer trois sig...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La fabrication efficace et stable de sphéroïdes cellulaires à haut débit à l’aide de technologies telles que le dispositif d’assemblage acoustique 3D est très prometteuse pour faire progresser l’ingénierie biomédicale et le criblage de médicaments 1,2,3. Cette approche simplifie la production de masse de sphéroïdes cellulaires grâce à des procédures simples.

Cependant, il y a des facteurs critiques à ...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ces travaux ont été soutenus par le Programme national clé de recherche et de développement de la Chine (2022YFA1104600) et la Fondation provinciale des sciences naturelles du Zhejiang de Chine (LQ23H160011).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0,22-&mu ; m filterMerckSLGSM33SSUtilisé pour la stérilisation en solution GelMA
Boîte de culture cellulaire de 35 mmCorning430165Utilisé pour la culture de cellules
Microscope confocalNikonA1RHD25Observation cellulaire fluorescente
Colorant DiOBeyotimeC1038Colorant utilisé pour colorer les cellules
DMEMGibco12430054Milieux de culture cellulaire
FBSGibco10099141CComplément de milieux de culture cellulaire
Générateur de fonctionsRigolDG5352Pour la génération de signaux RF
GelMARegenovononeUtilisé pour préparer la bioencre
Tampon de lyse GelMAEFLEFL-GM-LS-001Utilisé pour dissoudre les échafaudages
GelMA Microscope inverséNikonTi-UObservation cellulaire
LAPSigma-Aldrich900889Utilisé comme photoinitiateur
Live-Dead kitBeyotimeC2015MAnalyse de la vabilité cellulaire
PBSGibco10010002Utilisé comme tampon
Pénicilline-streptomycineGibco15070063Prévenir la contamination des cultures
cellulaires Amplificateur de puissanceMinicircuitLCY-22+Augmenter le amplitude de tension du signal RF
transducteurs PZTYantai Xingzhiwen Trading Co., Ltd.PZT-41Unités fonctionnelles pour dispositif d’assemblage acoustique
Fiole de culture cellulaire T25Corning430639Utilisé pour la culture de cellules
Trypan blue  ;Gibco15250061Comptage cellulaire
Trypsine-EDTA  ;Gibco25200056Enzyme de dissociation cellulaire

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).
  2. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125(2014).
  3. Habanjar, O., Diab-Assaf, M., Caldefie-Chezet, F., Delort, L. 3D cell culture systems: tumor application, advantages, and disadvantages. International Journal of Molecular Sciences. 22 (22), 12200(2021).
  4. Decarli, M. C., et al. Cell spheroids as a versatile research platform: formation mechanisms, high throughput production, characterization and applications. Biofabrication. 13 (3), 032002(2021).
  5. Lee, Y. B., et al. Engineering spheroids potentiating cell-cell and cell-ECM interactions by self-assembly of stem cell microlayer. Biomaterials. 165, 105-120 (2018).
  6. Zhuang, P., Chiang, Y. H., Fernanda, M. S., He, M. Using spheroids as building blocks towards 3d bioprinting of tumor microenvironment. International Journal of Bioprinting. 7 (4), 444(2021).
  7. Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. Journal of Visualized Experiments. 51, e2720(2011).
  8. Laschke, M. W., Menger, M. D. Life is 3D: boosting spheroid function for tissue engineering. Trends in Biotechnology. 35 (2), 133-144 (2017).
  9. Fu, W., et al. Combinatorial drug screening based on massive 3d tumor cultures using micropatterned array chips. Analytical Chemistry. 95 (4), 2504-2512 (2023).
  10. Kang, S. M., Kim, D., Lee, J. H., Takayama, S., Park, J. Y. Engineered microsystems for spheroid and organoid studies. Advanced Healthcare Materials. 10 (2), 2001284(2021).
  11. Kim, S. J., Kim, E. M., Yamamoto, M., Park, H., Shin, H. Engineering multi-cellular spheroids for tissue engineering and regenerative medicine. Advanced Healthcare Materials. 9 (23), 2000608(2020).
  12. Yang, Y., et al. 3D acoustic manipulation of living cells and organisms based On 2D array. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 69 (7), 2342-2352 (2022).
  13. Armstrong, J. P. K., et al. Engineering anisotropic muscle tissue using acoustic cell patterning. Advanced Materials. 30 (43), 1802649(2018).
  14. Drinkwater, B. W. A perspective on acoustical tweezers-devices, forces, and biomedical applications. Applied Physics Letters. 117 (18), 180501(2020).
  15. Bouyer, C., et al. A Bio-Acoustic Levitational (BAL) assembly method for engineering of multilayered, 3d brain-like constructs, using human embryonic stem cell derived neuro-progenitors. Advanced Materials. 28 (1), 161-167 (2016).
  16. Chansoria, P., Narayanan, L. K., Schuchard, K., Shirwaiker, R. Ultrasound-assisted biofabrication and bioprinting of preferentially aligned three-dimensional cellular constructs. Biofabrication. 11 (3), 035015(2019).
  17. Wu, Y., et al. Acoustic assembly of cell spheroids in disposable capillaries. Nanotechnology. 29 (50), 504006(2018).
  18. Hu, X., et al. On-chip hydrogel arrays individually encapsulating acoustic formed multicellular aggregates for high throughput drug testing. Lab on a Chip. 20 (12), 2228-2236 (2020).
  19. Wu, Z., et al. The acoustofluidic focusing and separation of rare tumor cells using transparent lithium niobate transducers. Lab on a Chip. 19 (23), 3922-3930 (2019).
  20. Chen, B., et al. High-throughput acoustofluidic fabrication of tumor spheroids. Lab on a Chip. 19 (10), 1755-1763 (2019).
  21. Sriphutkiat, Y., Kasetsirikul, S., Zhou, Y. Formation of cell spheroids using Standing Surface Acoustic Wave (SSAW). International Journal of Bioprinting. 4 (1), 130(2018).
  22. Guex, A. G., Di Marzio, N., Eglin, D., Alini, M., Serra, T. The waves that make the pattern: a review on acoustic manipulation in biomedical research. Materials Today Bio. 10, 100110(2021).
  23. Harley, W. S., et al. Advances in biofabrication techniques towards functional bioprinted heterogeneous engineered tissues: A comprehensive review. Bioprinting. 23, 00147(2021).
  24. Yang, Y., Dejous, C., Hallil, H. Trends and applications of surface and bulk acoustic wave devices: a review. Micromachines (Basel). 14 (1), 43(2022).
  25. Ma, Z., et al. Acoustic holographic cell patterning in a biocompatible hydrogel). Advanced Materials. 32 (4), 1904181(2020).
  26. Miao, T. K., et al. High-throughput fabrication of cell spheroids with 3D acoustic assembly devices. International Journal of Bioprinting. 9 (4), 733(2023).
  27. Jeger-Madiot, N., et al. Self-organization and culture of Mesenchymal Stem Cell spheroids in acoustic levitation. Scientific Reports. 11 (1), 8355(2021).
  28. Cai, H., et al. Acoustofluidic assembly of 3D neurospheroids to model Alzheimer's disease. Analyst. 145 (19), 6243-6253 (2020).
  29. Mei, J., Zhang, N., Friend, J. Fabrication of surface acoustic wave devices on lithium niobate. Jove-Journal of Visualized Experiments. (160), e61013(2020).
  30. Niculescu, A. G., Chircov, C., Bîrcă, A. C., Grumezescu, A. M. Fabrication and applications of microfluidic devices: a review. International Journal of Molecular Sciences. 22 (4), 2011(2011).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Demander l’autorisation de réutiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demander une autorisation

Mots-clés

Culture cellulaire 3Dfabrication de sph ro dessupport GelMAtransducteurs PZTpr paration de bio encremicroscopie fluorescenceagr gats cellulairessph ro des haut d bit

Articles connexes