Article de méthode

Une méthode simple, rapide et efficace pour l’analyse de la xénotransplantation tumorale dans les embryons de poisson-zèbre transparent

2.2K vues

⸱

DOI :

10.3791/66164

⸱

12 juillet 2024

 ,  ,  , 
1Nuclear Dynamics and Cancer Program, Fox Chase Cancer Center

Dans cet article

Résumé

Nous décrivons un protocole de xénotransplantation dans le jaune d’embryons de poisson-zèbre transparent qui est optimisé par une méthode de stadification simple et rapide. Les analyses post-injection comprennent la survie et l’évaluation de la charge de morbidité des cellules xénotransplantées par cytométrie en flux.

Résumé

Les études in vivo du comportement tumoral sont un élément essentiel de la recherche sur le cancer ; Cependant, l’utilisation de souris présente des défis importants en termes de coût et de temps. Ici, nous présentons les larves de poisson-zèbre comme un modèle de transplantation qui présente de nombreux avantages par rapport aux modèles murins, notamment la facilité de manipulation, le faible coût et la courte durée d’expérience. De plus, l’absence d’un système immunitaire adaptatif pendant les stades larvaires rend inutile la production et l’utilisation de souches immunodéficientes. Bien qu’il existe des protocoles établis pour la xénotransplantation chez les embryons de poisson-zèbre, nous présentons ici une méthode améliorée impliquant la stadification des embryons pour un transfert plus rapide, l’analyse de la survie et l’utilisation de la cytométrie en flux pour évaluer le fardeau de la maladie. Les embryons sont stagénés pour faciliter l’injection rapide de cellules dans le jaune des larves et le marquage cellulaire pour surveiller la consistance du bolus cellulaire injecté. Après l’injection, l’analyse de la survie embryonnaire est évaluée jusqu’à 7 jours après l’injection (dpi). Enfin, la charge de morbidité est également évaluée par le marquage des cellules transférées avec une protéine fluorescente et l’analyse par cytométrie en flux. La cytométrie en flux est rendue possible par une méthode standardisée de préparation de suspensions cellulaires à partir d’embryons de poisson-zèbre, qui pourrait également être utilisée pour établir la culture primaire de cellules de poisson-zèbre. En résumé, la procédure décrite ici permet une évaluation plus rapide du comportement des cellules tumorales in vivo avec un plus grand nombre d’animaux par bras d’étude et de manière plus rentable.

Introduction

L’analyse du comportement des tumeurs en réponse à une altération génétique ou à un traitement médicamenteux in vivo est un élément essentiel de la recherche sur le cancer 1,2,3,4. De telles études impliquent le plus souvent l’utilisation de modèles de souris immunodéprimées (Mus musculus)5 ; Cependant, les études de xénotransplantation chez la souris sont limitées à bien des égards, notamment en raison de leur capacité limitée, de leur durée prolongée, de leurs dépenses importantes et de la nécessité d’un équipement d’imagerie sophistiqué pour surveiller la progression des tumeurs internes 6,7. En revanche, le modèle du poisson-zèbre (Danio rerio) permet une plus grande capacité, une durée plus courte, des dépenses moindres et, en raison de sa transparence, un suivi simple de la progression de la maladie 8,9.

Le poisson-zèbre est un système modèle de vertébré bien développé avec un développement ex-utero et une fécondité élevée, avec des femelles individuelles produisant plus de 100 embryons10. De plus, les embryons de poisson-zèbre sont transparents, ce qui permet de visualiser facilement les processus de développement à l’aide de techniques liées à la fluorescence telles que les rapporteurs. Enfin, la conservation des processus de développement critiques en fait un modèle idéal pour de nombreux types d’études, y compris le comportement des cellules malignes transplantées11,12. Les embryons de poisson-zèbre de type sauvage développent des mélanocytes, ce qui les rend optiquement opaques à l’âge de 2 semaines, mais cela a été surmonté par la génération d’embryons de casper (roya9 ; mitfaw2), qui restent transparents tout au long de leur vie13. En raison de leurs propriétés optiques, les poissons-zèbres casper sont des receveurs idéaux de cellules tumorales transplantées 14,15,16. La xénotransplantation de cellules tumorales chez le poisson-zèbre a gagné en importance au cours des 2 dernières décennies 17,18,19,20,21. Les embryons de poisson-zèbre ont une immunité innée ; Cependant, ils n’ont pas d’immunité adaptative au cours de leur stade larvaire, ce qui les rend fonctionnellement immunodéprimés, ce qui leur permet de servir d’hôtes efficaces pour les xénogreffes tumorales transplantées22.

Des protocoles ont été développés pour la greffe tumorale chez les embryons de poisson-zèbre ainsi que chez les adultes qui ont pris en compte un certain nombre de variables différentes 23,24,25,26,27. Ceux-ci ont exploré de nombreux sites de dépôt tumoral chez le poisson zèbre, y compris des injections dans le vitellus, l’espace périvitellin et le cœur et à différents stades de développement16,28. La température ambiante de l’aquaculture pour les xénogreffes de poisson-zèbre est également importante, car l’élevage du poisson-zèbre se produit généralement à 28 °C, tandis que les cellules de mammifères se développent à 37 °C. Par conséquent, il faut utiliser une température de compromis qui soit tolérée par le poisson tout en favorisant la croissance tumorale, et 34 °C semble atteindre les deux objectifs29. L’analyse du comportement et de la progression des tumeurs après une xénotransplantation est un autre domaine d’intérêt majeur, et cela implique l’utilisation d’une variété de modalités d’imagerie ainsi que l’analyse de survie30. L’un des principaux avantages du modèle du poisson-zèbre est la disponibilité d’un grand nombre d’animaux à l’étude pour fournir une immense puissance statistique aux études in vivo du comportement tumoral ; Cependant, les approches précédentes ont considérablement limité ce potentiel en raison de l’exigence de procédures de montage fastidieuses pour les injections.

Ici, nous remédions à cette limitation en développant une méthode simple et rapide pour stadifier les embryons qui permet un débit élevé et un suivi de la qualité de l’injection à l’aide de la lignée transparente de poisson-zèbre casper . Cela implique l’injection de xénogreffes dans le sac vitellin des embryons de poisson-zèbre casper 2 jours après la fécondation (dpf). Nous observons la survie des embryons après une xénotransplantation dans le cadre de l’analyse du comportement tumoral. Nous montrons en outre l’évaluation de la charge de morbidité après une xénotransplantation en faisant des suspensions de cellules uniques et en analysant par cytométrie en flux (Figure 1).

Protocole

L’entretien, l’alimentation et l’élevage du poisson-zèbre ont eu lieu dans des conditions d’aquaculture standard à 28,5 °C, comme décrit31. Toutes les expériences liées au poisson-zèbre ont été réalisées à cette température ; cependant, à la suite d’une xénotransplantation, les animaux ont été élevés à 34 °C pendant toute la durée de l’expérience, conformément aux procédures approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

1. Reproduction (3 jours avant l’injection)

  1. Fournir des aliments secs (aliments supplémentaires ; 5 à 6 granulés par poisson) aux couples de poissons une semaine avant la reproduction afin de maximiser la santé des animaux et d’augmenter le nombre d’embryons produits par les couples reproducteurs.
  2. La veille de la récolte des embryons, installez les animaux reproducteurs dans des bassins d’élevage avec une séparatrice séparant les poissons mâles et femelles, en utilisant des accouplements de harem de 2 femelles pour chaque mâle.
    REMARQUE : Pour les expériences avec 4 bras de 100 animaux par bras, employez 20 couples reproducteurs par expérience. Pour déterminer le nombre de couples reproducteurs nécessaires, une bonne estimation est de 50 embryons par couple reproducteur de casper . Une autre option consiste à utiliser une souche de poisson-zèbre plus robuste et pigmentée et à la traiter avec de la 1-phényl-2-thiourée (PTU) pour prévenir la pigmentation31. En pratique, l’expérience doit être mise à l’échelle de manière à ce que l’on ait suffisamment d’embryons pour en injecter le double du nombre souhaité 1 jour après l’injection (dpi).

2. Prélèvement d’embryons (2 jours avant l’injection)

  1. Le lendemain matin, retirez les séparateurs, permettant aux poissons de se reproduire.
  2. Visualisez les embryons dans les bacs 20 minutes (min) après avoir retiré les séparateurs.
  3. Prélevez les embryons à l’aide d’un tamis dans une boîte de Pétri de 90 mm contenant de l’eau pour embryons fabriquée comme décrit dans le livre31 du poisson zèbre.
    1. Pour faire de l’eau d’embryon, ajoutez 1,5 mL de sels de bouillon à 1 L d’eau distillée et du bleu de méthylène à 0,1 % final. Préparez la solution mère en dissolvant 40 g de sels marins (Table des matériaux) dans 1 L d’eau distillée. La composition ionique de l’eau de l’embryon est K+ (0,68 mg/L), Cl− (31,86 mg/L), Na+ (17,77 mg/L), SO4− (4,47 mg/L), Mg2+ (2,14 mg/L) et Ca2+ (0,68 mg/L).
  4. Laissez le poisson-zèbre se reproduire pendant une heure supplémentaire et collectez les embryons résultants.
  5. Mettez les embryons en commun pour l’expérience.
  6. Le soir, retirez tous les embryons non fécondés ou morts, reconnaissables à leur morphologie anormale, et fournissez de l’eau fraîche aux embryons.

3. Maintenance de l’embryon et préparation de l’outil pour les injections (1 jour avant l’injection)

  1. Le lendemain matin, retirez tous les embryons morts supplémentaires et fournissez de l’eau fraîche pour les embryons.
  2. Préparez une plaque d’agarose en chauffant 1,5 % d’agarose dans de l’eau d’embryon et versez le mélange chauffé dans une plaque de Pétri de 90 mm. Une parabole de 90 mm nécessite 30 à 35 ml du mélange.
  3. Tirez les aiguilles non filamenteuses des capillaires en verre (borosilicate) à l’aide de l’extracteur d’aiguille. Les aiguilles sont tirées (sous pression thermique) produisant une extrémité fermée ; Clipsez-les avec une pince pour générer un orifice optimal. Évaluer l’adéquation de l’orifice de l’aiguille en déterminant le volume de liquide déplacé par unité de temps (voir ci-dessous, section 6.3).
    REMARQUE : Les capillaires en verre peuvent être achetés avec ou sans filaments centraux. Les capillaires dépourvus de filaments centraux sont privilégiés pour les injections cellulaires.
  4. Placez les aiguilles dans une plaque de Petri de 90 mm recouverte dans les rainures faites avec de l’argile (pâte à modeler pour enfants) jusqu’à utilisation (Figure 2A).

4. Préparation et marquage des cellules leucémiques avec CM-Dil (jour de l’injection)

  1. Maintenir les cellules à transplanter dans des conditions optimales pour leur croissance. Les cellules leucémiques murines utilisées ici étaient soit suffisantes (M82 ; Rpl22+/+) ou déficients (M109 ; Rpl22-/-) pour la protéine ribosomique Rpl22, qui fonctionne comme un suppresseur de tumeur32.
  2. Piles à granulés dans un tube conique de 50 ml. Compter, puis centrifuger à 300 x g à température ambiante (RT) pendant 5 min. Jetez le surnageant.
    REMARQUE : Le nombre de cellules nécessaires sera dicté par la portée et les conditions de l’expérience, mais 1 x 106 cellules est un bon point de départ.
  3. Effectuer la coloration CM-Dil
    REMARQUE : La coloration CM-Dil permet de surveiller le bolus d’injection.
    1. Préparez une solution mère de CM-Dil en remettant en suspension un flacon de 50 μg de CM-Dil dans 50 μL de diméthylsulfoxyde (DMSO ; 1 mg/mL ou ~1 mM final).
    2. Produire une solution efficace en diluant le stock (4,8 μL de colorant/mL) dans du sérum de veau fœtal à 1 % (FBS)/une solution saline équilibrée de Hank (HBSS) contenant tous les suppléments de soutien nécessaires aux cellules à utiliser.
  4. Remettre en suspension les cellules à 1 x 106/100 μL dans la solution de travail du colorant.
  5. Incuber à 37 °C pendant 10 min.
    REMARQUE : Les conditions de coloration doivent être optimisées pour les cellules utilisées (temps, etc.). Les cellules utilisées ici ont nécessité deux incubations distinctes de 10 minutes à des températures différentes pour obtenir une coloration optimale.
  6. Laver avec 10 ml de 1x HBSS à température ambiante (RT).
  7. Les cellules à granulés (centrifugation à 300 x g pendant 5 min à RT), décantent le surnageant, puis remettent en suspension avec 10 mL de HBSS et répétent la même chose pour un deuxième lavage.
  8. Remettre en suspension les cellules tumorales colorées à 40 000 cellules/μL dans 1% FBS/PBS et tout supplément de soutien nécessaire et maintenir la suspension cellulaire à 34 °C jusqu’à l’injection.
    REMARQUE : Des suppléments de soutien ont été nécessaires pour l’entretien des lignées cellulaires utilisées dans cette étude (p. ex., 1 % de FBS et de cytokines). Il peut être nécessaire d’adapter les suppléments et la xénotransplantation aux lignées cellulaires particulières à l’étude. Le PBS a été choisi ici au lieu du milieu pour éviter toute toxicité potentielle dans le vitellus.

5. Déchorionnation

  1. Déchorionnez manuellement les embryons de poisson-zèbre casper à 2 dpf à l’aide de seringues d’injection d’insuline sous grossissement 2x dans un microscope optique. Percez le chorion avec une aiguille tout en utilisant l’autre aiguille pour immobiliser le chorion.
    REMARQUE : L’utilisation de la pronase pour la déchorionation n’est pas recommandée car elle entraîne parfois une réduction de la santé de l’embryon. La déchorionation des embryons à 2 dpf est préférée car elle est plus facile et les embryons sont moins fragiles qu’aux époques précédentes (1 dpf).
  2. Lors de la déchorionnation, veillez à ne pas toucher les embryons avec les aiguilles. Toucher ou endommager le jaune d’embryon par contact accidentel avec les aiguilles peut entraîner la mort.
  3. Retirez les chorions dénudés en changeant l’eau de l’embryon.

6. Mise en place du micro-injecteur et de l’aiguille

  1. Mettez le micro-injecteur et la pompe en marche et mettez en place les conditions appropriées pour les micro-injections de cellules. Une pression d’injection de 9-11 psi et un temps d’injection de 0,5 seconde(s) sont un bon point de départ pour couper l’aiguille et régler l’orifice.
  2. Chargez soigneusement la suspension de la lignée cellulaire tumorale (~5 μL) dans la micro-aiguille en un seul passage, en évitant la formation de bulles d’air, qui perturberont le flux cellulaire à l’intérieur de l’aiguille.
  3. Coupez l’extrémité de l’aiguille à l’aide d’une pince (numéro de Dumont 5) pour produire un orifice qui supportera l’éjection de 10 à 15 nanolitres (nL) de suspension cellulaire par 0,2 à 0,3 s.
    REMARQUE : Le calcul ci-dessus du volume nL est effectué à l’aide de capillaires d’étalonnage, où 1 mm = 30 nL. En bref, réglez le temps sur 0,5 s, et après chaque clip de l’aiguille, appuyez sur injecter et récupérez le volume dans le capillaire d’étalonnage. Ensuite, la longueur du volume collecté est mesurée à l’aide de l’échelle au microscope, et l’écrêtage de l’aiguille est arrêté lorsque 30 nL sont injectés en 0,5 s. Ensuite, réglez le temps d’injection à 0,2-0,3 s. (injection de ~10-15 nL de cellules)

7. Préparation de l’embryon pour l’injection

  1. Sélectionnez les embryons sains au microscope, en éliminant ceux qui présentent des anomalies de développement telles qu’un œdème cardiaque ou un tronc court ou courbé.
  2. Anesthésier les embryons à l’aide de méthanesulfonate de tricaïne (MS-222 ; 0,16 g/L d’eau embryonnaire) pendant 1 min dans une plaque de Pétri de 90 mm.
  3. À l’aide d’une pipette Pasteur en verre, prélevez les embryons. Disposez 10 à 15 embryons en position latérale sur la plaque d’agarose à 1,5 % (figure 2B-D).
  4. Retirez l’excès d’eau à l’aide de la pipette Pasteur, en laissant la quantité minimale d’eau embryonnaire nécessaire pour maintenir les embryons en vie.

8. Procédure d’injection

  1. Vérifiez au microscope optique que les cellules se sont accumulées à l’extrémité de l’aiguille.
  2. Injectez les embryons à l’aide de l’aiguille calibrée pendant 0,2-0,3 s (avec 10-15 nL correspondant à 400-600 cellules) dans le jaune des embryons.
  3. Répétez l’injection pour tous les embryons, puis recueillez-les dans de l’eau fraîche pour l’embryon.
    REMARQUE : Étant donné que les cellules ont tendance à s’accumuler sur la pointe de l’aiguille, la pointe devra être légèrement recoupée toutes les 15 à 20 injections. Cela nécessitera également de réinitialiser la pression et le temps à chaque reclipsage pour s’assurer qu’un volume similaire est injecté.
  4. Pour vous assurer que la comparaison du comportement de deux ensembles distincts de cellules transférées est valide, surveillez le bolus de cellules transférées. Pour ce faire, triez les embryons en fonction de la coloration CM-Dil (dans le canal RFP) 1 heure après l’injection (hpi), en séparant ceux avec une coloration optimale (« bon bolus ») de ceux avec une coloration inférieure (« bolus inférieur » ; Figure 3, flèche jaune).
  5. Jetez les embryons avec un bolus inférieur ou utilisez-les pour évaluer l’impact d’une dose cellulaire différente sur la progression de la maladie.
  6. Retirez tous les embryons morts à la fin de la journée, car leur mort est liée à un traumatisme par injection plutôt qu’à la croissance tumorale. Retirer de l’analyse les embryons qui ne conservent pas de cellules, car les cellules se sont probablement échappées du site d’injection.
  7. Maintenir les embryons injectés à 34 °C pendant toute la durée de l’expérience dans une boîte de 90 mm avec ~60 embryons par plaque.
    REMARQUE : Après 5 dpf, le jaune aura été consommé par les embryons en croissance, de sorte que les embryons doivent recevoir de la nourriture à base de paramécie pendant la durée de l’expérience. Pour assurer une bonne nutrition, la paramécie doit être administrée quotidiennement aux embryons de 6 dpf (4 dpi) à 9 dpf (7 dpi). Les paramécies se multiplient par culture en flacons dans des conditions optimales de nutrition et de température, comme décrit31.

9. Analyse de survie

  1. Surveillez les embryons pour les 7 dpi suivants, en changeant l’eau de l’embryon tous les jours. Les changements d’eau peuvent être réduits à un jour sur deux pour des raisons de commodité si l’étude implique un traitement médicamenteux.
  2. Vérifiez la santé de l’embryon et notez la mort pendant la durée de l’analyse.
    REMARQUE : La durée de l’expérience était de 7 jours pour cette expérience, mais peut être plus courte ou plus longue en fonction de l’agressivité de la tumeur xénotransplantée.
  3. Utilisez la fluorescence CM-Dil pour évaluer la charge de morbidité (Figure 4A) et déterminer l’impact des altérations génétiques ou des traitements médicamenteux sur la survie à l’aide de l’analyse de Kaplan Meier et représentez graphiquement (par exemple, avec GraphPad Prism ; Graphique 4B) N° 33.

10. Suspension unicellulaire d’embryons pour l’analyse par cytométrie en flux

REMARQUE : La charge de morbidité peut être évaluée par analyse par cytométrie en flux après une xénotransplantation ; Cependant, cela nécessite un marquage indélébile des cellules tumorales. La protéine fluorescente rouge (RFP) délivrée rétroviralement ou lentiviralement ou mCherry est efficace car elle fournit un bon signal sur l’autofluorescence des cellules de poisson-zèbre, ce qui obscurcit le signal de la protéine fluorescente verte.

  1. Isolez les embryons au stade dpi de votre choix. 5 ppp s’affiche ici (Figure 5).
  2. Rassemblez 30 à 40 embryons par condition comme point de départ, mais le nombre d’embryons peut différer en fonction du stade et de l’agressivité des cellules transplantées. Anesthésier les embryons comme décrit ci-dessus.
    REMARQUE : Les embryons peuvent être subdivisés en répétitions pour fournir une signification statistique, comme le montre ici (figure 5B).
  3. Transférez les embryons dans des tubes à centrifuger de 1,5 ml.
  4. Utilisez 100 μL de solution de Ringer sans calcium (recette31) par échantillon pour dissoudre le jaune, car un faible taux de calcium ramollit les tissus embryonnaires, ce qui permet une dissociation plus efficace des tissus.
  5. Pipeter de haut en bas par intermittence pendant 5 min pour retirer le jaune à l’aide d’une pointe de pipette de 200 μL.
  6. Préchauffer la trypsine/PBS à 0,05 % (sans indicateur rouge de phénol) à 29 °C et la compléter avec 27 μL de collagénase IV (100 mg/mL) par mL de solution de trypsine. Un volume de 1 mL de solution sera nécessaire pour chaque échantillon d’embryons.
  7. Ajouter 1 mL de la solution de trypsine/collagénase à chaque échantillon d’embryons déjaunelus et incuber à 29 °C pendant 30 à 35 min.
  8. Pipetez les embryons de haut en bas dans cette solution à l’aide d’une pointe de pipette de 1 mL toutes les 5 minutes jusqu’à ce que la structure des embryons (colonne vertébrale) ne soit plus visible.
  9. Arrêtez la réaction à l’aide de 200 μL de FBS.
  10. Bien mélanger et incuber à 29 °C pendant 5 minutes supplémentaires pour assurer l’inactivation complète de la trypsine.
    REMARQUE : Une température de 29 °C est utilisée pour le protocole de dissociation des tissus afin de prévenir la mort des cellules de poisson-zèbre induite par le choc thermique, qui se produit à 37 °C ; cependant, si la conservation des cellules de poisson-zèbre n’est pas nécessaire, la digestion peut être effectuée à 37 °C.
  11. Granuler la suspension cellulaire à 300 x g pendant 5 min à 4 °C et jeter le surnageant.
  12. Remettre en suspension la pastille de cellule dans 4 °C PBS et la pastille comme ci-dessus.
  13. Répétez le lavage, puis filtrez les cellules à travers une passoire à cellules de 70 μm.
  14. Granulez et procédez à la coloration pour l’analyse par cytométrie en flux.
    REMARQUE : Si la culture de cellules primaires de poisson-zèbre est nécessaire, laver deux fois de plus avec du PBS à 4 °C et remettre en suspension dans un milieu L15 (avec des antibiotiques et 10 % de FBS).

11. Tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) : coloration et tri des cellules xénotransplantées

  1. Remettre en suspension la suspension cellulaire dans un milieu de coloration (HBSS avec 1% de FBS) et granuler à 300 x g pendant 5 min.
  2. Remettre en suspension la pastille cellulaire dans le milieu de coloration avec un anticorps réactif avec les cellules transplantées pour fournir un deuxième marqueur (en plus de RFP ou mCherry) permettant de distinguer les cellules transplantées des cellules de poisson-zèbre. Ici, 50 μL de CD45 anti-souris (APC-CD45) par échantillon ont été utilisés à une dilution de 1:50 (figure 5).
  3. Incuber pendant 20 min à 4 °C avant de laver comme ci-dessus avec 1 mL de produit de coloration pour éliminer l’anticorps non lié.
  4. Après avoir jeté le surnageant, remettre la pastille cellulaire en suspension dans 200 μL de milieu de coloration contenant le colorant vital Helix NP Blue (1 μM), qui permettra de distinguer les vivants et les morts.
  5. Transférez le mélange de cellules dans des tubes en polycarbonate à fond rond de 5 mL pour l’analyse par cytométrie en flux.
    REMARQUE : La coloration d’un contrôle de cellule tumorale en parallèle permet de dégager des portes lors de l’analyse par cytométrie en flux.

12. Cytométrie en flux

  1. Allumez le cytomètre en flux disponible à l’aide d’un faible débit (500 événements par seconde ou moins) pour définir les paramètres.
  2. Utilisez le contrôle des cellules tumorales (les mêmes cellules que celles utilisées pour la xénotransplantation) pour régler la tension des canaux FSC (diffusion directe), SSC (diffusion latérale), BV421/CasB (viabilité), CE-594 (mCherry) et APC (CD45.2).
    REMARQUE : Des échantillons colorés individuellement seront nécessaires pour établir les paramètres de compensation qui éliminent le chevauchement du fluorochrome entre les colorants distincts.
  3. Utilisez l’échantillon d’embryon non injecté pour établir des paramètres qui accueillent à la fois les cellules transplantées et les cellules de poisson-zèbre.
  4. Augmentez le débit à 8000 événements par seconde et enregistrez 1 million d’événements pour chaque échantillon.
  5. Analysez les données résultantes à l’aide d’un logiciel d’analyse approprié, en sélectionnant d’abord les singlets en traçant FSC-H en fonction de FSC-A (hauteur en fonction de la surface), puis en sélectionnant des cellules viables. Le logiciel FlowJo est largement utilisé pour de telles analyses.
  6. À l’aide du contrôle des cellules tumorales, tracez une porte autour des cellules transplantées par FSC-A v/s SSC-A, puis utilisez les colorants indicateurs, dans ce cas, CD45 et mCherry (Figure 5B).
    REMARQUE : La porte de taille sélectionnée pour la tumeur contiendra également des cellules de poisson-zèbre, ce qui constitue la base de la normalisation et de la détermination de la charge de morbidité.
  7. Analysez les échantillons d’embryons en utilisant les mêmes paramètres de porte que ci-dessus. Le graphique final de la coloration tumorale et de l’indicateur de protéine fluorescente fournira une mesure de la charge de morbidité (Figure 5C).
    REMARQUE : Ici, la différence de charge de morbidité a été tracée pour les embryons recevant un bon bolus de cellules injectées par rapport à ceux recevant un bolus inférieur.
  8. Si nécessaire, trier les cellules tumorales des embryons par cytométrie en flux pour une analyse moléculaire en aval.

Résultats

Xénotransplantation
La figure 1 présente une vue d’ensemble de l’ensemble de l’expérience et de l’analyse, allant de la production d’embryons à l’évaluation de la progression de la maladie par analyse de la survie et de la charge de morbidité par cytométrie en flux. Cette approche apporte plusieurs améliorations qui améliorent la reproductibilité et l’évolutivité de la xénotransplantation, ainsi qu’une nouvelle façon d’évaluer le fardeau de la maladie. Le succès de ces expériences dépend fortement de la santé des cellules transplantées, car les cellules qui ne sont pas saines et en phase logarithmique ne se propagent pas lors de la transplantation. La durée de la session d’injection est également un paramètre critique. Une fois les cellules tumorales préparées, il est essentiel de terminer l’injection dans le poisson-zèbre dans les 3-4 heures. L’approche utilisée dans cette étude permet d’injecter un plus grand nombre d’embryons pendant cette période grâce à la simple modification consistant à les stabiliser directement sur le côté sur une plaque d’agarose et à les injecter dans le jaune d’œuf (figure 2C, D). De plus, il est impératif que l’orifice optimal de l’aiguille soit sélectionné de manière à injecter suffisamment de cellules (400 à 600 cellules) mais que l’orifice ne soit pas trop grand pour ne pas endommager les embryons. Une autre considération est la pression d’injection. Nous constatons que des pressions supérieures à 12-13 psi perturbent le jaune des embryons, provoquant la mort. Enfin, une autre variabilité inhérente à cette procédure est la régularité de l’injection. Les cellules à injecter s’installent à l’extrémité de l’aiguille d’injection, ce qui rend difficile un contrôle précis dans le bolus d’injection. Lorsque les cellules sont xénotransplantées, tous les embryons ont le potentiel de recevoir le même bolus d’injection, mais en pratique, ce n’est pas le cas (Figure 3). Le nombre de cellules transférées peut varier considérablement en fonction du comportement des cellules tumorales (par exemple, l’agglutination) et du niveau de compétence de l’opérateur. Nous avons dissipé cette incertitude grâce à la coloration CM-Dil/marquage mCherry, qui permet la catégorisation post-injection des animaux qui ont reçu un bolus cellulaire approprié et cohérent, ainsi que ceux qui ont reçu un bolus inférieur. La coloration CM-Dil, mais plus efficace par une protéine fluorescente, présente l’avantage supplémentaire de faciliter le suivi de la progression de la maladie, soit par microscopie, soit par cytométrie en flux (Figure 4 et Figure 5).

Analyse du comportement tumoral
La progression tumorale peut facilement être surveillée à l’aide d’une simple microscopie à fluorescence axée sur la RFP (Figure 4A). De même, le suivi traditionnel de la survie peut être effectué par analyse de Kaplan-Meier (log-rank et test de Wilcoxon) (Figure 4B). De manière impressionnante, contrairement aux études de xénotransplantation sur des souris où il y a généralement 8 à 10 animaux par bras d’étude, en utilisant la méthode du poisson-zèbre décrite ici, il n’est pas difficile d’obtenir des bras d’étude avec plus de 60 animaux chacun (Figure 4B). Cela augmente considérablement le pouvoir de résolution des études in vivo . Enfin, nous avons mis en œuvre une autre approche pour l’analyse de la charge de morbidité à l’aide de la cytométrie en flux. Cela implique la perturbation d’un nombre équivalent d’embryons et l’analyse du contenu en cellules tumorales de la suspension unicellulaire résultante par cytométrie en flux. En combinant un marqueur de surface cellulaire spécifique à la tumeur avec l’indicateur de protéine fluorescente, les souris xénotransplantées/cellules humaines peuvent être identifiées en toute confiance par cytométrie en flux comme approche pour évaluer la charge de morbidité (Figure 5). À cette fin, les protéines fluorescentes rouges sont supérieures car les protéines fluorescentes vertes n’ont pas réussi à fournir un signal sur l’autofluorescence des cellules de poisson-zèbre hôte. Ici, mCherry a été utilisé pour le marquage et la surveillance cellulaires tout au long de la xénotransplantation pour l’analyse FACS avec CD45. Le double marquage nous a permis de mesurer les différences de charge tumorale entre une bonne inoculation en bolus et une inoculation en bolus inférieure (Figure 5B, C).

figure-results-1
Figure 1 : Schéma de l’ensemble des procédures de xénotransplantation et d’analyse post-injection. (A) La configuration de reproduction, la collecte d’embryons et la morphologie 2 jours après la fécondation (dpf) sont schématisées. (B) Préparation, coloration et injections de cellules leucémiques pour la xénotransplantation dans le jaune d’embryons de poisson-zèbre. (C) Analyses post-xénotransplantation, y compris la survie et la cytométrie en flux. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-2
Figure 2 : Images représentatives des outils utilisés pour les injections. (A) Aiguilles tirées dans une plaque de Pétri. (B) La plaque d’agarose pour la stadification de l’embryon. (C, D) Une plaque montrant les embryons stagénés (schéma représentatif dans le panneau C et les embryons réels (cerclés en rouge) dans le panneau D) pour les injections sur la plaque de chargement d’embryons. L’encart dans le coin inférieur droit du panneau D montre une vue à plus fort grossissement des embryons stagésés. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-3
Figure 3 : Images représentatives d’embryons xénotransplantés. Des images en fond clair et immunofluorescentes sont montrées des cellules positives à la coloration CM-Dil (rouge) dans le jaune des embryons de casper à 1 dpi (image de couvée). Les embryons avec un bolus inférieur sont indiqués par une flèche jaune, tandis que ceux avec une morphologie perturbée sont indiqués par un astérisque. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-4
Figure 4 : Évaluation de la progression de la maladie par imagerie par fluorescence et analyse de survie. (A) Image représentative d’embryons xénotransplantés à 4 dpi et 7 dpi. (B) Le graphique de Kaplan Meier montrant l’analyse de survie d’embryons avec deux lignées de leucémie génétiquement distinctes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-5
Figure 5 : Analyse cytométrique en flux de la charge de morbidité chez le poisson-zèbre xénotransplanté. (A) Représentation schématique de la préparation de la suspension cellulaire et analyse par cytométrie en flux. En bref, les embryons à 4 dpi sont désagrégés en suspensions unicellulaires à l’aide de trypsine et de collagénase, suivis d’une cytométrie en flux. (B) Graphiques représentatifs pour l’analyse par cytométrie en flux où l’image de gauche dans chaque panneau est un graphique FSC-A v/s SSC-A et l’image de droite est un signal CD45 v/s mCherry. (C) Graphique à barres montrant les statistiques cellulaires pour les cellules xénotransplantées obtenues à partir du graphique CD45 en fonction de mCherry pour les embryons non injectés, bons et inférieurs (n = 45, 40 et 40 pour chaque répétition (n = 3) ; valeur p * ≤ 0,05, calculée à l’aide du test t non apparié avec correction de Welch dans GraphPad Prism 9). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

La xénotransplantation de poisson-zèbre est apparue comme une alternative rapide, robuste et rentable aux études sur les souris12. Bien que plusieurs approches de xénotransplantation de poisson-zèbre aient été rapportées, notre adaptation a entraîné des améliorations significatives. En plus de normaliser les paramètres autour de la procédure, ces améliorations se concentrent spécifiquement sur l’accélération de la vitesse à laquelle les injections tumorales peuvent être effectuées, permettant ainsi une augmentation du nombre d’animaux par bras d’étude et l’utilisation du marquage tumoral pour surveiller la qualité de l’injection et le comportement post-injection.

Bien que les améliorations apportées à cette méthode décrites ici aient un grand potentiel, l’exécution réussie de cette stratégie nécessitera un praticien qualifié et une optimisation pour l’application spécifique. Nous avons utilisé des cellules leucémiques. Par conséquent, l’utilisation de cancers solides peut présenter des défis supplémentaires. De telles tumeurs peuvent être sujettes à l’agrégation, ce qui créerait une variabilité dans l’administration du bolus cellulaire ; cependant, même dans de telles circonstances, l’étiquetage RFP devrait permettre un contrôle adéquat de la qualité du bolus après l’injection. Ceci est supérieur au marquage GFP ou aux colorants verts, qui sont obscurcis par l’autofluorescence. Enfin, la standardisation décrite ici de la plupart des paramètres ayant un impact sur le succès (santé de l’embryon, température de l’aquaculture, orifice de l’aiguille, pression d’injection, etc.) minimise la variabilité de ce processus.

Le site d’injection est une considération majeure pour les expériences de xénotransplantation chez le poisson-zèbre. Ici, nous avons montré que les injections dans le vitellin sont assez faciles par rapport à d’autres sites plus difficiles sur le plan technique, comme l’espace périviteline34, le canal de Cuvier35 et l’injection intracardique (ventricule cardiaque)36. L’inconvénient de l’injection de vitellin est qu’il s’agit d’un organe vital pour les embryons en croissance, il faut donc veiller à ce que le diamètre et la pression de l’aiguille soient soigneusement contrôlés afin que l’embryon ne meure pas en raison d’un traumatisme par injection. L’approche décrite ici atténue cette préoccupation en minimisant les blessures et en éliminant toute blessure évidente ou la mort de 1 dpi, car ces problèmes ne sont pas liés à la croissance tumorale. La dernière considération concernant le site d’injection est que des microenvironnements distincts peuvent avoir une capacité plus ou moins grande à soutenir la propagation des tumeurs xénotransplantées. Par conséquent, peut-être que les injections de vitellus peuvent être effectuées en premier avant de passer à des injections orthotopiques plus difficiles. Le principal avantage de l’injection de vitellus est qu’elle ne nécessite pas de stadification précise de l’embryon et permet ainsi une injection plus rapide d’un plus grand nombre d’embryons, préservant ainsi mieux leur santé et augmentant la puissance statistique pour résoudre les différences de comportement des cellules tumorales transplantées.

La surveillance post-injection de la progression de la maladie est généralement évaluée à l’aide des effets sur la survie à l’aide de l’analyse de Kaplan-Meier37 ; Cependant, le dépistage de la charge de morbidité peut également être très informatif. Pour les cellules transplantées qui restent au site d’injection, la charge tumorale peut être quantifiée à l’aide de diverses méthodes de microscopie, à condition que la méthode de marquage des cellules tumorales ne soit pas obscurcie par l’autofluorescence29. La coloration CM-Dil est facilement résolue et n’est pas affectée par l’autofluorescence, elle fonctionne donc bien pour quantifier la charge tumorale des cellules localisées. Le défi se produit lorsque les cellules tumorales ne restent pas au site d’injection et se desserrent. Dans de tels cas, la cytométrie en flux, associée à un marquage génétique indélébile à l’aide de protéines fluorescentes rouges, est un moyen très efficace de surveiller la charge de morbidité dans les couvées standardisées d’embryons, car la tumeur marquée peut être analysée en utilisant des colorants spécifiques à l’espèce différents de ceux des cellules de poisson-zèbre. L’une des inconvénientes de CM-Dil est qu’il est dilué par la division cellulaire38. En conséquence, l’adaptation à l’aide du marquage génétique des tumeurs à l’aide de RFP ou de mCherry présente des avantages significatifs. L’expression de mCherry, associée à un anticorps spécifique de la tumeur, permet d’identifier avec certitude les cellules transplantées parmi ce qui peut être un modèle complexe de signaux de fond fournis par les cellules de poisson-zèbre hôte.

Ensemble, l’approche optimisée de xénotransplantation de poisson-zèbre et la méthode d’analyse utilisée dans cette étude apportent une amélioration substantielle à une plate-forme expérimentale déjà puissante.

Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent pas d’intérêts concurrents.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par des subventions des NIH R37AI110985 et P30CA006927, une affectation du Commonwealth de Pennsylvanie, de la Leukemia and Lymphoma Society et du Bishop Fund. Cette étude a également été soutenue par les installations centrales de Fox Chase, y compris la culture cellulaire, la cytométrie en flux et l’installation d’animaux de laboratoire. Nous remercions la Dre Jennifer Rhodes d’avoir maintenu l’installation de poisson-zèbre et de micro-injection au FCCC.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
1-phényl 2-thiourée (PTU)SigmaP7629
Passoire à cellules de 70 micronsCorning  ;CLS431751-50EA
Boîte de Pétri 90 mmThermo Fisher ScientificS43565
AgaroseApex bioresearch20-102GP
APC APC anti-souris CD45.2 Anticorps Biolegend109814
BD FACSymphony A5 Cell AnalyzerBD BiosciencesBD FACSymphony A5
capillairesSigma  ;P1424-1PAK
Traqueur de cellules CM-dil colorantInvitrogenC7001
Collageanse IVGibco17104019
Pince Dumont numéro 55Outils de sciences fines11255-20
FBSCorning  ;35-015-CV
Microscope à fluorescenceNikonSMZ1500
Capillaires en verre (Borosilicate)Instruments de précision mondiaux1B100-4
HBSSCorning  ;21-023-CV
Helix NP BlueBiolegend425305
Instant Ocean Sea SaltInstant oceanSS15-10
Microscope optiqueNikonSMZ1000
Bleu de méthylèneSigmaM9140-100G
Microloader (pointes longues pour laoding des cellules)eppendorf930001007
P1000 extracteur de micropipettesSutter instrumentsmodèle P-97
PM Microinjecteur à 1000 cellulesMicroData Instruments, Inc. (MDI)PM1000
Méthanessulfate de tricaïne (méthanesulfatate d’éthyle 3-aminobenzoate)SigmaE10521-10G
Trypsine-EDTA (0,5 %), sans rouge de phénolGibco15400054
Poisson zèbre adulte irradié régime alimentaire (alimentation sèche)Zeigler388763
calibration modèle modèle

Références

  1. Sharma, G., Goyal, Y., Bhatia, S. Handbook of Animal Models and its Uses in Cancer Research. Preclinical Animal Models of Cancer: Applications and Limitations. , Springer. Singapore. (2022).
  2. Singhal, S. S., et al. Recent advancement in breast cancer research: Insights from model organisms-Mouse models to zebrafish. Cancers. 15 (11), 2961(2023).
  3. Liu, Y., et al. Patient-derived xenograft models in cancer therapy: technologies and applications. Signal Transduction and Targeted Therapy. 8 (1), 160(2023).
  4. Fuochi, S., Galligioni, V. Disease Animal Models for Cancer Research. Cancer Cell Culture: Methods and Protocols. , Springer, Humana. New York, NY. (2023).
  5. Shaw, T. J., Senterman, M. K., Dawson, K., Crane, C. A., Vanderhyden, B. C. Characterization of intraperitoneal, orthotopic, and metastatic xenograft models of human ovarian cancer. Mol Ther. 10 (6), 1032-1042 (2004).
  6. Deroose, C. M., et al. Multimodality imaging of tumor xenografts and metastases in mice with combined small-animal PET, small-animal CT, and bioluminescence imaging. J Nucl Med. 48 (2), 295-303 (2007).
  7. Zeng, M., et al. Generation, evolution, interfering factors, applications, and challenges of patient-derived xenograft models in immunodeficient mice. Cancer Cell Int. 23 (1), 120(2023).
  8. Adhish, M., Manjubala, I. Effectiveness of zebrafish models in understanding human diseases-A review of models. Heliyon. 9 (3), e14557(2023).
  9. MacRae, C. A., Peterson, R. T. Zebrafish as a mainstream model for in vivo systems pharmacology and toxicology. Ann Rev Pharmacol Toxicol. 63, 43-64 (2023).
  10. Choe, S. -K., Kim, C. -H. Zebrafish: A powerful model for genetics and genomics. Int J Mol Sci. 24 (9), 8169(2023).
  11. White, R., Rose, K., Zon, L. Zebrafish cancer: the state of the art and the path forward. Nat Rev Cancer. 13 (9), 624-636 (2013).
  12. Al-Hamaly, M. A., Turner, L. T., Rivera-Martinez, A., Rodriguez, A., Blackburn, J. S. Zebrafish cancer avatars: A translational platform for analyzing tumor heterogeneity and predicting patient outcomes. Int J Mol Sci. 24 (3), 2288(2023).
  13. White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
  14. Hill, D., Chen, L., Snaar-Jagalska, E., Chaudhry, B. Embryonic zebrafish xenograft assay of human cancer metastasis. F1000Res. 7, 1682(2018).
  15. Corkery, D. P., Dellaire, G., Berman, J. N. Leukaemia xenotransplantation in zebrafish--chemotherapy response assay in vivo. Br J Haematol. 153 (6), 786-789 (2011).
  16. Lin, J., et al. A clinically relevant in vivo zebrafish model of human multiple myeloma to study preclinical therapeutic efficacy. Blood. 128 (2), 249-252 (2016).
  17. Grissenberger, S., et al. High-content drug screening in zebrafish xenografts reveals high efficacy of dual MCL-1/BCL-XL inhibition against Ewing sarcoma. Cancer Lett. 554, 216028(2023).
  18. Baxi, D. Zebrafish: A Versatile Animal Model to Study Tumorigenesis Process and Effective Preclinical Drug Screening for Human Cancer Research. Handbook of Animal Models and its Uses in Cancer Research. , Springer. Singapore. (2022).
  19. Li, X., Li, M. The application of zebrafish patient-derived xenograft tumor models in the development of antitumor agents. Med Res Rev. 43 (1), 212-236 (2023).
  20. Yin, J., et al. Zebrafish patient-derived xenograft model as a preclinical platform for uveal melanoma drug discovery. Pharmaceuticals. 16 (4), 598(2023).
  21. Nakayama, J., Makinoshima, H., Gong, Z. In vivo drug screening to identify anti-metastatic drugs in Twist1a-ER(T2) transgenic zebrafish. Bio Protoc. 13 (10), e4673-e4673 (2023).
  22. Lam, S., Chua, H., Gong, Z., Lam, T., Sin, Y. Development and maturation of the immune system in zebrafish, Danio rerio: a gene expression profiling, in situ hybridization and immunological study. Dev Comp Immunol. 28 (1), 9-28 (2004).
  23. Nicoli, S., Presta, M. The zebrafish/tumor xenograft angiogenesis assay. Nat Protoc. 2 (11), 2918-2923 (2007).
  24. Casey, M. J., et al. Transplantation of zebrafish pediatric brain tumors into immune-competent hosts for long-term study of tumor cell behavior and drug response. J Vis Exp. (123), e55712(2017).
  25. Soh, G. H., Kögler, A. C., Müller, P. A simple and effective transplantation device for zebrafish embryos. J Vis Exp. (174), e62767(2021).
  26. Martinez-Lopez, M., Póvoa, V., Fior, R. Generation of zebrafish larval xenografts and tumor behavior analysis. J Vis Exp. (172), e62373(2021).
  27. Ren, J., Liu, S., Cui, C., Ten Dijke, P. Invasive behavior of human breast cancer cells in embryonic zebrafish. J Vis Exp. (122), e55459(2017).
  28. Zhao, C., et al. A novel xenograft model in zebrafish for high-resolution investigating dynamics of neovascularization in tumors. PloS One. 6 (7), e21768(2011).
  29. Cabezas-Sáinz, P., Pensado-López, A., Sáinz Jr, B., Sánchez, L. Modeling cancer using zebrafish xenografts: drawbacks for mimicking the human microenvironment. Cells. 9 (9), 1978(2020).
  30. Haraoka, Y., Akieda, Y., Ishitani, T. Live-imaging analyses using small fish models reveal new mechanisms that regulate primary tumorigenesis. Yakugaku Zasshi. 139 (5), 733-741 (2019).
  31. Westerfield, M. The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. Oregon. (2000).
  32. Rao, S., et al. Inactivation of ribosomal protein L22 promotes transformation by induction of the stemness factor, Lin28B. Blood. 120 (18), 3764-3773 (2012).
  33. Goel, M. K., Khanna, P., Kishore, J. Understanding survival analysis: Kaplan-Meier estimate. Int J Ayurveda Res. 1 (4), 274-278 (2010).
  34. Usai, A., Di Franco, G., Gabellini, C., Morelli, L., Raffa, V. Establishment of zebrafish patient-derived xenografts from pancreatic cancer for chemosensitivity testing. J Vis Exp. (195), e63744(2023).
  35. Murali Shankar, N., et al. Preclinical assessment of CAR-NK cell-mediated killing efficacy and pharmacokinetics in a rapid zebrafish xenograft model of metastatic breast cancer. Front Immunol. 14, 1254821(2023).
  36. Takahi, M., et al. Xenograft of human pluripotent stem cell-derived cardiac lineage cells on zebrafish embryo heart. Biochem Biophys Res Commun. 674, 190-198 (2023).
  37. Rudner, L. A., et al. Shared acquired genomic changes in zebrafish and human T-ALL. Oncogene. 30 (41), 4289-4296 (2011).
  38. Regan, J. L., et al. RNA sequencing of long-term label-retaining colon cancer stem cells identifies novel regulators of quiescence. iScience. 24 (6), 102618(2021).

Réimpressions et autorisations

Demander l’autorisation de réutiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demander une autorisation

Mots-clés

Cytom trie en fluxInjection cellulaireCharge morbideAnalyse de la survie embryonnaireMarquage cellulaire fluorescentPr paration de suspension cellulaireTransplantation de cellules leuc miquesRas MAP kinase

Articles connexes