Isolement immunomagnétique des cellules souches CD34+ résidentes de la paroi vasculaire chez la souris

Summary

Cette étude a permis d’établir une méthode stable et efficace pour l’isolement, la culture et la détermination fonctionnelle des cellules souches CD34⁺ résidentes de la paroi vasculaire (CD34⁺ VW-SC). Cette méthode d’isolement facile à suivre et rapide peut être utilisée par d’autres chercheurs pour étudier les mécanismes potentiels impliqués dans les maladies cardiovasculaires.

Abstract

Les cellules souches et progénitrices résidentes de la paroi vasculaire CD34⁺ (VW-SC) sont de plus en plus reconnues pour leur rôle crucial dans la régulation et la réparation des lésions vasculaires. La mise en place d’une méthode stable et efficace pour cultiver des VW-SC CD34⁺ murins fonctionnels est essentielle pour approfondir l’étude des mécanismes impliqués dans la prolifération, la migration et la différenciation de ces cellules dans diverses conditions physiologiques et pathologiques. La méthode décrite combine le criblage par billes magnétiques et la cytométrie en flux pour purifier les VW-SC CD34⁺ résidents en culture primaire. Les cellules purifiées sont ensuite identifiées fonctionnellement par coloration par immunofluorescence et imagerie Ca²⁺ . En bref, les cellules vasculaires de l’adventice de l’aorte murine et de l’artère mésentérique sont obtenues par fixation par bloc tissulaire, suivie d’une sous-culture jusqu’à ce qu’elle atteigne un nombre de cellules d’au moins 1 × 10⁷. Par la suite, les VW-SC CD34⁺ sont purifiés à l’aide du tri par billes magnétiques et de la cytométrie en flux. L’identification des VW-SC CD34⁺ implique une coloration par immunofluorescence cellulaire, tandis que la multipotence fonctionnelle est déterminée en exposant les cellules à un milieu de culture spécifique pour une différenciation orientée. De plus, la libération interne fonctionnelle de Ca²⁺ et l’entrée externe de Ca²⁺ sont évaluées à l’aide d’un poste de travail d’imagerie disponible dans le commerce dans des cellules chargées de Fura-2/AM exposées à l’ATP, à la caféine ou à la thapsigargine (TG). Cette méthode offre une technique stable et efficace pour isoler, cultiver et identifier les cellules souches CD34⁺ résidentes de la paroi vasculaire, offrant l’opportunité d’études in vitro sur les mécanismes de régulation des VW-SC et le criblage de médicaments ciblés.

Introduction

La paroi vasculaire joue un rôle central dans le développement vasculaire, la régulation homéostatique et la progression des maladies vasculaires. Au cours des dernières années, de nombreuses études ont révélé la présence de diverses lignées de cellules souches dans les artères. En 2004, le groupe du professeur Qingbo Xu a signalé pour la première fois l’existence de cellules souches/progénitrices vasculaires à la périphérie de la paroi vasculaire adulte, exprimant CD34, Sca-1, c-kit et Flk-1¹. Ces cellules souches vasculaires présentent un potentiel de différenciation et de prolifération multidirectionnel. Dans des conditions normales, ils restent relativement calmes ; Cependant, lorsqu’ils sont activés par des facteurs spécifiques, ils peuvent se différencier en cellules musculaires lisses, en cellules endothéliales et en fibroblastes. Alternativement, ils peuvent réguler la matrice périvasculaire et la formation de microvaisseaux par des effets paracrines pour favoriser la réparation ou le remodelage des vaisseaux blessés 2,3,4,5,6. Récemment, on a constaté que les cellules souches CD34⁺ résidentes de la paroi vasculaire jouent un rôle dans la régénération des cellules endothéliales après une lésion du fil-guide de l’artère fémorale². Par conséquent, l’isolement et la quantification des VW-SC CD34⁺ et l’examen des caractéristiques biologiques de base des cellules souches CD34⁺ sont cruciaux pour étudier plus avant les voies de signalisation impliquées dans la régulation des VW-SC CD34⁺.

Diverses méthodes de séparation cellulaire sont actuellement disponibles, y compris des techniques basées sur les caractéristiques de la culture cellulaire ou les propriétés physiques des cellules, telles que la centrifugation par gradient de densité, qui aboutit à des cellules triées contenant de nombreuses cellules non cibles et une pureté relativement faible 7,8,9,10,11,12 . Une autre technique couramment utilisée est le tri cellulaire assisté par fluorescence/magnétique. Le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) est un système complexe avec des exigences techniques élevées, et il est relativement coûteux, prend du temps et affecte potentiellement l’activité des cellules triées^13,14. Cependant, le tri cellulaire activé par magnétisme (MACS) est plus efficace et plus pratique, avec un taux de récupération et une activité cellulaire élevés et un impact moindre sur les applications en aval⁸. Par conséquent, dans ce protocole, nous avons appliqué MACS pour purifier les VW-SC CD34⁺ et identifié davantage les cellules par cytométrie en flux. La mise en place de méthodes d’isolement basées sur MACS pour étudier les cellules souches de la paroi vasculaire serait inestimable. Tout d’abord, il permet des études expérimentales de génétique et de biologie cellulaire. Deuxièmement, l’isolement et la culture efficaces des cellules souches résidentes de la paroi vasculaire permettent une évaluation et un dépistage systématiques des facteurs de signalisation régulant les fonctions des cellules souches. Troisièmement, l’identification de phénotypes cruciaux dans les cellules souches fournit un « contrôle de qualité » important dans l’évaluation de l’état cellulaire. Ainsi, l’identification de méthodes de purification pourrait être utile pour des applications similaires aux cellules souches analogues dérivées de vaisseaux.

Ce rapport fournit une démonstration détaillée d’une méthode stable et fiable pour la culture de CD34⁺ VW-SC, y compris l’identification cellulaire et l’évaluation fonctionnelle effectuées par cytométrie en flux, coloration par immunofluorescence et mesure de la signalisation Ca²⁺ . Cette étude fournit une base pour d’autres recherches approfondies sur la fonction des VW-SC CD34⁺ et leurs mécanismes de régulation dans des conditions physiologiques et pathologiques.

Protocol

Cette étude a été approuvée et les animaux ont été manipulés conformément aux Lignes directrices pour la gestion et l’utilisation des animaux de laboratoire en Chine. La recherche a strictement respecté les exigences éthiques de l’expérimentation animale, avec l’approbation du Comité d’éthique animale (numéro d’approbation : SWMU2020664). Des souris C57BL/6 en bonne santé âgées de huit semaines, des deux sexes, pesant entre 18 et 20 g, ont été utilisées pour la présente étude. Les animaux ont été hébergés au Laboratory Animal Center de la Southwest Medical University (SWMU).

1. Culture en bloc tissulaire d’adventites de l’aorte et des artères mésentériques

1. Isolement des VW-SC CD34⁺ résidents
   1. Anesthésier deux souris avec une inhalation d’isoflurane à 3 % (en suivant les protocoles approuvés par l’établissement). Confirmez l’anesthésie adéquate par pincement des orteils. Placez la souris en position couchée avec du ruban adhésif médical et vaporisez un désinfectant à l’éthanol à 70 % pour désinfecter la fourrure de la souris. Ouvrez les cavités thoracique et abdominale à l’aide de ciseaux ophtalmiques stériles et de pinces pour exposer le cœur et les intestins. Après avoir disséqué l’aorte isolée et les artères mésentériques, épinglez l’aorte et le lit mésentérique dans une boîte de Pétri contenant de l’élastomère de silicium et remplie d’une solution saline physiologique. Avec une autre paire de ciseaux et de pinces stérilisés, disséquez rapidement la graisse autour de l’aorte et des artères mésentériques.
   2. Transférez les tissus disséqués dans une boîte de Pétri de 6 cm contenant une solution à 1 % de pénicilline-streptomycine-amphotéricine B (voir la table des matières). Après avoir rincé deux fois, transférez les artères dans une hotte de culture tissulaire sous un stéréomicroscope.
   3. Coupez les artères longitudinalement et utilisez des pinces fines pour décoller la couche externe de l’aorte et la première branche des artères mésentériques. Transférez les couches externes dans une boîte de Pétri de 3,5 cm contenant de 0,1 à 0,2 mL de milieu de culture (voir le tableau des matériaux). Coupez les couches extérieures en petits morceaux (environ 1 mm³).
   4. Transférez les morceaux de tissu dans une fiole T25 recouverte de gélatine, en assurant une répartition uniforme sur le fond de la fiole. Maintenez une distance modérée entre les morceaux de tissu pour faciliter la rampe et la croissance des cellules. Placer le ballon verticalement dans un incubateur (37 °C, 5 % CO₂) pendant 3 h pour permettre aux blocs de tissus d’adhérer au fond du ballon.
   5. Après 3 h, ajoutez 5 ml de milieu de croissance à haute teneur en glucose DMEM pour immerger les blocs tissulaires. Orientez la fiole T25 horizontalement. Surveillez la migration cellulaire autour des blocs de tissus à l’aide d’un microscope à des intervalles de 3 jours.
      REMARQUE : Le milieu doit contenir 20 % de sérum fœtal bovin, 0,2 % de facteur inhibiteur de la leucémie (LIF), 0,2 mM de β-Mercaptoéthanol et 1 % de pénicilline/streptomycine (voir le tableau des matériaux). Le sérum fœtal bovin favorise la prolifération cellulaire, tandis que le LIF et le β-Mercaptoéthanol entravent la différenciation cellulaire ^7,8.
   6. Lorsque les cellules du ballon T25 atteignent environ 80 % de confluence, passez-les et cultivez-les dans un ou deux ballons T75. Sous-cultivez les cellules sur cinq passages pour assurer une bonne croissance et une bonne santé.
2. Séparation magnétique des cellules souches CD34⁺ résidentes
   1. Lorsque les cellules d’un ou deux flacons T75 atteignent une confluence de 80 %, dissocier les cellules avec de la trypsine et les remettre en suspension dans 1 mL de tampon de tri (2 mM d’EDTA et 0,5 % de FBS). Déterminer le numéro de cellule (fiole^{10 7}/T75) et centrifuger la suspension cellulaire à 300 x g pendant 5 min (à température ambiante).
   2. Jeter complètement le surnageant et remettre en suspension la pastille de cellule dans 98 μL de tampon de tri pour 10⁷ cellules au total. Ajouter 2 μL d’anticorps CD34 (voir le tableau des matériaux). Bien mélanger et incuber 30 min à 4°C dans l’obscurité en secouant de temps en temps.
   3. Laver les cellules en ajoutant 2 mL de tampon de tri et centrifuger à 300 x g pendant 10 min à température ambiante.
   4. Retirez le surnageant soigneusement et complètement, puis remettez les cellules en suspension dans 80 μL de tampon de tri.
   5. Ajouter 20 μL de microbilles anti-FITC (par 10⁷ cellules au total, voir le tableau des matériaux) dans le tampon. Bien mélanger par pipetage répétitif et incuber pendant 15 min à 4 °C dans l’obscurité avec agitation intermittente.
   6. Lavez les cellules deux fois en ajoutant 2 ml de tampon et centrifugez à 300 x g pendant 5 minutes pour regranuler les cellules. Jetez complètement le surnageant et remettez les cellules en suspension dans 1 mL de tampon.
   7. Placer une colonne MS dans le champ magnétique d’un séparateur approprié, en s’assurant qu’un tube collecteur (p. ex., un tube à centrifuger de 15 ml) est placé sous la colonne MS pour recueillir les composants séparés. (voir le tableau des matériaux). Rincez la colonne avec un tampon de 500 μL et attendez qu’elle soit complètement écoulée.
   8. Chargez la suspension cellulaire dans la colonne et recueillez le flux contenant des cellules non étiquetées dans le tube de 15 ml.
   9. Retirez la colonne du séparateur et placez-la sur un nouveau tube à centrifuger de 15 ml. Introduisez 500 μL de tampon dans la colonne, puis rincez rapidement les cellules marquées magnétiquement en poussant le piston dans la colonne.
   10. Pour améliorer la pureté des cellules CD34⁺ , la fraction éluée peut être enrichie à l’aide d’une deuxième colonne MS. Répétez le processus de séparation comme mentionné ci-dessus. Évaluez la pureté des cellules triées par cytométrie en flux.
       REMARQUE : En règle générale, on obtient 10 à 20 % de cellules CD34⁺ , avec environ 70 à 80 % de cellules négatives et une perte d’environ 10 % due aux procédures de coloration et de centrifugation.
   11. Pour confirmer davantage la pureté des cellules souches CD34⁺ de la paroi vasculaire, identifiez les cellules triées par cytométrie en flux. La présente étude a montré une pureté de plus de 90%.

2. Identification cellulaire par immunofluorescence

1. Cellules de semence sur lamelles (diamètre 8 mm) pré-enrobées de gélatine à 0,04 %.
2. Lorsque les cellules atteignent environ 60 % à 70 % de confluence, rincez deux fois avec du PBS et fixez les cellules avec du paraformaldéhyde à 4 % pendant 10 min.
3. Laver les cellules avec du PBS pendant 3 minutes (3 fois) et perméabiliser les cellules avec 0,2% de Triton X-100 (en PBS) pendant 5 minutes à température ambiante.
4. Laver les cellules avec du PBS pendant 3 minutes (3 fois) et bloquer la liaison non spécifique des anticorps avec du sérum d’âne à 5% (dans du PBS) pendant 1 h.
5. Retirez le tampon de blocage en tenant chaque lamelle sur son bord à l’aide d’une pince et en l’égouttant sur une feuille de lingette non pelucheuse.
6. Incuber les cellules dans des anticorps primaires 100 fois dilués (CD34, Flk-1, c-kit, Sca-1, Ki67, voir tableau des matériaux) dans 1 % de BSA (dans PBS) pendant une nuit à 4 °C.
7. Décantez la solution et lavez les cellules avec du PBS pendant 3 minutes (3 fois). Incuber les cellules avec l’anticorps secondaire marqué Alexa Fluor 488 (1:200 dans 1% BSA) (voir le tableau des matériaux) pendant 1 h à température ambiante dans l’obscurité.
8. Effectuer une contre-coloration au DAPI en diluant la solution mère de DAPI à 0,5 μg/mL dans du PBS et en incubant les cellules pendant 5 min.
9. Rincez avec du PBS et scellez les lamelles avec un réactif anti-décoloration. Capturez des images sous le microscope confocal à balayage laser.

3. Différenciation induite et caractérisation des VW-SC CD34⁺

1. Ensemencer les cellules souches CD34⁺ à une densité appropriée (40 % à 50 % de confluence) sur des lamelles et des plaques à 6 puits, respectivement.
2. Induire la différenciation orientée vers les cellules endothéliales à partir des cellules CD34⁺ en cultivant des cellules dans le milieu de culture de cellules endothéliales EBM-2 (voir le tableau des matériaux) pendant 1 semaine.
3. Induire la différenciation orientée vers les cellules fibroblastiques à partir des cellules CD34⁺ en cultivant des cellules dans le milieu de culture cellulaire de fibroblastes FM-2 (voir le tableau des matériaux) pendant 3 jours.
4. Soumettez les cellules indifférenciées et différenciées à une coloration par immunofluorescence (comme mentionné à l’étape 2) à une excitation laser de 488 nm et à un objectif 40x. Détecter l’expression des marqueurs des cellules endothéliales (CD31, VWF) et des marqueurs des cellules fibroblastiques (PDGFRα, Vimentin) (voir Tableau des Matériaux).
5. Dissocier les cellules avec de la trypsine et obtenir la pastille cellulaire par centrifugation (300 x g, 5 min, température ambiante). Remettre en suspension les cellules avec 100 μL de tampon de tri. Préincuber la suspension cellulaire avec un anticorps anti-souris CD16/CD32 purifié (1 μg) (voir le tableau des matériaux) à 4 °C pendant 5 min.
6. Ajouter 2 μL d’anticorps monoclonaux PE anti-souris CD34 (1:50), CD31 (PECAM-1) (2 μL, 1:50) et CD140a (PDGFRa) Monoclonal Antibody FITC (2 μL, 1:50) directement dans les cellules préincubées en présence du bloc Fc de souris et incuber davantage à 4 °C pendant 15 min.
7. Lavez les cellules deux fois en ajoutant 2 mL de tampon et centrifugez à 300 x g pendant 5 min (température ambiante) pour regranuler les cellules. Jetez complètement le surnageant et remettez les cellules en suspension dans 300 μL de tampon. Mettez les tubes d’écoulement avec des cellules colorées dans une glacière prête pour la cytométrie en flux.

4. Détection de la signalisation intracellulaire Ca²⁺ dans les cellules souches vasculaires CD34⁺

1. Cellules de semence sur lamelles 10 h avant les expériences à une densité allant jusqu’à 70 % de confluence.
2. Sortez les lamelles et fixez-les au fond d’une chambre personnalisée avec de la vaseline.
3. Laver les lamelles une fois avec du PBS, les remplacer par du Fura-2/AM (5 μM) dans la solution de Tyrode (NaCl 137 mM, KCl 5,4 mM, MgCl₂ 1,2 mM, glucose 10 mM, HEPES 10 mM, CaCl₂ 2,4 mM) (voir le tableau des matériaux) et incuber les cellules pendant 30 minutes dans l’obscurité.
4. Enlever le colorant en traitant avec la solution de Tyrode pendant 10 minutes pour permettre la désestérification de fura-2/AM.
5. Monter la chambre sur la platine d’un microscope à fluorescence inversée équipé d’un système d’imagerie à grand champ contenant un monochromateur et une caméra CCD (voir Tableau des matériaux).
6. Ouvrez la fenêtre principale, accédez à la boîte de dialogue Paramètres de saisie et à la page de l’appareil photo, puis appuyez sur le bouton en direct pour afficher l’image en direct .
7. Choisissez le type d’image de fluorescence, réglez les temps de répétition de boucle 340 nm/380 nm, la taille de l’image et le temps d’exposition de l’appareil photo à 380 nm et 340 nm pour obtenir une luminosité d’image optimale.
8. Prenez des instantanés uniques et tracez plusieurs lignes à main levée pour entourer les cellules de différentes couleurs et prédéfinir les régions d’intérêt (ROI), en indiquant l’arrière-plan comme ROI 0.
9. Rééditez un protocole déjà incorporé dans la vue de l’espace de travail et créez un nouvel espace de travail.
10. Exécutez le protocole et le « Fluorescence 340 nm div Fluorescence 380 nm (Live Kinetic) » affichera le graphique cinétique en ligne.
11. Dans la vue numérique, une feuille de calcul sera visible, présentant des colonnes de valeurs en niveaux de gris et les informations temporelles correspondantes. Exportez les données de la feuille de calcul à l’aide du presse-papiers.
12. Calculez F340 nm/F380 nm indiquant les changements intracellulaires de Ca²⁺ après soustraction de la fluorescence de fond (ROI 0).

Results

Isolement et purification des CD34⁺ VW-SC
La haute pureté des VW-SC CD34⁺ est obtenue à partir de l’adventice de l’artère aortique et de l’artère mésentérique de la souris par fixation tissulaire et tri magnétique des microbilles. Le pourcentage de cellules CD34⁺ dans la paroi du vaisseau est généralement de 10 % à 30 %. La cytométrie en flux confirme que la pureté des cellules CD34⁺ obtenues par tri par billes magnétiques est supérieure à 90% (

Discussion

Cette étude fournit une méthode rapide et pratique pour obtenir des VW-SC CD34⁺ fonctionnels à partir de l’aorte et des artères mésentériques de souris. Les VW-SC CD34⁺ obtenus par cette méthode ont une activité proliférative et des propriétés de différenciation multidirectionnelle. Les récepteurs triphosphate 1,4,5-trisphosphate d’inositol (IP₃Rs), les récepteurs de la ryanodine (RyRs) et les canaux calciques exploités par le stockage médient la libération et l’entrée de Ca²⁺ ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Solution de gélatine à 2 %	Sigma	G1393
Anticorps anti-CD31	R& D	AF3628
Anticorps anti-CD34	Abcam	ab81289
Anticorps anti-c-kit	CST	77522
Microbilles anti-FITC	Miltenyi Biotec	130-048-701  ;
Microbilles anti-FITC MACS	Miltenyi Biotec	130-048-701
Anticorps anti-Flk-1	Abcam	ab24313
Anticorps anti-Ki67	CST	34330
Anticorps anti-PDGFR&alpha ;	Abcam	ab131591
Anticorps anti-Sca- 1	Invitrogen	710952
CD140a (PDGFRA) Monoclonal Anticorps (APA5), FITC	eBioscience   ; Invitrogen	11-1401-82
CD31 (PECAM-1) Anticorps monoclonal (390), APC	eBioscience  ; Invitrogen	17-0311-82
CD34 Anticorps, anti-souris, FITC, REAfinity Clone REA383	Miltenyi Biotec	130-117-775
capot de culture cellulaire	JIANGSU SUJING GROUP CO., LTD  ;	Centrifugeuse SW-CJ-2FD
	; CÔNE  ;   ;	L530
CO2 incubateurs  ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;	Thermofisher Scientific	4111
Microscope confocal à balayage laser  ;	Zeiss  ;	ZEISS 980°   ;
DMEM High Glucose Medium ATCC		30-2002
EBM-2 milieu de culture	Lonza	CC-3162
FACSMelody  ;   ;	BD Biosciences
FACSMélody&commerce ; Système	;
Sérum fœtal bovin	Millipore	ES-009-C
FM-2 milieu de culture	ScienCell	2331
Fura-2/AM  ;	Invitrogen	M1292
Anticorps secondaire anti-Rabbit IgG (H+L) hautement adsorbé croisé, Alexa Fluor Plus 488	² ; Thermofisher Scientific  ;   ;   ;	A32731
Facteur inhibiteur de la leucémie	Millipore	LIF2010
Microscope  ;	Olympus	IX71
MiniMACS  ;   ; Kit de démarrage	Miltenyi Biotec	130-090-312
Pénicilline-Streptomycine-Amphotéricine B Solution	Beyotime	C0224
Anti-souris de rat purifié CD16/CD32 (souris BD Fc Block)	BD Pharmingen	553141
Stéréomicroscope  ;	Olympus	SZX10° ;
Programme TILLvisION 4.0	; T.I.L.L.Photonics GmbH	polychrome V  ;
Anticorps monoclonal VWF (F8/86)	Thermofisher Scientific	; MA5-14029
&beta ;-Mercaptoethanol	Thermofisher	21985023