Isolement de mutants sans interaction/altérés à l’aide du test à deux hybrides de levure

Les interactions entre les biomolécules sont la partie la plus fondamentale des phénomènes biologiques. Les interactions protéine-protéine constituent une partie importante de ces interactions. Par conséquent, l’identification du ou des partenaires d’interaction d’une protéine d’intérêt est essentielle pour élucider davantage la fonction de la protéine/du gène d’intérêt. La méthode à deux hybrides de levure (Y2H) est une technique populaire pour identifier les interactions protéine-protéine in vivo¹. Dans ce système, deux protéines (X et Y) dont l’interaction doit être testée sont fusionnées respectivement au domaine de liaison à l’ADN (DB) et au domaine d’activation transcriptionnelle (AD). La protéine de fusion DB-X se lie à une séquence de reconnaissance du domaine DB ; par conséquent, lorsque les protéines X et Y interagissent, la protéine de fusion AD-Y se rapproche de la séquence de reconnaissance. Par conséquent, la transcription du gène rapporteur en aval de la séquence de reconnaissance est activée. Par conséquent, la présence ou l’absence d’activité du gène rapporteur peut être utilisée pour déterminer la présence ou l’absence de l’interaction protéine-protéine¹.

Une fois qu’un partenaire d’interaction spécifique de la protéine d’intérêt est identifié, d’autres analyses doivent être effectuées pour élucider la fonction biologique de l’interaction. À cette fin, si les mutants des protéines qui altèrent ou suppriment l’interaction protéine-protéine spécifique peuvent être isolés, ils serviront d’outils puissants. Le système Y2H peut être utilisé directement pour isoler de tels mutants en criblant des clones « à interaction négative », en commençant par le clone de type sauvage à « interaction positive ». Pour accélérer ce processus, des systèmes Y2H « inversés » (rY2H) ont été développés ^2,3. Dans les systèmes rY2H, les souches de levure hôte hébergent des gènes marqueurs contre-sélectionnables en tant que gènes rapporteurs, ce qui signifie que les cellules de levure ne se développent que lorsque les protéines AD-Y et DB-X n’interagissent pas.

Bien que les systèmes Y2H et rY2H permettent d’isoler les mutants négatifs à interaction, le processus d’isolement des mutants est laborieux car tous les candidats obtenus par criblage ne portent pas le type de mutations souhaité (généralement des mutations faux-sens). Le problème le plus grave est qu’une fraction importante des candidats présentent des mutations de décalage de cadre ou non-sens, et qu’il est nécessaire d’effectuer un western blot pour exclure les clones indésirables. Pour pallier ce problème, de nouveaux vecteurs plasmidiques ont été développés⁴. Dans ces vecteurs, KanMX, un marqueur de résistance aux médicaments, est positionné hors cadre en aval du domaine DB ou AD. Le gène marqueur ne devient dans le cadre du domaine DB ou AD que lorsque le gène d’intérêt est inséré. Lorsqu’une ou plusieurs mutations aléatoires sont introduites dans le gène d’intérêt, les mutants indésirables, tels que ceux présentant des mutations décalées ou non-sens, peuvent être facilement éliminés en effectuant une sélection de résistance aux médicaments, et les candidats porteurs de mutations faux-sens souhaitables peuvent être facilement identifiés avec le crible Y2H⁴. Cet article présente un protocole permettant d’isoler les mutants sans interaction/altérés d’une protéine d’intérêt en utilisant cette stratégie.

1. Construction de la bibliothèque mutante

1. Mettre en place la réaction en chaîne par polymérase (PCR) (un exemple est présenté ci-dessous). En général, préparez 50 μL de la réaction, qui est divisée en dix aliquotes de 5 μL, et amplifiez le fragment de gène cible dans une machine PCR⁴.
   REMARQUE : Les utilisateurs doivent sélectionner une polymérase appropriée pour introduire efficacement les mutations. Si le fragment d’ADN à amplifier est court, une polymérase avec un taux d’erreur plus élevé, comme la Taq polymérase, qui manque d’activité de relecture, est nécessaire. Si le fragment d’ADN à amplifier est long, une polymérase plus fidèle est nécessaire pour réduire le nombre de mutations. Les mutations se produisent toutes les quelques centaines de paires de bases après 30 cycles d’amplification avec la Taq polymérase⁴ régulière. Dans les résultats représentatifs, une Taq polymérase différente a été utilisée (voir le tableau des matériaux), qui a une fidélité plus élevée que la Taq polymérase ordinaire, et le taux de mutation était d’un sur 600 paires de bases. Un exemple des mélanges de PCR, les détails de l’amorce et les conditions de réaction sont fournis dans le fichier supplémentaire 1.
2. Lorsque la PCR est terminée, combiner toutes les aliquotes de la réaction, confirmer que les fragments d’ADN d’intérêt ont été amplifiés par électrophorèse sur gel d’agarose, etc., et purifier l’ADN⁵.
3. Assemblez le fragment d’ADN généré à l’étape 1.2 avec le vecteur Y2H approprié à l’aide d’une stratégie de clonage « sans couture » (Figure 1).
   REMARQUE : Le système de clonage sans soudure, tel que l’assemblage^{Gibson 6}, minimise la contamination de la bibliothèque de mutants construite par des vecteurs vides générés par auto-ligature. Une liste des vecteurs Y2H est fournie dans le Tableau 1. Ils peuvent être préparés par digestion BamHI avant assemblage. Tous les plasmides sont disponibles auprès du National BioResource Project - levure (voir le tableau des matériaux).
4. Introduire le mélange réactionnel généré à l’étape 1.3 dans des cellules compétentes d’Escherichia coli préparées selon un protocole de transformation d’E. coli très efficace (p. ex., Inoue et ^al.7). Répartissez toutes les cellules compétentes sur plusieurs plaques LB (1 % de tryptone, 0,5 % d’extrait de levure, 1 % de NaCl et 2 % d’agar) contenant des antibiotiques appropriés (voir le tableau des matériaux). À ce stade, étalez une petite quantité (~1/100 de la réaction totale) sur la même plaque de sélection pour calculer le titre de bibliothèque. Incuber les plaques à 37 °C pendant la nuit.
5. Une fois qu’un grand nombre de colonies d’E. coli sont apparues, grattez toutes les cellules de la surface de la plaque à l’aide d’une boucle en plastique jetable. Récupérez l’ADN plasmidique de ces cellules à l’aide de méthodes populaires, telles que la lyse alcaline⁸. Dans le même temps, comptez le nombre de colonies qui apparaissent après avoir étalé de petites aliquotes du mélange de transformation sur la plaque. À l’aide de ce nombre, estimez le nombre total de clones indépendants dans la bibliothèque.
   REMARQUE : À ce stade, prélevez quelques colonies indépendantes (4-6) qui apparaissent sur la plaque sur laquelle les petites aliquotes de la réaction de transformation ont été étalées, cultivez-les séparément et isolez-en des plasmides pour confirmer que pratiquement tous les clones portent les fragments d’ADN souhaités⁵. De nombreux kits commerciaux sont disponibles pour isoler les plasmides d’E. coli. Le nombre de colonies qui apparaissent sur la plaque après l’épandage de petites aliquotes peut être compté manuellement.
6. Mesurer la concentration du pool d’ADN de la bibliothèque. Habituellement, quelques centaines de nanogrammes d’ADN de bibliothèque suffisent pour obtenir plusieurs milliers de transformants à l’étape suivante.
   REMARQUE : Il est recommandé de mesurer la concentration d’ADN à l’aide d’un colorant fluorescent qui se lie à l’ADN car la mesure de A₂₆₀ est souvent imprécise.

2. Transformation de la levure avec la bibliothèque de mutants et placage de réplique

1. Introduire la banque de mutants dans la souche de levure hôte (TAT-7 (L40-ura3)^9,10 MATa, leu2-3,112, trp1-901, his3-Δ200, ade2-101, gal80Δ, LYS2 :(lexAop)4-HIS3, ura3 :(lexAop)_8-lacZ) pour le test Y2H en utilisant environ 100 ng d’ADN. Pré-transformer les cellules hôtes avec le plasmide « appât ».
   1. Après la procédure de transformation, suspendre les cellules de levure dans de l’eau stérile et étaler des aliquotes de différentes quantités sur des plaques appropriées (généralement un milieu SC dépourvu de leucine et de tryptophane : SC-LW [0,67 % de base azotée de levure, 2 % de glucose, 1,546 g/L de mélange à double chute SC -Leu -Trp et 2 % d’agar, voir tableau des matériaux]). Incuber ces plaques pendant une nuit à 30 °C.
      REMARQUE : Le protocole standard, tel que la méthode acétate de lithium-PEG¹¹ avec ~5 × 10⁶ cellules à croissance logarithmique, est suffisant pour la transformation de la levure. Une autre méthode à haut rendement de transformation, comme l’électroporation, peut également être utilisée.
2. Le lendemain, lorsque de minuscules colonies apparaissent, sélectionnez les plaques avec un nombre approprié de cellules (500-2000) et faites-en des répliques comme suit.
3. Placez deux feuilles de papier filtre sur un bloc de réplique pour en faire plusieurs répliques (le support est le SC-LW et le SC-LW contenant de la kanamycine) (voir la table des matériaux). Incuber à 30 °C pendant 1 à 2 jours.
   REMARQUE : La concentration de kanamycine (G418) est de 600 μg/mL. N’utilisez pas de velours pour le placage de réplique car la résolution des colonies sera perdue.
4. Une fois que les colonies ont grandi, comparez les assiettes et choisissez des candidats. Effectuez un test de couleur Y2H (voir étape 3) si lacZ est utilisé comme rapporteur.
   REMARQUE : Pour le rapporteur Y2H, lacZ est généralement meilleur pour détecter une interaction faible que HIS3.

3. Dosage des couleurs Y2H

1. Placez une feuille de papier filtre coupée à l’avance à la taille appropriée sur la réplique de la plaque préparée à l’étape 2. Veillez à ne pas laisser se former de bulles d’air entre le papier filtre et la plaque.
   REMARQUE : Utilisez du papier filtre n° 4A ou du papier filtre de grade 50 (voir le tableau des matériaux). Toute plaque SC-LW ou SC-LW contenant de la kanamycine, qui sont fabriquées par placage de réplique, peut être utilisée pour le test de couleur.
2. Lorsque le papier filtre sur la plaque est complètement humidifié (lorsque la couleur du papier filtre change complètement), placez plusieurs feuilles d’essuie-tout sur le dessus et mettez-le en contact avec le papier filtre pour éliminer l’excès d’humidité. Retirez l’essuie-tout lorsqu’il absorbe l’eau et change de couleur. Répétez ce processus deux ou trois fois.
3. Prenez les bords du papier filtre à l’aide d’une pince à épiler, décollez-le rapidement de la plaque, plongez-le dans de l’azote liquide et congelez-le. Si l’azote liquide n’est pas disponible, placez le papier filtre sur un plateau en plastique avec la colonie vers le haut et placez-le immédiatement dans un congélateur (-20 °C à -80 °C) pour qu’il soit complètement congelé.
4. Retirez le papier filtre gelé et placez-le, côté colonie vers le haut, sur une serviette en papier sèche pour décongeler. Immédiatement après la décongélation, placez le papier filtre, côté colonie vers le haut, sur un autre papier filtre qui a été placé sur un plateau en plastique ou un récipient refermable et imbibé de tampon Z (60 mM Na₂HPO₄, 40 mM NaH₂PO₄, 10 mM KCl et 1 mM MgSO₄, pH 7,0) contenant du X-gal (5-bromo-5-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside) et du 2-mercaptoéthanol⁹ (voir le tableau des matériaux). Veillez à ne pas laisser de bulles d’air se former entre les papiers filtres supérieur et inférieur.
5. Couvrez le plateau en plastique contenant le papier filtre et mettez-le dans un récipient hermétique ou un sac en plastique. Fermez le récipient hermétique ou le sac en plastique et incubez-le à 37 °C jusqu’à ce qu’une couleur bleue apparaisse.
6. Lorsqu’une couleur bleue apparaît, placez le papier filtre avec la colonie vers le haut sur environ 500 μL de solution d’arrêt (1 M Na₂CO₃) placés sur un plateau en plastique propre. La solution d’arrêt pénètre rapidement ; Par conséquent, retirez immédiatement le filtre, placez-le sur une serviette en papier fraîche avec le côté colonie vers le haut et laissez-le sécher.
7. Une fois que l’essuie-tout est remplacé et que le filtre est suffisamment sec, utilisez un scanner ou un autre appareil pour capturer les données.

4. Récupération et confirmation des clones candidats

1. Sélectionnez des clones candidats blancs et Kan^R dans la plaque d’origine de la réplique (ou la plaque répliquée non utilisée pour le test de couleur). La figure 1C en montre des exemples. Confirmer que les clones candidats sont blancs et Kan^R en les restaçant en petites taches sur un milieu SC-LW contenant de la kanamycine et en les laissant incuber à 30 °C pendant 1 à 2 jours. Faites au moins deux séries ou faites des répliques le lendemain.
   REMARQUE : Les colonies blanches doivent être sélectionnées car les colonies bleu pâle peuvent conserver l’interaction.
2. Une fois que les clones candidats ont bien repoussé, répétez l’essai de couleur avec au moins une plaque générée à l’étape 4.1, comme décrit à l’étape 3, et confirmez qu’ils restent blancs et ne virent pas au bleu (figure 2A).
   REMARQUE : Lorsque vous re-streaez les candidats, ne transmettez pas de grandes quantités de cellules. Trop de cellules rendent impossible de distinguer les clones de Kan^R et de Kan^S .
3. Prélever des clones encore blancs et Kan^R générés à l’étape 4.2 dans les restes de la plaque et les cultiver indépendamment dans 1 mL de milieu de sélection (SC-L ou SC-W, selon le vecteur utilisé pour la construction de la bibliothèque) pendant une nuit à 30 °C.
4. Transférez la culture dans un microtube et prélevez les cellules par centrifugation (~15 000 × g, pendant 10 à 30 secondes à température ambiante). Isolez l’ADN entier de la pastille cellulaire comme suit.
5. Mettre en suspension la pastille cellulaire dans 400 μL de tampon de lyse (2 % de Triton X-100, 1 % de SDS, 100 mM de NaCl, 10 mM de Tris-Cl (8,0) et 1 mM d’EDTA) contenant 1 μL de 2-mercaptoéthanol et 1 μL de zymolyase 100T (voir le tableau des matières), et incuber à 37 °C pendant 30 minutes pour digérer les parois cellulaires. À ce moment, mélangez doucement en inversant le tube toutes les 5 à 10 minutes.
6. Lorsque la suspension cellulaire est devenue opaque ou translucide, ajouter un volume égal d’un mélange phénol-chloroforme-alcool isoamylique (25:24:1) et bien mélanger en tourbillonnant à vitesse modérée pendant 10 à 20 s.
7. Centrifuger les microtubes dans une microcentrifugeuse pendant 5 min à pleine vitesse (~15 000 × g, à température ambiante) et récupérer la phase aqueuse contenant de l’ADN dans un nouveau microtube. Ajouter 0,8 volume d’isopropanol et bien mélanger en inversant le tube.
8. Laissez le tube à température ambiante pendant 2-3 min, puis centrifugez-le dans une microcentrifugeuse pendant 4-5 min à pleine vitesse (~15 000 × g, à température ambiante) pour précipiter l’ADN.
9. Retirer le surnageant et laver le précipité avec environ 500 μL d’éthanol à 70 %. Retirez complètement l’éthanol et séchez brièvement le précipité.
10. Ajouter 20 μL de tampon TE (10 mM de Tris-Cl (8,0) et 1 mM d’EDTA) au précipité, mélanger brièvement et laisser le tube toute la nuit à température ambiante pour dissoudre le précipité.
    REMARQUE : Si les utilisateurs sont pressés, maintenez les tubes à 37-50 °C. Le précipité d’ADN se dissoudra en quelques heures.
11. Une fois que la pastille est complètement dissoute, transformez E. coli avec une petite quantité de cette solution d’ADN.
    REMARQUE : Environ 0,5 μL de solution d’ADN est suffisant si E . coli à haute efficacité de transformation est utilisé.
12. Lorsque des colonies d’E. coli apparaissent, choisissez plusieurs colonies indépendantes, cultivez-les et récupérez les plasmides par des méthodes standard, telles que la lyse alcaline.
13. Introduisez l’ADN plasmidique obtenu à l’étape 4.12 dans les cellules hôtes Y2H hébergeant le plasmide d’appât. Lorsque des transformants apparaissent, vérifiez-les par le test de couleur (ils doivent apparaître blancs) et le western blot⁴ (ils doivent exprimer une protéine de la taille souhaitée).
    REMARQUE : La méthode post-alcaline¹² est un moyen facile et rapide de préparer un extrait de cellule entière à partir de levure.
14. Si les deux critères ci-dessus sont remplis, déterminer le site de mutation des clones par séquençage nucléotidique⁴.

Récemment, il a été constaté que la moitié C-terminale de la protéine Pol2 (Pol2-C) interagit avec Mcm10. Les deux protéines sont essentielles à l’initiation de la réplication de l’ADN et, par conséquent, à la croissance cellulaire chez la levure bourgeonnante Saccharomyces cerevisiae 13,14,15. Pour aider à comprendre la signification biologique de cette interaction, les mutants Pol2-C qui n’ont pas ou moins d’interaction avec Mcm10 ont été isolés à l’aide de la méthode décrite ici.

Une banque de mutations a été construite selon la méthode décrite à l’étape 1. Des fragments d’ADN Pol2-C ont été amplifiés avec la polymérase GoTaq et clonés dans le vecteur Gal4AD (pST2525) à l’aide de l’enzyme In-Fusion. Le nombre de clones indépendants dans la bibliothèque a été estimé à 5000.

Comme décrit à l’étape 2, l’ADN du plasmide de la banque a été introduit dans la souche hôte Y2H TAT-7, qui a été prétransformée avec le plasmide LexA-Mcm10. Les cellules ont été étalées sur une plaque SC-LW et répliquées sur les plaques SC-LW et SC-LW+G418 le lendemain. Les répétitions ont été soumises au test de couleur décrit à l’étape 3. Certains des résultats de l’essai couleur sont présentés à la figure 1C.

Quarante-sept colonies qui étaient blanches dans le test de couleur et résistantes au G418 ont été isolées comme premières candidates à partir d’environ 8500 transformants. Ils ont été testés à nouveau avec le test de couleur, et 25 des 47 clones ont été confirmés comme étant blancs (Figure 2A). Ces 25 clones ont été retenus comme candidats. Des ADN plasmidiques candidats ont été récupérés de chacun des 25 candidats, comme décrit à l’étape 4. Ils ont été réintroduits dans des cellules hôtes de levure Y2H hébergeant LexA-Mcm10 et testés avec le test de couleur, et 16 clones manquant de couleur ont été sélectionnés. Pour confirmer qu’il s’agissait de mutants faux-sens Pol2-C, l’expression de la protéine Pol2-C a été confirmée par western blot. Douze candidats ont présenté une bande à une position presque identique à celle du témoin positif (protéine de fusion Gal4AD-HA-Pol2-C-KanMX, calculée m.w. : 158,8 kDa) (Figure 2B). Le test couleur a montré que ces 12 clones n’interagissaient pas avec Mcm10 (Figure 2C). Après avoir déterminé les séquences nucléotidiques de ces clones, il a été confirmé qu’ils présentaient tous une ou plusieurs mutations faux-sens. Le nombre de mutations faux-sens variait de un à cinq (données non présentées). En moyenne, environ une mutation faux-sens s’est produite toutes les 1000 bases.

Figure 1 : Schémas de l’approche basée sur Y2H pour le dépistage des mutants sans interaction/altérés. (A) Le système Y2H. (B) Stratégie pour isoler les mutants sans interaction/altérés. 1 : Le vecteur Y2H nouvellement construit contient une copie du gène KanMX en aval de l’étiquette Y2H, du domaine DB et de l’AD. Il est important de noter que ce gène KanMX n’a pas de codon de départ et qu’il est hors cadre de l’étiquette Y2H. Par conséquent, on ne s’attend pas à ce que le gène KanMX soit exprimé à partir de ce vecteur. Lorsque le fragment d’ADN amplifié par PCR est inséré dans le vecteur, le gène KanMX est dans le cadre avec l’étiquette Y2H et exprimé. Par conséquent, seuls les plasmides hébergeant l’insert de type sauvage ou un insert avec une ou plusieurs mutations faux-sens peuvent exprimer le gène KanMX, qui confère une résistance à G418. Les plasmides présentant une mutation non-sens ou un décalage de cadre ne peuvent pas exprimer le gène KanMX. 2 : La banque de mutants construite à l’étape 1 est introduite dans les cellules de levure hôte Y2H. Lorsque des transformants apparaissent, des répliques sont fabriquées. En comparant l’expression d’un ou plusieurs gènes rapporteurs et la résistance à G418, des candidats de mutants sans interaction/altérés peuvent être sélectionnés. (C) Un exemple de dépistage. La banque de plasmides, qui hébergeait Gal4-AD et un fragment d’ADN Pol2-C mutagénisé par PCR, a été introduite dans la souche hôte Y2H TAT-7, qui a été prétransformée avec le plasmide LexA-Mcm10. Des images de cellules avant (à gauche) et après (au milieu) le test couleur et de cellules cultivées sur une plaque SC-LW+G418 (à droite) sont présentées. Des exemples de candidats de mutants sans interaction/altérés et de faux candidats sont indiqués respectivement par des pointes de flèches blanches et noires. (D) Séquence d’ADN autour du site de clonage des vecteurs Y2H, AD (en haut) et DB (en bas). La séquence des dix derniers acides aminés (aa) de l’étiquette Y2H (rouge) à la portion correspondant aux dix premiers aa de KanMX (vert) est affichée. Les sites de reconnaissance de SmaI et BamHI sont également présentés. Les positions des amorces de PCR sont indiquées en bas lorsque le site BamHI est utilisé comme site de clonage. Les mêmes amorces s’appliquent pour cloner le gène d’intérêt dans les autres plasmides (pST2303/2523). Cette figure a été modifiée à partir de Tanaka et al.4. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Un exemple du processus de criblage de mutants sans interaction/altérés. (A) Les 47 colonies isolées en tant que clones candidats, comme le montre la figure 1C, ont de nouveau été cultivées sur un milieu SC-LW contenant G418 et soumises au test de couleur. + : contrôle positif (Wt Pol2-C), - : contrôle négatif (vecteur). Les clones candidats numérotés de 1 à 25 ont été cultivés pour récupérer les plasmides. (B) Des plasmides ont été récupérés de chaque clone candidat en (A), introduits dans les cellules hôtes Y2H, et à nouveau soumis au test de couleur. Seize d’entre eux étaient blancs (sans couleur). Des extraits de cellules entières ont été préparés à partir de ceux-ci, et un western blot avec un anticorps monoclonal anti-HA a été effectué. Le numéro sur le panneau correspond au numéro (A). Des analyses ont été effectuées sur plusieurs clones plasmidiques indépendants récupérés sur chaque candidat sauf #6. (C) Résultats de l’essai de couleur pour les 12 clones finaux. Les numéros correspondent à ceux de (A). #16, qui a conservé l’interaction avec Mcm10, a été utilisé comme contrôle positif dans le test couleur. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Liste des vecteurs Y2H contenant KanMX hors cadre avec la balise Y2H.

Dossier supplémentaire 1 : Un exemple des mélanges de PCR, les détails de l’amorce et les conditions de réaction. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun conflit d’intérêts.