Le virus adéno-associé est produit en culture cellulaire en suspension et purifié par centrifugation à double gradient de densité d’iodixanol. Des étapes sont incluses pour augmenter le rendement total du virus, réduire le risque de précipitation du virus et concentrer davantage le produit viral final. Les titres finaux attendus atteignent 10à 12 particules virales/mL et conviennent à une utilisation préclinique in vivo .
Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.
Article de méthode
Culture en suspension, production et purification de virus adéno-associés par centrifugation par gradient de densité d’iodixanol pour des applications in vivo
Dans cet article
Résumé
Résumé
Ce protocole décrit la production et la purification de virus adéno-associés recombinants (rAAV) par centrifugation par gradient de densité d’iodixanol, une méthode de purification de l’AAV indépendante du sérotype décrite pour la première fois en 1999. Les vecteurs rAAV sont largement utilisés dans les applications de thérapie génique pour délivrer des transgènes à divers types de cellules humaines. Dans ce travail, le virus recombinant est produit par transfection de cellules Expi293 en culture en suspension avec des plasmides codant pour les gènes auxiliaires du transgène, de la capside vectorielle et de l’adénoviral. La centrifugation par gradient de densité d’iodixanol purifie les particules AAV complètes en fonction de la densité des particules. De plus, trois étapes sont incluses dans cette méthodologie désormais omniprésente afin d’augmenter le rendement total du virus, de diminuer le risque de précipitation due aux protéines contaminantes et de concentrer davantage le produit viral final, respectivement : précipitation des particules virales à partir de milieux cellulaires à l’aide d’une solution de polyéthylène glycol (PEG) et de chlorure de sodium, introduction d’un deuxième cycle de centrifugation par gradient de densité d’iodixanol, et échange de tampon via un filtre centrifuge. En utilisant cette méthode, il est possible d’obtenir des titres constants de l’ordre de 10à 12 particules virales/mL d’une pureté exceptionnelle pour une utilisation in vivo .
Introduction
Les vecteurs viraux adéno-associés recombinants (rAAV) sont des outils largement utilisés pour le traitement des maladies génétiques, notamment l’amyotrophie spinale, la dystrophie rétinienne et l’hémophilie A 1,2,3. Les vecteurs rAAV sont conçus pour ne pas contenir de gènes viraux présents dans l’AAV4 de type sauvage, un petit virus icosaédrique sans enveloppe avec un génome linéaire monocaténaire de 4,7 kb. L’AAV a été découvert pour la première fois dans les années 1960 en tant que contaminant des préparations d’adénovirus5.....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Protocole
La composition des solutions et des tampons utilisés dans ce protocole est fournie dans le tableau 1.
| Solution | Composition | |
| Tampon de lyse AAV | 1,2 mL de solution de NaCl 5 M | |
| 2 mL de solution de 1 M de Tris-HCl pH 8,5 | ||
| 80 μL de solution de 1 M de MgCl2 | ||
| mQ d’eau à 40 mL | ||
| Solution de précipitation AAV | ||
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Résultats
Cette méthode peut être utilisée pour obtenir des titres d’au moins 10à 12 particules virales par ml. Un titre peut être obtenu (Figure 3) par qPCR à l’aide des amorces ITR fournies dans le tableau supplémentaire 1, par ddPCR ou par toute autre méthode de titrage. Des titres sous-optimaux pourraient résulter de l’utilisation d’un gène cap codant pour une capside avec une faible efficacité d’emballage.
Une autre source possible .......
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Discussion
Le protocole de purification à double gradient de densité d’iodixanol est la méthode universelle car il est applicable à tous les variants mutants AAV, quelle que soit leur spécificité de récepteur. Les premières méthodes de purification des AAV reposaient sur la densité des particules et comprenaient la centrifugation isopycnique dans le CsCl et la centrifugation continue par gradient de densité du saccharose19. Plus tard, des approches spécifiques au sérotype ont été développées, qui ont utilisé.......
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont aucune divulgation à signaler.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 5810 R centrifugeuse de paillasse | Eppendorf | 22625501 | |
| pompe péristaltique à 8 canaux ; | Watson-Marlow | 020.3708.00A | |
| Compteur automatisé de cellules ; | NanoEntek | EVE-MC | |
| Avanti J-E centrifugeuse à grande vitesse | Beckman Coulter | 369001 | |
| Benzonase | Thermo Scientific | 88701 | |
| Armoire de sécurité biologique | Labconco | 322491101 | |
| CO2 incubateur avec agitateur ; | Réglé à 8 % CO2 et 37 ° ; C | ||
| Tubes à centrifuger coniques | Thermo Scientific | 339652 | 50 mL |
| Tubes à centrifuger coniques | Thermo Scientific | 339650 | 15 mL |
| Micro-pipettes jetables | Fisherbrand | 21-164-2G | Capillaires |
| saline tamponnée au phosphate Dulbecco’s sans CaCl2 et MgCl2sp ; (DPBS) (10 fois) | Sigma-Aldrich | D1408 | |
| ECLIPSE Ts2R-FL microscope inversé | Nikon | ||
| Expi293 Expression Medium | Gibco | A1435101 | |
| Expi293F cellules | Gibco | A14527 | |
| Filtres | USA Scientific | 1126-7810 | 1000 µ ; L |
| Filtres | USA Scientific | 1120-8810 | 200 µ ; L |
| Filtres | USA Scientific | 1120-1810 | 20 & micro ; L |
| Filtres | USA Scientific | 1121-3810 | 10 µ ; L |
| Aiguilles hypodermiques | Tyco Healthcare | 820112 | 20 GA x 1-1/2 A |
| Seau à glace avec couvercle | VWR | 10146-184 | |
| JS-5.3 rotor | Beckman Coulter | 368690 | |
| Solution de chlorure de magnésium (1 M) | Millipore Sigma | M1028-100ML | |
| Support et pince métalliques ; | Fisherbrand | 05-769-6Q | |
| Microtubes à centrifuger | Eppendorf | 22600028 | 1,5 mL |
| bec effilé | |||
| Optima XE-90 ultracentrifugeuse | Beckman Coulter | A94471 | |
| Opti-MEM I Sérum réduit Moyen | Gibco | 31985062 | |
| OptiPrep média à gradient de densité (iodixanol) | Serumwerk | AXS-1114542 | Solution d’iodixanol à 60 % |
| P1000 Pipet | Gilson | F144059M | |
| P2 Pipet | Gilson | F144054M | |
| P20 Pipet | Gilson | F144056M | |
| P200 Pipet | Gilson | F144058M | |
| Rouge phénol solution | Sigma-Aldrich | P0290 | |
| Solution saline tamponnée au phosphate (PBS) | Sigma-Aldrich | P4474 | |
| Contrôleur de pipette Pipet-Aid XP | Drummond Scientific | 4-000-101 | |
| Plasmide pCapsid | De novo ou Addgene, etc. | N/A | Nous avons utilisé pACGrh74. ; |
| Plasmide pHelper | Addgene | 112867 | |
| Plasmide pTransgene | De novo ou Addgene, etc. | N/A | Nous avons utilisé pdsAAV-GFP. |
| Solution de polyol Pluronic F-68 (10 %) | Mp Biomedicals | 92750049 | |
| Polyéthylène glycol 8000 | Research Products International | P48080-500.0 | |
| Polyéthylénimine HCl Max (PEI-Max) | Polysciences | NC1038561 | Diluer dans l’eau à 40 &mu ; M |
| Tubes à centrifuger en polypropylène, stériles | Corning | 431123 | 500 mL |
| Tubes à centrifuger en polypropylène, stériles | Corning | 430776 | 250 mL |
| Tubes en polypropylène Optiseal | Beckman Coulter | 361625 | |
| Pipettes sérologiques | Alkali Scientific | SP250-B | 50 mL |
| Pipettes sérologiques | Alkali Scientific | SP225-B | 25 mL |
| Pipettes sérologiques | Alkali Scientific | SP210-B | 10 mL |
| Pipettes sérologiques | Alkali Scientific | SP205-B | 5 mL |
| Fioles agitatrices | Fisherbrand | PBV1000 | 1 L |
| Fioles agitatrices | Fisherbrand | PBV50-0 | 500 mL |
| Fioles agitatrices | Fisherbrand | PBV250 | 250 mL |
| Fioles agitatrices | Fisherbrand | PBV12-5 | 125 mL |
| Solution de chlorure de sodium (5 M) | Fisher Scientific | NC1752640 | |
| Seringues stériles | Fisherbrand | 14-955-458 | 5 mL |
| Filtre à seringue | Millipore | SLGV013SL | 0,22 micron |
| Tris-HCl pH 8,5 (1 M) | Kd Médical | RGE3363 | |
| Trypan bleu solution | Gibco | 15250061 | |
| Ensemble de rack de tubes | Beckman Coulter | 361646 | |
| Entretoises de tube (x4) | Beckman Coulter | 361669 | |
| Tube pour pompe péristaltique | Fisher Scientific | 14190516 | |
| Type 70 Ti Rotor en titane à angle fixe | Beckman Coulter | 337922 | |
| Congélateur ultra basse température | Réglé à -70 ° ; C | ||
| Concentrateur centrifuge Vivaspin 20 | Sartorius | VS2041 | |
| Bain-marie ; | Fixé à 37 ° ; L |
Références
- Strauss, K. A., et al. Onasemnogene abeparvovec for presymptomatic infants with three copies of SMN2 at risk for spinal muscular atrophy: the Phase III SPR1NT trial. Nat Med. 28 (7), 1390-1397 (2022).
- Fuller-Carter, P. I., Basiri, H., Harvey, A. R., Carvalho, L. S.
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Réimpressions et autorisations
