Modèle postopératoire d’iléus murin

Résumé

Nous décrivons un modèle murin d’iléus postopératoire généré par manipulation intestinale. La fonction du transit gastro-intestinal, les changements pathologiques et l’activation des cellules immunitaires ont été évalués 24 h après la chirurgie.

Résumé

La plupart des patients souffrent d’iléus postopératoire (POI) après la chirurgie, ce qui est associé à une augmentation de la morbidité, de la mortalité et du temps d’hospitalisation. Le POI est une conséquence de dommages mécaniques pendant la chirurgie, entraînant une perturbation de la motilité dans le tractus gastro-intestinal. Les mécanismes de l’IOP sont liés à une sensibilité neuronale aberrante, à une altération de la fonction de barrière épithéliale et à une augmentation de l’inflammation locale. Cependant, les détails restent énigmatiques. Par conséquent, les modèles murins expérimentaux sont cruciaux pour élucider la physiopathologie et le mécanisme des lésions POI et pour le développement de nouvelles thérapies.

Ici, nous introduisons un modèle murin de POI généré par manipulation intestinale (IM) qui est similaire à la chirurgie clinique ; Ceci est réalisé par des dommages mécaniques à l’intestin grêle en massant l’abdomen 1 à 3 fois avec un coton-tige. Retard du transit gastro-intestinal IM 24 h après la chirurgie, tel qu’évalué par gavage FITC-dextran et détection par fluorescence du tube digestif segmentaire. De plus, le gonflement tissulaire de la sous-muqueuse et l’infiltration des cellules immunitaires ont été étudiés par coloration à l’hématoxyline et à l’éosine et par cytométrie en flux. Une pression appropriée de l’IM et un effet hyperémique sur l’intestin sont essentiels pour la procédure. Ce modèle murin de POI peut être utilisé pour étudier les mécanismes de lésions intestinales et de récupération après une chirurgie abdominale.

Introduction

L’iléus postopératoire (POI) est un syndrome qui pose un défi important dans le domaine de la santé humaine, notamment dans la prise en charge des patients subissant une chirurgie abdominale. Caractérisé par une récupération retardée de la motilité gastro-intestinale, le POI contribue à des séjours prolongés à l’hôpital et à une augmentation des coûts des soins de santé, mais il n’existe aucune définition, étiologie ou traitement établi¹. Des recherches récentes ont mis en lumière le rôle central des cellules immunitaires dans la progression de POI ^2,3,4, mais des recherches supplémentaires sont nécessaires pour élucider les mécanismes sous-jacents impliqués.

Dans ce protocole, nous introduisons un modèle murin de POI induit par la chirurgie intra-abdominale, qui imite étroitement l’impact de la chirurgie abdominale sur le tube digestif. Notre objectif était de fournir une méthode standardisée de modélisation de la POI chez la souris, permettant aux chercheurs d’étudier sa physiopathologie et d’explorer de nouvelles interventions thérapeutiques.

La raison d’être du développement et de l’utilisation de cette technique réside dans le besoin de modèles précliniques fiables pour étudier le POI. Les approches traditionnelles d’étude des POI manquent souvent de pertinence translationnelle ou ne parviennent pas à saisir l’interaction complexe des facteurs contribuant à la maladie. En introduisant un modèle murin qui reproduit fidèlement le scénario clinique, les chercheurs peuvent étudier plus précisément les mécanismes sous-jacents aux POI et tester des interventions thérapeutiques potentielles dans un cadre expérimental contrôlé.

Par rapport aux techniques alternatives, le modèle murin de POI présenté dans ce protocole offre plusieurs avantages. Initialement, nous avons intégré nos résultats expérimentaux aux progrès récents afin d’établir un protocole standardisé et reproductible pour induire des POI chez les animaux de laboratoire. Ce protocole facilite l’évaluation cohérente de la fonction de transit gastro-intestinal. Deuxièmement, l’utilisation de la coloration histologique et de la cytométrie en flux a permis d’évaluer l’enflure des tissus, la prolifération et l’activation des cellules immunitaires, ce qui a permis d’obtenir des informations précieuses sur les processus inflammatoires sous-jacents au POI⁵.

Dans le contexte plus large de la littérature, l’établissement d’un modèle murin de POI contribue à l’expansion du corpus de recherches visant à comprendre la physiopathologie de cette maladie. En comblant le fossé entre la science fondamentale et la pratique clinique, les modèles précliniques jouent un rôle central dans l’élaboration de nouvelles stratégies thérapeutiques pour le POI⁶. De plus, la disponibilité de modèles animaux standardisés améliore la reproductibilité et la comparabilité des résultats de recherche entre différents laboratoires. Cependant, ce modèle POI repose sur une stimulation mécanique pendant l’intervention chirurgicale. D’autres formes d’iléus induit par la stimulation peuvent ne pas convenir à ce modèle. De plus, les chercheurs doivent tenir compte de facteurs tels que les réglementations sur le bien-être animal, les considérations éthiques et la disponibilité des ressources lors de la planification d’expériences utilisant ce modèle.

En résumé, l’introduction d’un modèle murin de POI représente une avancée notable dans la recherche préclinique sur cette maladie débilitante. De plus, nous avons utilisé la coloration H&E et la cytométrie en flux pour évaluer l’enflure des tissus et la prolifération et l’activation des cellules immunitaires. L’établissement d’un modèle murin de POI faciliterait la découverte de mécanismes POI et favoriserait le développement de nouvelles thérapies pour le POI.

Protocole

Les soins aux animaux et les procédures expérimentales ont été menés conformément aux Principes directeurs relatifs au soin et à l’utilisation des animaux (Chine) et ont été approuvés par le Comité d’éthique de l’hôpital de l’amitié de Pékin (n° 20-2056). Des souris C57BL/6 (âgées de 8 à 12 semaines) ont été utilisées pour l’étude.

1. Préparation à l’opération

1. Accélérer toutes les souris pendant 12 h avant la modélisation prévue pour répondre à la standardisation des conditions expérimentales (Figure 1A).
2. Préparer et stériliser les instruments chirurgicaux.
3. Préparez l’anesthésique tribromoéthanol et le coussin chauffant. Surveillez le coussin chauffant pour éviter la surchauffe et maintenez-le à une température constante (37,5 °C).

2. Anesthésie

1. Anesthésie chaque souris avec du tribromoéthanol.
   1. Diluer le tribromoéthanol pour préparer une solution à 20 mg/mL dans une solution saline normale. Administrer 0,2 mL de la solution de travail au tribromoéthanol pour 10 g de poids corporel par injection intrapéritonéale. Utilisez une pommade ophtalmique sur les yeux des souris pour prévenir la sécheresse sous anesthésie.
   2. Assurez-vous que les souris sont complètement anesthésiées dans les 5 minutes et restez anesthésiées pendant 20 minutes.
2. Évaluez la profondeur de l’anesthésie en observant l’incapacité de la souris à rester droite et vérifiez la relaxation musculaire. Observez la perte de mouvement volontaire, le réflexe de clignement des yeux et la réponse à la stimulation réflexe (pincement de l’orteil ou de la queue avec une pression ferme).
3. Évaluez la fréquence respiratoire et le schéma respiratoire de la souris en surveillant les mouvements de la paroi thoracique et de l’abdomen. Assurez-vous que la fréquence respiratoire est de ~ 55-65 respirations/min sous anesthésie optimale.
4. Placez la souris anesthésiée sur une planche et fixez-la avec du ruban adhésif.
5. Une fois les souris complètement anesthésiées, utilisez un rasoir électrique pour enlever les poils de l’abdomen. Après le rasage, essuyez tous les poils morts de l’abdomen à l’aide d’une boule de coton imbibée d’une solution saline.
   REMARQUE : Assurez-vous d’une ventilation adéquate et de l’utilisation d’une hotte ou d’une enceinte de biosécurité lors de la manipulation du tribromoéthanol afin de minimiser les risques d’exposition. Pendant l’intervention, portez un équipement de protection individuelle approprié, y compris des gants et des blouses de laboratoire, pour éviter tout contact accidentel avec des produits chimiques et des matières biologiques.

3. Chirurgie

1. Étendez complètement les membres pour exposer l’abdomen. Assurez-vous que la tête de la souris est positionnée de manière à maintenir les voies respiratoires dégagées (Figure 1B).
2. Désinfectez la peau de la zone chirurgicale à deux reprises à l’aide d’une boule de coton imbibée d’alcool à 75 %. Après la désinfection, utilisez une gaze médicale sèche et stérile pour éliminer l’excès d’alcool de l’abdomen. Administrer de la lidocaïne (10 mg/kg, par voie sous-cutanée) à l’endroit prévu avant l’incision.
3. À l’aide d’un scalpel stérile, faites une incision dans la peau et soulevez le muscle droit de l’abdomen au milieu de l’abdomen à l’aide d’une pince à épiler.
   1. Faites une petite incision le long de la ligne médiane du muscle droit de l’abdomen, en prenant soin d’éviter de blesser divers organes de l’abdomen.
   2. Assurez-vous que l’amplitude approximative de l’incision est la suivante. Assurez-vous que le bord supérieur de l’incision est de 6 à 8 mm de l’apophyse xiphoïde du sternum, que le bord inférieur est de 6 à 8 mm des organes génitaux externes et que la longueur de l’incision est de ~1 cm.
4. Placez un morceau de champ chirurgical stérile ou de gaze stérile des deux côtés de l’incision abdominale. À l’aide d’une pince hémostatique, la gaze stérile est fixée sur les bords supérieur et inférieur de l’incision, exposant ainsi l’incision (figure 1C).
   REMARQUE : Dans le groupe simulé, l’incision a été recouverte de gaze humide pendant 5 minutes sans aucune opération chirurgicale.
5. Fixez correctement le champ ou la gaze stérile, puis utilisez deux cotons-tiges pré-humidifiés avec du sérum physiologique pour appuyer doucement contre les deux côtés de la paroi abdominale adjacente à l’incision. Pressez une petite quantité du tube intestinal à travers l’incision et exposez-le en le plaçant sur le champ stérile ou la gaze (Figure 1D).
6. Humidifiez complètement deux cotons-tiges stériles avec une solution saline normale. Saisissez doucement le tissu intestinal avec les cotons-tiges humidifiés et retirez soigneusement l’intestin grêle.
   1. Localisez le cæcum puis retirez l’intestin avec les cotons-tiges stériles jusqu’à 2 cm avant l’estomac pour éviter de toucher le pancréas. Étendre l’intestin de l’extrémité proximale du ligament pancréato-duodénal à l’extrémité distale de la région iléo-caecale.
7. Appliquez une pression constante sur tout l’intestin grêle, de l’extrémité proximale à l’extrémité distale. Assurer une application de force uniforme pendant 5 minutes jusqu’à ce que de petites taches de saignement apparaissent à la surface de l’intestin (figure 1E).
8. Après 5 min, utilisez des cotons-tiges stériles pré-humidifiés pour replacer soigneusement tous les intestins grêles dans la cavité abdominale, en suivant la position anatomique physiologique normale de l’intestin grêle.
9. Massez doucement l’abdomen sur la gaze stérile et la paroi abdominale pendant 3 à 5 secondes pour s’assurer que l’intestin est rétabli dans sa position anatomique naturelle et pour prévenir l’obstruction intestinale mécanique artificielle ou la torsion mésentérique après la chirurgie.
10. Injectez 100 μL de solution saline dans la cavité abdominale pour remplacer les liquides perdus pendant l’opération et lubrifier le tissu abdominal.
11. Fermez l’abdomen à l’aide d’une suture chirurgicale 6-0 et effectuez une fermeture à deux couches au niveau de l’incision abdominale. Commencez par fermer la couche musculaire avec des sutures continues, en prenant soin d’éviter d’endommager les organes abdominaux. Soulevez le muscle droit de l’abdomen pendant la suture (Figure 1F).
12. Après avoir complètement fermé le muscle droit de l’abdomen, suturez-le complètement avec des sutures intermittentes simples à l’aide d’une suture chirurgicale 6-0. Maintenez une longueur de point de ~0,5 mm et un espacement des aiguilles de ~2 mm.
13. Après avoir fermé l’incision abdominale, essuyez doucement la zone près de l’incision avec de la gaze médicale sèche et stérile pour la garder sèche et exempte de sang, de liquide tissulaire ou de solution saline normale.
14. Appliquez une petite quantité d’adhésif médical pour incision sur et autour de l’incision pour éviter de se fendre après la chirurgie.
15. Une fois que l’adhésif d’incision médicale a complètement séché, transférez les souris sur une serviette en papier et placez la serviette en papier cage sur une couverture chauffante maintenue à une température constante de 37,5 °C jusqu’à ce que les souris se rétablissent complètement. Ne laissez pas les animaux sans surveillance jusqu’à ce qu’ils aient repris une conscience suffisante pour maintenir le décubitus sternal.
16. Transférez les souris éveillées dans l’environnement de la barrière d’alimentation des animaux et laissez-les boire librement jusqu’au moment de la détection.

4. Test de transit gastro-intestinal

1. Administrer 200 μL de solution de FITC-dextran (5 mg/mL dans du PBS) aux souris à jeun par gavage 22,5 h après la chirurgie (figure 1A).
2. Euthanasier les souris à l’aide d’une méthode approuvée par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC), comme l’inhalation de CO₂ suivie d’une luxation cervicale.
   1. Pour isoler le tube digestif, faites une incision médiane du diaphragme au bassin, en retirant soigneusement les tissus conjonctifs et les organes environnants.
   2. Séparez le tube digestif des tissus et organes environnants, en vous assurant que tout le tractus de l’estomac à l’anus est inclus.
3. Divisez le tube digestif en 15 segments égaux (de l’estomac au côlon), numérotés séquentiellement de 1 à 15 en fonction de la position physiologique (séquence : St -S1 :S10-Ce-L1 :L3) (Figure 2A).
4. Coupez chaque segment de tissu intestinal avec son contenu en morceaux mesurant de 1 à 4 mm et placez-les dans des tubes à centrifuger séparés de 1,5 ml contenant 1 ml de DPBS.
5. Vortex les tubes de centrifugation pendant 10 s pour homogénéiser les échantillons.
6. Centrifuger les tubes à 500 × g pendant 1 min. Prélever le surnageant pour la quantification de la fluorescence FITC à l’aide d’un lecteur de microplaques multimode.
7. Décrivez le transit gastro-intestinal en calculant le centre géométrique (CG) du FITC-dextran et calculez à l’aide de la formule suivante : (Σ[ % FITC par segment x nombre de segments])/100.

5. Enrobage de paraffine et coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (HE)

1. Euthanasier les souris par inhalation de CO₂ suivie d’une luxation cervicale après 24 h. Effectuez l’enrobage de paraffine et les tests gastro-intestinaux sur le même animal.
2. Ouvrez la cavité abdominale et prélevez du tissu de l’intestin grêle pour une analyse plus approfondie.
3. Fixez l’ensemble de l’intestin avec le contenu intestinal dans le fixateur de Carnoy (60 % de méthanol + 10 % d’acide acétique + 30 % de chloroforme) à 4 °C pendant 2 h.
4. Désacidifiez les tissus en les rinçant deux fois au méthanol pendant 30 minutes à chaque fois.
5. Remplacez le méthanol par de l’éthanol deux fois pendant 30 minutes à chaque fois.
6. Désacidifiez les tissus en les rinçant deux fois au méthanol pendant 30 minutes à chaque fois. Pour obtenir une transparence tissulaire avec du xylène, immergez le tissu dans du xylène et incubez pendant 1 h.
7. Incorporez le tissu dans de la cire de paraffine à l’aide d’une machine d’enrobage de paraffine. Coupez le tissu incrusté en tranches de 4 m d’épaisseur à l’aide d’un microtome.
   REMARQUE : Divisez l’intestin grêle en différentes cires pour améliorer les performances. Étiquetez correctement les segments pour identifier leur emplacement.
8. Effectuez la coloration HE à l’aide du kit de coloration HE. Scellez les lames et examinez-les au microscope pour analyse.

6. Isolement des cellules immunitaires et cytométrie en flux

1. Préparez les solutions suivantes.
   1. Solution de prédigestion : Préparez la solution saline équilibrée de Hank’s sans Ca²⁺ et Mg²⁺ avec 1 mM de dithiothréitol (DTT) et 10 mM d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA).
   2. Solution de digestion : Préparez une solution contenant 200 μg/mL de DNAase I, 500 μg/mL de collagénase IV, 4 % de FBS et 100 μM de tampon HEPES dans RPMI 1640.
   3. Tampon MACS (Magnetic Activated Cell Sorting Works) : Préparez un tampon contenant 5 g/L de BSA et 2 mM d’EDTA dans du PBS sans Ca²⁺ ou Mg²⁺.
2. Éliminez le contenu fécal en lavant les intestins avec une solution saline normale. Retirez les plaques de Peyer et le tissu conjonctif de l’intestin grêle. Coupez l’intestin grêle dans le sens longitudinal, puis coupez-le en segments de 1 cm dans du PBS glacé.
3. Laver les segments de l’intestin avec une solution de prédigestion à 37 °C pendant 20 min sur un agitateur orbital. Prélever la solution de prédigestion et la filtrer à travers des crépines cellulaires de 70 μm pour obtenir des lymphocytes intra-épithéliales (IEL).
4. Digérer les segments dans la solution de digestion pendant 30 min, puis filtrer la suspension à travers des crépines cellulaires de 70 μm pour obtenir des lymphocytes de lamina propria (LPL).
5. Centrifuger les cellules LPL à 500 × g pendant 10 min et jeter le surnageant.
6. Laver et suspendre les cellules avec du DPBS (azoture de sodium, Tris et sans protéines) à une concentration de 1 x 10⁶ cellules/100 μL.
7. Incuber les cellules avec un colorant de viabilité fluorescent (1:500) pendant 15 min à température ambiante (RT) dans l’obscurité.
8. Suspendez les cellules avec un tampon MACS et centrifugez-les à 500 × g pendant 5 min.
9. Comptez les cellules colorées à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur de cellules automatisé. Remettre les cellules en suspension à une concentration de 1 x 10⁶ cellules/100 μL de tampon MACS. Effectuer la coloration des anticorps (1:200-1:400) en ajoutant le volume approprié d’anticorps à la suspension cellulaire et en incubant à 4 °C pendant 15 min.
10. Lavez les cellules comme décrit à l’étape 6.8.
11. Détectez les échantillons à l’aide de la cytométrie en flux et analysez les données à l’aide du logiciel de cytométrie en flux^{associé 7,8}.

Résultats

Dans ce protocole, le POI a été induit chirurgicalement par une manipulation intestinale (MI), ce qui est similaire à l’effet de la chirurgie clinique. Dans le groupe fictif, une incision a été pratiquée sans l’IM. Les souris POI ont été sacrifiées 24 heures après la chirurgie POI avec des souris témoins factices. La fonction critique du tube digestif, la fonction de transit du contenu, a été détectée par gavage de FITC-dextran. Le modèle POI a été considéré comme un succès parce que l’intensité de la FITC a augmenté dans la partie proximale de l’intestin grêle (figure 2B). Les GC moyennes ont été calculées pour quantifier le dysfonctionnement du transit de l’IM et indiquer la cohérence de l’opération (figure 2C).

La coloration à l’EH a indiqué la morphologie des différents segments du tube digestif (Figure 3). La sous-muqueuse et la couche musculaire lisse du duodénum et de l’iléon sont devenues enflées 24 h après l’induction du POI (Figure 3A,B). Par rapport à celles des souris fictives, la coloration HE du duodénum a révélé une augmentation de l’infiltration des cellules immunitaires chez les souris POI (Figure 3A).

L’analyse cytométrique en flux multicolore est la méthode centrale pour analyser la proportion, l’état et la fonction des cellules immunitaires. Le tissu intestinal a été digéré avec de la collagénase et de la désoxyribonucléase et séparé en une suspension unicellulaire pour la cytométrie en flux. La stratégie de déclenchement a été utilisée pour déterminer les proportions de lymphocytes T CD3 et de sous-populations apparentées parmi les LPL (figure 4A). Le marqueur d’activation et d’adhésion CD69 et l’expression des lymphocytes T CD4, des lymphocytes T CD8 et des lymphocytes T gd sont régulés à la hausse chez les souris POI (Figure 4B)⁷. De même, la proportion de la sous-population CD44+-1+ (marqueur d’activation, de différenciation terminale et d’épuisement) a montré une tendance à la hausse (Figure 4C)⁷. En plus des lymphocytes, les proportions de sous-ensembles de cellules myéloïdes (neutrophiles, cellules dendritiques et macrophages) sont également augmentées après une chirurgie IM (Figure 4D)⁸.

Figure 1 : Modèle murin de l’iléus postopératoire. (A) Schéma du modèle murin de l’iléus postopératoire. (B) Fixation de la souris après l’anesthésie et le rasage. (C) L’incision a été exposée et recouverte d’une gaze médicale stérile. (D) Des tubes intestinaux ont été extraits de la cavité abdominale par l’incision abdominale et exposés en les plaçant sur de la gaze stérile. (E) L’ensemble de l’intestin grêle a été exposé à un coton-tige stérile humidifié. (F) La couche musculaire a été fermée par une suture chirurgicale. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Test de transit gastro-intestinal pour l’évaluation de la fonction du tube digestif. 22,5 h après l’opération, les souris simulacres ou POI ont été gavées avec une solution de FITC-dextran et sacrifiées 90 minutes plus tard. (A) Le tube digestif a été divisé en 15 segments et numéroté en fonction de la position physiologique. (B) Intensité FITC de chaque segment du tube digestif des souris simulacres et POI. (C) Les centres géométriques du FITC-dextran administré ont été calculés et sont représentés sous forme de graphiques de violon. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Coloration HE représentative de l’intestin grêle chez des souris POI. Coloration HE de coupes transversales du duodénum (A) et de l’iléon (B) de souris simulacres et POI. Barres d’échelle : 100 μm ou 25 μm (image agrandie de l’encart). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Analyse cytométrique en flux représentative de cellules immunitaires de l’intestin grêle de souris POI. (A) Stratégie de contrôle par cytométrie en flux pour les populations de lymphocytes T à partir des tissus de l’intestin grêle de souris POI 24 h après la chirurgie. (B) Les proportions du marqueur actif des lymphocytes T CD69⁺ dans les lymphocytes T CD4, les lymphocytes T CD8 et les lymphocytes T gd de l’intestin grêle des souris fictives et des souris POI. (C) Les proportions de marqueurs actifs CD44⁺-1⁺ parmi les lymphocytes T CD4, les lymphocytes T CD8 et les lymphocytes T gd dans l’intestin grêle des souris fictives et des souris POI. (D) Les proportions de neutrophiles (Ly6G⁺ CD11b⁺), de cellules dendritiques (CD11c⁺ MHC-II⁺) et de macrophages (CD11b⁺ F4/80⁺) parmi les cellules immunitaires CD45^{+ Aqua-live} de l’intestin grêle de souris simulacres et POI. Le nombre dans chaque panneau représente le pourcentage des types de cellules respectifs. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

Le succès de la chirurgie repose sur plusieurs étapes critiques. Tout d’abord, il est impératif de maintenir la cohérence pendant la chirurgie intra-muros intestinale (IM) pour induire des lésions étendues à l’intestin grêle. Une pression appropriée appliquée pendant la procédure IM et l’effet hyperémique qui en résulte sur l’intestin sont cruciaux pour le succès de l’opération. L’observation de l’ensemble du tube digestif devenant rose et affichant des taches hémorragiques rouges après un frottement avec un coton-tige a servi d’indicateur de réussite de l’opération. De plus, le fait de s’assurer que la valeur moyenne de GC reste à environ 5 après la chirurgie indique que le modèle a été réussi par rapport à celui des souris opérées par placebo. L’examen microscopique de l’enflure des tissus dans la sous-muqueuse et de l’infiltration des cellules immunitaires, comme démontré par la coloration de l’EH, constitue également une étape critique pour valider la gravité de l’IOP.

Des modifications au protocole peuvent être nécessaires pour optimiser les résultats ou résoudre les problèmes rencontrés. Par exemple, pour afficher avec précision les changements morphologiques de l’épithélium intestinal, il est recommandé d’intégrer le tissu intestinal avec son contenu à l’aide du fixateur de Carnoy⁹. Ce protocole d’enrobage unique assure une fixation rapide, essentielle à la préservation de la morphologie des tissus. Cependant, si les objectifs de l’investigateur se concentrent sur l’épithélium ou la lamina propria, il est conseillé d’utiliser la technique de roulage suisse améliorée pour l’enrobage à la cire de la préparation du tissu intestinal¹⁰. Cette technique comprime l’espace interspatial du tissu intestinal et assure une direction cohérente des villosités, facilitant ainsi l’intégration de l’ensemble de l’intestin grêle dans un échantillon incrusté de cire.

Malgré son utilité, le protocole a des limites. L’une des limites est la dépendance à l’égard de modèles animaux, qui peuvent ne pas reproduire pleinement la complexité de la physiopathologie humaine. De plus, les variations dans la technique chirurgicale et les réponses individuelles des souris peuvent introduire une variabilité dans les résultats. Selon notre récente étude, l’utilisation d’un opérateur cohérent est un principe important pour réduire la variabilité dépendante de l’opérateur. De plus, Van et al. ont introduit un dispositif fabriqué par eux-mêmes capable d’appliquer un poids spécifique à l’intestin, assurant une pression constante sur l’IM chez différentes souris¹¹. Cette approche s’avère en effet précieuse pour maintenir la cohérence du modèle.

Ce protocole représente une contribution précieuse au domaine en fournissant une méthode standardisée pour induire l’IOP par chirurgie IM chez la souris. En élucidant les étapes critiques et en proposant des modifications pour l’intégration tissulaire et l’isolement des cellules immunitaires, ce protocole améliore la reproductibilité et la fiabilité de la modélisation des POI. L’utilisation de la cytométrie^{en flux 7,8} pour l’analyse des cellules immunitaires permet une étude complète de la réponse immunitaire sous-jacente à la pathogenèse des POI, complétant ainsi les techniques existantes et élargissant notre compréhension de ce syndrome complexe.

Le protocole présenté ici est prometteur pour la recherche préclinique future axée sur la compréhension et le traitement de l’IOP. En affinant les techniques chirurgicales et en optimisant les méthodes de traitement des tissus, les chercheurs peuvent explorer davantage les mécanismes sous-jacents au développement des POI et identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. De plus, la compatibilité du protocole avec la cytométrie en flux permet un profilage immunitaire approfondi, ouvrant ainsi la voie à l’étude d’interventions immunomodulatrices visant à soulager les symptômes du POI. Dans l’ensemble, le protocole jette les bases de l’avancement de nos connaissances sur les POI et de l’élaboration de stratégies thérapeutiques ciblées pour améliorer les résultats pour les patients.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
1 M HEPES	Thermo	15630080
APC anti-souris I-A/I-E (MHC-II)Biolegend		107614
APC anti-souris TCRb	Biolegend	109212
APC/Cy7 anti-souris CD4	Biolegend	100414
APC/Cy7 anti-souris Ly6G	Biolegend	127624
Brilliant Violet 421 anti-souris CD69	Biolegend	104545
Brilliant Violet 421 anti-souris F4/80	Biolegend	123132
Brilliant Violet 785 anti-souris/humain CD44	Biolegend	103041
BUV395 anti-souris CD8a	BD	563786
BUV737 anti-souris CD3e	BD	612771
Collagénase IV	Sigma-Aldrich	C5138
Microscope de culture	CKX53	Olympus
Désoxyribonucléase I du pancréas bovin (DNase I)	Sigma-Aldrich	DN25-5G
DL-Dithiothreitol solution	Sigma-Aldrich	43816-10ML
EDTA	Sigma-Aldrich	EDS-100G
FITC anti-souris CD45	Biolegend
FITC-dextran (70 kWM)	Sigma-Aldrich	FD70-100MG	Gastrointestinal Transit Assay
Kit de coloration HE	solarbio	G1120
PE anti-souris CD11b	Biolegend	101208
PE anti-souris-1	Biolegend	114118
PE/Cy7 anti-souris CD11c	Biolegend	117318
Percoll	GE (Pharmacia)	17-0891-01
Symphony A5 Cytomètre en flux	BD-Immune		détection et tri des cellules
Tribromoéthanol	Sigma-Aldrich	T48402	Anesthésie
Varioskan LUX	Thermo	N16699	Lecteur de microplaques multimode
Zombie Aqua Fixable Kit de viabilité	Biolegend	423102	Fluorescent teinture de viabilité  ;