Method Article

Différenciation et caractérisation des ostéoclastes à partir de cellules souches pluripotentes induites humaines

DOI:

10.3791/66527

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March 22nd, 2024

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1Department of Bioengineering, Department of Medicine, University of Washington, 2Department of Orthopedics and Trauma Surgery, Medical Faculty Mannheim, Heidelberg University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole présente la différenciation des ostéoclastes humains à partir des cellules souches pluripotentes induites (CSPi) et décrit des méthodes de caractérisation des ostéoclastes et des précurseurs d’ostéoclastes.

Abstract

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Ce protocole détaille la propagation et le passage des cellules iPS humaines et leur différenciation en ostéoclastes. Tout d’abord, les cellules iPS sont dissociées en une suspension unicellulaire pour une utilisation ultérieure dans l’induction du corps embryoïde. Après induction mésodermique, les corps embryoïdes subissent une différenciation hématopoïétique, produisant une population de cellules hématopoïétiques flottantes. Par la suite, les cellules hématopoïétiques récoltées subissent une étape de maturation du facteur de stimulation des colonies de macrophages et, enfin, une différenciation des ostéoclastes. Après différenciation des ostéoclastes, les ostéoclastes sont caractérisés par une coloration pour TRAP en conjonction avec une coloration nucléaire au vert de méthyle. Les ostéoclastes sont observés sous forme de polycaryons multinucléés TRAP+. Leur identification peut être renforcée par la coloration à la cathepsine K. Les tests de résorption osseuse et minérale permettent une caractérisation fonctionnelle, confirmant l’identité d’ostéoclastes authentiques. Ce protocole démontre une méthode robuste et polyvalente pour différencier les ostéoclastes humains des cellules iPS et permet une adoption facile dans les applications nécessitant de grandes quantités d’ostéoclastes humains fonctionnels. Des applications dans les domaines de la recherche sur les os, du cancer, de l’ingénierie tissulaire et de la recherche sur les endoprothèses pourraient être envisagées.

Introduction

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Les ostéoclastes (OC) sont des types cellulaires polyvalents dérivés de l’hématopoïétique 1,2 qui sont couramment utilisés par les chercheurs dans des domaines tels que la recherche sur les maladies osseuses 3,4, la recherche sur le cancer 5,6, l’ingénierie tissulaire 7,8 et la recherche sur les endoprothèses 9,10. Néanmoins, la différenciation des CO peut être difficile car la fusion des précurseurs mononucléaires en CO multinucléés est nécessaire pour créer des CO fonctionnels11. Plusieurs facteurs biologiques, tels que l’activateur du récepteur du ligand NF-κB (RANKL) et le facteur de stimulation des colonies de macrophages (M-CSF), sont nécessaires à la différenciation du CO. Il a été rapporté que le M-CSF a un effet positif sur la prolifération cellulaire, la survie cellulaire et l’expression de RANK 12,13,14. D’autre part, RANKL se lie à RANK, qui active des cascades de signalisation en aval qui induisent l’ostéoclastogenèse. L’activation est médiée par le facteur 6 associé au récepteur TNF (TRAF6), qui conduit à la dégradation du facteur nucléaire de l’activateur du gène polypeptidique léger kappa dans l’inhibiteur des lymphocytes B, alpha (IκB-α), une protéine de liaison qui se lie aux dimères NF-kB16,17. Par conséquent, la dégradation de l’IκB-α libère des dimères NF-kB, qui se transloquent ensuite dans le noyau et induisent l’expression des facteurs de transcription c-Fos et Nuclear Factor of Activated T-Cells 1 (NFATc1). Ceci, à son tour, déclenche la transcription d’une multitude de protéines liées à la différenciation OC 15,18. Des protéines régulées à la hausse telles que DC-Stamp et Atp6v0d2 interviennent dans la fusion cellule-cellule des précurseurs de CO, conduisant à la formation de syncytium 19,20,21.

En ce qui concerne les cellules primaires humaines, les PBMC CD34+ et CD14+ sont actuellement les types de cellules les plus utilisés pour la différenciation en OC22. Cependant, cette approche est limitée par l’hétérogénéité au sein de la population CD34+ des cellules prélevées sur des donneurs23 et leur capacité d’extensibilité limitée. Les CSPi humaines constituent une source alternative de CO. Comme ils peuvent être propagésindéfiniment 24, ils permettent l’évolutivité et la mise à l’échelle de la production de CO. Cela permet de différencier un grand nombre de CO, ce qui facilite la recherche sur les CO.

Plusieurs protocoles pour la différenciation des CSPi en CO ont été publiés 25,26,27. L’ensemble du processus de différenciation peut être divisé en une partie de propagation des CSPi, une partie de différenciation mésodermique et hématopoïétique et une partie de différenciation des CO. La propagation des cellules iPS avant le processus de différenciation permet la mise à l’échelle de la production de CO avant la différenciation. Plusieurs approches existent en ce qui concerne la différenciation mésodermique et hématopoïétique. Traditionnellement, la formation du corps embryoïde (EB) a été utilisée pour différencier les cellules hématopoïétiques, mais les approches basées sur des monocouches représentent une autre stratégie de différenciation hématopoïétique qui ne nécessite pas d’induction EB. Néanmoins, les systèmes monocouches semblent nécessiter une optimisation supplémentaire, car nous et d’autres avons constaté que les approches basées sur l’EB étaient plus robustes pour la différenciation des OC.

Ici, nous décrivons la différenciation des CO des iPSC humains à l’aide d’un protocole basé sur EB. Ce protocole a été adapté de Rössler et al.26 et modifié pour augmenter la robustesse et permettre la cryoconservation pendant le processus de différenciation. Tout d’abord, nous n’avons récolté des cellules hématopoïétiques qu’une seule fois après 10 jours de différenciation. Les cellules hématopoïétiques ont ensuite été cryoconservées pour permettre une plus grande flexibilité pendant le processus de différenciation. De plus, nous avons augmenté la densité d’ensemencement des cellules hématopoïétiques de 1 x 105 à 2 x 105 cellules/cm2 pour la différenciation du CO. Un milieu humain sans sérum iPSC plus récent (hiPSC-SFM, voir le tableau des matériaux) a été utilisé, et le revêtement des puits a été effectué avec 200 à 300 μg/mL d’un extrait de membrane basale (voir le tableau des matériaux) au lieu de 0,1 % de gélatine. La pénicilline/streptomycine n’a pas été ajoutée aux médias.

Le protocole de Rössler et al.26 a été adapté à l’origine d’une CSPi à un protocole de différenciation des macrophages28 qui utilise la formation d’EB pour la différenciation hématopoïétique. Bien que la formation d’EB ait été utilisée pendant une longue période par les chercheurs pour la différenciation hématopoïétique29,30, plusieurs méthodes d’induction d’EB ont été décrites dans la littérature, telles que l’agrégation spontanée, la centrifugation dans une plaque à fond rond, la culture de gouttes suspendues, la culture de bioréacteurs, la culture de tubes coniques, les vaisseaux latéraux à rotation lente et la culture de gel de micromoules31. Ce protocole utilise la centrifugation de cellules iPS dissociées dans une plaque à puits à fond rond pour rapprocher les cellules iPSC individuelles les unes des autres et permettre la formation de sphères (EB), comme décrit ci-dessous.

Protocol

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REMARQUE : Tous les réactifs utilisés dans ce protocole se trouvent dans la table des matériaux. Sauf indication contraire, tous les milieux ont été pré-équilibrés à 37 °C avant utilisation. Toutes les étapes de centrifugation sont effectuées à 37 °C et en utilisant le mode d’accélération/décélération le plus lent. Sauf indication contraire, le surnageant est toujours éliminé à l’aide de pipettes jetables en verre Pasteur.

1. Décongélation et propagation des cellules iPS humaines

  1. Un jour avant la décongélation des CSPi, enduire un puits d’une plaque à 6 puits de 1 mL d’un extrait de membrane basale à une concentration de 200 à 300 μg/mL. Placez la plaque de puits à 4 °C pendant la nuit.
  2. Le lendemain, décongelez et transférez les cellules dans un tube de 15 ml à l’aide d’une pipette P1000. Goutte à goutte, ajouter 5 à 7 mL de DMEM/F-12 avec 15 mM HEPES.
  3. Centrifuger les cellules à 300 x g pendant 5 min. Retirez délicatement les cellules de la centrifugeuse et assurez-vous de ne pas déranger la pastille de cellule.
  4. Retirer délicatement le surnageant à l’aide d’une pipette en verre Pasteur et remettre les cellules en suspension dans 1 mL de milieu libre de sérum hiPSC (hiPSC-SFM contenant 10 μM d’inhibiteur de la Rho kinase (ROCK) Y-27632) à l’aide de P1000 avec des pointes à large alésage.
  5. Aspirer l’extrait de membrane basale du puits revêtu la veille (étape 1.1) et transférer 1 mL de hiPSC-SFM avec 10 μM Y-27632 dans le puits. Ajouter des cellules iPS remises en suspension dans le puits pour atteindre un volume final de 2 mL par puits.
  6. Agitez la plaque pour répartir uniformément les agrégats de CSPi avant de les placer dans un incubateur à 37 °C et 5 % de CO2.
  7. Effectuer des changements complets de milieu tous les deux jours à l’aide de hiPSC-SFM (sans ajout d’inhibiteur de ROCK Y-27632). Les cellules iPS atteignent généralement une confluence de 70 à 80 % après 3 à 4 jours de propagation.

2. Transmission des cellules iPS

  1. Un jour avant le passage des cellules iPS, enduire les puits d’une plaque à 6 puits d’un extrait de membrane basale à une concentration de 200 à 300 μg/mL. Placez la plaque de puits à 4 °C pendant la nuit.
    REMARQUE : Confirmez que les cellules ont atteint une confluence d’environ 70 à 80 %. Assurez-vous que les cellules iPS ne deviennent pas trop confluentes (plus de 80 % de confluence), car cela favorisera la différenciation spontanée.
  2. Commencer à faire passer les cellules iPS en enlevant les régions différenciées ou les régions avec de nombreux agrégats de cellules iPS mortes sous le stéréomicroscope à l’aide de pointes de pipette de 10 μL ou de 20 μL ou d’un racleur de cellules. Les régions différenciées apparaîtront de couleur plus dense ou plus blanche.
    REMARQUE : Les agrégats cellulaires grattés peuvent encore se fixer partiellement au fond du puits.
  3. Lavez le fond du puits plusieurs fois avec une pipette P1000 à large alésage pour éliminer les agrégats qui pourraient encore être partiellement attachés au fond du puits.
  4. Jeter le milieu usé dans lequel les CSPi ont été cultivées et qui contient les agrégats de CSPi détachés. Répétez l’étape de lavage deux fois de plus avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
  5. Ensuite, ajoutez 1 mL de 5 U/mL Dispase par puits. Les bords des colonies de CSPi se décollent de la plaque du puits, ce qui peut être observé au stéréomicroscope après 3 à 5 minutes d’incubation à température ambiante.
  6. Retirer délicatement Dispase pour éviter de déloger les agrégats légèrement détachés et ajouter 1 mL de DMEM/F-12 avec 15 mM de HEPES. Utilisez un élévateur de cellules jetable pour découper les agrégats en petites tailles. La cohérence de la taille des agrégats de CSPi peut être améliorée à l’aide d’un outil de transmission de cellules souches.
  7. Laver les agrégats de CSPi tranchés avec le milieu dans le puits et transférer le milieu avec les agrégats dans un tube conique de 15 mL à l’aide d’une pipette sérologique de 5 mL ou de P1000 avec un embout à large alésage.
  8. Rincez le puits avec du DMEM/F-12 et transférez le milieu dans le tube de 15 mL avec les agrégats iPSC.
  9. Centrifuger les agrégats de cellules iPSC tranchées à 200 x g pendant 3 min. Retirer le surnageant à l’aide d’une pipette en verre Pasteur et ajouter 2 mL de hiPSC-SFM pour déloger et remettre en suspension les cellules iPS à l’aide d’une pipette sérologique de 5 mL ou d’une P1000 à pointes à large alésage.
  10. Aspirer l’extrait de membrane basale restante de la ou des plaques de puits pré-enrobées et ajouter 1 mL de hiPSC-SFM dans chaque puits de la plaque à 6 puits.
  11. Transvaser les cellules iPS dans de nouveaux puits d’une plaque à 6 puits de manière à ce que le volume final soit de 2 mL de hiPSC-SFM par puits à l’aide d’un P1000 avec des pointes à large alésage. En fonction de la ligne iPSC, les rapports de fractionnement doivent être optimisés. Ici, un rapport de division de 1 :6 a été utilisé.
  12. Vérifier la présence d’agrégats flottants dans le puits et la taille des agrégats sous le stéréomicroscope. Idéalement, la taille de l’agrégat devrait être comprise entre 50 et 200 μm.
  13. Agiter la plaque de puits pour répartir uniformément les cellules sur la plaque après le transfert des agrégats et incuber à 37 °C à 5 % de CO2 jusqu’à 70-80 % de confluence.

3. Congélation des cellules iPS

  1. Pour recongeler les cellules iPSC, faites passer les cellules comme décrit ci-dessus (voir l’étape du protocole « 2. Passage des cellules iPS »). Une fois que les cellules ont été découpées en colonies et lavées du fond du puits (étape 2.10), faites tourner les agrégats tranchés à 200 x g pendant 3 minutes. Aspirer le surnageant.
  2. Ajouter 1 mL de milieu de cryoconservation sans sérum par puits d’une plaque à 6 puits dans le tube de 15 mL et remettre en suspension les agrégats tranchés à l’aide d’un P1000 avec une pointe à large alésage.
  3. Transférez les cellules dans des cryotubes prémarqués. Fermez les tubes et les tubes de transfert dans un récipient de cryoconservation pré-refroidi à 4 °C. Conserver les cellules à -80 °C pendant 24 à 48 h.
  4. Transférez les cryoflacons dans de l’azote liquide pour un stockage à long terme.
    NOTA : La figure 1 illustre un résumé schématique du processus de différenciation des CO.

4. Induction du corps embryoïde

  1. Cultivez et développez suffisamment de cellules iPS comme décrit ci-dessus pour l’induction de l’EB.
    REMARQUE : La production de CO peut être augmentée en augmentant le nombre de corps embryoïdes, qui à leur tour produisent un rendement global plus élevé de cellules hématopoïétiques. Un puits de cellules iPS confluentes à 70-80 % donne environ 8,4 x 105 cellules par puits d’un puits à plaques à 6 puits. 12 500 cellules iPS unicellulaires sont nécessaires pour former un corps embryoïde.
  2. Aspirer le milieu usé des cultures d’iPSC et rincer les colonies d’iPSC avec du D-PBS.
  3. Ajouter 0,5 mL de réactif de dissociation unicellulaire préchauffé à température ambiante dans chaque puits d’une plaque à 6 puits et faire tourner le récipient de culture pour recouvrir toute la surface du puits. Incuber le récipient de culture à 37 °C pendant 5 à 8 min.
  4. Retirer le récipient de l’incubateur, aspirer le réactif de dissociation de cellule unique et ajouter 1 mL du milieu de différenciation de stade 1 dans les puits, constitué d’un milieu libre de sérum hiPSC avec 50 ng/mL de protéine morphogénétique osseuse humaine 4 (hBMP4), 50 ng/mL de facteur de croissance de l’endothélium vasculaire humain-165 (hVEGF), 20 ng/mL de facteur de cellules souches humaines (hSCF), et 10 μM Y-27632.
  5. Détachez délicatement les cellules en rinçant le puits avec le médium de l’étape 1. Regrouper les cellules iPS dissociées dans un tube conique de 15 ml.
  6. Ajouter 1 mL de milieu de différenciation de stade 1 dans les puits et laver les cellules restantes ou utiliser un grattoir à cellules pour les colonies qui ne se lavent pas facilement.
  7. Après avoir transféré toutes les cellules dans le tube, centrifuger à 200 × g pendant 5 min à température ambiante pour former une pastille de cellule. Aspirer et remettre en suspension les cellules dans un total de 2 mL de milieu de différenciation de stade 1 prééquilibré à l’aide d’une pipette sérologique de 5 mL ou d’une P1000 avec un embout à large alésage.
  8. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un dispositif automatisé de comptage cellulaire. Ajouter le milieu dans le tube de 15 mL contenant la suspension à cellule unique pour plaquer 12 500 cellules par puits dans une plaque à fond rond à fixation ultra-basse de 96 puits dans 100 μL du milieu de différenciation de l’étape 1.
    REMARQUE : Au microscope, les cellules apparaîtront comme une suspension unicellulaire avec des cellules dispersées dans tout le puits.
  9. Centrifuger les plaques à 96 puits pendant 3 min à 100 x g. Après centrifugation, les cellules devraient commencer à ressembler à des sphéroïdes lorsqu’elles sont observées au microscope. Placez l’assiette dans un incubateur à 37 °C pendant 24 h.
  10. Changez la moitié du milieu le jour 1 et le jour 2 avec le milieu de différenciation de l’étape 1. Pour améliorer l’efficacité, utilisez une pipette multicanal pour éliminer 50 μL du milieu de différenciation de l’étape 1 épuisé dans une boîte de Pétri.
  11. Après avoir éliminé le milieu de la plaque à 96 puits, vérifiez qu’il n’y a pas d’EB sous le stéréomicroscope qui auraient pu être accidentellement retirés. Transférez les EB retirés accidentellement sur la plaque à 96 puits à l’aide d’une pipette P1000 avec des pointes à large alésage.
  12. Ajouter 50 μL de milieu de différenciation frais de l’étape 1 dans chaque puits d’une plaque à fond rond à très faible fixation à 96 puits à l’aide d’une pipette multicanaux.

5. Différenciation hématopoïétique

  1. Un jour avant de commencer la différenciation hématopoïétique, enduire un puits d’une plaque à 6 puits avec 1 mL d’un extrait de membrane basale à une concentration de 200 à 300 μg/mL. Placez la plaque de puits à 4 °C pendant la nuit.
    REMARQUE : Chaque puits recevra 8 EB à un moment ultérieur de ce protocole. En fonction du nombre d’EB préparés, enduire les puits en conséquence.
  2. Aspirer l’extrait de membrane basale en excès et préremplir les puits de la plaque à 6 puits avec 3 mL du milieu de différenciation de stade 2, constitué d’un milieu basal hématopoïétique auquel on ajoute 2 mM d’ultraglutamine, 55 μM de 2-mercaptoéthanol, 25 ng/mL d’interleukine humaine 3 (hIL-3) et 100 ng/mL de facteur de stimulation des colonies de macrophages humains (hM-CSF).
  3. À l’aide d’un P1000 avec des pointes à large alésage, transférez 8 EB dans chaque puits de la plaque à 6 puits. Après le transfert, confirmer à l’œil nu ou au stéréomicroscope qu’il y a 8 EB dans chaque puits.
    REMARQUE : Après 1 jour, les EB flottants adhéreront au fond du puits. Dans les 5 à 7 jours suivants, une population de cellules flottantes comprenant des cellules hématopoïétiques devrait devenir visible. La période de différenciation hématopoïétique peut être variée, à partir de 7 jours. La différenciation sur 10 jours a montré une population hématopoïétique composée de grandes sous-populations de CD45+, CD14+ et CD11b+ .
  4. Après 5 jours de traitement avec le milieu de différenciation de l’étape 2, effectuez un changement de milieu en retirant le milieu épuisé et en le distribuant dans un tube conique de 50 ml. Pipetez lentement pour essayer d’éliminer le moins de cellules flottantes possible et de maintenir la contrainte de cisaillement aussi faible que possible. Le pipetage sous stéréomicroscope peut aider à éviter l’élimination accidentelle de cellules.
  5. Ajouter immédiatement 1 mL de milieu de différenciation frais de l’étape 2 dans les puits. Afin de récupérer les cellules hématopoïétiques flottantes qui peuvent déjà être présentes à ce stade du processus de différenciation, ne jetez pas le milieu distribué. Au lieu de cela, faites tourner le tube avec le milieu épuisé à 300 x g pendant 5 min et aspirez le surnageant.
  6. Ajouter un nouveau milieu de différenciation de stade 2 dans le tube et le remettre en suspension afin de détacher les cellules qui auraient pu être transférées avec le milieu épuisé.
  7. Ajouter 2 mL du milieu de différenciation frais de l’étape 2 avec les cellules récupérées dans chaque puits, qui a été préalablement rempli avec 1 mL du milieu de différenciation de l’étape 2.
  8. Au jour 10 de la différenciation hématopoïétique, vérifiez la présence d’un grand nombre de cellules hématopoïétiques flottantes. Récoltez-les en les recueillant dans un tube de 50 ml. Ils peuvent être soit recongelés dans 10 % de DMSO, 50 % de FBS et 40 % de milieu, soit être utilisés immédiatement pour différencier les cellules en CO.

6. Maturation M-CSF et différenciation OC

  1. Cellules germées à une concentration de 200 000 cellules/cm2 sur des plaques de culture tissulaire bien traitées et traitées avec de l’alpha-MEM, complété par 10 % de FBS et 50 ng/mL de hM-CSF.
  2. Pour effectuer des tests fonctionnels ou de l’imagerie, détacher les cellules matures M-CSF 3 jours après l’ensemencement en les lavant avec du PBS préchauffé à 37 °C à l’aide d’un P1000 avec une pointe à large alésage. Des étapes de lavage répétées peuvent être nécessaires pour détacher complètement les cellules.
  3. Transvaser les cellules détachées dans un tube de 15 mL à l’aide d’un P1000 avec une pointe à alésage large et centrifuger à 300 x g pendant 5 min. Jeter le surnageant.
  4. Remettre en suspension et dissoudre la pastille cellulaire avec le milieu de différenciation OC, composé d’alpha-MEM complété par 10 % de FBS, 50 ng/mL de hM-CSF et 80 ng/mL de hRANKL. Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un dispositif automatisé de comptage cellulaire et réensemencer les cellules matures M-CSF à une densité de 200 000 à 250 000 cellules/cm2 dans un matériel de culture approprié pour les tests fonctionnels ou l’imagerie (c’est-à-dire les tests de résorption osseuse, les lames de lamelle pour l’imagerie, etc.).
  5. Différencier avec le milieu de différenciation OC pendant 7 à 9 jours. Effectuer un changement complet de milieu de puits avec le milieu de différenciation OC frais tous les 2-3 jours.
    REMARQUE : Les CO multinucléés apparaissent généralement après 5 à 7 jours.

Results

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Suivi de la morphologie cellulaire tout au long du processus de différenciation
Tous les résultats décrits ci-dessous ont été générés à l’aide de la lignée MCND-TENS2 iPSC pour la différenciation OC. Cette lignée iPSC a déjà été utilisée dans plusieurs études 32,33. Néanmoins, d’autres lignées iPSC ont également été utilisées avec succès avec ce protocole de différenciation.

L’évaluation visuelle régulière révèle des caractéristiques morphologiques différentes et distinctes des CSPi tout au long du processus de différenciation en CO (Figure 2). Les colonies de cellules iPS (figure 2A) ont été dissociées en une suspension unicellulaire, qui apparaît sous forme de cellules individuelles dans toute la plaque de puits à fond rond avant la centrifugation (figure 2B). Après centrifugation (étape 4.9 du protocole), les cellules s’accumulent au centre de la plaque de puits de fixation ultra-basse à fond rond et forment ensuite des sphères (corps embryoïdes, EB, Figure 2C). Les EB augmenteront de deux à trois fois en taille tout au long du processus de différenciation mésodermique (Figure 2D) et deviendront facilement visibles à l’œil nu à la fin de la période de différenciation de 4 jours (Figure 2E). On peut voir des EB adhérer et fusionner avec le fond de la plaque du puits après le transfert dans les puits d’une plaque à 6 puits pour la différenciation hématopoïétique (étape 5.3 du protocole, figure 2F). Après 7 à 8 jours, de grandes quantités de cellules hématopoïétiques flottantes deviennent visibles dans le milieu de culture (Figure 2G). Après le prélèvement et le replacage des cellules hématopoïétiques, une phase de maturation M-CSF s’ensuit et la différenciation des CO est initiée (étape 6.4 du protocole). En l’espace de 5 à 6 jours, les cellules multinucléées dotées d’un grand corps cellulaire transparent deviennent visibles pour la première fois (Figure 2H). Un grand nombre de cellules mononucléées sont encore visibles à ce stade. Après 2 à 3 jours supplémentaires de différenciation des CO, les CO fusionneront davantage avec les cellules adjacentes pour former de grands polycarions avec encore plus de noyaux (Figure 2I).

Évaluation de la population hématopoïétique dérivée de l’EB
La différenciation hématopoïétique peut être effectuée pendant une durée variable. Des périodes allant de 7 jours à 9 semaines ont été décrites dans la littérature. Dans ce protocole, la différenciation hématopoïétique est effectuée pendant une période de 10 jours. Nous avons constaté que 10 jours de différenciation hématopoïétique donnaient un faible nombre de CD34+ précoces (0,53 %, figure 3A) et un plus grand nombre de progéniteurs hématopoïétiques CD43+ à mi-parcours (48,5 %, figure 3B). Plus important encore, des quantités suffisantes de CD45+ (96,2 %, figure 3C), de CD14+ (33 %, figure 3D) et de CD11b+ (35,9 %, figure 3E) ont été générées après une période de traitement de 10 jours pour les différencier davantage en CO. Cependant, il peut être nécessaire d’ajuster et d’optimiser la période de traitement des cytokines pour la différenciation hématopoïétique (étape 5.4 du protocole) en fonction de la lignée iPSC afin de générer des quantités adéquates de cellules CD45+, CD14+ et CD11b+ .

En moyenne, 6 millions de cellules hématopoïétiques ont été prélevées après 10 jours de différenciation dans chaque puits avec 8 EB.

Évaluation de la morphologie et de l’activité du CO
À la suite de la différenciation des CO, les CO peuvent être évalués morphologiquement et fonctionnellement. Les précurseurs de CO sont réensemencés sur des lames de chambre ou des lames de lamelles après l’étape de maturation du M-CSF afin d’améliorer la qualité de l’image lors de la coloration pour le TRAP ou la cathepsine K. La coloration enzymatique du TRAP après la différenciation du CO montre de grands CO multinucléés et positifs pour le TRAP (Figure 4A). De plus, des cellules mononucléées légèrement TRAP-positives peuvent être observées intercalées entre les CO multinucléaires. Les témoins négatifs sans ajout de RANKL n’affichent pas de CO multinucléaire à fusible. Néanmoins, un petit nombre de cellules mononucléées légèrement TRAP-positives peuvent être représentées (Figure 4B).

Les images de microscopie confocale à balayage laser (CLSM) montrent des CO colorés pour la cathepsine K (turquoise) et la F-actine (rouge) en conjonction avec la coloration nucléaire DAPI (bleu) (Figure 4C, 4D). De grands CO multinucléaires sont visibles lorsqu’ils sont traités avec RANKL selon le protocole, qui décrit une structure cytosquelettique étendue de l’actine F et une coloration positive pour la cathepsine K (Figure 4C). D’autre part, les témoins négatifs sans ajout de RANKL ne montrent pas de cellules multinucléées fusionnées.

Les CO peuvent être évalués plus en détail sur le plan fonctionnel en mesurant l’activité de résorption. Des tests de résorption osseuse ou minérale peuvent être utilisés pour déterminer l’activité de résorption. Ici, les précurseurs du CO ont été ensemencés sur des puits recouverts de phosphate de calcium et différenciés de manière terminale. De grandes zones où le revêtement minéral a été résorbé sont visibles dans une couleur gris bleuâtre (figure 4E). Des fosses de résorption de différentes tailles peuvent être identifiées. Non résorbée, la couche de phosphate de calcium restante est visible en brun. La présence de piqûres de résorption confirme l’identité des cellules multinucléées différenciées en tant que CO. De plus, les fosses de résorption peuvent être quantifiées afin d’évaluer et de comparer l’activité de résorption. La superficie totale du minéral résorbé sur la surface totale du puits peut être quantifiée en pourcentage. De plus, la taille et le nombre de fosses de résorption peuvent être quantifiés. Les témoins négatifs non traités n’ont pas présenté de piqûres de résorption (figure 4F).

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Figure 1 : Illustration schématique du processus de différenciation des ostéoclastes à partir des cellules iPS humaines. Illustration dessinée par Hannah Blümke à l’aide d’Affinity Designer 2.1.1. L’illustration utilise des dessins déjà utilisés33. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 2 : Images microscopiques tout au long du processus de différenciation des CSPi humaines vers les ostéoclastes. (A) Colonies de CSPi indifférenciées tout au long de la propagation. (B) CSPi dans des puits à fond rond après dissociation en une suspension unicellulaire avant centrifugation. (C) Cellules iPS unicellulaires collectées de manière centralisée après centrifugation. (D) Les EB grossissent tout au long de la période de différenciation mésodermique de 4 jours. (E) Corps embryoïdes visibles après différenciation mésodermique. (F) À la suite du transfert des corps embryoïdes sur des plaques à 6 puits recouvertes d’extrait de membrane basale, on peut voir des corps embryoïdes adhérer et fusionner avec le fond du puits. (G) Après 5 à 7 jours de différenciation hématopoïétique, un grand nombre de cellules hématopoïétiques flottantes peuvent être observées dans le milieu. (H) Après maturation du M-CSF, les premiers ostéoclastes à 3-4 noyaux apparaissent après 5 à 7 jours de différenciation avec RANKL. (I) À la fin de la différenciation des ostéoclastes, de grandes cellules multinucléées peuvent être observées. Barres d’échelle : A, D, F, G = 200 μm, B, C, H, I = 50 μm, E = 1 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-3
Figure 3 : Analyse des marqueurs de surface des cellules hématopoïétiques dérivées du corps embryoïde par cytométrie en flux. L’expression des marqueurs permet l’analyse des cellules hématopoïétiques et l’identification des sous-populations après le déclenchement des singuliers et des cellules vivantes. (A) La population ontogénétiquement précoce de cellules progénitrices hématopoïétiques CD34+ est très faible ou absente en conjonction avec ce protocole. (B) Les cellules CD43+ représentent environ 50 % de l’ensemble de la population. (C) Les cellules progénitrices hématopoïétiques CD45+ à un stade avancé constituent la plus grande partie de la population hématopoïétique avec 96,2 %. (D, E) Les précurseurs directs de CD14+ et de CD11b+ représentent respectivement 33 % et 36 %. En rouge : contrôle négatif non coloré, en bleu : contrôle de l’isotype, en jaune : cellules colorées avec l’anticorps marqueur respectif. Les graphiques utilisent des données déjà publiées33. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 4 : Évaluation morphologique et fonctionnelle des ostéoclastes humains différenciés par les CSPi. (A) La coloration TRAP après différenciation des ostéoclastes montre de grands ostéoclastes multinucléés et positifs pour les TRAP. Des cellules mononucléées légèrement TRAP positives peuvent être observées intercalées entre les ostéoclastes multinucléaires. (B) Les témoins négatifs sans ajout de RANKL coloré pour TRAP ne présentent pas d’ostéoclastes multinucléaires fusionnés. Néanmoins, un petit nombre de cellules mononucléées légèrement TRAP positives peuvent être représentées. (C) Des images de microscopie confocale à balayage laser de cellules hématopoïétiques différenciées par ostéoclastes sur une lame de lamelle colorée pour l’actine F (rouge) et la cathepsine K (turquoise) en conjonction avec la coloration nucléaire DAPI (bleu) montrent de grands ostéoclastes positifs à la cathepsine K multinucléés. (D) Les témoins négatifs sans ajout de RANKL montrent des cellules mononucléées similaires à celles (B) à une densité cellulaire plus faible. (E) L’évaluation fonctionnelle peut être effectuée en évaluant l’activité de résorption des ostéoclastes. Pour cela, la différenciation des ostéoclastes est réalisée sur un test de résorption osseuse ou minérale. Des images de puits en mosaïque acquises avec un microscope à champ large inversé en mode contraste de phase montrent de grandes zones de résorption de la couche minérale de phosphate de calcium. L’activité de résorption peut être quantifiée en mesurant la surface de résorption sur la surface totale. (F) Les témoins négatifs sans ajout de RANKL ne montrent pas de zones de résorption. Barres d’échelle : A, B = 100 μm, C, D = 50 μm, E, F = 1 mm. Les images ont été éditées à partir de données publiées antérieurement33. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

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Ce protocole offre une méthode fiable et robuste pour différencier les cellules iPS en CO. Néanmoins, il existe plusieurs pièges qui peuvent être rencontrés tout au long du processus de différenciation. Des lignées de CSPi humaines générées à partir de cellules d’origines tissulaires différentes ont été différenciées avec succès à l’aide de ce protocole33. Lors de la congélation des cellules iPS (voir l’étape de protocole « 3. Congélation des cellules iPS »), un puits au point de passage a été recongelé dans un cryoflacon. Lors de la décongélation (voir l’étape du protocole « 1. Décongélation et propagation des cellules iPS humaines »), un cryoflacon a été décongelé dans un seul puits d’une plaque à 6 puits. Les différentes lignées de CSPi se comporteront légèrement différemment et les taux de prolifération varieront. Le taux de fractionnement devra être ajusté en conséquence.

Lors du passage des cellules iPS ou de la dissociation des cellules iPS dans une suspension unicellulaire pour l’induction de l’EB, il est important d’éliminer les colonies ou agrégats de cellules mortes spontanément différenciés afin d’améliorer l’efficacité et l’efficience de la différenciation mésodermique et hématopoïétique. Cela peut être fait sous un stéréomicroscope à l’aide d’un grattoir à cellules, de pointes de pipette d’une pipette P10 ou P20, ou d’un outil de grattage construit à partir d’une pipette Pasteur35.

Comme mentionné ci-dessus, ce protocole implique la dissociation des colonies de cellules iPS en une suspension unicellulaire pour l’induction de l’EB, tandis qu’avec d’autres protocoles, les cellules iPS sont laissées sous forme d’agrégats à centrifuger pour l’induction de l’EB36. La taille, le nombre de cellules, la forme et la morphologie de l’EB ont tous été signalés comme influençant la différenciation 37,38,39. Ainsi, nous émettons l’hypothèse que la dissociation en une suspension unicellulaire permet une meilleure uniformité de taille et de forme d’EB à EB après centrifugation et, par conséquent, des résultats plus cohérents de production de cellules hématopoïétiques31.

D’autres méthodes d’induction de l’EB ont été décrites. De telles méthodes qui utilisent une suspension unicellulaire en conjonction avec un inhibiteur de ROCK pour améliorer la survie cellulaire ont été rapportées comme étant avantageuses dans le contrôle de la taille de l’EB et du résultat de différenciation31.

La méthode d’induction d’EB à plaque à fond rond à 96 puits décrite dans ce protocole convient à la production à grande échelle d’EB et permet une mise à l’échelle de la production de CO. D’autres méthodes nouvelles de différenciation hématopoïétique sans étape d’induction du corps embryoïde ayant le potentiel de faciliter le processus de différenciation ont récemment été décrites32. Néanmoins, ces protocoles n’ont pas encore été établis pour la différenciation OC33.

Dans le protocole mentionné ci-dessus, nous décrivons le changement de milieu au jour 5 de la différenciation hématopoïétique. Un petit nombre de cellules flottantes peuvent déjà apparaître autour des jours 4 et 5 de la différenciation. Afin d’éviter de jeter des cellules flottantes, le milieu doit être recueilli dans un tube et centrifugé avant d’être jeté. La pastille de cellule au fond du tube doit ensuite être délogée avec le milieu frais et doit être transférée dans les puits d’une plaque à 6 puits. L’importance de la population précoce de cellules flottantes dans la différenciation des CO reste cependant à déterminer.

La production de cellules hématopoïétiques peut être évaluée à l’aide de la cytométrie en flux. Des rendements élevés de cellules CD45+, CD14+ et CD11b+ sont souhaitables pour la différenciation des ostéoclastes33. La cryoconservation des cellules hématopoïétiques flottantes récoltées s’est avérée difficile, avec des taux de récupération généralement limités et une faible viabilité cellulaire40,41. En cryoconservant des cellules hématopoïétiques dans un milieu de cryoconservation composé de 50 % d’un milieu d’expansion cellulaire hématopoïétique sans sérum (voir tableau des matériaux), de 40 % de FBS et de 10 % de DMSO, nous avons pu récupérer des cellules avec une viabilité cellulaire d’environ 90,3 % ± 2,62 ET (n = 7) après décongélation.

L’ostéoclastogenèse nécessite la fusion de plusieurs précurseurs mononucléés d’OC pour former des ostéoclastes multinucléés capables de résorption minérale et osseuse. Alors que les lignées cellulaires murines précurseurs d’OC ont simplement besoin de l’ajout de RANKL pour induire la formation d’OC42, les précurseurs humains ont besoin d’un supplément de M-CSF pour la survie et la prolifération cellulaires43. OSCAR a récemment été découvert comme un récepteur supplémentaire impliqué dans la différenciation du CO, même si seul le collagène de type I a été identifié jusqu’à présent comme un ligand. Alors que la recherche sur l’OSCAR avec des CO dérivés d’iPSC est encore limitée, les concentrations supraphysiologiques in vitro de RANKL et de M-CSF dans une lignée cellulaire murine semblent contourner la nécessité de l’activation d’OSCAR44, l’activation d’OSCAR in vivo semble être un signal costimulateur nécessaire pour l’ostéoclastogenèse45. Un autre facteur qui doit être pris en compte est la surface de la plaque du puits. Les propriétés chimiques46 et physiques47 de surface sont connues pour influencer la différenciation des ostéoclastes et peuvent favoriser ou entraver une différenciation réussie. Une certaine hétérogénéité au sein de la population de précurseurs semble également essentielle à la réussite de la fusion des CO, car différents facteurs liés à la fusion tels que CD47 et DC-STAMP agissent à différents stades de la fusion des ostéoclastes48.

En conclusion, ce protocole permet de différencier les CO humains des CSPi afin de faciliter et d’accélérer la recherche sur les CO.

Disclosures

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Les auteurs ne déclarent pas d’intérêts concurrents.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs tiennent à remercier les membres du laboratoire Giachelli pour leur aide technique et leur soutien. Nous remercions le Centre de microscopie W. M. Keck et le directeur du Centre Keck, le Dr Nathanial Peters, pour leur aide dans l’obtention des images de microscopie confocale et de microscopie à grand champ. Nous remercions également l’UW Flow Core Facility et le directeur de Flow Core Facility, Aurelio Silvestroni, pour leur soutien technique et leur assistance. Enfin, nous remercions Hannah Blümke pour son soutien en matière d’illustration et de conception graphique.

Le financement a été fourni par le biais de la subvention R35 HL139602-01 des National Institutes of Health. Nous remercions également la subvention S10 S10 OD016240 du NIH pour le financement des instruments au W. M. Keck Center, ainsi que la subvention 1S10OD024979-01A1 des NIH pour le financement des instruments de l’UW Flow Core Facility.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Anticorps 2-MercaptoethanolSigma AldrichM6250-10ML
- Anti-Cathepsine K  ;AnticorpsAbcam ab19027
- Anticorps anti-humain CD45BD555485
- IgG1 de souris conjugué à l’APC, &kappa ; Contrôle des isotypesBD555751
Anticorps - Anticorps anti-humains CD14563372
BV711 - IgG2b de souris conjugués à la BV711, &kappa ; Contrôle d’isotypeBD563125
Anticorps - Chèvre Anti-Lapin IgG H& L Alexa Fluor® ; 647Abcamab150079
Anticorps anti-CD14 humain conjugué au PER& D SystemsFAB3832P-025
Anticorps - Intégrine humaine alpha M/CD11b conjuguée au PE& D SystemsFAB16991P-025
Anticorps anti-humain conjugué au PE-Cy7 CD34BD560710
Anticorps - IgG1 de souris conjugué au PE-Cy7 &kappa ; Contrôle des isotypesBD557872
Anticorps anti-CD11b humain conjugué PE/Cyanine5Biolegend301308
Anticorps - IgG1 de souris conjugué à PE/Cyanine5, &kappa ; Isotype CtrlBiolegend400118
Anticorps - Souris conjuguée PerCP-Cy5.5 IgG1 &kappa ; Contrôle d’isotypeBD550795
Anticorps - PerCpCy5.5-conjugué Anti-Human CD43BD563521
Kit de dosage de résorption osseuseCosmoBioUSACSR-BRA-24KIT
Countess 3 Compteur de cellules automatisé ThermoFisher16812556
Cultrex Qualifié de cellules souches Facteur de croissance réduit Extrait de membrane basaleR& D Sytems3434-010-02Extrait de membrane basale
DAPIR& D Systems5748/10
Dispase (5 U/mL)STEMCELL Technologies7913
DMEM/F-12 avec 15 mMde cellules souches36254
DMSOSigma AldrichD2650
DPBSSigma AldrichD8537-500ML
Protéine morphogénétique osseuse humaine 4 (hBMP4)STEMCELL Technologies78211
IL-3 humaineSTEMCELL Technologies78146.1
Facteur de stimulation des colonies de macrophages humains (hM-CSF)STEMCELL Technologies78150.1
Activateur du récepteur soluble humain du facteur nucléaire-&kappa ; B Ligand (hsRANKL)STEMCELL Technologies78214.1
Facteur de cellules souches humaines (hSCF)STEMCELL Technologies78155.1
Human TruStain FcX (solution de blocage du récepteur Fc)Biolegend422301
Facteur de croissance de l’endothélium vasculaire humain-165 (hVEGF165)STEMCELL Technologies78073
Invitrogen Rhodamine PhalloidinInvitrogenR415
MEM &alpha ;, nucléosides, sans rouge de phénolThermoFisher41061029
mFreSRSTEMCELL Technologies05855Milieu de cryoconservation sans sérum
mTeSR Plus milieuSTEMCELL Technologies100-0276Milieu sans sérum iPSC humain (hiPSC-SFM)
Nunclon Sphera 96-Well, Nunclon Sphera-Treated, U Bottom-Saw MicroplaqueThermo Scientific174925Fond rond fixation ultra-basse Plaque à 96 puits
P1000 Embouts à alésage largeThermoFisher2079GPK
ROCK-Inhibitor Y-27632STEMCELL Technologies72304
StemSpan SFEMStemCell09650Milieu de culture cellulaire hématopoïétique
TrypLE Select Enzyme (1X), sans rouge de phénolThermo Fisher12563011Réactif de dissociation unicellulaire
UltraglutamineBioscience LonzaBE17-605E/U1
X-VIVO 15 Milieu cellulaire hématopoïétique sans sérumBioscience Lonza04-418QMilieu basal hématopoïétique
µ ;-Slide 8 Bien élevéIbidi80806
conjugué à l’APC BD conjugués à R HEPES

References

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