Prédiction et validation de cibles protéiques de composés à petites molécules

Les protéines sont des macromolécules très importantes dans les organismes vivants et possèdent une gamme variée de fonctions uniques au sein des cellules, telles que la composition membranaire, la formation du cytosquelette, l’activité enzymatique, le transport, la signalisation cellulaire et l’implication dans les mécanismes intracellulaires et extracellulaires ^1,2,3. Les protéines manifestent leurs fonctions biologiques principalement par des interactions spécifiques avec une variété de molécules, y compris d’autres protéines, des acides nucléiques, des ligands de petites molécules et des ions métalliques ^1,4. Les ligands sont de petits composés moléculaires qui se lient spécifiquement aux protéines d’un organisme. L’interaction entre les protéines et les ligands se produit à des sites spécifiques de la protéine, appelés sites de liaison, également connus sous le nom de poches de liaison⁵. Dans la recherche en chimie médicinale, l’accent est mis sur l’identification de protéines clés qui sont clairement associées à des maladies, qui servent de cibles pour les médicaments⁶. Par conséquent, il est de la plus haute importance d’acquérir une compréhension approfondie des sites de liaison entre les protéines et les ligands pour promouvoir la découverte, la conception et la recherche de médicaments ^7,8.

L’amarrage moléculaire est un outil de calcul largement utilisé pour étudier la liaison protéine-ligand, qui utilise les structures tridimensionnelles des protéines et des ligands pour explorer leurs modes de liaison primaires et leurs affinités lors de la formation de complexes stables ^9,10,11. L’application de la technologie d’amarrage moléculaire a vu le jour dans les années 1970. Sur la base du principe de l’appariement serrure et clé et en utilisant les algorithmes des logiciels d’amarrage moléculaire, on peut déterminer l’interaction entre les composés et les cibles moléculaires en analysant les résultats d’amarrage. Cette approche permet de prédire les sites de liaison actifs à la fois pour le composé et la molécule cible. Par conséquent, il facilite l’identification d’une conformation de liaison optimale (appelée ici modèle de liaison) pour les interactions ligand-récepteur, ce qui est crucial pour comprendre la mécanique de ces engagements moléculaires 12,13,14,15. Bien que l’amarrage moléculaire fournisse de précieuses prédictions informatiques des interactions ligand-récepteur, il est important de noter qu’il s’agit de résultats préliminaires. Par conséquent, une vérification expérimentale supplémentaire est essentielle pour confirmer ces interactions.

Le test de décalage thermique cellulaire (CETSA), initialement proposé par l’équipe de recherche de Pär Nordlund en 2013, sert de méthode pour valider les interactions médicament-protéine cible. Cette technique teste spécifiquement la stabilité thermique des protéines cibles induite par la liaison aux médicaments, fournissant une approche pratique pour confirmer les interactions moléculaires 16,17,18. Cette approche est basée sur le principe fondamental selon lequel la liaison des ligands initie un changement thermique au sein des protéines cibles et s’applique à un large éventail d’échantillons biologiques, y compris les lysats cellulaires, les cellules vivantes intactes et les tissus^19,20. CETSA soutient l’engagement direct de petites molécules cibles dans des cellules intactes en détectant la stabilisation thermodynamique des protéines due à la liaison des ligands et en liant la réponse phénotypique observée au composé cible^21,22. Parmi les différentes méthodologies dérivées de CETSA, le Western Blot-CETSA (WB-CETSA) est considéré comme une approche classique. Après la préparation de l’échantillon à l’aide de la méthode CETSA, l’analyse par transfert Western est utilisée pour détecter les altérations de la stabilité thermique de la protéine cible. Cela permet de déterminer avec précision les interactions médicament-protéine au sein des systèmes cellulaires^17,23.

La xanthatine est un composé bioactif isolé de la plante Xanthium L. avec des propriétés telles que l’anti-inflammatoire, qui a été utilisé dans la médecine traditionnelle chinoise pour traiter des maladies comme la sinusite nasale et l’arthrite^24,25. La protéine 1 associée à l’ECH (Keap1) est un composant du complexe protéique multi-sous-unitaire ubiquitine ligase Cullin-RING E3 basé sur Cullin3 et un régulateur important de l’homéostasie redox intracellulaire, qui influence l’intensité et la durée de la réponse inflammatoire en modulant l’état redox intracellulaire²⁶. Dans cette étude, nous avons d’abord utilisé l’amarrage moléculaire pour étudier l’interaction entre la xanthatine (petite molécule) et la protéine Keap1, dans le but de prédire leur mode de liaison. Par la suite, nous avons utilisé la méthode CETSA pour valider cette interaction en évaluant l’impact de la xanthatine sur la stabilité thermique de la protéine Keap1.

1. Téléchargement des structures de xanthatine et Keap1

1. Ouvrez la base de données PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/), entrez xanthatine (petite molécule), puis appuyez sur Rechercher et cliquez sur Le premier résultat. Cliquez sur Télécharger et cliquez sur Enregistrer sous la structure 2D pour enregistrer le composé au format .sdf.
2. Téléchargez la structure cristalline de la protéine.
   1. Ouvrez la base de données UniProt (https://www.uniprot.org/), saisissez Keap1 et cliquez sur Rechercher. Cliquez sur Humain sous organismes populaires dans la colonne de gauche, puis cliquez sur La première entrée nommée Q14145 dans la colonne de droite.
   2. Cliquez sur Structure sous la fonction dans la colonne de gauche, recherchez la structure avec l’ID PDB : 2FLU, puis cliquez sur RCSB-PDB. Cliquez sur Télécharger les fichiers et sélectionnez Format PDB pour télécharger la structure cristalline de la protéine Keap1.

2. Amarrage moléculaire

1. Créez un nouveau dossier nommé amarrage moléculaire sur le bureau et enregistrez les structures xanthatine (petite molécule) et Keap1 (protéine) téléchargées dans ce dossier.
   REMARQUE : Le nom et le chemin d’accès du dossier doivent être en anglais.
2. Ouvrez le logiciel Maestro, cliquez sur Fichier, sélectionnez Modifier le répertoire de travail, cliquez sur Bureau, double-cliquez pour sélectionner le dossier d’ancrage moléculaire nouvellement créé et cliquez sur Choisir les options.
3. Traitement de petites molécules
   1. Cliquez sur Options de fichier et d’importation de structures, sur Bureau, double-cliquez sur le dossier d’ancrage moléculaire, cliquez sur Fichier de structure xanthatin, puis cliquez sur Ouvrir pour importer un fichier de petites molécules.
   2. Cliquez sur Tâches dans le coin supérieur droit du logiciel et sélectionnez l’option LigPrep . Utiliser les structures de l’espace de travail ; les autres paramètres sont les paramètres par défaut et cliquez sur Exécuter pour effectuer le traitement des petites molécules.
4. Traitement de la structure des protéines
   1. Cliquez sur les options Fichier et Importer des structures , sur Bureau, puis double-cliquez sur le dossier Ancrage moléculaire . Cliquez sur le fichier Keap1 Protein Structure , puis sur Ouvrir pour importer le fichier de structure protéique.
   2. Cliquez sur Tâches dans le coin supérieur droit du logiciel et sélectionnez l’option Assistant de préparation des protéines . Cochez la case avant de supprimer les eaux au-delà de 5 Å des groupes Het et entrez un pH de 7,4+/-0,0. Cliquez sur Prétraiter, sur Affiner, puis sur Optimiser > Supprimer les eaux > Réduire.
   3. Cliquez sur la tâche suivante lorsque la tâche précédente est terminée. Cliquez sur Tâches et sélectionnez l’option Sitemap , utilisez les paramètres par défaut pour tous les paramètres, puis cliquez sur Exécuter.
   4. Cliquez sur les options Fichier et Importer des structures , cliquez sur Bureau, double-cliquez sur le dossier d’ancrage moléculaire et ouvrez le dossier nommé sitemap_1. Cliquez sur le premier fichier nommé Sitemap_1_out.maegz, puis cliquez sur Ouvrir.
   5. Double-cliquez sur le point pour sélectionner sitemap_1_protein dans l’espace de travail, puis cliquez sur Sitemap_1_site_1 pour le sélectionner . Cliquez sur Tâches et sélectionnez l’option Génération de grille réceptrice .
      REMARQUE : Les sites de protéines prédits par le sitemap sont classés en fonction du score, le site ayant obtenu le score le plus élevé étant situé en premier lieu.
   6. Sélectionnez l’option Entrée sous récepteur, avec les autres paramètres inchangés. Cliquez sur la petite boule blanche dans la structure de la protéine pour générer une boîte d’ancrage de taille par défaut et changez le nom de la tâche en grid_2FLU de glissement. Cliquez sur Exécuter.
5. Amarrage moléculaire
   1. Cliquez sur Tâches et sélectionnez l’option Ligand Docking . Sélectionnez la grille réceptrice As dans le fichier et cliquez sur Parcourir. Cliquez sur Bureau, double-cliquez sur le dossier de la station d’accueil moléculaire, double-cliquez sur le fichier grid_2FLU glissé, cliquez sur Glide-grid_2FLU.zip fichier, puis cliquez sur Ouvrir.
   2. Cliquez sur Utiliser les ligands des fichiers > parcourir > Bureau. Double-cliquez sur le dossier d’ancrage moléculaire, double-cliquez sur le fichier ligprep_1, cliquez sur le fichier Ligprep_1-out.maegz, puis cliquez sur Ouvrir.
   3. Cliquez sur Paramètres et sélectionnez Précision en tant qu’option XP (précision supplémentaire), remplacez le nom de la tâche par dock_XP_2FLU de glissement, puis cliquez sur Exécuter.
6. Afficher les résultats de la station d’accueil
   1. Cliquez sur les options Fichier et Importer des structures , cliquez sur Bureau, puis double-cliquez sur le dossier Amarrage moléculaire . Double-cliquez sur le fichier glide-dock_XP_2FLU , cliquez sur le fichier glide-dock_XP_1_pv.maegz , puis cliquez sur Ouvrir.
   2. Double-cliquez sur le point pour sélectionner ligand dans l’espace de travail, puis cliquez pour sélectionner sitemap_1_protein. Cliquez sur Tableau, faites glisser votre curseur vers l’extrême droite et affichez le score sous Score d’ancrage.
7. Visualisation des résultats 2D
   1. Double-cliquez sur le point pour sélectionner ligand dans l’espace de travail, puis cliquez pour sélectionner également sitemap_1_protein. Cliquez sur Ligand Interaction > View et cochez la case Légende LID .
   2. Cliquez sur Fichier, choisissez Enregistrer la capture d’écran, entrez 6000 à la largeur, décochez la case Arrière-plan transparent et cliquez sur OK. Cliquez sur Bureau, nommez le fichier 2D-xanthatin-2FLU et enregistrez l’image.
8. Visualisation des résultats 3D
   1. Double-cliquez sur le point pour sélectionner ligand dans l’espace de travail, puis cliquez pour sélectionner également sitemap_1_protein.
   2. Cliquez sur L dans Sélection rapide pour sélectionner de petites molécules, puis cliquez sur Style. Cliquez sur la deuxième ligne du style pour changer la taille de la liaison à petite molécule et cliquez sur les atomes de couleur pour changer la couleur de la petite molécule.
   3. Sélectionnez la petite molécule dans la figure, cliquez sur le bouton droit de la souris, sélectionnez Développer la sélection et choisissez 4 Å. Cliquez sur Appliquer les étiquettes dans le style pour afficher les étiquettes.
   4. Cliquez sur la deuxième ligne du style pour modifier la taille des liaisons d’acides aminés et cliquez sur la couleur des atomes pour changer la couleur des acides aminés.
   5. Cliquez sur Suivant > Inverser, maintenez la touche Ctrl enfoncée et cliquez sur la première position de l’œil sous Style pour afficher uniquement les acides aminés avec des étiquettes.
   6. Cliquez sur Style > rubans pour afficher la protéine en tant que style de ruban et cliquez sur Modifier le ruban sous les rubans pour changer la couleur du ruban.
   7. Cliquez sur Interactions dans le coin inférieur droit de l’écran, cliquez sur le bouton droit de la souris et décochez contacts/conflits.
   8. Recherchez mesurer dans tâches, sélectionnez Distance et cliquez sur les deux atomes reliés par la ligne pointillée jaune (liaison hydrogène) à l’écran pour mesurer la longueur des liaisons hydrogène.
   9. Appuyez sur la molette de la souris et maintenez-la enfoncée pour faire pivoter la protéine, ajustez la protéine au centre de l’écran et assurez-vous que chaque étiquette d’acide aminé est visible.
   10. Cliquez sur Espace de travail > Enregistrer l’image sous , puis cliquez sur le bureau. Enregistrez l’image au format 600dpi par défaut, nommez le fichier 3D-xanthatin-2FLU, choisissez le type de fichier au format tiff et enregistrez l’image.

3. Culture cellulaire et préparation d’échantillons CETSA

1. Culture cellulaire
   1. Ajouter 5 x 10⁶ cellules RAW264.7/mL dans une boîte de culture de 100 mm et incuber avec 6 mL de milieu DMEM avec 10 % de FBS et 1 % de solution d’antibiotique-antimycosique à 37 °C, 95 % d’humidité et 5 % de CO₂. Préparez trois plats et réalisez l’expérience lorsque les cellules atteignent 80% de confluence.
2. Préparation des échantillons CETSA
   1. Aspirez l’ancien milieu, ajoutez 2 ml de solution saline tampon de phosphate (PBS) réchauffée à température ambiante dans chaque plat et lavez-le 2 fois.
   2. Ajoutez 2 ml de PBS dans chaque boîte de cellules, mélangez les cellules et collectez les cellules dans deux tubes de microcentrifugation de 1,5 ml. Centrifuger à 377 x g pendant 3 min à température ambiante.
   3. Jetez le surnageant et remettez en suspension les cellules avec 2 mL de PBS contenant 1 % de mélanges d’inhibiteurs de protéase à large spectre. Répartir dans des microtubes à centrifuger individuels contenant 1 mL de suspension cellulaire.
   4. Congelez les tubes de microcentrifugation dans de l’azote liquide jusqu’à ce qu’ils soient blancs et solides, puis décongelez-les immédiatement dans un bain-marie à 37 °C et répétez l’opération 3 fois. Centrifugeuse à 12 000 x g à 4 °C pendant 10 min.
   5. Prendre deux tubes de microcentrifugation, l’un avec 100 μM de xanthatine et l’autre avec un volume égal de DMSO, et ajouter 450 μL de surnageant centrifugé dans chaque tube, incuber à 37 °C pendant 30 min.
   6. Ajouter le surnageant des deux tubes de microcentrifugation à 14 tubes de PCR d’un volume de 60 μL/tube, et des tubes chauffants simultanément à différentes températures (45 °C, 48 °C, 51 °C, 54 °C, 57 °C, 60 °C et 63 °C) pendant 3 min, avec deux tubes de PCR à chaque température, pour les groupes DMSO et xanthatine, respectivement.
   7. Pour le groupe non chauffé, prélever le surnageant de chacun des deux tubes de microcentrifugation et l’ajouter à 14 tubes PCR, 7 pour le groupe DMSO et 7 pour le groupe xanthatine, dans un volume de 60 μL chacun. Ne chauffez pas les échantillons ici.
   8. Refroidissez les tubes à température ambiante pour le groupe chauffé. Centrifuger tous les tubes (chauffés et non chauffés) à 12 000 x g pendant 10 min à 4 °C et prélever 48 μL de surnageant de chaque tube dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 mL. Ajouter 12 μL de tampon de charge de protéines SDS-PAGE dans chaque tube, bien mélanger et chauffer au bain-marie à 100 °C pendant 5 min.
      REMARQUE : Les échantillons de CETSA préparés doivent être conservés à -80 °C et analysés par western blot dans un délai de 1 semaine.

4. Transfert Western

1. Préparation du gel SDS-PAGE
   1. Rincez une plaque de verre longue et une plaque de verre courte avec de l’eau ultra-pure. Placez les plaques dans la fente de serrage, puis sur une planche transparente. Ajouter de l’eau ultra-pure et vérifier l’étanchéité pendant 10 min.
   2. Ajouter 8 mL de solution de gel inférieur et 8 mL de tampon de gel inférieur dans une fiole conique et mélanger en secouant doucement. Ajouter 160 μL de promoteur coagulant à la solution de gel et bien mélanger.
      REMARQUE : Le volume de la couche inférieure d’adhésif ne doit pas dépasser la ligne verte sur la fente de serrage.
   3. Égouttez l’eau ultrapure des plaques et séchez-les avec du papier filtre. Ajouter la solution de gel inférieure préparée. Ajouter 2 ml d’alcool isopropylique et attendre 20 min pour la solidification.
   4. Prendre 2 mL de solution de gel supérieure et 2 mL de tampon de gel supérieur dans une fiole conique et mélanger en secouant doucement la fiole.
   5. Retirez l’alcool isopropylique de la couche de gel et épongez l’excès d’alcool isopropylique avec du papier filtre.
   6. Ajouter 40 μL de promoteur coagulant à la solution supérieure de gel mélangée, bien mélanger, puis ajouter entre les plaques de verre longues et courtes et insérer un peigne à 15 trous de 1,5 mm, attendre 20 min.
      REMARQUE : Le peigne doit être inséré perpendiculairement à la couche supérieure, sans bulles d’air entre le peigne et la solution.
2. Électrophorèse
   1. Ajoutez 1 L d’eau ultrapure dans un bécher, ajoutez un sachet de poudre tampon courante SDS-PAGE, mélangez bien avec une tige de verre et ajoutez le gel préparé dans l’unité d’électrophorèse. Placez l’appareil dans la boîte et retirez le peigne.
   2. Décongelez les échantillons de marqueur et de CETSA à température ambiante, en tourbillonnant et en tournant vers le bas. Ajouter 2,5 μL de marqueur dans le premier puits et 20 μL d’échantillons CETSA dans chacun des puits restants selon la séquence prédéterminée.
      NOTA : Les échantillons CETSA ont été ajoutés successivement en fonction du traitement thermique décrit à l’étape 3.2.6 de 45 °C à 63 °C ; on a ajouté en premier le groupe DMSO, puis le groupe xanthatine (Figure 1).
   3. Ajoutez la solution d’électrophorèse restante dans l’unité d’électrophorèse, fermez le couvercle et insérez l’électrode, pôle positif à pôle positif, pôle négatif à pôle négatif.
   4. Allumez l’interrupteur d’alimentation et réglez le commutateur de tension sur 80 V pour démarrer l’électrophorèse.
3. Transfert sur membrane
   1. Ajoutez 850 ml d’eau ultrapure, 100 ml d’éthanol anhydre et 50 ml de tampon de transfert rapide dans un bécher et mélangez bien. Préparez des panneaux de mousse, des couteaux en plastique, des pinces à épiler, des plateaux et des dispositifs de transfert à membrane.
   2. Coupez la membrane PVDF en fonction de la taille du gel, marquez-la et trempez-la dans du méthanol pendant 30 s pour l’activer.
   3. Versez la solution de transfert dans le plateau, placez et ouvrez les pinces de transfert, puis placez un tampon éponge et trois couches de papier filtre de transfert.
   4. Arrêtez l’électrophorèse puis ouvrez le couvercle du boîtier d’électrophorèse. Prenez l’appareil d’électrophorèse, versez la solution d’électrophorèse et retirez la plaque. Placez la plaque sur le panneau de mousse, retirez-la doucement avec un couteau en plastique et coupez le gel pour visualiser clairement le marqueur protéique et les protéines cibles.
   5. Tenez un côté du marqueur à l’aide d’une pince à épiler, lavez-le dans un bac contenant la solution transmembranaire et posez-le à plat sur du papier filtre. Trempez la membrane PVDF activée dans la solution de transfert, tenez le côté étiqueté avec une pince à épiler et couvrez le gel face vers le bas.
      REMARQUE : Le côté marqué de la membrane PVDF est la face avant et faites attention au fait qu’aucune bulle n’est générée pendant le processus de placement.
   6. Placez deux couches de papier filtre de transfert et une couche de tampon éponge sur la membrane PVDF, couvrez et fixez les clips de transfert, puis placez-les dans le réservoir de transfert.
      REMARQUE : Couleur noire du clip de transfert à couleur noire de la fente de transfert.
   7. Ajouter la solution transmembranaire restante dans la cassette transmembranaire, couvrir avec le couvercle, positif à positif, négatif à négatif.
   8. Réglez le courant à 400 mA, le temps à 30 min, puis appuyez sur Exécuter pour commencer à transférer la membrane à température ambiante.
4. Bloquant
   1. Ajoutez 2 L d’eau ultrapure dans un flacon en verre, ajoutez un sachet de poudre de TBS, puis ajoutez 2 mL de Tween pour obtenir une solution de TBST. Peser la poudre de BSA pour préparer une solution de BSA à 5 % avec du TBST et ajouter 6 mL de solution de BSA dans la boîte d’incubation.
   2. Arrêtez le transfert de membrane, puis ouvrez le clip de transfert. Fixez le côté marqueur de la membrane PVDF et placez-le dans la boîte d’incubation. Placez la boîte d’incubation sur un agitateur et bloquez pendant 1,5 h à température ambiante.
5. Incubation de l’anticorps primaire
   1. Préparez l’anticorps primaire (voir le tableau des matériaux pour plus de détails) avec une solution de BSA à 5 % à 1:1000, recyclez la solution de BSA dans la boîte d’incubation et ajoutez 6 mL d’anticorps primaires dans la boîte d’incubation. Placez la boîte d’incubation dans une boîte en mousse avec des packs de glace et conservez-la sur un shaker pendant la nuit.
6. Incubation d’anticorps secondaires
   1. Prélever l’anticorps primaire dans la boîte d’incubation le lendemain, puis ajouter 6 ml de solution de TBST et le placer sur un agitateur pour laver pendant 5 min.
   2. Videz la solution TBST lavée et ajoutez-la fraîche pour le lavage ; répétez l’opération 5 fois et préparez l’anticorps secondaire avec une solution de BSA à 5 % à 1:5000.
   3. Videz la solution de TBST et ajoutez 6 mL d’anticorps secondaires dans la boîte d’incubation. Placez la boîte d’incubation sur un agitateur et incubez pendant 1,5 h à température ambiante.
   4. Prélever l’anticorps secondaire (voir le tableau des matériaux pour plus de détails), puis ajouter 6 ml de solution de TBST et le placer sur un agitateur pour laver pendant 5 min. Videz la solution TBST lavée et ajoutez-la fraîche pour le lavage ; Répétez 5 fois.
7. Exposition des bandes
   1. Conservez la solution TBST à la fin du dernier lavage. Prenez des volumes égaux de réactifs chimiluminescents A et B, agitez et mélangez bien. Protégez la solution de la lumière.
   2. Ouvrez le système d’imagerie sur gel, cliquez sur Échantillons, vérifiez l’étalonnage, attendez la fin de l’étalonnage, puis cliquez sur Marqueur, vérifiez l’étalonnage.
   3. Prenez le côté marqueur de la bande à l’aide d’une pince à épiler et immergez-le complètement dans la solution de réactif chimiluminescent. Fixez un côté du marqueur pour placer la bande face vers le bas dans l’imageur, fermez le couvercle de l’imageur, cliquez sur Exposition et réglez le temps d’exposition sur 1 s.
      REMARQUE : Le développeur doit couvrir complètement la bande et le développement doit se faire dans un environnement sombre.
   4. Cliquez sur Enregistrer, nommez l’image et enregistrez-la en tant que fichier .tif. Analyser la densité optique du western blot. Les valeurs de gris de chaque température du groupe DMSO ont été comparées aux valeurs de gris de 45 °C, et les valeurs de gris de chaque température du groupe de la xanthatine ont été comparées aux valeurs de gris de la xanthatine à 45 °C.

L’analyse de l’amarrage moléculaire a permis de prédire l’interaction entre la xanthatine et la protéine Keap1. La figure 2 montre la formation de liaisons hydrogène entre la xanthatine et les résidus d’acides aminés Gly-367 et Val-606 de la protéine Keap1, avec une longueur de liaison hydrogène de 2,17 Å pour Gly-367 et de 2,13 Å pour Val-606. De plus, le score d’amarrage calculé de -5,69 kcal/mol signifie une bonne affinité de liaison entre la xanthatine et la protéine Keap1.

La méthode CETSA a montré que la liaison à la xanthatine modifiait la stabilité thermique de la protéine Keap1, confirmant l’interaction entre la xanthatine et la protéine21 de Keap1. La figure 3 indique que la xanthatine modifie remarquablement la stabilité thermique de la protéine Keap1 dans la plage de température de 48 °C à 57 °C, par rapport au groupe DMSO. Pour assurer une charge d’échantillon égale, tout d’abord, la densité d’inoculation cellulaire dans laquelle nous avons effectué les expériences était cohérente ; deuxièmement, les échantillons cellulaires du groupe DMSO et du groupe xanthatine ont été bien mélangés dans les boîtes de culture cellulaire, puis ont été répartis uniformément dans deux tubes de microcentrifugation, ce qui a permis d’assurer une quantité constante d’échantillons cellulaires, et, le volume de surnageant ajouté à chaque tube PCR était de 60 μL, et enfin, le volume de chaque échantillon téléchargé dans le Western blot était de 20 μL, ce qui assurait un chargement égal pour les échantillons chauffés. La dégradation des protéines dans les échantillons à partir d’environ 51 °C est principalement due à des modifications de la structure des protéines et à des réactions chimiques accélérées causées par des températures élevées. Les résultats ci-dessus démontrent que la xanthatine pourrait se lier directement à la protéine Keap1.

Figure 1 : Ordre de chargement du western blot. La température dans l’ordre de gauche à droite était de 45 °C, 48 °C, 51 °C, 54 °C, 57 °C, 60 °C et 63 °C.  La première voie a été ajoutée avec un marqueur ; deux voies ont été utilisées pour chaque température ; la première voie était le groupe DMSO, et la deuxième voie était le groupe xanthatin. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Interaction entre la xanthatine et la protéine Keap1 (PDB : 2FLU). (A) La représentation 2D de la liaison de la xanthatine à Keap1. (B) La visualisation 3D de la xanthatine et de la protéine Keap1. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Effet de la xanthatine sur la stabilité thermique de la protéine Keap1. (A) Les effets de la xanthatine sur la stabilité thermique de Keap1 ont été détectés par CETSA. (B) Les densités optiques de Keap1 ont été normalisées à celles obtenues à 45 °C. Les données sont représentées sous forme de moyenne ± écart-type. L’analyse statistique a été effectuée par analyse de variance à un facteur (ANOVA à un facteur). n = 3. *p < 0,05, **p < 0,01, p < 0,001, p < 0,0001. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Les auteurs n’ont rien à divulguer.