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Spectrométrie de masse en tandem haute résolution pour l’étude des constituants chimiques de Gynura bicolor DC

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DOI :

10.3791/66612

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2 février 2024

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1Chongqing Clinical Research Center for Dermatology, Chongqing Key Laboratory of Integrative Dermatology Research, Key Laboratory of External Therapies of Traditional Chinese Medicine in Eczema, Department of Dermatology, Chongqing Hospital of Traditional Chinese Medicine, 2General Surgery, Chongqing Hospital of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Nous décrivons un protocole général qui intègre l’analyse par spectrométrie de masse à haute résolution et l’amarrage moléculaire dans la recherche en médecine traditionnelle chinoise.

Résumé

La séparation et l’analyse des composants chimiques souhaités sont des sujets importants pour la recherche fondamentale de la médecine traditionnelle chinoise (MTC). La chromatographie liquide à ultra-haute performance et la spectrométrie de masse en tandem quadripolaire à temps de vol (UPLC-Q-TOF-MS/MS) est progressivement devenue une technologie de pointe pour l’identification des ingrédients de la MTC. Gynura bicolor DC. (BFH), une plante vivace sans tige utilisée pour la médecine et l’alimentation en Chine, a des effets médicinaux tels que l’élimination de la chaleur, l’humidification des poumons, le soulagement de la toux, la dispersion de la stase et le soulagement de l’enflure. Les polyphénols et les flavonoïdes contiennent de nombreux isomères, ce qui entrave l’identification des composés complexes dans la BFH. Cet article présente un protocole systématique pour l’étude des constituants chimiques de la BFH basé sur l’extraction par solvant et les données intégrées via UPLC-Q-TOF-MS.

La méthode décrite ici comprend des protocoles systématiques pour le prétraitement des échantillons, l’étalonnage MS, l’acquisition MS, le traitement des données et l’analyse des résultats. Le prétraitement de l’échantillon comprend la collecte, le nettoyage, le séchage, le broyage et l’extraction. L’étalonnage MS consiste en une correction multipoint et monopoint. Le traitement des données comprend l’importation de données, l’établissement de méthodes, le traitement de l’analyse et la présentation des résultats. Des résultats représentatifs du modèle de fragmentation typique des acides phénoliques, des esters et des glycosides chez Gynura bicolor DC (BFH) sont présentés dans cet article. De plus, la sélection des solvants organiques, l’extraction, l’intégration des données, la sélection de l’énergie de collision et l’amélioration de la méthode sont discutées en détail. Ce protocole universel peut être largement utilisé pour identifier des composés complexes en MTC.

Introduction

La médecine traditionnelle chinoise (MTC) est pratiquée cliniquement en Chine depuis des milliers d’années et joue un rôle essentiel dans le maintien de la santé des Chinois1. La composition de la MTC est diverse et complexe, et la MTC a été largement rapportée dans de nombreuses études qualitatives axées sur la composition chimique2. Les composants chimiques de la MTC peuvent être grossièrement divisés dans les catégories suivantes telles que les alcaloïdes, les acides organiques, les phénylpropanoïdes, les coumarines, les lignanes, les quinones, les flavonoïdes, les terpénoïdes, les saponines triterpénoïdes, les saponines stéroïdes, les glycosides cardiaques et les tanins3. Étant donné le grand nombre de composants inconnus et d’isomères indiscernables dans la MTC, la séparation et l’analyse des composants chimiques souhaités sont des sujets importants pour la recherche fondamentale de la MTC4.

La chromatographie liquide à ultra-haute performance et la spectrométrie de masse quadripolaire à temps de vol (UPLC-Q-TOF-MS) ont été appliquées pour analyser des substances de la médecine traditionnelle chinoise (MTC), qui peuvent être séparées par chromatographie liquide à ultra-haute performance 5,6. La haute résolution de MS peut fournir des informations ioniques étendues, qui sont utilisées pour l’analyse de bases de données avec une erreur inférieure à 5 ppm7. Après avoir activé l’énergie de collision, le mode MS secondaire peut obtenir des ions de fragments secondaires, dont l’intensité et le nombre sont affectés par l’intensité de l’énergie8.

Gynura bicolor DC. (BFH), une plante vivace sans tige largement utilisée en médecine et en alimentation (Figure 1A), est une plante rare et menacée unique à la Chine9. BFH a une abondance d’anthocyanes, de polyphénols, de flavonoïdes et une forte capacité antioxydante10. BFH a des effets médicinaux, notamment l’élimination de la chaleur, le refroidissement du sang, l’humidification des poumons, le soulagement de la toux, la dispersion de la stase, le soulagement de l’enflure, le soulagement de la chaleur estivale et l’élimination de la chaleur. Peu d’études se sont concentrées sur la composition chimique de BFH11. Les polyphénols et les flavonoïdes contiennent de nombreux isomères, ce qui rend difficile l’identification des composés complexes dans la BFH. Il faut développer une méthode universelle d’identification des composants chimiques, qui puisse être appliquée à tous les types de MTC. Cette étude visait à rendre compte d’un protocole systématique d’étude des constituants chimiques de la BFH basé sur l’extraction par solvant et les données intégrées via UPLC-Q-TOF-MS.

Protocole

1. Prétraitement de l’échantillon

  1. Lavez toute l’herbe de BFH dans de l’eau pure jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de dépôts et d’impuretés visibles. Placez le BFH propre dans un plat, puis placez-le au four (Figure 1B). Réglez le four à 50 °C pendant 24 h.
    REMARQUE : La plante entière de BFH a été récoltée dans la province du Sichuan, en Chine.
  2. Broyage séché BFH dans un broyeur multifonction à grande vitesse. Transférez la poudre grossière dans un tamis de 50 mailles (Figure 1C). Recueillez la poudre fine dans un sac hermétique et stockez-la dans une tour de séchage.
  3. Pesez avec précision six échantillons BFH de 0,25 g chacun et placez-les dans six flacons coniques. Ajouter 30 mL de solvant organique (50 % d’éthanol dans l’eau, 70 % d’éthanol dans l’eau, de chloroforme, d’éther de pétrole, d’acétate d’éthyle et d’alcool n-butylique) dans chaque bouteille conique (figure 1D).
  4. Transvaser le mélange dans un sonicateur à bain d’ultrasons pendant 30 min d’extraction à 25 °C. Centrifuger l’échantillon à 14 000 x g pendant 5 min. Préparez une seringue d’injection et un filtre à membrane microporeuse organique de 0,22 μm. Filtrer tous les surnageants dans des flacons d’échantillon de 2 ml.

2. Étalonnage MS

  1. À l’aide d’une pipette de 1 000 μL, transférez 500 μL de solution d’hydroxyde de sodium 0,1 M dans une fiole jaugée de 100 mL, puis transférez 450 μL d’eau désionisée ou ultrapure dans la fiole jaugée de 100 mL (figure 2).
  2. À l’aide d’une pipette de 200 μL, ajouter 50 μL d’acide formique dans la fiole jaugée de 100 mL. Préparer un volume total de 100 mL avec du 2-propanol 90:10 et soniser la solution pendant 5 min. Étiquetez le ballon avec une solution de formiate de sodium de 0,5 mM dans du 2-propanol 90:10 et conservez-le au réfrigérateur.
    REMARQUE : La solution de formiate de sodium expire en 1 semaine à température ambiante.
  3. Lancez le logiciel de contrôle UPLC-Q-TOF-MS, puis ouvrez la fenêtre MS tune . Dans le panneau de contrôle du débit d’échantillon , réglez 25 μL/min dans l’option Débit d’infusion et sélectionnez C dans l’option Réservoir . Attendez environ 1 min pour que la purge automatique soit terminée.
  4. Cliquez sur le bouton Flow pour commencer à administrer la solution de formiate de sodium. Cliquez sur le bouton Positif pour passer en mode ion positif, puis cliquez sur le bouton Sensibilité pour passer en mode sensibilité.
    REMARQUE : Passez à l’étape suivante jusqu’à ce que les pics caractéristiques de formiate de sodium apparaissent sur la fenêtre de spectre en temps réel.
  5. Dans le logiciel de contrôle UPLC-Q-TOF-MS, ouvrez la fenêtre MS Console . En position gauche, sélectionnez les options SYNAPT XS et Intellistart dans l’ordre.
  6. Cochez la case Créer un étalonnage et cliquez sur le bouton Démarrer . Cliquez sur le bouton Suivant , puis sélectionnez Profil d’étalonnage dans le menu déroulant. Cliquez sur le bouton Suivant et sélectionnez le mode Sensibilité en polarité positive . Cliquez successivement sur les boutons Suivant, Régler la page, Suivant et Démarrer .
  7. Basculez vers la fenêtre MS tune , puis cliquez sur le bouton Negative pour passer en mode ions négatifs. Revenez à la fenêtre MS Console .
  8. Cochez la case Créer un étalonnage et cliquez sur le bouton Démarrer . Cliquez sur le bouton Suivant et sélectionnez Profil d’étalonnage dans le menu déroulant. Cliquez sur le bouton Suivant et sélectionnez le mode Sensibilité en polarité négative . Cliquez successivement sur les boutons Suivant, Régler la page, Suivant et Démarrer .
  9. Dans le panneau de contrôle de débit LockSpray , réglez un débit de 50 μL/min et cliquez sur le bouton Débit pour laisser la solution LE entrer dans le spectromètre de masse. Passez à la fenêtre de réglage MS , cochez la configuration de la source LockSpray et cliquez sur le bouton Démarrer pour commencer l’étalonnage.

3. Acquisition de MS

  1. Passez à l’interface principale et cliquez avec le bouton droit de la souris sur la colonne Fichier d’entrée pour ouvrir la méthode de chromatographie liquide.
  2. Cliquez sur le bouton Entrée , puis définissez les paramètres, notamment le temps d’exécution et le dégradé. Cliquez sur le bouton Échantillonneur automatique , puis définissez les paramètres, notamment le temps d’exécution, la colonne et l’échantillon. Cliquez sur le bouton Enregistrer .
  3. Cliquez avec le bouton droit de la souris sur la colonne Méthode MS pour ouvrir la méthode de spectrométrie de masse.
  4. Cliquez sur le bouton Informations , puis définissez les paramètres, notamment l’heure de fin, la polarité, le mode analyseur, la masse faible, la masse élevée et l’énergie de collision de transfert de rampe. Cliquez sur le bouton OK , puis sur le bouton Enregistrer .
  5. Remplissez le tableau de séquence, y compris le nom du fichier, le flacon et le vol. Cliquez sur le bouton Enregistrer .
  6. Sélectionnez la ligne de la table de séquence pour l’échantillon que vous souhaitez exécuter. Cliquez sur le bouton Exécuter , puis cliquez sur le bouton OK dans la fenêtre qui s’affiche.

4. Traitement des données

  1. Lancez le logiciel d’analyse de données. Dans la colonne Mon travail , cliquez sur le bouton Importer des données MassLynx pour ouvrir une nouvelle fenêtre.
  2. Cliquez sur le bouton du signe plus et vérifiez les cinq fichiers bruts en mode positif. Entrez un nom de groupe et cliquez sur le bouton Créer un jeu d’échantillons UNIFI pour lancer l’importation des données (Figure 3A).
  3. Double-cliquez sur le fichier de la méthode d’analyse en mode positif. Cliquez sur l’étiquette Traitement , puis sur le bouton Cible par masse . Entrez le nombre de 5 ppm dans la zone de saisie après Tolérance de correspondance cible et Tolérance de correspondance de fragment.
  4. Cliquez sur le bouton Accueil , puis sur le bouton Adduits . Sélectionnez les lignes +H et +Na, puis cliquez sur le bouton en forme de flèche droite . Cliquez sur le bouton Enregistrer (Figure 3B).
  5. Double-cliquez sur le fichier de la méthode d’analyse en mode négatif. Cliquez sur l’étiquette Traitement , puis sur le bouton Cible par masse . Entrez le nombre de 5 ppm dans la zone de saisie après Tolérance de correspondance cible et Tolérance de correspondance de fragment.
  6. Cliquez sur le bouton Accueil, puis sur le bouton Adduits . Sélectionnez les rangées -H et +HCOO et cliquez sur le bouton en forme de flèche droite . Cliquez sur le bouton Enregistrer .
  7. Dans la colonne Mon travail, cliquez sur le bouton Analyse pour ouvrir une nouvelle fenêtre. Choisissez les données qui viennent d’être importées et la méthode qui vient d’être créée, puis cliquez sur le bouton Suivant. Entrez le nom du fichier. Sélectionnez le dossier dans lequel les données d’analyse sont stockées, puis cliquez sur le bouton Terminer
  8. Cliquez sur le bouton Traiter et attendez quelques minutes jusqu’à ce que les résultats s’affichent (Figure 3C).
  9. Copiez la table des résultats dans un formulaire vide (Figure 3D).

5. Analyse des résultats

  1. Sélectionnez un composé dans la table des résultats. Le spectre de masse secondaire correspondant sera affiché dans le coin inférieur droit (Figure 4A).
  2. Cliquez sur le bouton en forme de tableau et sélectionnez l’option Fragments de haute énergie pour afficher le tableau des ions de fragments secondaires (Figure 4B).
  3. Sélectionnez un ion de fragment secondaire dans le tableau. Déplacez la souris sur le pic d’ions correspondant au spectre de masse secondaire, et la rupture structurelle correspondante s’affichera à l’écran (Figure 4C).
    REMARQUE : Évaluez manuellement le caractère raisonnable de la fissuration donnée par le logiciel et distinguez les isomères en fonction des ions de fragments secondaires.
  4. Dessinez manuellement le motif de fragmentation dans le logiciel de dessin.
    REMARQUE : Des exemples de modèles de fragmentation sont décrits en détail dans la section des résultats représentatifs.

Résultats

L’identification de la composition chimique de la BFH a été utilisée comme modèle pour afficher les résultats représentatifs. Chromatogrammes de pointe de base de Gynura bicolor DC extrait par solvant. sont indiqués dans le fichier supplémentaire 1-Figure supplémentaire S1-S6, et le temps de rétention observé (RT), le nom du composant, la formule, le rapport masse/charge (m/z) et l’erreur de masse sont répertoriés dans les tableaux S1-S6. Dans le ZBTK, les 35 types de composés ont été identifiés à partir de pics séparés dans UPLC-TOF-MS. Comme le montre le dossier supplémentaire 1-Tableau supplémentaire S1, les principaux produits chimiques contenaient de l’acide (acide quinique, acide DL-malique, acide citrique, acide o-coumarique et acide 3-O-trans-coumaroylquinique), des glycosides (gentiopicrine, picroside II, suffruticoside J, copoline et bornéol-2-O-β-D-apiofuranosyl-(1→6)-β-D-glucoside) et des esters (bilobalide, citrate de triméthyle et trans-O-glucosyl-méthyl-trans-cinnamate). Dans le ZBTK-CT, 25 types de composés supplémentaires ont été détectés (Fichier supplémentaire 1-Tableau supplémentaire S2), et 45 types de composés totaux ont été observés.

Lorsque le chloroforme a été utilisé comme agent d’extraction, les 50 composés ont été trouvés. Parmi eux, les 28 types de composés supplémentaires comprenaient l’acide coronarique, l’acide sanleng, l’agrimol A et le méthylartémisate (Dossier supplémentaire 1-Tableau supplémentaire S3). Lorsque l’éther de pétrole a été utilisé comme agent d’extraction, 44 types de composés totaux ont été observés. Nous avons trouvé 17 types de composés supplémentaires, y compris le notoptérol, l’onjisaponine et le cnideol B (Fichier supplémentaire 1-Tableau supplémentaire S4). Au total, 65 composés ont été obtenus dans un solvant en utilisant de l’acétate d’éthyle comme agent extractible. Par rapport aux quatre extractifs précédents, 37 composés supplémentaires ont été notés, tels que la daphnétine, l’acétovanillone B et le stigmastérol-3-O-β-D-glucoside (Dossier supplémentaire 1-Tableau supplémentaire S5). Dans l’extraction de l’alcool butylique, nous avons trouvé 67 types de composés totaux, qui contenaient 26 types de composés supplémentaires, y compris le rengyoside C, les chromones, l’aturamételine F et la désacétylmatricarine-8-O-β-D-glucopyranoside (Dossier supplémentaire 1-Tableau supplémentaire S6). En résumé, nous avons trouvé 168 composés sur la base de tous les résultats de composés de six extractants.

Pour comprendre en profondeur la voie de clivage des types de composés dans UPLC-TOF-MS, nous avons sélectionné trois composés à titre d’exemples. Pour les acides, l’acide 3-O-trans-coumaroylquinique avec m/z = 337,09222 pourrait perdre un groupe C7H10O5 ou C9H8O2 via la réaction d’hydrolyse pour former des intermédiaires avec m/z = 163,04116 ou 199,05557, respectivement (Figure 4D). Pour les esters, le trans-O-glucosyl-méthyl-trans-cinnamate avec m/z = 385,11308 pourrait être converti en intermédiaire avec m/z = 153,07485 ou 135,04679 via le clivage C-C à différents sites (Figure 4E). Pour les glycosides, la citrusine C avec m/z = 385,11308 s’est transformée en intermédiaire avec m/z = 272,09174 via le clivage de la liaison C-C dans la chaîne aliphatique, tandis que la perte du groupe C7H6O2 a entraîné un intermédiaire avec m/z = 113,02534 (Figure 4F). Dans une autre voie, la rupture de la liaison C-O-C sur le cycle benzénique a conduit à la formation d’un intermédiaire avec m/z = 163,11245, tandis que l’unité hexose a disparu.

Les résultats représentatifs de l’amarrage moléculaire ont révélé des structures 2D et 3D dans les figures 4G et H, respectivement. L’analyse d’enrichissement de l’ontologie génétique a montré les résultats de la fonction des gènes en termes de processus biologique (BP), de composante cellulaire (CC) et de fonction moléculaire (MF ; Figure 4I). L’analyse de l’annotation des voies de l’Encyclopédie de Kyoto des gènes et des génomes a montré les résultats des voies des gènes exprimés de manière différentielle, qui pourraient être utilisés pour mieux comprendre la fonction des gènes (Figure 4J). Les résultats détaillés de l’amarrage moléculaire sont présentés dans le Fichier supplémentaire 1-Tableau supplémentaire S7 et le Fichier supplémentaire 1-Figure supplémentaire S7-S9.

figure-results-1
Figure 1 : Méthode de prétraitement de la médecine traditionnelle chinoise. (A) Gynura bicolor DC. (B) Nettoyage et séchage. (C) Pulvérisation. (D) Ajout de solvant organique. (E) Extraction par ultrasons. (F) Centrifugation du mélange. (G) Filtration du surnageant. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-2
Figure 2 : Procédure d’utilisation de l’UPLC-Q-TOF-MS/MS. (a) Préparation de formiate de sodium. (B) Étalonnage de l’axe de masse. (C) Mélodie MS. (D) Placement de l’échantillon. E) Acquisition massive du spectre. (F) Affichage du spectre de masse. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-3
Figure 3 : Traitement et intégration des données. (A) Conversion des données. (B) Modification de la méthode. (C) Traitement des données. (D) Analyse statistique des résultats. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-4
Figure 4 : Analyse approfondie des résultats. (A) Spectre de masse secondaire. (B) Affichage des ions de fragments secondaires. (C) Affichage du site de fracture. (D) modèle de fragmentation 1. (E) Modèle de fragmentation 2. (F) Modèle de fragmentation 3. (G) Démonstration de l’objectif d’action de la matière active. (H) Structure 3D de la cible d’action de l’ingrédient actif. (I) Analyse de l’enrichissement GO. (J) Analyse d’annotation de la voie KEGG. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Fichier supplémentaire 1 : Identification des composés, résultats d’amarrage moléculaire, chromatogrammes à pic de base et analyse de réseau. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Outre la décoction d’eau12, l’extraction par solvant organique est une autre méthode courante de prétraitement MTC13. Selon le principe de la dissolution de phase similaire, de nombreux composants ont été extraits par la combinaison de divers solvants organiques14. L’extraction assistée par ultrasons est l’une des principales méthodes utilisées pour obtenir des composants dans la MTC15. L’extraction au dioxyde de carbone supercritique est bonne pour extraire certains types de substances telles que les lignanes16. De plus, l’extraction assistée par micro-ondes dans des liquides ioniques (IL) a été étudiée comme alternative aux extractions conventionnelles par solvant organique17. Cependant, le contrôle précis de l’énergie des micro-ondes est difficile à obtenir, ce qui peut provoquer des réactions secondaires telles que la déshydratation de l’éthérification et la déshydratation de l’estérification.

Des paramètres optimaux de l’énergie de collision peuvent fournir des informations supplémentaires sur les fragments MS de second ordre. L’information provenant de la spectrométrie de masse en tandem, c’est-à-dire du mode MSE , a été fournie par deux balayages alternatifs parallèles utilisant soit une faible énergie pour obtenir des informations sur les ions moléculaires, soit une énergie élevée pour obtenir des ions de fragment de masse précis à balayage complet18. Lors du réglage de paramètres à haute énergie, la plage de 10 à 35 V est généralement utilisée dans l’énergie de collision de transfert de rampe pour améliorer l’efficacité de fragmentation des précurseurs19.

La grande quantité de données MS brutes a été générée à partir de MS haute résolution. Les données MS brutes, qui comprenaient des pics d’ions moléculaires dans le spectre MS et des pics d’ions fragmentaires dans le spectre MS/MS, doivent être soigneusement traitées et intégrées. Le logiciel d’analyse de données MS visait à analyser tous les métabolites d’un échantillon biologique de manière exhaustive20. Le criblage des métabolites sulfatés a été basé sur l’acquisition dépendante des données de la MS complète et des données multidimensionnelles sur les métabolites21. Sur la base de l’évolution de la technologie, la prédiction de l’intelligence artificielle sera une direction de développement réalisable pour l’analyse des données MS.

La majorité des composés peuvent être identifiés par cette méthode. Cependant, les fragments secondaires limités ne peuvent pas identifier complètement tous les isomères, y compris les flavonoïdes et les tanins. Pour parvenir à l’identification de la structure, les chercheurs peuvent utiliser la spectrométrie de masse en tandem pour fournir des informations supplémentaires sur les ions fragments, ce qui aide à l’identification des structures composées8. Étant donné la limitation de l’ion ionisation par électronébulisation ou de la source d’ionisation chimique sous pression atmosphérique, la spectrométrie de masse à haute résolution ne convient pas à l’analyse des macromolécules. L’ionisation par désorption laser assistée par matrice peut favoriser l’ionisation de composés moléculaires de grande taille, tels que les protéines22. En résumé, UPLC-Q-TOF-MS/MS est l’une des techniques les plus largement applicables pour l’identification des composés de la MTC. Il a le potentiel d’être appliqué à d’autres domaines, notamment la médecine clinique et la chimie énergétique.

Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.

Remerciements

Ce travail a été financé par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (82104881), l’équipe d’hérédité et d’innovation du traitement des maladies immunitaires de la MTC, le projet de recherche scientifique médicale de Chongqing (projet conjoint de la Commission de la santé de Chongqing et du Bureau des sciences et de la technologie) (2022DBXM007), un projet spécial d’incitation à la performance et d’orientation de l’Institut de recherche scientifique de Chongqing (cstc2022jxjl120005), un projet spécial pour la Fondation des sciences postdoctorales de Chongqing (2022CQBSHTB3035), Programme de talents médicaux seniors de Chongqing pour les Yong et les personnes d’âge moyen, le Programme pour les institutions scientifiques de Chongqing (projet de recherche indépendant n° 2022GDRC015).

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
chloroformeSinopharm Chemical ReagentCo., LtdCAS 67-66-3
éthanolChuandongChemicalCAS 64-17-5
acétate d’éthyleChuandongChemicalCAS 141-78-6
chromatographe en phase liquideWatersACQUITY Classe 1 plus
MassLynxWatersV4.2MS logiciel
de contrôlealcool n-butyliqueChuandongChemicalCAS 71-36-3
éther de pétroleChuandongChemicalCAS 8032-32-4
Spectrométrie de masse quadripolaire à temps de volWaters SYNAPTXS
UNIFI WatersLogiciel d’analyse de données

Références

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