Article de méthode

Microinjection embryonnaire pour la transgenèse chez la drosophile

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DOI :

10.3791/66679

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7 juin 2024

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1Clinical Research Institute, The Affiliated Nanhua Hospital, Hengyang Medical School, University of South China, 2Department of Clinical Laboratory, The Affiliated Nanhua Hospital, Hengyang Medical School, University of South China, 3Institute of Biochemistry and Molecular Biology, Hengyang Medical School, University of South China, 4Department of Neurology, The Affiliated Nanhua Hospital, Hengyang Medical School, University of South China

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Cet article prend l’exemple de la transgenèse médiée par l’intégrase phiC31 chez la drosophile et présente un protocole optimisé pour la micro-injection embryonnaire, une étape cruciale pour la création de mouches transgéniques.

Résumé

La transgenèse chez la drosophile est une approche essentielle pour étudier la fonction des gènes au niveau de l’organisme. La micro-injection d’embryons est une étape cruciale pour la construction des mouches transgéniques. La micro-injection nécessite certains types d’équipement, notamment un micro-injecteur, un micromanipulateur, un microscope inversé et un stéréomicroscope. Les plasmides isolés à l’aide d’un kit de miniprep plasmidique sont qualifiés pour la micro-injection. Les embryons au stade pré-blastoderme ou blastoderme syncytial, où les noyaux partagent un cytoplasme commun, sont soumis à une micro-injection. Une passoire cellulaire facilite le processus de déchâtionnement des embryons. Le moment optimal pour la déchorionisation et la dessiccation des embryons doit être déterminé expérimentalement. Pour augmenter l’efficacité de la micro-injection d’embryons, les aiguilles préparées par un extracteur doivent être biseautées par un broyeur d’aiguilles. Dans le processus de broyage des aiguilles, nous utilisons une pompe à air à pied avec un manomètre pour éviter l’effet capillaire de la pointe de l’aiguille. Nous injectons régulièrement 120 à 140 embryons pour chaque plasmide et obtenons au moins une lignée transgénique pour environ 85 % des plasmides. Cet article prend l’exemple de la transgenèse médiée par l’intégrase phiC31 chez la drosophile et présente un protocole détaillé pour la micro-injection embryonnaire pour la transgenèse chez la drosophile.

Introduction

La mouche des fruits Drosophila melanogaster est extrêmement sensible à la manipulation génétique et à l’analyse génétique. Les mouches des fruits transgéniques sont largement utilisées dans la recherche biologique. Depuis son développement au début des années 1980, la transgenèse médiée par le transposon de l’élément P est indispensable à la recherche sur la drosophile 1. Dans certains scénarios, d’autres transposons, tels que piggyBac et Minos, ont également été utilisés pour la transgenèse chez la drosophile 2. Les transgènes via transposon sont insérés au hasard dans le génome de la drosophile, et les niveaux d’expression des transgènes à différents loci génomiques peuvent varier en raison des effets de position et ne peuvent donc pas être comparés2. Ces inconvénients ont été surmontés par la transgénèse spécifique au sitemédiée par phiC31 3. Le gène phiC31 du bactériophage code pour une intégrase qui médie la recombinaison spécifique de la séquence entre les sites attB et attP chez la drosophile3. De nombreux sites d’amarrage attP ont été caractérisés et sont disponibles dans le Bloomington Drosophila Stock Center 3,4,5,6,7,8,9.

Le système de transgenèse phiC31 pour la drosophile a été largement utilisé par la communauté des mouches. Parmi les sites d’amarrage attP, attP18 sur le chromosome X, attP40 sur le deuxième chromosome et attP2 sur le troisième chromosome sont généralement les sites privilégiés pour l’intégration des transgènes sur chaque chromosome, car les transgènes sur les trois sites présentent des niveaux élevés d’expression inductible tout en ayant de faibles niveaux d’expression basale5. Récemment, cependant, van der Graaf et ses collègues ont découvert que le site attP40, proche du locus du gène Msp300, et les transgènes intégrés à attP40 provoquent le regroupement nucléaire des muscles larvaires chez la drosophile10. Dans une autre étude récente, Duan et ses collègues ont découvert que le chromosome homozygote attP40 perturbe l’organisation glomérulaire normale de la classe de neurones récepteurs olfactifs Or47b chez la drosophile11. Ces résultats suggèrent que des contrôles rigoureux devraient être inclus lors de la conception des expériences et de l’interprétation des données.

La drosophile est un organisme modèle idéal pour l’interrogation in vivo de la fonction des gènes en raison de son cycle de vie court, de son faible coût et de sa facilité d’entretien. Le criblage génétique à l’échelle du génome repose sur la construction de banques transgéniques à l’échelle du génome chez la drosophile 12,13,14,15. Nous avons précédemment généré 5551 constructions UAS-ADNc/ORF basées sur le système binaire GAL4/séquence d’activation en amont (GAL4/UAS), couvrant 83% des gènes de la drosophile conservés chez l’homme dans la collection Gold16 du Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). Les plasmides UAS-ADNc/ORF peuvent être utilisés pour la création d’une banque transgénique UAS-ADNc/ORF chez la drosophile. Une technologie efficace de micro-injection d’embryons peut accélérer la création de banques de mouches transgéniques.

Pour la microinjection d’embryons, la pointe de l’aiguille est normalement cassée contre une lamelle17. Ainsi, les aiguilles se bouchent fréquemment ou provoquent des fuites de grandes quantités de cytoplasme, et lorsque ces problèmes surviennent, de nouvelles aiguilles doivent être utilisées. Bien que les aiguilles biseautées puissent améliorer l’efficacité de la microinjection, la solution de broyage pénètre dans la pointe biseautée pendant le processus de broyage. La solution de broyage dans la pointe biseautée ne s’évapore pas rapidement naturellement ; Par conséquent, les aiguilles ne peuvent pas être utilisées pour la micro-injection directement après le biseautage. Ces facteurs réduisent l’efficacité des procédures de micro-injection d’embryons. Ici, en utilisant la transgenèse spécifique du site médiée par phiC31 chez la drosophile comme exemple, nous présentons un protocole de micro-injection embryonnaire pour la transgenèse chez la drosophile. Pour empêcher la solution de broyage de pénétrer dans l’aiguille, nous utilisons une pompe à air pour exercer une pression d’air à l’intérieur de l’aiguille, empêchant ainsi la solution de broyage de pénétrer dans la pointe biseautée. Les aiguilles biseautées sont prêtes pour le chargement de l’échantillon et la micro-injection directement après le biseautage.

Protocole

1. Préparation des plasmides

  1. Isolez les plasmides de 4 ml de cultures bactériennes pendant la nuit à l’aide d’une trousse de minipréparation de plasmides. Éluer avec 40 μL de tampon d’élution.
    REMARQUE : L’isolement des plasmides à l’aide d’un kit de préparation de plasmides n’est pas nécessaire. Un kit de miniprep plasmidique peut répondre pleinement aux exigences expérimentales de la micro-injection d’embryons. Dans ce protocole, les plasmides UAS-ADNc/ORF préparés contiennent dix copies de UAS, un promoteur minimal Hsp70, un site attB, un gène mini-blanc et un gène d’intérêt.
  2. Déterminez la concentration d’ADN plasmidique à l’aide d’un spectrophotomètre et conservez-le au congélateur à -80 °C.
    REMARQUE : La concentration plasmidique n’est pas critique pour la réussite de la micro-injection embryonnaire, car des concentrations plasmidiques allant de 20 ng/μL à 1683 ng/μL fonctionnent bien pour la transgenèse chez la drosophile (tableau supplémentaire 1).
  3. Juste avant la microinjection, décongeler les plasmides et centrifuger à 13000 x g pendant 5 min.
  4. Transférez 10 μL de chaque plasmide de la couche supérieure du liquide dans un nouveau tube de 1,5 mL.

2. Tirer les aiguilles

  1. Allumez un extracteur d’aiguille avec les réglages sélectionnés (Chaleur : 500, Traction : 50, Vel : 60, Retard : 90, Pression : 200, Test de rampe : 510).
  2. Insérez un capillaire en verre borosilicate (diamètre extérieur 1,0 mm, diamètre intérieur 0,75 mm, longueur 10 cm) dans l’extracteur d’aiguille et fermez le couvercle.
  3. Appuyez sur le bouton Tirer . Chaque capillaire de verre forme deux aiguilles.

3. Broyage des aiguilles (Figure 1)

  1. Utilisez un broyeur à aiguilles monté avec une plaque abrasive appropriée (pour les pointes de 0,7 à 2,0 μm) d’un broyeur à aiguilles.
  2. Mouillez le chiffon (fil de référence) avec une solution de broyage (100 ml d’eau distillée avec 0,9 g de NaCl, 1 ml d’agent mouillant) et fixez le chiffon.
  3. Allumez le broyeur d’aiguilles et maintenez la plaque de broyage en rotation.
  4. Connectez une aiguille à une pompe à air à pied avec un manomètre via un tube capillaire en silicone, puis montez l’aiguille sur un porte-aiguille du broyeur d’aiguilles. Ajustez l’angle de l’aiguille par rapport à la plaque de broyage à 35° (Figure 1A, B).
  5. Ajustez la position de la pointe de l’aiguille juste au-dessus de la surface de la plaque de broyage à l’aide d’un bouton de commande grossier placé sous le microscope (Figure 1C).
    REMARQUE : Les aiguilles tirées obtenues dans la section 2 ont un cône de 6 à 8 mm et une pointe inférieure à 1 μm (Figure 1D), comme décrit dans le manuel d’utilisation de l’extracteur.
  6. Maintenez la pression intérieure de l’aiguille à 40 psi à l’aide de la pompe à air à pied. Ajustez la position de la pointe de l’aiguille à l’aide d’un bouton de commande fin sous le microscope et faites en sorte que la pointe de l’aiguille touche la plaque de broyage.
  7. Broyer pendant 3 à 5 s. Lorsque de minuscules bulles d’air sortent de la pointe de l’aiguille, déchargez l’aiguille (Figure 1E).
    REMARQUE : Dans le processus de broyage, l’utilisation d’une pompe à air empêche la solution de broyage de siphonner.
  8. Mettez les aiguilles à broyer dans un étui de rangement.
    REMARQUE : Utilisez autant que possible des aiguilles fraîchement moulues, bien que les aiguilles broyées puissent être conservées dans un étui de rangement pendant au moins quelques semaines avant la micro-injection.

4. Préparation des pipettes pour le chargement des plasmides

  1. Chauffer une pipette de 200 μL avec la flamme extérieure d’un brûleur à alcool.
  2. Une fois qu’elle commence à fondre, étirez la pipette.
  3. Coupez l’extrémité scellée de la pipette étirée avec des ciseaux, et la pipette étirée est alors prête à charger l’ADN dans une aiguille broyée.
    REMARQUE : Alternativement, des pointes extrêmement longues et fines pour remplir les aiguilles broyées sont disponibles dans le commerce.
  4. Placez ces pipettes dans une boîte en plastique autoclave.

5. Prélèvement d’embryons

  1. Prélever des mouches (vas-phiC31 ; + ; attP2) exprimant la phiC31 intégrase et portant le site d’amarrage de l’attP2 3 jours après leur éclosion à partir de 50 flacons et les transférer dans une cage (φ 90 mm x 150 mm). Ajouter un peu de pâte de levure fraîche au centre de chaque assiette de géloseau raisin 18.
  2. Préparez 2 à 4 cages de mouches. Gardez les cages et les plaques à 25 °C et changez les plaques tous les jours pendant 2 à 4 jours.
    REMARQUE : Cette étude a combiné le transgène vas-phiC31 (Stock # 36313, Bloomington Drosophila Stock Center) sur le premier chromosome et le transgène attP2 (Stock # 36313, Bloomington Drosophila Stock Center) sur le troisième chromosome. Le stock résultant (vas-phiC31 ; + ; attP2) est utilisé dans ce protocole. La pâte de levure doit être préparée quotidiennement et la pâte de levure fraîche doit être donnée aux mouches. Les cages remplacées doivent être nettoyées et séchées pour se débarrasser des embryons restants dans les cages.
  3. Le jour de la microinjection, changez les cages et les plaques le matin. Ensuite, changez les plaques toutes les 30 minutes et prélevez les embryons dans ces plaques. Changez toutes les cages et plaques à température ambiante (RT) et maintenez ensuite les cages et les plaques à 25 °C.
    REMARQUE : Certains protocoles préfèrent incuber les cages et les plaques à 18 °C pour la ponte. Cela dépend du nombre d’embryons dont on a besoin pour la micro-injection.

6. Embryons déchorionnés

  1. Préparez de l’eau de Javel à 30 % en mélangeant 60 ml d’eau de Javel (contenant du chlore actif de 34 à 46 g/L) et 140 ml d’eau distillée doublement.
  2. Retirez les mouches restantes sur les plaques de gélose au jus de raisin à l’aide d’une brosse ou d’une pince et rincez les embryons dans une passoire cellulaire avec de l’eau distillée deux fois.
  3. Séchez la passoire cellulaire contenant les embryons avec du papier de soie.
  4. Placez-le dans une boîte de Pétri contenant 30 % d’eau de Javel et faites tourner la passoire cellulaire à la main ou à l’aide d’un agitateur horizontal pendant 1,5 min à 60 tr/min.
    REMARQUE : Le rinçage est une étape critique. Si le temps de rinçage n’est pas assez long, la coquille d’un embryon ne se détachera pas complètement. Si le temps de rinçage est trop long, l’embryon deviendra mou et se cassera facilement. La passoire à cellules doit être complètement immergée dans l’eau de Javel à 30 %. Portez une paire de gants en caoutchouc et une blouse de laboratoire pour éviter les blessures causées par l’eau de Javel.
  5. Rincez les embryons pendant 2 minutes avec de l’eau distillée double stockée dans une bouteille de lavage en plastique de laboratoire pour éliminer l’eau de Javel résiduelle. Choisissez les embryons flottants pour la gamme.

7. Aligner les embryons

  1. Coupez l’agar au jus de raisin solide en longues lanières à l’aide d’une lame.
    REMARQUE : Utilisez du jus de raisin violet pour faciliter l’alignement des embryons blancs.
  2. Transférez les embryons sur une longue bande à l’aide d’un pinceau.
  3. Alignez environ 60 embryons avec une aiguille de dissection le long du bord d’une longue bande, les postérieurs tournés vers l’extérieur de la bande. Alignez environ 60 embryons en 5 minutes.
    REMARQUE : Le micropyle est une saillie en forme de cône au pôle antérieur de l’embryon, par laquelle le spermatozoïde entre pour féconder l’ovocyte (Figure 2A). Par conséquent, sur la base de la saillie en forme de cône au pôle antérieur de l’embryon, il est facile de déterminer la partie postérieure de l’embryon déchorionné.
  4. Placez un ruban adhésif double face de 18 mm dans le sens de la longueur le long du bord d’une lamelle (18 mm x 18 mm) et retirez le support papier. Appuyez doucement sur la lamelle sur les embryons alignés. Assurez-vous que les embryons sont collés au centre du ruban.

8. Dessécher les embryons

  1. Placez la lamelle avec les embryons alignés dans une boîte contenant du déshydratant. Le temps de séchage varie en fonction de la température et de l’humidité.
    REMARQUE : Le temps de séchage est critique pour la micro-injection et doit être déterminé expérimentalement. Le temps de séchage est généralement de 9 à 10 minutes en été et de 17 à 18 minutes en hiver.
  2. Couvrez les embryons d’huile d’halocarbure.
    REMARQUE : Ne laissez pas tomber trop d’huile sur les embryons, car l’huile supplémentaire pourrait déborder de l’adhésif. Le rapport volumique de l’huile d’halocarbure 700 et de l’huile d’halocarbure 27 est de 1:3.

9. Micro-injection d’embryons

  1. Chargez 2 μL d’ADN dans l’aiguille à l’aide de la pipette étirée. Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles dans l’aiguille. Placez l’aiguille dans le porte-aiguille du micromanipulateur.
  2. Placez les embryons alignés recouverts d’huile d’halocarbure sous un microscope inversé. Assurez-vous que les extrémités postérieures des embryons font face à l’aiguille.
  3. Utilisez le micromanipulateur pour approcher l’aiguille des embryons. Nettoyez l’aiguille. Assurez-vous qu’une goutte de liquide sortant de l’aiguille est visible. À partir d’une pression d’injection de 300 hPa et d’une pression d’équilibre de 20 hPa, ajustez la pression d’injection et la pression d’équilibre pour assurer la taille optimale de la goutte de liquide.
  4. À l’aide du micromanipulateur, insérez l’aiguille dans les extrémités postérieures des embryons et à l’aide de la pédale de commande reliée au microinjecteur pour injecter l’ADN (figure 2). Si un petit halo est visible, l’ADN est injecté avec succès dans l’embryon.
    REMARQUE : Sélectionnez les embryons multinucléés pour l’injection et tuez les embryons plus âgés à l’aide du bouton « nettoyer ». Si une grande quantité de cytoplasme fuit après l’injection, les embryons sont sous-secs. Si seule une petite quantité de cytoplasme ou aucune quantité ne s’échappe après l’injection, les injections sont considérées comme réussies. Si plus d’un tiers des embryons fuient du cytoplasme après l’injection, prolongez le temps de séchage de 1 à 2 minutes. Si plus d’un tiers des embryons sont trop secs, raccourcissez le temps de séchage de 1 à 2 minutes.
  5. Retirez l’aiguille de l’embryon. Déplacez l’aiguille vers l’extrémité postérieure de l’embryon suivant. Répétez les étapes ci-dessus.
  6. Mettez les embryons injectés dans une plaque de gélose. Placez l’assiette dans une pièce à 18-20 °C. Le lendemain, transférez la plaque dans un incubateur à une température de 25 °Cet une humidité de 50 à 60 %, et incubez pendant 1 jour.
    REMARQUE : Après l’injection, conservez les embryons à une température de 18-20 °C pour ralentir leur développement, faciliter l’intégration de l’ADN plasmidique dans le génome de la drosophile et augmenter le taux de survie des embryons injectés.

10. Collecte des larves

  1. Utilisez une aiguille de dissection pour gratter et détacher les aliments dans un flacon. Fournissez à la nourriture quelques gouttes d’eau distillée.
    REMARQUE : Laissez l’eau distillée être absorbée dans la nourriture pour éviter que les larves ne se noient.
  2. Sortez les plaques de l’incubateur.
  3. Prélevez les larves écloses à l’aide d’un pinceau sous un stéréomicroscope et transférez-les dans le flacon.
  4. Placez le flacon dans un incubateur à une température de 25 °Cet à une humidité de50 à 60 %.

11. Obtenir des mouches transgéniques

  1. Récupérez les mouches écloses après l’incubation du flacon à 25 °Cpendant 10 jours.
  2. Croisez une seule mouche mâle avec trois mouches femelles vierges des équilibreurs TM2/TM6C Sb1 Tb1 , et croisez une seule mouche femelle avec trois mouches mâles des équilibreurs TM2/TM6C Sb1 Tb1 .
  3. Placez les croix dans un incubateur à une température de 25 °C et à une humidité de 50 à 60 %.
  4. Filtrez la progéniture pour les mouches aux yeux orange. Il s’agit des mouches transgéniques (Figure 3A-C).
    REMARQUE : Les mouches portant une copie du transgène au site d’amarrage attP2 ont les yeux orange.
  5. Croisez une seule mouche mâle aux yeux orange avec trois mouches femelles vierges des équilibreurs TM2/TM6C Sb1 Tb1 pour établir un stock.
    REMARQUE : Plus d’une génération de croisements doit être mise en place afin de rayer le transgène phiC31 sur le premier chromosome.

Résultats

La pointe d’une aiguille d’injection est biseautée par une meuleuse à aiguilles (Figure 1). On peut biseauter 50 à 60 aiguilles en une heure. L’ADN est micro-injecté dans la partie postérieure d’un embryon au stade pré-blastoderme ou blastoderme syncytial, où les noyaux partagent un cytoplasme commun (Figure 2A). La partie postérieure d’un embryon peut être facilement localisée grâce au micropyle situé à l’avant de l’embryon (Figure 2A). Les embryons aux stades du blastoderme cellulaire et de la gastrulation ne peuvent pas être utilisés pour l’injection, car chaque noyau est entouré d’une membrane cellulaire à ces stades, et par conséquent, les chances d’obtenir des mouches transgéniques sont presque nulles (Figure 2B). Les embryons surséchés sont déformés lorsqu’ils sont perforés et ne peuvent pas être utilisés pour la microinjection (figure 2C). Les embryons sous-séchés peuvent extruder une grande quantité de cytoplasme lorsqu’ils sont piqués avec l’aiguille (figure 2D), ce qui entraîne un taux de survie plus faible des embryons. Les embryons qui sont séchés de manière appropriée peuvent ou non laisser échapper une petite quantité de cytoplasme lorsqu’ils sont injectés (figure 2E).

La lignée de drosophile exprimant l’intégrase phiC31 et portant le site d’amarrage attP2 qui est utilisée pour la micro-injection d’embryons dans ce protocole a les yeux blancs (Figure 3A), et les mouches âgées de ce génotype ont des yeux roses résultant de l’accumulation de protéines fluorescentes rouges exprimées spécifiquement dans l’œil (Figure 3B). Nous utilisons le gène mini-blanc comme marqueur sélectif de la transgenèse chez la drosophile, et les mouches transgéniques sont identifiées par la couleur des yeux allant du jaune clair au rouge. Les mouches transgéniques porteuses d’un transgène au site d’amarrage attP2 ont des yeux orange (Figure 3C), que l’on peut facilement distinguer des mouches ne portant aucun transgène.

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Figure 1 : Meulage des aiguilles. (A) Une pompe à air à pied avec un manomètre est utilisée pour appliquer une pression d’air à l’aiguille. (B) Une aiguille est montée sur un broyeur d’aiguilles à un angle de 35° par rapport à la surface d’une plaque de broyage. (C) Utilisez un bouton de réglage grossier pour positionner la pointe de l’aiguille juste au-dessus de la surface de la plaque de meulage, puis utilisez un bouton de réglage fin pour commencer à biseauter la pointe. (D) La pointe d’une aiguille tirée est sous un microscope. Barres d’échelle = 10 μm. (E) Une aiguille biseautée est sous un microscope. La pointe biseautée de l’aiguille est indiquée par une flèche. Barres d’échelle = 10 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 2 : Embryons de drosophile aptes à la microinjection. (A) Un embryon de drosophile au stade pré-blastoderme ou blastoderme syncytial peut être injecté dans le pôle postérieur de l’embryon, indiqué par une ellipse rouge. Le micropyle au pôle antérieur de l’embryon est indiqué par une flèche. (B) Un embryon de drosophile au stade de blastoderme cellulaire ne peut pas être utilisé pour la micro-injection. (C) Un embryon trop desséché semble déformé. (D) Une dessiccation insuffisante d’un embryon entraîne une grande quantité de fuite cytoplasmique après l’injection. (E) Pour une injection réussie, une petite quantité de cytoplasme peut s’échapper. Barres d’échelle = 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 3 : Couleur des yeux d’une drosophile transgénique porteuse d’un transgène au site d’amarrage attP2. (A) La ligne d’injection attP2 exprimant l’intégrase phiC31 (vas-phiC31 ; + ; attP2) a un œil blanc. La RFP spécifiquement exprimée dans l’œil est utilisée comme marqueur sélectif du transgène phiC31. (B) La ligne d’injection attP2 âgée exprimant l’intégrase phiC31 a un œil rose résultant de l’accumulation de la protéine RFP dans l’œil. (C) Les mouches porteuses d’un transgène intégré dans le site d’amarrage attP2 ont un œil orange. Barres d’échelle = 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Tableau supplémentaire 1 : Transgenèse chez la drosophile résultant de la micro-injection embryonnaire de 100 plasmides distincts. Au total, 100 plasmides distincts de concentrations variées allant de 20 ng/μL à 1683 ng/μL ont été injectés dans des embryons, et des mouches transgéniques ont été obtenues pour 85 des 100 plasmides. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau supplémentaire 2 : Efficacité de la micro-injection embryonnaire pour la transgenèse chez la drosophile. Au total, 120 plasmides distincts ont été injectés dans les embryons, et des mouches transgéniques ont été obtenues pour 101 des 120 plasmides. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Ici, nous présentons un protocole de micro-injection embryonnaire pour la transgenèse chez la drosophile. Pour la transgenèse spécifique du site médiée par phiC31, nous avons injecté 120 à 140 embryons pour chaque plasmide et obtenu au moins une lignée transgénique pour environ 85 % des plasmides (tableau supplémentaire 2). D’après notre expérience, l’ADN plasmidique isolé par un kit de mini-préparation plasmidique suffit pour la transgenèse chez la drosophile. Des concentrations d’ADN plasmidique allant de 20 ng/μL à 1683 ng/μL pourraient n’avoir aucun effet apparent sur le taux de réussite de la transgenèse, car la plupart d’entre elles peuvent produire des mouches transgéniques (tableau supplémentaire 1).

La préparation des aiguilles d’injection est essentielle pour une micro-injection efficace de l’embryon. Une aiguille d’injection est fermée après avoir été tirée par un extracteur d’aiguille. Pour la transgenèse de routine médiée par phiC31 chez la drosophile, la pointe d’une aiguille est généralement cassée par une lamelle17. Cependant, les aiguilles cassées au hasard ne sont souvent pas bien adaptées à la micro-injection d’embryons, car elles peuvent se bloquer ou provoquer une fuite d’une grande quantité de cytoplasme et doivent donc être remplacées par une nouvelle lors de l’injection. Les aiguilles d’injection dont les pointes sont biseautées par un broyeur ne se bloquent généralement pas ou ne provoquent pas de fuites cytoplasmiques importantes, ce qui réduit la fréquence de remplacement de l’aiguille. Nous avons remarqué que la solution de broyage peut pénétrer dans la pointe biseautée d’une aiguille une fois que la pointe est ouverte pendant le meulage. Une fois qu’elle pénètre dans l’aiguille, la solution de broyage ne sèche pas rapidement naturellement. Pour éviter que la solution de broyage ne siphonne, nous connectons une aiguille d’injection à une pompe à air à pied avec un manomètre. Lors du broyage de la pointe de l’aiguille, nous utilisons la pompe à air pour appliquer une pression d’air à l’aiguille, et ainsi, la solution de broyage est empêchée de pénétrer dans la pointe biseautée, ce qui permet à l’aiguille biseautée d’être utilisée immédiatement. Ensemble, la pompe à air du pied et le manomètre devraient aider à accélérer la transgenèse chez la drosophile, en particulier pour un grand nombre de plasmides.

L’identification des embryons au stade pré-blastoderme ou blastoderme syncytial est essentielle pour la micro-injection19,20, car l’injection d’embryons à des stades ultérieurs produit à peine des mouches transgéniques. Les mouches de moins de 10 jours sont utilisées pour la ponte car elles ont tendance à pondre plus d’œufs que les plus âgées. Dans le processus de déchiffonnage des embryons, une crépine cellulaire est utilisée pour simplifier le traitement à l’eau de Javel et le rinçage à l’eau distillée double des embryons. Après le rinçage des embryons, les embryons flottants indiquent que les coquilles d’œufs ont été bien traitées et peuvent être utilisées pour une micro-injection ultérieure. La déchorionnation et le temps de séchage des embryons sont critiques pour la micro-injection et doivent être optimisés expérimentalement, car une déchorionisation ou un temps de séchage prolongé peut tuer les embryons. La détérioration et le temps de séchage sont affectés par la température et l’humidité qui varient d’un endroit à l’autre et de temps en temps et doivent être ajustés en conséquence en fonction du taux d’éclosion embryonnaire.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Les travaux ont été soutenus par le Fonds de recherche scientifique pour les talents de haut niveau de l’Université de Chine du Sud.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
100 &mu ; m Crépine à cellulesNEST258367
3M Adhésif double face3M415
Verre borosilicatéSUTTERB100-75-10
Plaque abrasive diamantéeSUTTER104E
FLAMING/BROWN Extracteur de micropipettesSUTTERP-1000
Pompe à air à pied avec manomètreShenfengSF8705D
Huile d’halocarbure 27SigmaH8773
Huile d’halocarbure 700SigmaH8898
Microscope inverséNikonECLIPSE Ts2R
Pompe de micro-injectioneppendorfFemtoJet 4i
MicromanipulateureppendorfTransferMan 4r
Micropipette BevelerSUTTERBV-10
Lunettes de protection de microscope (18 mm x 18 mm)CITOLAS10211818C
Lames de microscope (25 mm x 75 mm)CITOLAS188105W
Boîte de Pétri (90 mm x 15 mm)LAIBOER4190152
Photo-Flo 200Kodak1026269
QIAprep Spin Miniprep KitQiagen27106
Stereo MicroscopeNikonSMZ745

Références

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