Exploration de solutions de perfusion alternatives à l’aide de transporteurs d’oxygène polymérisés à base d’hémoglobine de nouvelle génération dans un modèle de perfusion pulmonaire ex vivo chez le rat

Summary

Ici, nous décrivons l’application d’un transporteur d’oxygène polymérisé à base d’hémoglobine humaine (PolyhHb) en tant que perfusat et le protocole dans lequel cette solution de perfusion peut être testée dans un modèle de perfusion pulmonaire ex vivo chez le rat.

Abstract

La transplantation pulmonaire est entravée par le manque de donneurs appropriés. Auparavant, les donateurs jugés marginaux ou insuffisants étaient écartés. Cependant, de nouvelles technologies passionnantes, telles que la perfusion pulmonaire ex vivo (EVLP), offrent aux prestataires de transplantation pulmonaire une évaluation prolongée pour les allogreffes de donneur marginal. Cette plateforme d’évaluation dynamique a entraîné une augmentation des transplantations pulmonaires et a permis aux prestataires d’utiliser des donneurs qui avaient été précédemment rejetés, élargissant ainsi le bassin de donneurs. Les techniques de perfusion actuelles utilisent des perfusats cellulaires ou acellulaires, et les deux présentent des avantages et des inconvénients distincts. La composition de la perfusion est essentielle au maintien d’un environnement homéostatique, à la fourniture d’un soutien métabolique adéquat, à la diminution de l’inflammation et de la mort cellulaire et, en fin de compte, à l’amélioration de la fonction des organes. Les solutions de perfusion doivent contenir une concentration protéique suffisante pour maintenir une pression oncotique appropriée. Cependant, les solutions de perfusion actuelles entraînent souvent une extravasation de liquide à travers l’endothélium pulmonaire, entraînant un œdème pulmonaire par inadvertance et des dommages. Ainsi, il est nécessaire de développer de nouvelles solutions de perfusion qui préviennent les dommages excessifs tout en maintenant une bonne homéostasie cellulaire. Ici, nous décrivons l’application d’un transporteur d’oxygène polymérisé à base d’hémoglobine humaine (PolyhHb) comme perfusat et le protocole dans lequel cette solution de perfusion peut être testée dans un modèle d’EVLP de rat. L’objectif de cette étude est de fournir à la communauté de la transplantation pulmonaire des informations clés pour concevoir et développer de nouvelles solutions de perfusion, ainsi que les protocoles appropriés pour les tester dans des modèles de transplantation translationnelle cliniquement pertinents.

Introduction

Comme tout domaine de la transplantation d’organes solides, la transplantation pulmonaire souffre d’une pénurie d’organes de donneurs. Afin d’augmenter le nombre de donneurs, d’importantes recherches ont été consacrées à l’étude du potentiel des allogreffes que l’on croyait autrefois impropres à la transplantation, c’est-à-dire les donneurs à critères élargis (ECD). Ces allogreffes peuvent être considérées comme ECD pour un ensemble de raisons, notamment une qualité douteuse, une mauvaise fonction, une infection, un traumatisme, des périodes ischémiques prolongées chaudes ou froides et un âge avancé^{de 1 et 2} ans. Dans certains cas, lorsque ces poumons conviennent à une transplantation immédiate³, il est souvent avantageux pour les prestataires et les receveurs d’évaluer ces poumons pendant une période supplémentaire afin de déterminer s’ils conviennent à la transplantation. La perfusion pulmonaire ex vivo (EVLP) est une technologie qui permet une évaluation approfondie des allogreffes pulmonaires potentielles dans un circuit fermé à l’extérieur du donneur ^2,4,5,6,7, offrant au fournisseur de greffe la possibilité de déterminer l’adéquation de la transplantation. L’EVLP a montré sa capacité à évaluer correctement les organes du donneur 8,9,10,11, à diminuer les effets des lésions de reperfusion ischémique (IRI)^12,13 et à augmenter le nombre de donneurs^14,15, faisant ainsi de la transplantation pulmonaire un traitement plus accessible à tous.

En général, un système EVLP est un système fermé avec un circuit ventilatoire (réalisé en connectant un ventilateur à la trachée pour introduire de l’air dans le système) et un circuit vasculaire (réalisé en connectant l’oreillette gauche (LA) à l’artère pulmonaire (PA) avec une tubulure)⁷. Le circuit vasculaire est doté d’un perfusat qui traverse la tubulure pour fournir aux poumons les nutriments et l’oxygène essentiels tout en limitant le temps ischémique à froid (CIT)5,8,16,17. Cette solution est soit à base de sang (c’est-à-dire via l’ajout de concentrés de globules rouges (PRBC)^)16,17, soit à base acellulaire (c’est-à-dire sans PRBC)^4,5. Cependant, l’utilisation des PRBC présente plusieurs inconvénients notables. Si vous utilisez des PRBC provenant de donneurs décédés d’un traumatisme ou de donneurs en état de mort cérébrale (BDD), ces fluides contiennent souvent de grandes quantités de cytokines inflammatoires, ce qui peut augmenter les dommages cellulaires pendant l’EVLP ainsi que les niveaux d’hémoglobine libre (Hb), d’hème, de fer et de fragments cellulaires qui causent des dommages supplémentaires aux cellules^18,19. De plus, comme ces donneurs sont souvent multi-organes, le prélèvement de CBRP avant l’acquisition pourrait entraîner une diminution du volume sanguin chez le donneur et, par conséquent, une augmentation de l’ischémie de tous les organes. S’ils utilisent des PRBC provenant d’une autre source, les prestataires pourraient faire face à des pénuries de sang, car il s’agit d’un matériau rare en soi^20,21. Enfin, les PRBC sont sujets à la lyse mécanique sur le circuit EVLP quelle que soit leur source, libérant de l’Hb et d’autres composants qui contribuent aux dommages cellulaires.

Ainsi, pour de nombreuses raisons, il pourrait être avantageux d’utiliser un substitut artificiel des globules rouges, c’est-à-dire des transporteurs d’oxygène à base d’hémoglobine (HBOC), comme supplément de perfusate. L’hémoglobine humaine polymérisée (PolyhHb) est un HBOC particulièrement prometteur. PolyhHb est synthétisé à partir d’Hb purifiée à partir de PRBC périmés qui ont été jugés inaptes à la transfusion immédiate²². Ils se sont révélés être des substituts sanguins viables dans le choc hémorragique²³ et la transplantation²⁴ et peuvent être produits en grandes quantités²². Cependant, l’adoption à grande échelle de PolyhHb n’a pas été couronnée de succès en raison de complications imprévues telles que la vasoconstriction, l’augmentation de la pression artérielle et l’arrêt cardiaque^23,25. Les raisons de ces résultats étaient probablement dues à la présence d’Hb acellulaire ou de polymères Hb de faible poids moléculaire (< 500 kDa) dans la solution PolyhHb, car ils ont une propension à extravaser dans l’espace tissulaire, ce qui a entraîné une diminution de la disponibilité de l’oxyde nitrique, une vasoconstriction ultérieure, une hypertension systémique et, finalement, des lésions tissulaires oxydatives^26,27. Pour améliorer ces problèmes, le laboratoire Palmer a travaillé à la mise au point d’un PolyhHb de nouvelle génération qui contient un minimum d’espèces à faible MW et d’Hb acellulaire, qui a démontré des caractéristiques biophysiques améliorées et des réponses in vivo 22,28,29,30. Plusieurs études de transfusion chez l’animal ont montré que si les polymères d’Hb de faible poids moléculaire sont éliminés du HBOC, la vasoconstriction, l’hypertension systémique et les dommages oxydatifs peuvent être atténués 28,29,31,32,33,34,35. Par conséquent, ce PolyhHb de nouvelle génération est un candidat prometteur pour le perfusat.

Ici, nous décrivons l’application d’un PolyhHb de nouvelle génération à utiliser dans un perfusat et le protocole par lequel cette solution de perfusion peut être testée dans un modèle d’EVLP de rat. L’objectif de cette étude est de fournir à la communauté de la transplantation pulmonaire des informations clés pour concevoir et développer de nouvelles solutions de perfusion, ainsi que de fournir des protocoles pour les tester dans des modèles de transplantation translationnelle cliniquement pertinents.

Protocol

Des rats Sprague-Dawley (300 g de poids corporel) ont été obtenus commercialement et hébergés dans des conditions exemptes d’agents pathogènes à l’établissement vétérinaire du Wexner Medical Center de l’Université d’État de l’Ohio. Toutes les procédures ont été effectuées sans cruauté conformément au Guide for the Humane Care and Use of Laboratory Animals du NIH et au National Research Council et avec l’approbation du Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université d’État de l’Ohio (protocole IACUC 2023A00000071).

1. Synthèse et purification de polyhHb

REMARQUE : La production et la synthèse du matériel PolyhHb qui a été utilisé pour les expériences EVLP suivantes ont été initialement publiées par Cuddington et al. en 2020²². Veuillez vous référer à ce travail pour des schémas approfondis et une analyse de la synthèse de PolyhHb. Ce qui suit est un résumé de la synthèse et de la purification de PolyhHb à l’échelle pilote et de sa préparation ultérieure en tant que perfusat.

1. Lavage, lyse et purification de l’Hb par RBC
   1. Procurez-vous 18 unités de PRBC humains périmés et versez-les dans un récipient de filtration de 20 L, diluez avec une solution saline à 0,9 % en poids jusqu’à obtenir un hématocrite final de 22 % (figures 1B et C).
   2. Effectuez six échanges de volume du système (diacycles) sur un module de filtration à flux tangentiel (TFF) en polyéthylène-sulfone modifié (mPES) de 0,65 μm avec 0,9 % en poids de solution saline sur la solution de globules rouges. REMARQUE : Le but de cette étape de lavage est d’éliminer les globules rouges endommagés, les fragments de membrane et autres matériaux extracellulaires avant l’hémolyse (Figure 1B, C).
   3. Lyser la solution de globules rouges avec 10 L de tampon phosphate (PB, 3,75 mM, pH 7,4) pendant 1 h à 4 °C en agitant constamment.
   4. Éliminer les fragments de membrane lysée et les autres agrégats en filtrant la solution sur un module TFF de 500 kDa et en recueillant le perméat dans la cuve du réacteur discontinu de 30 L (figure 1A-C).
   5. Une fois que 480 g de Hb sont dans le réacteur, ajoutez une charge de sel pour convertir le PB en solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
   6. Faire recirculer l’Hb à travers un contacteur de gaz alimenté en azote, ainsi que maintenir un espace de tête azoté dans le réacteur, pour désoxygéner la protéine pendant la nuit. Réfrigérer à 14 °C pour limiter la formation de méthémoglobine (metHb).
2. Polymérisation de l’Hb
   1. Chauffer la solution d’Hb à température physiologique (37 °C) tout en faisant recirculer la solution sur une boucle de contacteur de gaz.
      REMARQUE : L’objectif est de désoxygéner la protéine à un pO₂ entre 0 et 10 mmHg pour s’assurer que la majeure partie de l’Hb est à l’état quaternaire tendu (Figure 1A).
   2. Ajoutez 1 g de dithionite de sodium, au besoin, pour assurer une désoxygénation efficace.
   3. Tout en maintenant la boucle de recirculation et en dégazant la solution d’Hb, ajoutez un rapport molaire de 30:1 de glutaraldéhyde (GA) à Hb dilué dans 3 L de PBS désoxygéné (pH 7,4).
   4. Ajouter la solution à la cuve du réacteur pendant 3 h avec une heure supplémentaire de temps de réaction.
   5. Éteindre la réaction de réticulation avec un rapport molaire de 7:1 de cyanoborohydrure de sodium à GA, dilué dans 3 L de PBS (pH 7,4). Ajouter au réacteur pendant plus de 10 min.
   6. Réfrigérer le réacteur à 14 °C pendant la nuit.
3. Purification polyhHb
   1. Pompez le contenu du réacteur dans une cuve de filtration de 10 L et commencez à circuler à travers un module TFF en polyéthylène-sulfone (PES) de 0,2 μm (étape 1). Cette étape permettra d’éliminer les gros agrégats et les contaminants indésirables.
   2. Introduisez le perméat dans un récipient de filtration secondaire de 10 L qui circulera sur un module TFF en polysulfone (PS) de 500 kDa (étape 2) une fois plein. Continuez jusqu’à ce que le réacteur soit vidé (Figure 1B,D).
   3. Une fois le réacteur vidé dans le circuit de purification, commencer l’échange d’excipient à l’étape 1 avec une solution de Ringer lactée modifiée (pH 7,4). Après chaque échange de volume complet, mesurer la concentration en protéines dans le perméat de l’étape 1 à l’aide de la spectroscopie UV-visible.
   4. Lorsque le perméat de l’étape 1 a une concentration inférieure à 1 mg Hb/mL, transférez la solution de Ringer modifiée à l’étape 2. Tout retard à l’étape 1 est un déchet et doit être éliminé de manière appropriée. Au total, assurez-vous que 12 échanges de volumes complets de la solution Ringer’s modifiée sont effectués au cours des deux étapes.
   5. Une fois les diacycles terminés, concentrer le contenu de l’étape 2 à au moins 10 g/dL sur le module TFF de 500 kDa.
   6. Emballer la solution concentrée dans des tubes coniques de 50 mL et conserver à -80 °C jusqu’à utilisation.

2. Formulation de perfusat

1. Préparez le perfusat jusqu’à ce qu’il consomme 165 ml. Diluer PolyhHb à une concentration finale de 3,7 g/dL avec le E Medium de William.
2. Ajouter de l’albumine sérique humaine (HSA) à une concentration finale de 3 % de HSA en poids. Ajouter 1 mL d’héparine à la solution finale.

3. Configuration du circuit de perfusion pulmonaire ex vivo

1. Placez le perfusate de PolyhHb dans le réservoir du circuit EVLP et allumez le bain d’eau chaude à 37 °C. Assurez-vous que le perfusat circule dans le circuit en allumant les pompes à rouleaux.
2. Connectez le gaz de désoxygénation (c’est-à-dire 6 % O₂, 8 % CO₂, 84 % N₂) à l’oxygénateur à fibres creuses pour désoxygéner le perfusat. Ceci est fait pour évaluer la capacité du poumon à oxygéner le perfusat.
3. Ouvrez le logiciel d’acquisition de données sur un ordinateur à proximité. Assurez-vous que la pression artérielle pulmonaire, la pression différentielle trachéale, la pression différentielle du débit respiratoire, le poids pulmonaire et les transducteurs de vitesse de la pompe sont connectés à la fois au circuit et au boîtier du convertisseur de données.
4. Assurez-vous qu’il n’y a pas de fuites dans tout le système en examinant attentivement tous les raccords des tubes et que de l’eau chaude circule dans tout le système (figure 2). Appuyez sur Exécuter sur le logiciel d’acquisition de données pour vous assurer que tous les transducteurs de pression fonctionnent. Une fois que le système fonctionne correctement, éteignez les pompes à rouleaux.

4. Obtention d’un bloc pulmonaire de rat donneur

1. Installez la table d’opération et disposez les instruments (Figure 3). Autoclave tous les instruments à 121 °C pendant 30 min.
2. Préparez 1200 U/kg d’héparine, un mélange de kétamine/xylazine pour l’anesthésique (60 mg/kg de kétamine et 5 mg/kg), ainsi que des sutures en soie de 5 à 10 cm de long (3-0 ou 4-0).
3. Injecter une solution de kétamine/xylazine par voie intrapéritonéale chez le rat. Attendez 5 à 10 minutes pour que l’avion anesthésique se développe. Pour assurer un niveau d’anesthésie approprié, pincez le rat du pied pour provoquer une réaction. S’il n’y a pas de réaction, le niveau d’anesthésie approprié a été atteint.
4. Rasez l’abdomen du rat et placez le rat en position couchée sur la planche chirurgicale. Nettoyez l’abdomen avec de la povidone iodée et de l’éthanol à 70 %. Placez une pommade ophtalmique sous les yeux du rat pour éviter la sécheresse.
5. Déplacez le rat sur la planche chirurgicale et fixez-le en place (Figure 4A). Allumez le logiciel d’acquisition de données et commencez l’enregistrement. Allumez le ventilateur à 4 mL/kg et assurez-vous que la pression expiratoire positive (PEP) est d’environ 2 cm/H₂O.
   REMARQUE : Ces paramètres initiaux sont spécifiques à l’expérience. Il appartient à tous les chercheurs de déterminer les meilleures stratégies ventilatoires pour des expériences individuelles.
6. Une fois que la profondeur anesthésique appropriée est atteinte, effectuez une laparotomie médiane du processus xiphoïde à la symphyse pubienne à l’aide d’une paire de ciseaux. Ensuite, effectuez une rotation viscérale médiale-latérale et visualisez la veine cave inférieure infra-hépatique à l’aide d’un instrument contondant (IVC)36,37,38 (Figure 4B). Injectez de l’héparine dans la VCI à l’aide d’une aiguille de 20 G (Figure 4C).
7. Portez votre attention sur le cou et coupez la peau de l’encoche sternale jusqu’à juste en dessous de l’angle de la mandibule avec une paire de ciseaux. Ensuite, commencez à disséquer vers la trachée (Figure 5A).
8. Dans le cou, disséquez brusquement les muscles de la sangle nécessaires pour exposer la trachée (Figure 5B). Faites une incision transversale avec une paire de ciseaux sur la trachée antérieure entre les anneaux cartilagineux assez grands pour le tube endotrachéal (TE) (plusieurs millimètres), mais ne coupez pas la partie postérieure de la trachée. Placez une suture en soie 5-0 autour de la trachée (Figure 5C).
9. Insérez le tube endotrachéal et fixez-le en place avec la suture en soie 5-0 susmentionnée (Figure 5D). Connectez le tube ET au ventilateur et assurez-vous d’une bonne élévation de la poitrine.
10. Effectuez une sternotomie médiane et pénétrez à nouveau dans la cavité thoracique à l’aide de ciseaux. Placez les écarteurs de la paroi thoracique pour exposer le cœur et les poumons (figure 6A). Évitez toute manipulation par inadvertance des poumons, car ils sont incroyablement friables.
11. Retirez le thymus du médiastin antérieur par une combinaison de dissection tranchante (ciseaux) et émoussée. Veillez à ne pas endommager les gros vaisseaux ou les poumons.
12. Identifier l’artère pulmonaire (AP ; Graphique 6B) et placez une suture en soie 5-0 autour de celle-ci pour préparer la canulation (Figure 6C). En raison de l’anatomie microscopique des gros vaisseaux du rat, il est souvent plus facile de placer la suture autour de l’AP et de l’aorte en même temps.
13. Faites une incision de 2 à 3 mm dans la voie d’écoulement ventriculaire droite (RVOT) à l’aide d’une paire de ciseaux (Figure 6D-E) pour placer la canule artérielle à l’intérieur de l’AP et fixez-la en place avec la suture 5-0 décrite une étape plus tôt (Figure 6F).
14. Faites une incision de 5 mm dans le ventricule gauche (VG) ainsi qu’une VCI infra-hépatique à l’aide d’une paire de ciseaux pour euthanasier le rat. Connectez rapidement le liquide de préservation pulmonaire à la canule artérielle pour rincer les poumons par gravité avec environ 20 ml (Figure 7A-B). Assurez-vous que le liquide de préservation pulmonaire est désaéré avant de le connecter à la canule artérielle, car les embolies gazeuses sont très dommageables pour les poumons.
15. Connectez la canule artérielle au circuit EVLP. Allumez la pompe à rouleau et laissez une petite quantité de perfusat s’écouler dans le poumon et sortir du ventricule gauche dans la cavité thoracique. Une fois que le perfusat commence à s’écouler de l’oreillette gauche, éteignez la pompe à rouleaux (Figure 7C). Tout en laissant le perfusat s’écouler, assurez-vous que la pression du PA n’augmente pas, ce qui indiquerait un blocage ou un placement incorrect.
16. Placez de petites pinces dans le VG et étirez doucement l’anneau de la valve mitrale, ce qui permettra l’introduction de la canule de l’oreillette gauche (LA) (Figure 8A). Placez une cravate de soie 5-0 autour du cœur et attachez-la sans serrer (Figure 8B).
17. Insérez la canule LA dans le VG et avancez la canule LA jusqu’à ce qu’elle soit visible dans l’oreillette. Terminez de fixer le LA avec la suture 5-0 pré-nouée (Figure 8C).
18. Identifiez l’œsophage et clampez-le avec un hémostat le plus près possible du diaphragme. Coupez l’œsophage sous l’hémostat pour vous assurer qu’il n’y a pas de débordement dans la cavité thoracique (figure 9A).
19. En utilisant la colonne vertébrale comme guide, coupez toutes les attaches ligamentaires reliant le bloc cœur-poumon aux structures environnantes à l’aide d’une paire de ciseaux (Figure 9B). Une fois que le bloc cœur-poumon est librement mobile, disséquez la trachée à partir du cou et enfin coupez la trachée au-dessus du tube ET à l’aide d’une paire de ciseaux pour libérer le bloc cœur-poumon (Figure 9C).
20. Déplacez le bloc cœur-poumon vers la gaine thoracique à l’intérieur du circuit EVLP et fixez la canule LA au circuit EVLP (Figure 9D). Allumez la pompe à rouleaux et connectez le moniteur de ventilation.
21. Vérifiez le piège à bulles pour vous assurer qu’aucune embolie gazeuse n’est introduite dans le système.
22. Modifiez lentement les paramètres de ventilation et de perfusion aux niveaux expérimentaux souhaités pendant les 15 premières minutes 36,37,38. De plus, pendant cette phase initiale de montée en puissance, augmentez le débit de perfusion au débit et/ou à la pression souhaités.
23. Aux moments désignés par l’expérience, vérifiez les niveaux de gaz perfusats ainsi que les tests de la fonction respiratoire.

Results

La validation de notre perfusat à base de PolyhHb, et de surcroît, la stabilité de ce perfusat sur plusieurs heures, sont démontrées à la figure 10. Au cours de la première 1 h, tous les perfusats testés (PolyhHb, témoin (Williams Media + 5 % HSA), à base de GR) ont montré une légère diminution de LA pO₂ (Post pO₂). Cependant, le perfusat à base de globules rouges a montré une diminution significative à 1 h par rapport à PolyhHb (p < 0,05). Lorsqu’ils ont été testés au cours des heures suivantes, les perfusats PolyhHb et Control avaient des pO_{2 LA stables,} tandis que PolyhHb avait une tendance non significative (p > 0,05) à une pO₂ plus élevée (figure 10A). Delta pO₂, c’est-à-dire la variation de la pO₂ LA par rapport à la pO₂ PA, a de nouveau diminué de manière significative à 1 h dans le groupe perfusé de globules rouges (p < 0,05), tandis qu’il est resté stable dans les perfusats PolyhHb et Témoin avec une tendance non significative (p > 0,05) de pO₂ plus élevé dans le groupe PolyhHb (figure 10B). La_pCO2 de LA était significativement plus faible dans le perfusat de globules rouges et le perfusat de contrôle par rapport au perfusate de PolyhHb après la première heure (p < 0,05), et cela s’est vérifié au cours des heures suivantes lorsque l’on compare le perfusat de PolyhHb et le perfusate de contrôle (figure 10C). Enfin, le delta pCO₂ (c’est-à-dire la variation de la pCO2 LA par rapport au pCO2 PA) a augmenté de manière significative dans le perfusat de globules rouges après 1 h (p < 0,05), et après plusieurs heures, il est demeuré stable dans le perfusat PolyhHb et le perfusat témoin (figure 10D).

Les données physiologiques pulmonaires en temps réel recueillies par le logiciel d’acquisition fournissent des informations complémentaires pour perfuser les niveaux de gaz (Figure 11). La résistance vasculaire pulmonaire (RVP) a de nouveau montré que le perfusate de globules rouges augmentait significativement au cours de la première heure (p < 0,05). Au cours des dernières heures, les perfusats PolyhHb et témoin ont présenté une RVP stable et faible (figure 11A). La variation du poids pulmonaire a également augmenté de manière significative pour le perfusate de globules rouges au cours de la première heure (p < 0,05) et a augmenté pour le perfusate PolyhHb et le perfusate témoin au cours des autres heures, avec un poids légèrement plus élevé pour le perfusate PolyhHb (figure 11B). Enfin, l’observance a diminué de manière significative dans le groupe perfusé de globules rouges au cours de la première heure (p < 0,05), tandis qu’il y a eu une diminution non significative dans le groupe Perfusate PolyhHb et le perfusate témoin (p > 0,05), le PolyhHb ayant l’observance la plus élevée après 4 h (Figure 11C).

En termes de succès et/ou d’échec technique (Figure 12), plusieurs points sont importants à souligner. Sur la figure 12A, nous pouvons voir l’échec de l’allogreffe dû à une nécrose du lobe supérieur droit due à un possible caillot dans le système vasculaire pulmonaire. La figure 12B montre également un œdème tissulaire sévère dans le lobe droit, conduisant à un échec expérimental. La figure 12C-E montre la préservation et l’apparence correctes des tissus dans les conditions expérimentales respectives. Enfin, dans la figure 12F, nous pouvons voir une préservation tissulaire idéale après un rinçage avec une solution de préservation pulmonaire.

Figure 1 : Synthèse et purification de PolyhHb à l’échelle pilote. (A) Bioréacteur pour la polymérisation. (B) Les procédés de filtration à flux tangentiel (TFF) sont mis en place dans un réfrigérateur à 4 °C. (C) Gros plan de la configuration parallèle de TFF pour le lavage des globules rouges (GR) et la purification de l’hémoglobine (Hb). (D) Gros plan du système TFF en deux étapes pour la purification du PolyhHb. Les récipients des étages un et deux sont situés respectivement à gauche et à droite des filtres. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Vue d’ensemble du circuit de perfusion pulmonaire ex vivo (EVLP). (A) Schéma du circuit EVLP. (B) Mise en place in vivo de la canule de l’artère pulmonaire et de la canule auriculaire gauche. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Instruments chirurgicaux utilisés pour la perfusion pulmonaire ex vivo. (A) Suture en soie. (B) Pince à pointe fine (longueur moyenne). (C) Pince à pointe fine (grande longueur). (D) Pince incurvée à pointe fine. (E) Ciseaux Mayo. (F) Canule trachéale. (G) Canule de l’artère pulmonaire (PA). (H) Canule auriculaire gauche (LA). (I) Enrouleurs de cage thoracique. (J) Ciseaux à ressort. (K) Pince DeBakey. (L) Hémostat. (M) Petits ciseaux. (N) Petite pince incurvée à pointe fine. (O) Pick-ups Adson. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Positionnement chirurgical et exposition de la veine cave inférieure (IVC). (A) Positionnement du rat pour l’approvisionnement pulmonaire. (B) Exposer la VCI infra-hépatique. (C) Canulation de la VCI et injection d’héparine avec une aiguille 27G. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Canulation de la trachée avec la sonde endotrachéale (ET). (A) Commencez par couper la peau de la région du cou. (B) Disséquez les muscles de la sangle et le tissu conjonctif pour exposer la trachée. (C) Faire une incision transversale sur la trachée antérieure entre les anneaux cartilagineux assez grande pour le tube TE. (D) Insérez le tube ET dans la trachée et fixez-le en place avec une suture en soie. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6 : Placement de la canule de l’artère pulmonaire. (A) Exposer la cavité thoracique pour visualiser le cœur et les poumons. (B) Identifier l’AP et l’isoler. (C) Placer des sutures autour de PA. (D) Découpe d’un petit trou dans la voie d’éjection du ventricule droit (RVOT) pour la canule PA. (E) Placement correct de la canule PA à l’intérieur de l’AP. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7 : Rincer les poumons avec une solution de conservation. (A) Connecter la canule de chasse d’eau à la canule de l’artère pulmonaire (PA). (B) Un liquide clair doit sortir de l’oreillette gauche (LA). (C) Connecter la canule PA au circuit de perfusion pulmonaire ex vivo pour assurer un écoulement et un placement corrects de la canule PA. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 8 : Mise en place de la canule auriculaire gauche (LA). Dilater doucement l’anneau de la valve mitrale à l’aide d’une paire de pinces. (B) Placer sans serrer une suture en soie autour du ventricule gauche (VG). Placer la canule LA dans l’oreillette gauche. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 9 : Extraction du bloc cœur-poumon. (A) Ligature de l’œsophage sous l’hémostat. (B) La dissection libère le bloc cœur-poumon de la colonne vertébrale. (C) Dissection libre de la trachée. (D) Connexions et placement corrects de la canule de perfusion pulmonaire ex vivo (EVLP). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Graphique 10. Perfusez les niveaux de gaz au fil du temps. (A) Post-pO₂, c’est-à-dire auriculaire gauche (LA) pO₂, sur une perfusion de 4 heures. (B) Delta pO₂, c’est-à-dire la variation de la pO₂ de l’artère pulmonaire (PA) pO₂ au cours d’une perfusion de 4 heures. (C) Post-pCO₂, c’est-à-dire LA pO₂, sur une perfusion de 4 heures. (D) Delta pCO₂, c’est-à-dire la variation de l’AL pO₂ à partir de PA pO₂ sur une perfusion de 4 heures. Le bleu représente le perfusat PolyhHb, le noir le perfusat de contrôle (média William standard) et le rouge représente le perfusat à base de globules rouges. N = 6 par groupe. Les barres d’erreur indiquent l’écart-type. La signification a été testée à l’aide d’un test T de Student, et est notée par un *, p < 0,05. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Graphique 11. Données physiologiques pulmonaires en temps réel. (A) Résistance vasculaire pulmonaire (PVR) sur 4 h de reperfusion. (B) Changement (noté Δ) du poids pulmonaire au fil du temps. (C) Observance sur 4 h de reperfusion. Le bleu représente le perfusat PolyhHb, le noir le perfusat de contrôle (média William standard) et le rouge représente le perfusat à base de globules rouges. N = 6 par groupe. Les barres d’erreur indiquent l’écart-type. La signification a été testée à l’aide d’un test T de Student, et est notée par un *, p < 0,05. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 12 : Résultats techniques représentatifs. (A) Échec de la greffe dû à un infarctus du lobe supérieur droit. (B) Échec de la greffe en raison d’un œdème sévère du lobe droit. (C) Canulation et perfusion réussies de l’allogreffe pulmonaire avec du perfusat de globules rouges. (D) Canulation et perfusion réussies de l’allogreffe pulmonaire avec du perfusat de PolyhHb. (E) Canulation et perfusion réussies de l’allogreffe pulmonaire avec du perfusat standard. (F) Préservation idéale des tissus après rinçage avec une solution de préservation des poumons. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

Le développement et la mise à l’essai de solutions de perfusion sont une entreprise novatrice dans laquelle de nombreuses personnes se lancent dans le monde entier. Traditionnellement, les perfusats standard offrent la capacité de suspendre le temps ischémique et d’atténuer les lésions associées à l’ischémie, ainsi qu’à la reperfusion¹⁸. Cependant, la prochaine évolution de l’EVLP consiste à améliorer la technologie actuelle du perfusat ainsi qu’à incorporer des thérapies de réparation et de reconditionnement 39,40,41,42,43.

Le PolyhHb décrit dans ce travail est entre 500 kDa et 0,2 μm pour empêcher le matériau d’extravaser du circuit vers le poumon, ce qui empêchera la vasoconstriction et l’augmentation de la pression PA³⁰. Il est essentiel que, tout au long des étapes de polymérisation de cette synthèse, la pression partielle d’oxygène (pO₂) soit maintenue à la valeur appropriée pour le produit PolyhHb d’affinité d’oxygène souhaité. Cela comprend toutes les solutions ajoutées tout au long de la réaction (c.-à-d. réticulant, solution d’extinction, etc.) ayant une pO2 adaptée au bioréacteur (c.-à-d. dégazée avec de l’azote, oxygénée, etc.). L’un des principaux avantages de cette procédure de synthèse est que le produit final présente des équilibres d’oxygène modifiables pour permettre différentes applications avec différentes demandes en oxygène (c’est-à-dire une faible affinité d’oxygène PolyhHb pour la médecine transfusionnelle, une affinité d’oxygène modérée pour la perfusion pulmonaire ou une affinité d’oxygène élevée pour une administration ciblée d’oxygène). Il est également important de s’assurer qu’il y a un mécanisme de chauffage sur le bioréacteur qui n’entraîne pas un échauffement excessif des points de contact, entraînant la formation de protéines endommagées. Nous avons constaté qu’une bobine de cuivre dans l’ensemble de la cuve fournissait un chauffage et un refroidissement plus uniformes et moins dommageables qu’une enveloppe chauffante isolée à l’extérieur de la cuve (figure 1A).

Bien que le développement d’un modèle de rat EVLP ne soit pas nouveau^37,38, nous avons noté plusieurs domaines qui peuvent conduire à de meilleurs résultats. Tout d’abord, il est nécessaire de faire de petites incisions dans la VCI lors du sacrifice pour s’assurer qu’il n’y a pas d’air supplémentaire qui pourrait pénétrer dans les poumons par la circulation. Lors du rinçage de l’allogreffe pulmonaire avec la solution de préservation des poumons, une couleur blanche pâle uniforme des poumons permet au microchirurgien de savoir que le processus d’approvisionnement est un succès technique. S’il y a encore un poumon de couleur rose dans le parenchyme, il est parfois conseillé d’ajuster la canule PA de manière à ce que tout le poumon soit uniformément irfusé. Alors que la canule PA est souvent la partie la plus facile de la procédure à réaliser, l’introduction de la canule LA est légèrement plus difficile. Il est toujours nécessaire de dilater l’anneau de la valve mitrale afin que la canule LA atteigne le LA. Cependant, cela doit être fait avec une extrême prudence car il est facile de perforer le ventricule ou les oreillettes. Une fois que l’extrémité de la canule se trouve à l’intérieur des oreillettes, elle peut souvent s’égarer lors de la fixation de la suture autour du ventricule. Il est souvent nécessaire d’ajuster l’angle de la table (plus horizontal) ou de placer un morceau de gaze au fond de la canule pour qu’elle reste en place.

Limitations
Il y a quelques limitations à ce modèle. Bien qu’il soit utile d’évaluer l’efficacité des perfusats et leur capacité à améliorer les allogreffes potentielles, il ne s’agit pas d’un modèle de transplantation qui serait en mesure de nous donner des résultats in vivo de différents perfusats et technologies. De plus, bien que PolyhHb soit une nouvelle technologie de perfusat passionnante, son utilisation, son efficacité et ses limites potentielles devront être davantage étayées par des expériences de perfusion précliniques et cliniques supplémentaires avant que l’adoption généralisée de cette technologie puisse être envisagée.

Conclusions
Ici, nous avons démontré l’application d’un perfusate de PolyhHb de nouvelle génération et le protocole par lequel cette solution de perfusion peut être testée dans un modèle d’EVLP de rat. Au fur et à mesure que la technologie des perfusats progresse, il sera avantageux d’explorer les possibilités d’utiliser PolyhHb comme substitut potentiel aux perfusats³⁰ traditionnels. Les générations précédentes de PolyhHb ont entraîné des effets secondaires néfastes en fonction de leur composition ; Cependant, les améliorations apportées à la synthèse ont créé un polymère moins susceptible d’extravaser, d’entraîner un œdème et donc de provoquer des lésions cellulaires³⁰. Avec PolyhHb, il est possible d’effectuer des EVLP sans avoir besoin de globules rouges tout en répondant à la demande métabolique des allogreffes pulmonaires. Cela permettra sans aucun doute une meilleure fonction d’allogreffe ex vivo. Cependant, une validation supplémentaire de PolyhHb dans les contextes précliniques et cliniques est nécessaire. Nous espérons que ce protocole fournira à la communauté de la transplantation pulmonaire des informations clés pour concevoir et développer de nouvelles solutions de perfusion, ainsi que les protocoles appropriés pour les tester dans des modèles de transplantation translationnelle cliniquement pertinents.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Seringue à insuline de 10 cc 29 G x 1/2" aiguille	B-D	309301
30 L Bioréacteur en verre	Ace Glass
30g Aiguille	Med	BD-305106
Baytril (enrofloxacine) Comprimés antibactériens	Elanco	NA
Chlorure de calcium dihydraté (CaCl2.2H2O)	Sigma Aldrich	10035-04-8	en lactate de Ringer
modifié type 672	Harvard Apparatus	731747
Connect kit D150	Cole-Parmer	; VK 73-3763
Dumont #5 Forceps	Fine Science tools	11252-50
Dumont Medical #5/45 Pince - Angulaire 45° ;	Outils de science fine	11253-25
Ecoline Star Edition 003, E100 Chauffe-eau	Lauda	LCK 1879
Leucocyter humain expiré, unités de RBC emballées	Wexner Medical Center Canadian Blood Services Zen-Bio Inc
Fiberoxygenator D150	Hugo Sachs Elektronik	PY2 73-3762
Forceps	Outils de science	fine11027-12
Glutaraldéhyde (C5H8O2 70 % en poids)	Sigma Aldrich	111-30-8 (G7776)
Halsted-Mosquito Hemostat	Roboz Surgical	RS-7112
Héparine 30 000 unités par 30 ml	APP Pharmaceuticals
Albumine sérique humaine (HSA)	OctaPharma Plasma		Additif
de perfusat IL2 Ensemble de tubes pour perfusat	Appareil de Harvard	733842
IPL-2 Système de perfusion pulmonaire de base	Appareil
Kétamine 500 mg par 5 ml	JHP Pharmaceuticals
gauche	Appareil de Harvard	730712
Liqui-Cel EXF Series G420 Contacteur à membrane	3M	G420	contacteur de gaz
solution de glucose à faible teneur en potassium et dextran (perfadex)	XVIVO		rinçant le poumon
Tubulure enduite de platine Masterflex(Taille : 73,17,16,24)	Cole-Palmer
N-Acétyl-L-cystéine (NALC, C5H9NO3S)	Sigma Aldrich	616-91-1 (A7250)	nalgéniques de lactate de Ringer modifiés
( 10L, 20L)	Nalgene		Récipients
de filtration Pompe péristaltique	; Ismatec	; ISM 827B
PES, 0,65 & micro ; m module TFF	Repligen	N02-E65U-07-N
PhysioSuite	Kent Scientific Corporation	PS-MSTAT-RT
polyéthersulfone (PES), 0.2 µ ; m Module TFF	Repligen	N02-S20U-05-N
Polysulfone (PS), 500 kDa Module TFF	Repligen	N02-P500-05-N
Chlorure de potassium (KCl)	Fisher Scientific	7447-40-7	Pour PBS
PowerLab 8/35	; ADInstruments	730045
Canule de l’artère pulmonaire	Harvard Apparatus	730710
Tube de tête de pompe (Taille : 73,17,16,24)	PharMed BPT
Puralube  ; Pommade ophtalmique	Dechra	NA
Ciseaux	pour les sciences fines	14090-11
SCP Servocontrôleur pour perfusion type 704	Appareil Harvard	732806
Ventilateur pour petits animaux modèle 683	Appareil Harvard	55-000
Chlorure de sodium (NaCl)	Fisher Scientific	7647-14-5 (S271-10)	Pour PBS et solution saline
Cyanoborohydrure de sodium (NaCNBH3)	Sigma Aldrich	25895-60-7
Dithionite de sodium (Na2S2O4)	Sigma Aldrich	7775-14-6
Hydroxyde de sodium (NaOH)	Fisher Scientific	1310-73-2	Pour le lactate de Ringer modifié
Lactate de sodium (NaC3H5O3)	Sigma Aldrich	867-56-1	Pour le lactate de Ringer modifié
Phosphate de sodium dibasique (Na2HPO4)	Fisher Scientific	7558-79-4	Pour le
phosphate de sodium monobasique PBS (NaH2PO4)	Fisher Scientific	7558-80-7	Pour
PBS SomnoSuite Système d’anesthésie pour petits animaux	Kent Scientific Corporation	SS-MVG-Module
Sprague-Dawley rats	Envigo
TAM-A Module amplificateur de transducteur type 705/1	Harvard Apparatus	73-0065
Amplificateur de transducteur TAM-D type 705/2	Harvard Apparatus	; 73-1793
Module de contrôle du temps TCM type 686	Appareil Harvard	731750
Canule trachéale	Appareil Harvard	733557
Ensemble de tubes pour chambre humide	Appareil Harvard	; 73V83157
Cassette de tube	Cole-Parmer	IS 0649
Pince à épiler #5 Dumostar	Kent Scientific Corporation	; INS500085-A
Pince à épiler #5 en acier inoxydable, incurvée	Kent Scientific Corporation	IND500232
Pince à épiler #7 en titane	Kent Scientific Corporation	;
Tygon E-3603 Tubulure 2,4 mm ID	Appareil de Harvard	721017	ligne de perfusat entrant dans le poumon
Tygon E-3603 Tubulure 3,2 mm ID	Appareil de Harvard	721019	ligne de perfusat sortant du poumon
Vannas-Tübingen Ciseaux à ressort	Outils de science fine 15008-08
Module de commande de ventilateur VCM type 681	Appareil de Harvard	731741
William’s E Media	Gibco, ThermoFisher Scientific	A12176-01	Additif de perfusate
Xylazine 100 mg par 1 ml	Akorn