Isolement de noyaux à partir de tissu adipeux intermusculaire humain et séquençage d’ARN à noyaux uniques en aval

Résumé

La biologie du tissu adipeux intermusculaire (IMAT) est largement inexplorée en raison de l’accessibilité limitée des tissus humains. Ici, nous présentons un protocole détaillé pour l’isolement des noyaux et la préparation de banques d’IMAT humain congelé pour le séquençage de l’ARN à noyaux uniques afin d’identifier la composition cellulaire de ce dépôt adipeux unique.

Résumé

Le tissu adipeux intermusculaire (IMAT) est un dépôt adipeux relativement peu étudié situé entre les fibres musculaires. La teneur en IMAT augmente avec l’âge et l’IMC et est associée à des maladies dégénératives métaboliques et musculaires ; cependant, une compréhension des propriétés biologiques de l’IMAT et de son interaction avec les fibres musculaires environnantes fait cruellement défaut. Ces dernières années, le séquençage de l’ARN unicellulaire et nucléimétrique nous a fourni des atlas spécifiques au type cellulaire de plusieurs tissus humains. Cependant, la composition cellulaire de l’IMAT humaine reste largement inexplorée en raison des défis inhérents à son accessibilité à partir de la collecte de biopsies chez l’homme. En plus de la quantité limitée de tissus collectés, le traitement de l’IMAT humain est compliqué en raison de sa proximité avec les tissus musculaires squelettiques et les fascias. La nature chargée en lipides des adipocytes le rend incompatible avec l’isolement unicellulaire. Par conséquent, le séquençage de l’ARN à noyaux uniques est optimal pour obtenir une transcriptomique de haute dimension à une résolution cellulaire unique et offre le potentiel de découvrir la biologie de ce dépôt, y compris la composition cellulaire exacte de l’IMAT. Ici, nous présentons un protocole détaillé pour l’isolement des noyaux et la préparation de banques d’IMAT humain congelé pour le séquençage de l’ARN à noyaux uniques. Ce protocole permet le profilage de milliers de noyaux à l’aide d’une approche basée sur les gouttelettes, offrant ainsi la capacité de détecter des types de cellules rares et peu abondantes.

Introduction

Le tissu adipeux intermusculaire (IMAT) est un dépôt adipeux ectopique résidant entre et autour des fibres musculaires¹. Comme décrit en détail dans une étude récente de Goodpaster et al., l’IMAT peut être détecté à l’aide de la tomodensitométrie (TDM) à haute résolution et de l’imagerie par résonance magnétique (IRM) (Figure 1A, B) et se trouve autour et dans les fibres musculaires de tout le corps¹. La quantité d’IMAT varie considérablement d’un individu à l’autre et est influencée par l’IMC, l’âge, le sexe, la race^{et la} sédentarité2,3,4. De plus, le dépôt d’IMAT est couramment observé dans les conditions pathologiques associées à la dégénérescence musculaire⁵, et de nombreuses études ont documenté une augmentation de la masse IMAT chez les personnes atteintes d’obésité, de diabète de type 2, de syndrome métabolique et de résistance à l’insuline 6,7,8,9. Néanmoins, les propriétés cellulaires et biologiques de l’IMAT commencent à peine à être démêlées. L’accessibilité limitée et la variation des emplacements et du contenu de l’IMAT dans l’ensemble du corps ont rendu difficile la collecte d’échantillons de ce dépôt adipeux² unique. De plus, les échantillons sont facilement « contaminés » par les muscles squelettiques (SM) lors de la collecte, ce qui rend difficile la séparation entre la contribution biologique des différents tissus (Figure 1C). À cette fin, le séquençage de l’ARN à noyau unique (snRNA-seq), qui a fait l’objet d’une attention considérable au cours de la dernière décennie, constitue une méthodologie idéale pour permettre la séparation des modèles d’expression génique dérivés de l’IMAT et du SM avec une résolution unicellulaire. De plus, l’isolement des noyaux est particulièrement utile pour le tissu adipeux en raison des grands adipocytes chargés de lipides, qui sont impossibles à dissocier en suspension unicellulaire sans compromettre l’intégrité des cellules. Enfin, cette technologie a le potentiel de découvrir de nouveaux marqueurs d’adipocytes spécifiques d’IMAT et de découvrir la composition et la présence de différentes populations de cellules progénitrices, ainsi que d’étudier la variation de la composition cellulaire dans des conditions pathologiques et normales.

Figure 1 : Images de l’IMAT. Image représentative par résonance magnétique (IRM) de l’IMAT provenant (A) d’une femme maigre d’âge moyen et (B) d’un homme d’âge moyen obèse. Rouge : tissu adipeux sous-cutané, jaune : tissu adipeux intermusculaire, vert : muscle squelettique, bleu : os. Image reproduite avec l’aimable autorisation de Heather Cornnell, Institut de recherche translationnelle AdventHealth. (C) Échantillon de tissu frais avec IMAT (entouré d’une ligne noire pointillée). Image reproduite avec l’aimable autorisation de Meghan Hopf, AdventHealth Translational Research Institute et Bryan Bergman, Université du Colorado. Cette figure a été modifiée avec la permission de Goodpaster et ^al.1. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Un certain nombre d’études ont été publiées dans l’industrie de l’élevage portant sur le persillage de la viande (IMAT en particulier) chez les porcs, les poulets et les bovins à l’aide de cellules uniques (sc) et de snRNA-seq¹⁰. Ces études ont permis d’identifier plusieurs sous-populations d’adipocytes et de marqueurs de cellules progénitrices potentielles d’IMAT 11,12,13 ; cependant, on ne sait pas si ces compositions cellulaires se traduisent par de l’IMAT humain. À notre connaissance, une seule étude s’est penchée sur l’hétérogénéité cellulaire du muscle humain avec infiltration graisseuse, obtenue chez des patients masculins atteints d’arthrose de la hanche, à l’aide du snRNA-seq¹⁴. Les chercheurs ont signalé une petite population d’adipocytes et plusieurs sous-populations de progéniteurs fibro-adipogéniques (PAF) au sein de la grande population de myonoyaux¹⁴. Notre étude est la première à développer une méthode pour interroger directement l’IMAT disséqué manuellement du muscle humain pour la composition cellulaire à l’aide du snRNA-seq.

Il est important de noter que les protocoles de séquençage de l’ARNsn doivent être personnalisés pour le tissu spécifique étudié, car la quantité de tissu disponible et les propriétés physiques du tissu spécifique dicteront les étapes de traitement optimales. Le rendement tissulaire pour l’IMAT est généralement faible, ne dépassant souvent pas 50 mg, même lors de la réalisation de biopsies guidées par échographie. Par conséquent, un traitement approprié de ce tissu rare est essentiel. Nous pensons que ce protocole constituera une ressource précieuse pour les chercheurs qui étudient l’IMAT humain.

Protocole

L’échantillon utilisé pour ce protocole faisait partie de l’étude SOMMA)^15, qui a été approuvée par le comité d’examen institutionnel de l’IRB-Copernicus Group (WCG) de l’Ouest et a été réalisée conformément à la Déclaration d’Helsinki. Les participants ont fourni un consentement éclairé écrit pour leur participation à l’étude.

REMARQUE : Ce protocole est adapté d’un protocole précédent utilisant 100 mg de tissu adipeux sous-cutané abdominal humain sur une plateforme basée sur des nanopuits¹⁶. Le protocole actuel est optimisé pour 50 mg d’IMAT humain et la préparation de banques à l’aide d’une plate-forme basée sur des gouttelettes. Une optimisation supplémentaire de ce protocole pour l’isolement des noyaux à partir d’IMAT non humains ou d’autres dépôts adipeux pourrait être nécessaire.

1. Préparation des tampons et des réactifs (Tableau 1 et Tableau 2)

REMARQUE : Préparez des tampons frais le jour de l’expérience et ne les réutilisez pas.

1. Pré-refroidissez une centrifugeuse à 4 °C.
2. Préparer le tampon d’homogénéisation et le milieu d’isolement des noyaux.
   1. Obtenez deux seaux de glace et pré-refroidissez 2 tubes coniques de 15 ml.
   2. Mélanger tous les réactifs pour le tampon d’homogénéisation (HB) dans un tube conique de 15 mL dans l’ordre indiqué au tableau 1. Restez sur la glace. Mélanger par vortex.
   3. Mélanger tous les réactifs pour milieu d’isolement des noyaux (MIN) dans un tube conique de 15 mL dans la liste ordonnée du tableau 2. Restez sur la glace. Mélanger par vortex.
   4. Préparez 10 % de Triton-X en ajoutant 100 μL de Triton X-100 à 900 μL d’eau sans nucléases. Vortex pour assurer un bon mélange. Conserver à température ambiante (RT).

Réactif	Volume (μL)		Concentration finale (mM)
	1x	2 fois
1 M MgCl2	10	20	5
Tampon Tris de 1 m, pH 8,0	20	40	10
2 M KCl	25	50	25
1,5 M de saccharose (-4°C)	334	668	250
1mM TNT	2	4	0,001 (~1 μM)
100x inhibiteur de protéase	20	40	1x
Superasine 20 U/μL	40	80	0,4 U/μL
Eau sans nucléases	1549	3098	-
Total Volume	2000	4000	-

Tableau 1 : Tampon d’homogénéisation (HB). Restez sur la glace. Mélanger par vortex.

Réactif	Volume (μL)		Concentration finale (mM)
	1x	2 fois
EDTA	0.4	0.8	0.1
Inhibiteur de l’ARNase Ribolock (40U/μL)	40	80	0,8 U/μL
1 % BSA-PBS (-/-)	1959.6	3919.2	-
Total Volume	2000	4000	-

Tableau 2 : Milieu d’isolement des noyaux (NIM). Restez sur la glace. Mélanger par vortex.

2. Pulvérisation de tissus congelés (figure 2A)

1. Configurer le poste de travail pour l’homogénéisation.
   1. Remplissez le bidon d’azote liquide (LN₂).
      ATTENTION : lorsque vous travaillez avec LN_2, portez toujours des lunettes et des gants cryogéniques.
   2. Obtenez 2x mortiers, 1x pilon, 1x spatule à micro-pelle, 1x déounce en verre et 1x pilon en acier inoxydable pour le décéneur automatique.
   3. Configurez le dénonciateur automatique.
   4. Remplissez un bécher de glace et pré-refroidissez le verre.
2. Remplissez les 2 mortiers (contenant le pilon et la spatule) avec du LN₂ pour refroidir les instruments. Laissez le LN₂ s’évaporer et répétez.
3. Pendant que les instruments refroidissent, ajoutez 1 mL de HB dans le verre dounce.
4. Remplissez une dernière fois les deux mortiers de LN₂ et versez l’échantillon IMAT de 50 mg dans l’un des mortiers.
5. Pulvérisez l’IMAT à l’aide du pilon en appuyant doucement sur le morceau de tissu pour le briser en petits morceaux. Assurez-vous que tous les morceaux sont pulvérisés.
6. Le LN₂ va s’évaporer lentement tout en pulvérisant les tissus. Lorsque le tissu est correctement pulvérisé et qu’il reste encore 1/4 à 1/2 d’un mortier de LN₂ , inclinez le mortier vers la lèvre du mortier pour recueillir le tissu pulvérisé par la lèvre. Laissez le LN₂ s’évaporer complètement.
7. Immédiatement après l’évaporation du dernier LN₂ , versez le tissu pulvérisé dans le verre contenant 1 mL de HB.

3. Homogénéisation des tissus pulvérisés

1. Homogénéiser le tissu pulvérisé à l’aide du débaucheur automatique. Amenez le verre de haut en bas sur le pilon en acier inoxydable pendant 10 coups dans le sens avant, suivis de 10 coups dans le sens inverse.
2. Assurez-vous que la solution est trouble après l’homogénéisation et qu’elle ne contient aucun morceau de tissu visible. Une couleur rose clair est souvent attendue en raison de la contamination par le tissu musculaire.
3. Transférez l’homogénat dans un tube pré-refroidi de 1,7 ml à faible liaison sur de la glace.
4. Utilisez 400 μL de HB pour rincer le dounce pour vous assurer que tout le matériau est transféré et ajoutez-le dans le tube.
   REMARQUE : Deux échantillons peuvent être traités à la fois. Pour ce faire, doublez le montant de HB et de NIM. Pulvériser et homogénéiser un échantillon de tissu et immédiatement après, pulvériser et homogénéiser le deuxième échantillon de tissu pour pouvoir effectuer les étapes d’isolement et de nettoyage en parallèle.

4. Isolement et nettoyage des noyaux (figure 2B)

1. Ajouter 14 μL de Triton-X (10 %) à l’homogénat pour obtenir une concentration de 0,1 %.
2. Gardez le tube sur de la glace et dans l’obscurité pendant 10 à 15 minutes tout en tourbillonnant toutes les 3 minutes.
3. Prémouiller une crépine de 100 μm et une crépine de 40 μm (par échantillon) avec 100 μL de RT DPBS pour chacune dans un tube conique de 50 mL.
4. Filtrer l’homogénat à travers la crépine à cellules de 100 μm.
5. Rincez le tube de 1,7 mL avec 400 μL de HB et filtrez à travers la crépine à cellules de 100 μm.
6. Ensuite, filtrez la solution à travers la crépine à cellules de 40 μm.
7. Transférez une quantité égale de solution dans deux tubes pré-refroidis de 1,7 mL à faible liaison, correspondant à ~900 μL dans chaque tube.
8. Centrifuger les tubes pendant 10 min à 2700 x g à 4 °C. Il devrait y avoir une petite pastille visible après la centrifugation.
9. Retirer et jeter la couche lipidique supérieure et le surnageant restant, en laissant une solution de ~50 μL du premier tube.
10. Répétez l’opération pour le deuxième tube.
11. Remettez soigneusement la pastille en suspension dans le premier tube en le pipetant doucement de haut en bas 20 fois et transférez-la dans un nouveau tube à faible liaison de 1,7 ml. Évitez de créer des bulles.
12. Répétez cette procédure pour le deuxième tube et transférez la solution remise en suspension dans le même tube.
13. Ajouter 500 μL de NIM et mélanger avec le pipetage.
14. Centrifuger le tube avec une balance à 1000 x g pendant 10 min à 4 °C.
15. Retirer le surnageant, en laissant ~50 μL, et pipeter doucement de haut en bas jusqu’à ce que la pastille soit remise en suspension. Si vous le souhaitez, transférez la pastille remise en suspension dans un nouveau tube propre s’il reste des lipides sur le côté du tube.
16. Ajouter 200 μL de NIM et mélanger par pipetage.

5. Coloration et comptage des noyaux (Figure 2C et Figure 3)

REMARQUE : Pour faciliter le comptage, mettez en place un protocole de « comptage des noyaux » sur un compteur de cellules automatisé, car le réglage du champ clair et des canaux DAPI peut affecter considérablement le comptage. Ajustez les canaux de manière à ce que seuls les noyaux et non les débris soient capturés. Assurez-vous que le canal de fond clair ne marque que les « objets » qui ont également une coloration DAPI.

1. Ajoutez 1 goutte de la solution de coloration des cellules vivantes et laissez-la dans l’obscurité, sur de la glace, pendant 15 min.
2. Filtrez la solution à travers une crépine de 30 μm.
3. Mélanger la solution de noyaux par pipetage et ajouter 10 μL de la solution à une lame de chambre de comptage cellulaire.
4. Comptez les noyaux à l’aide d’un compteur de cellules automatisé.
   REMARQUE : La concentration optimale est de 1000 noyaux/μL correspondant à 1,0 x 10⁶/mL.
   1. Assurez-vous qu’il n’y a pas d’amas de noyaux, car cela pourrait obstruer la puce pour générer des gouttelettes de noyaux uniques (Figure 3).
   2. Si la concentration des noyaux n’est pas assez élevée, faire tourner la solution à 1000 x g pendant 10 min à 4 °C pour obtenir une pastille, retirer le surnageant et remettre en suspension dans un volume plus petit.
   3. Si le degré de débris dans la solution est élevé, remettre la solution de noyaux en suspension dans un plus grand volume de MNI (c.-à-d. 1 mL) et filtrer à nouveau à travers une crépine cellulaire de 30 μm. Ensuite, essorer à 1000 x g pendant 10 min à 4 °C et remettre en suspension dans un volume approprié par rapport à la concentration des noyaux.
5. Après avoir obtenu la concentration des noyaux, passez directement à la première étape de la préparation de la bibliothèque.

Figure 3 : Coloration de noyaux isolés. Image du compteur cellulaire de noyaux colorés avec NucBlue/DAPI (image de gauche) et l’image en fond clair correspondante (image de droite). La présence de petites quantités de débris est évidente dans l’image en champ clair. Le compteur de cellules automatisé utilisé ici n’a pas d’option pour inclure des barres d’échelle. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

6. Paramètres de préparation et de séquençage de la bibliothèque

1. Reportez-vous à un protocole complet pour la préparation de la banque à l’aide de l’approche des noyaux uniques basée sur des gouttelettes disponible sur la page Web du fournisseur¹⁷.
   1. Viser une récupération ciblée de 10 000 noyaux. Cependant, pour les échantillons présentant un niveau élevé de débris ou des noyaux fragiles, on s’attendrait à ce qu’un nombre plus faible de noyaux récupérés soit attendu.
   2. Conservez les échantillons à 4 °C jusqu’à 72 h après l’étape 2.3. dans le protocole de préparation de la banque pour combiner le traitement d’un plus grand nombre d’échantillons en parallèle. Pour ce faire, traitez deux échantillons jusqu’à l’étape 2.3 pendant deux jours consécutifs, et le troisième jour, traitez les 4 échantillons ensemble à partir de l’étape 3 et au-delà dans le protocole de préparation de la banque.
2. Paramètres de séquençage : Séquençage sur une plateforme de séquençage visant 50 000 lectures d’extrémité appariées par noyau.
   REMARQUE : Les données présentées dans ce protocole ont été séquencées sur la plateforme NovaSeq 6000, visant 50 000 lectures d’extrémités appariées par noyaux.

Figure 2 : flux de travail du protocole. Illustration schématique du flux de travail dans (A) les étapes 2 et 3, (B) l’étape 4 et (C) l’étape 5 du protocole. La figure a été créée avec BioRender.com. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

7. Traitement et analyse des données

REMARQUE : Dans ce protocole, certains des logiciels et progiciels R recommandés utilisés pour traiter les données de séquençage résultantes sont brièvement présentés, en se concentrant sur les étapes après le prétraitement initial (Tableau 3). Cette étude fournit des mesures générales de contrôle de la qualité (CQ) et un exemple d’approximation et de projection de variétés uniformes (UMAP) à la figure 4. Cependant, une description approfondie de l’analyse bioinformatique n’entre pas dans le cadre de ce protocole. Par conséquent, les lecteurs peuvent se référer à la récente revue sur les meilleures pratiques pour l’analyse de cellules uniques par Heumos et ^al.18.

1. Pré-traitement des données de séquençage
   1. Mappez les lectures de noyaux uniques sur le génome humain de référence GRCh38.
   2. Incluez les lectures d’intron dans le décompte.
2. Effectuez le contrôle qualité et le filtrage des données à l’aide du package Seurat R ¹⁹.
   1. Calculez un score de complexité cellulaire en divisant le nombre log(10) de gènes détectés par le nombre log(10) de lectures détectées.
   2. Tracez les mesures de contrôle qualité les plus importantes à l’aide d’un histogramme ou d’un graphique de violon, y compris le nombre de gènes détectés par noyau, le pourcentage de lecture mitochondriale et le score de complexité cellulaire.
   3. Filtrez les noyaux avec moins de 200 ou plus de 10 000 gènes par noyau, plus de 10 % de lectures mitochondriales et un score de complexité inférieur à 0,8.
3. Normalisez les données et effectuez une réduction de la dimensionnalité.
   1. Utilisez la fonction SCTransform de Seurat pour normaliser les données à l’aide de 2000 caractéristiques variables.
   2. Regroupez les données à l’aide des fonctions suivantes du package Seurat R : RunPCA, FindNeighbors, FindClusters et RunUMAP.
   3. Tracez un UMAP pour visualiser le clustering des données.
4. Filtrez les doublets prévus à l’aide du package DoubletFinder R ²⁰ et regroupez les données.
5. Annoter les grappes à l’aide de marqueurs génétiques connus des types de cellules susceptibles d’être présents dans le tissu (approche supervisée) ou en fonction des 5 principaux gènes exprimés différentiellement entre les grappes (approche non supervisée).
6. Utilisez decontX²¹pour déterminer le degré de contamination par l’ARN ambiant et pour ajuster la matrice d’expression génique pour l’ARN ambiant.
   1. Incluez la matrice génétique brute comme arrière-plan.
7. Enregistrez l’objet Seurat pour une exploration ultérieure des données.
   REMARQUE : Le code pour le contrôle de la qualité et l’analyse par grappes est disponible dans le fichier supplémentaire 1.

Progiciels/progiciels R utilisés dans le flux de données	Logiciels/progiciels alternatifs	Étape de traitement
CellRanger	STARsolo, kallisto	Découpage, alignement, mappage
Seurat	SingleCellExperiment, Cellranger	QC, analyse et exploration de données
DoubletFinder	scds, scdblFinder, Scrublet	Détection de doublet
DecontX	SoupX, CellBender	Ajustement de l’ARN ambiant

Tableau 3 : Logiciels/outils pour le flux de données

Résultats

Ce flux de travail a été conçu pour guider le traitement d’échantillons IMAT humains congelés afin d’obtenir des profils d’expression génique à une résolution de noyau unique, permettant ainsi l’identification du type de cellule. Ici, un échantillon représentatif de l’IMAT provenant d’un participant à l’étude SOMMA est présenté.

La première étape de toute analyse de données de séquençage de l’ARNsn consiste à évaluer la qualité des données afin d’identifier les noyaux de mauvaise qualité, qui devraient potentiellement être retirés de l’ensemble de données. Il est important de noter que les étapes et les seuils de filtrage doivent être déterminés pour le type spécifique d’échantillon et d’ensemble de données que vous avez en main, car les mesures couramment évaluées peuvent différer entre les tissus et les types de cellules^22,23. La figure 4A fournit des visuels de certaines des principales mesures utilisées pour évaluer la qualité des données de séquençage de l’ARNnb générées. Le nombre de gènes détectés par noyau dépend de la profondeur de séquençage et du type de cellule, mais on s’attend à ce qu’il soit supérieur à 200 pour les noyaux de bonne qualité^18,23. Il a été constaté que les données générées à l’aide de ce protocole se situent dans la fourchette attendue avec une médiane de 1134 gènes par noyau, sur un total de 4662 noyaux.

Le pourcentage de lectures mitochondriales est évalué car un degré élevé de contamination mitochondriale peut provenir de noyaux endommagés ou d’un ARN ambiant se fixant aux noyaux, indiquant des noyaux de mauvaise qualité. Dans l’ensemble de données présenté ici, un pourcentage médian de lecture mitochondriale de 2,65 a été trouvé, ce qui est bien inférieur au seuil de 5 % à 20 % couramment utilisé dans la littérature 24,25,26. Le pourcentage de lectures ribosomales diffère selon les types de cellules et les tissus. Cependant, comme de grandes proportions de gènes ribosomiques peuvent influencer le regroupement des données, il est recommandé de vérifier le pourcentage de lecture ribosomique et éventuellement de supprimer les gènes ribosomiques ou les noyaux présentant des niveaux élevés de gènes ribosomiques de l’ensemble de données avant le regroupement. Les données générées avec ce protocole ont montré un faible niveau de lectures ribosomales avec une médiane de 2,46 % et un maximum de 16,5 %, et par conséquent, nous n’avons pas filtré en fonction de cette mesure. Enfin, un score de complexité cellulaire a été calculé sur la base du nombre log(10) de gènes détectés divisé par le nombre log(10) de lectures détectées. Les noyaux de bonne qualité devraient être supérieurs à 0,8, et une médiane de 0,92 a été obtenue dans l’échantillon utilisé dans cette étude. Sur la base de ces mesures de contrôle de la qualité, on peut décider quels noyaux filtrer dans l’ensemble de données. Pour l’analyse, nous avons choisi de filtrer les noyaux avec moins de 200 ou plus de 10 000 gènes par noyau, plus de 10 % de lectures mitochondriales et un score de complexité inférieur à 0,8.

Après l’évaluation initiale de la qualité et l’étape de filtrage, un UMAP peut être généré pour visualiser le regroupement des noyaux. Le clustering a été effectué sur la base des 2000 gènes les plus variables à l’aide de la transformation SCT. Les étapes initiales de regroupement peuvent être utilisées pour vérifier si l’une des caractéristiques du CQ se regroupe, par exemple, des noyaux avec des lectures mitochondriales élevées. De plus, des informations de regroupement sont nécessaires pour certaines méthodes de détection de doublets, y compris DoubletFinder²⁰, qui a été utilisé dans ce protocole. DoubletFinder a été utilisé avec un taux de multiplet prévu fixé à 4,8 %, comme suggéré par les fournisseurs de la plate-forme basée sur les gouttelettes. Après l’élimination du doublet, le niveau de contamination de l’ARN ambiant a été estimé, ce qui est particulièrement fréquent dans les préparations de noyaux uniques, car l’ARN est libéré du cytoplasme lors de la lyse cellulaire et est distribué dans les billes de gel en émulsion (GEM) et amplifié dans les étapes de préparation de la banque suivantes. Ainsi, plusieurs outils ont été développés pour corriger le problème inhérent à la contamination par l’ARN ambiant (voir tableau 3). Nous avons utilisé le package R decontX^21, dans lequel la matrice d’arrière-plan brute (y compris uniquement les gouttelettes vides) est utilisée pour ajuster la matrice d’expression génique, améliorant ainsi la signature d’expression génique réelle.

L’agrégation et la capacité à détecter des types de cellules peu abondants dépendent du nombre de noyaux. Cette étude a détecté tous les principaux types de cellules attendus dans l’IMAT (Figure 4B) à partir d’un total de 3817 noyaux après filtrage QC, élimination du doublet et ajustement de l’ARN ambiant. Il s’agissait notamment de cellules souches, de progéniteurs fibro-adipogènes (PAF) et d’adipocytes matures, ainsi que de péricytes, de cellules musculaires lisses, de cellules immunitaires, de cellules progénitrices musculaires et de myonoyaux provenant de la contamination des cellules musculaires squelettiques.

Dans l’ensemble, nous avons démontré que ce protocole produit des données à haute résolution sur des noyaux uniques permettant la détection de l’annotation du type cellulaire importante pour démêler la biologie et les origines cellulaires de l’IMAT.

Figure 4 : Évaluation de la qualité, regroupement et annotation du type cellulaire des données de séquençage. (A) Graphiques en violon des paramètres essentiels pour l’évaluation de l’échantillon et les performances de séquençage, y compris le nombre de gènes détectés par noyau, le pourcentage de lectures mitochondriales, le pourcentage de lectures ribosomiales et la complexité cellulaire mesurée en divisant le nombre log(10) de gènes détectés par le nombre log(10) de lectures détectées. Les valeurs médianes de chaque mesure sont indiquées dans des cases fermées. Nombre total de noyaux : 4662. (B) UMAP affichant le regroupement des noyaux individuels et DotPlot correspondant montrant l’expression génique relative des gènes marqueurs de type cellulaire pour chaque groupe après filtrage. Nombre de noyaux : 3817. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Fichier supplémentaire 1 : Le code pour le contrôle qualité et l’analyse de clustering. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Travailler avec IMAT présente plusieurs défis inhérents. En plus de son accessibilité limitée, le rendement des échantillons est souvent très rare et la « contamination » des muscles squelettiques est presque impossible à éviter. Pour obtenir un échantillon de la meilleure qualité, il faut pénétrer dans le fascia musculaire lors de l’insertion de l’aiguille de biopsie (pour s’assurer de ne pas prélever de tissu adipeux sous-cutané) et retirer autant de tissu musculaire que possible en disséquant l’échantillon au microscope immédiatement après le prélèvement, suivi d’un traitement ultérieur pour l’histologie, la congélation instantanée, etc. Il s’agit de la première méthode d’utilisation d’échantillons IMAT collectés et disséqués de manière prospective à partir du muscle squelettique. Comparativement, les données précédentes de séquençage de l’ARNsn dans l’IMAT ont été obtenues par l’isolement des noyaux d’un mélange de biopsies de muscles squelettiques avec infiltration graisseuse connue et non par l’IMAT seul.

L’IMAT est de nature plus dense que les tissus adipeux sous-cutanés, ce qui rend essentielle une pulvérisation correcte du tissu lors de l’isolement des noyaux pour libérer les noyaux de la structure tissulaire. Une pulvérisation inappropriée peut entraîner un rendement plus faible des noyaux, ce qui est défavorable avec une quantité limitée de tissu. De plus, le calcul du nombre correct de noyaux dans la solution de noyaux préparée est une étape essentielle pour garantir qu’il y a suffisamment (mais pas trop) de noyaux à charger sur la puce pour la génération de GEM. Un trop grand nombre de noyaux, ou la présence de gros amas de noyaux ou de débris, peut entraîner un bouchon, affectant la concentration finale d’ADNc et, en fin de compte, le résultat du séquençage. Il est difficile de contourner l’agglutination des noyaux et les débris dans la préparation des noyaux uniques et la qualité de l’échantillon l’affecte. L’agglutination des noyaux et/ou la présence de débris peuvent être réduites en incluant une étape de filtrage supplémentaire avec la crépine cellulaire de 30 μm.

Il est important de traiter les échantillons rapidement pour réduire le risque de dégradation de l’ARN. Le maintien des solutions sur de la glace ou refroidies pendant toutes les étapes possibles de l’isolement des noyaux, ainsi que l’ajout d’une quantité suffisante d’inhibiteurs de l’ARNase, peuvent minimiser la dégradation. En raison de l’importance du temps de traitement de chaque échantillon, nous avons recommandé d’analyser un maximum de deux échantillons à la fois. De plus, la solution des noyaux doit être manipulée avec soin pour ne pas rendre les noyaux trop fragiles. Les noyaux fragiles sont susceptibles d’éclater lors de la génération de GEM, ce qui peut entraîner de grandes quantités d’ARN ambiant dans l’échantillon. Dans ce protocole, l’étape de filtrage à l’aide d’une seringue (décrite dans le protocole STAR¹⁶) a été exclue afin de préserver l’intégrité des noyaux.

Le choix de la méthode de préparation de la bibliothèque dépend de la question de recherche. Nous avons travaillé avec une approche à noyau unique basée sur des gouttelettes et sur des nanopuits. L’approche basée sur les nanopuits permet de dresser le profil de 1200 à 1600 noyaux et d’environ 3000 à 6000 gènes détectés par noyaux¹⁶. De plus, cette approche prend en charge la transcriptomique complète, ce qui permet d’étudier la variation structurelle, les pseudo-gènes et les variantes d’épissage²⁷. En comparaison, plus de 10 000 noyaux peuvent être profilés à l’aide de l’approche basée sur les gouttelettes, mais au détriment d’un nombre inférieur de gènes détectés par noyau (2 à 3 fois plus faible). Pour ce protocole, nous avons choisi d’utiliser l’une des plateformes à base de gouttelettes car le plus grand nombre de noyaux profilés nous donne une plus grande capacité à détecter des types de cellules rares avec une faible abondance²⁸.

La principale limitation du snRNA-seq est la perte de contenu cytosolique, limitant l’analyse de l’expression aux transcrits nucléaires. Le noyau contient 10 à 100 fois moins d’ARNm que celui de l’ensemble de la cellule²⁹, ce qui pourrait être préoccupant pour la découverte de tous les types de cellules dans un tissu. Cependant, une étude récente de Gupta et al. a révélé que la transcriptomique nucléaire - par rapport à la transcriptomique de cellules entières²⁹ - a détecté des populations cellulaires et des profils d’expression similaires de gènes biologiquement pertinents dans des préadipocytes en culture et des adipocytes matures. Des résultats similaires ont été trouvés dans d’autres types de cellules^30,31.

L’isolement de noyaux uniques présente l’avantage de fournir des modèles d’expression génique de résolution de cellules fragiles incompatibles avec le séquençage de l’ARNsc. De plus, des échantillons congelés de biobanques peuvent être utilisés, et l’isolement des noyaux ne nécessite pas de digestion enzymatique du tissu, ce qui peut induire une réponse de stress dans les cellules, affectant le transcriptome³². En utilisant snRNA-seq, nous avons pu profiler transcriptionnellement les adipocytes et d’autres types de cellules présents dans l’IMAT, ce qui ne serait pas possible avec le scRNA-seq en raison du fait que les adipocytes sont chargés de lipides et incompatibles avec l’approche basée sur les gouttelettes.

Une application importante du snRNA-Seq de l’IMAT est de déchiffrer la composition cellulaire et les différences transcriptionnelles de l’IMAT dans divers états métaboliques. De plus, les ensembles de données snRNA-seq peuvent être utilisés pour déconvoluer le séquençage de l’ARN en vrac sur IMAT afin d’évaluer les différences de composition cellulaire à plus grande échelle³³. De plus, l’analyse pseudo-temporelle des données de séquençage de l’ARNsn peut servir à identifier les trajectoires de maturation cellulaire, ce qui est particulièrement intéressant dans des tissus tels que l’IMAT, dans lesquels les origines cellulaires des adipocytes matures sont encore débattues.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
0,2 et micro ; Filtres à seringue M Corning  ;	Millipore Sigma	CLS431229
1,7 mL Tubes LoBind d’ADN	Eppendorf	22431021	Tubes à faible liaison
10 % Tween 20	Bio-Rad	1662404
100x inhibiteur de protéase	Thermo Fisher Scientific	78437
Séparateur magnétique 10X	Genomics	230003
10X Vortex Adapter	10X Genomics
tubes canoniques de 15 mL	Sarstedt	6,25,54,502
2100 Bioanalyseur  ;	Agilent	G2939BA
50 mL tubes coniques	Sarstedt	6,25,47,254
CellRanger	Genomics	N/A
Chromium iX kit d’accessoires	10X Genomics	PN1000323
Chromium iX Controller	10X Genomics	PN1000326
Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit  ;	10X Genomics	PN1000127
Chromium Next GEM Single Cell 3' Kit de perles de gel v3.1  ;	10X Genomics	PN1000129
Chromium Next GEM Single Cell GEM Kit v3.1	10X Genomics	PN1000130
Countess 3 Compteur de cellules automatisé	Thermo Fisher Scientific	AMQAX2000	Compteur de cellules automatisé
Lames de chambre de comptage de cellules Countess	Thermo Fisher Scientific	C10228
DoubletFinder	R  ;	N/D
DPBS (sans calcium, sans magnésium)	Thermo Fisher Scientific	14190144
DTT	Thermo Fisher Scientific	R0861
Dual Index Kit TT Set A, 96 rxns	10X Genomics	PN1000215
Dynabeads MyOne SILANE  ;	10X Génomique	PN2000048
Falcon 100 & micro ; m Crépine à cellules	Corning Life Science	352360
Falcon 40 µ ; m Passoire cellulaire	Corning Life Science	352340
Glycérine (glycérol), 50 % (v/v) Solution aqueuse	Ricca Chemical Company	3290-32
KCL	Thermo Fisher Scientific	AM9640G
Library Kit de construction v3.1	10X Genomics	PN1000196
MACS SmartStrainers (30µ ; m)	Miltenyi Biotec	130-098-458
Mastercycler Nexus Gradient Thermocycleur	Eppendorf	6331000017
MgCl2	Ambion	AM9530G
Mortier et pestel	Logistique des soins de santé  ;	14075
NucBlue Live Ready Probes Réactif	Thermo Fisher Scientific	R37605
Eau sans nucléase (non traitée DEPC)	Thermo Fisher Scientific	AM9930
Probumin Sérum bovin Albumine Sans acides gras, poudre	Sigma-Aldrich	820024
Qiagen Buffer EB	Qiagen	19086
Inhibiteur de la RNAse Ribolock	Thermo Fisher Scientific	EO0382
Seurat	R  ;	N/A
Saccharose	Sigma-Aldrich	S0389
SUPERasin 20 U/µ ; L	Thermo Fisher Scientific	AM2695
ThermoMixer C	Eppendorf	;
Homogénéisateur de tissus	Glass-Col	099C K54
Tampon Tris pH 8.0	Thermo Fisher Scientific	AM9855G
Triton X-100	Thermo Fisher Scientific	AC327372500
UltraPure 0.5M EDTA pH 8.0	Gibco	15575020