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Rongeur inférieur Venoplastie Cave Venoplastie Modèle de ballon

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DOI :

10.3791/66820

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24 mai 2024

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1Section of Vascular Surgery, Department of Surgery, University of Michigan, 2Surmodics, Inc.

Dans cet article

Résumé

Le protocole présente un modèle de survie chez les rongeurs pour tester les interventions de veinoplastie par ballonnet (VB) dans les veines profondes non thrombotiques, thrombotiques et post-thrombotiques.

Résumé

La veinoplastie par ballonnet est une technique clinique couramment utilisée pour traiter la sténose veineuse profonde et l’occlusion à la suite d’un traumatisme, d’anomalies anatomiques congénitales, de thrombose veineuse profonde aiguë (TVP) ou de la pose d’un stent. L’obstruction veineuse profonde chronique est caractérisée histopathologiquement par une thrombose, une fibrose ou les deux. À l’heure actuelle, aucun traitement direct n’est disponible pour cibler ces processus pathologiques. Par conséquent, un modèle animal in vivo fiable pour tester de nouvelles interventions est nécessaire. Le modèle de veinoplastie par ballonnet (VBM) de survie des rongeurs permet l’étude de la veinoplastie par ballonnet dans des conditions non thrombotiques et post-thrombotiques à plusieurs points temporels. L’effet local et systémique des ballonnets de veinoplastie avec et sans revêtement peut être quantifié à l’aide d’analyses tissulaires, de thrombus et sanguines telles que la réaction en chaîne par polymérase en temps réel (RT-PCR), le transfert Western, le test immuno-enzymatique (ELISA), la zymographie, l’analyse cellulaire de la paroi veineuse et du thrombus, les analyses de sang total et de plasma et l’analyse histologique. Le VBM est reproductible, reproduit les interventions chirurgicales humaines, peut identifier les modifications locales de la protéine thrombi de la paroi veineuse et permet plusieurs analyses à partir du même échantillon, réduisant ainsi le nombre d’animaux requis par groupe.

Introduction

Les obstructions veineuses profondes dues à des thrombus non résolus sont une conséquence fréquente de la thrombose veineuse profonde (TVP) et sont l’une des causes du syndrome post-thrombotique (SPT), coûtant des milliards de dollars en soins de santé et ayant un impact significatif sur la qualité devie1,2,3. Le SPT est une pathologie inflammatoire unique avec une fibrose de la paroi veineuse4 qui n’est pas entièrement capturée dans les modèles de TVP chez les petits animaux 5,6,7, et plus important encore, les modèles précédents ne peuvent pas évaluer la réponse aux interventions thérapeutiques. Les obstructions veineuses thrombotiques sont souvent traitées par une endoprothèse et une veinoplastie par ballonnet 8,9 ; De telles interventions sont entravées par un taux élevé de réintervention dû à la resténose et à l’occlusion 10,11,12.

Malgré la disponibilité de ballons enrobés de médicament pour traiter les sténoses/occlusions spécifiques aux artères, il n’en existe aucun pour les veines profondes. Le mécanisme moléculaire de la resténose est mal compris dans les veines et n’a pas de traitement direct4. Par conséquent, notre objectif est de présenter un modèle animal capable de tester des thérapies délivrées localement via des ballonnets de veinoplastie simulant des obstructions post-thrombotiques veineuses profondes. Ce modèle reproduit l’état post-thrombotique et évalue comment différents types de ballons de veinoplastie affectent la paroi veineuse in vivo.

Protocole

Le protocole suivant suit les politiques et les directives de l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Université du Michigan (UMICH), les principes du gouvernement américain pour l’utilisation et le soin des animaux vertébrés utilisés dans les tests, la recherche et la formation, et les directives ARRIVE 2.0. L’accord d’assurance du bien-être animal de l’UMICH est conforme aux normes OLAW et USDA et est entièrement accrédité par AAALAC International. Ce protocole a été approuvé avec le numéro d’identification PRO00010841. Des rats Sprague Dawley mâles consanguins des Charles River Laboratories, pesant 450 g et âgés de 15 semaines, ont été utilisés.

1. Anesthésie chez le rat

  1. Sortez les animaux de leur cage et placez-les dans une chambre à gaz d’induction préopératoire anesthésique à 5 % d’isoflurane et à 100 % d’oxygène à un débit de 0,8 à 1 L/min (contrôlée par vaporisateur) pour induire une anesthésie générale.
  2. Enfermez les rats dans la chambre d’induction anesthésique, retirez-les de la chambre, pesez, lubrifiez leurs yeux avec une pommade ophtalmique stérile, puis placez-les en position couchée dorsale sur un appareil de chauffage à circulation d’eau chaude. Confirmez la profondeur adéquate de l’anesthésie à l’aide du réflexe de pédale (pincement ferme des orteils).
  3. Rasez l’abdomen ventral avec une tondeuse électrique. Maintenir l’anesthésie générale à 2,5 % d’isoflurane et à 100 % d’oxygène à 0,8 à 1 L/min avec un circuit sans réinspiration à travers un cône nasal.

2. Échographie chez le rat

  1. Surveillez les évaluations physiologiques, y compris la fréquence respiratoire, la fréquence cardiaque et la température, pendant l’imagerie.
  2. Pour l’imagerie abdominale de la veine cave inférieure (IVC), appliquez un gel conducteur et orientez le transducteur en position transversale. Lors du préréglage du vasculaire périphérique, utilisez le mode d’imagerie bidimensionnel ou le mode B, abaissez la sonde linéaire (10 MHz) au centre de l’abdomen, en ajustant la profondeur avec la pression jusqu’à ce que les vaisseaux abdominaux soient visibles.
  3. Différenciez l’IVC de l’aorte abdominale en évaluant la compressibilité et en évaluant l’écoulement à l’aide du mode Doppler couleur et à ondes pulsées avec une sonde linéaire à haute fréquence (10 mHz).
    1. Lors de l’application d’une compression avec la sonde à ultrasons, différenciez les deux car l’IVC est compressible, tandis que l’aorte conserve sa forme et sa perméabilité.
  4. Évaluez la direction et la vitesse du flux sanguin à l’aide d’un Doppler couleur et d’un Doppler à ondes pulsées. La fenêtre Doppler couleur représente le flux vers la sonde en rouge et s’éloigne de la sonde en bleu. Basculez l’instrument en mode Doppler à ondes pulsées (mode Duplex) pour évaluer la direction et la vitesse du flux sanguin au fil du temps. Acquérez les images d’écoulement nécessaires à l’aide de l’outil de capture d’image automatisé de l’échographe (les spécifications exactes pour l’acquisition d’images peuvent varier d’un système d’échographie à l’autre).
    1. Utilisez la méthode d’évaluation suivante : l’aorte a un flux sanguin vers la sonde et une forme d’onde triphasique, tandis que l’IVC a un flux spontané loin de la sonde avec une amplitude beaucoup plus faible.
    2. Si la VCI proximale présente une forme d’onde normale, mais qu’une forme d’onde non phasique ou absente (plate) est détectée distalement, explorez la possibilité d’une obstruction veineuse entre ces points d’examen.
  5. Une fois la VCI localisée, identifiez la section médiane, qui se trouve dans la partie du tiers médian, inférieure aux veines rénales et supérieure à la bifurcation de la VCI, très probablement là où se trouvent les veines lombaires.
  6. Mesurez au niveau de la section médiane IVC le diamètre d’une paroi à l’autre dans la vue transversale à l’aide de l’image en coupe transversale en mode B, en enregistrant le diamètre le plus large du récipient. L’acquisition de l’imagerie peut varier selon les appareils à ultrasons. Stockez des données à l’aide de disques compacts (CD) dans des fichiers DICOM.

3. Microchirurgie et récupération chez le rat

  1. Nettoyez l’abdomen avec un gommage à la chlorhexidine imbibé de gaze et une solution de chlorhexidine 3x pour assurer une condition chirurgicale aseptique.
  2. Placez un film alimentaire stérilisé comme enveloppe chirurgicale pour couvrir le thorax et la région abdominale du rat, les boutons du microscope (grossissement et mise au point) et l’oculaire.
  3. Faites une incision médiane ventrale (3 cm) à environ 2 cm sous l’apophyse xiphoïde avec des ciseaux à iris à travers la peau et la paroi abdominale, en exposant le contenu abdominal. Utilisez de la gaze stérile imbibée de solution saline de 2 pouces x 2 pouces pour refléter les intestins vers le côté droit de l’animal.
  4. En cas d’exposition à une VCI, effectuez une dissection contondante à l’aide d’un applicateur stérile à embout de coton. Placez un spéculum métallique dans l’incision, permettant la visualisation IVC.
  5. Cautériser toutes les branches lombaires IVC à l’aide d’un cautère à pointe fine à basse température, des veines rénales à la bifurcation iliaque, et ligaturer les branches latérales avec des sutures en polypropylène non résorbables 7-0.
  6. Placez un micro-clip vasculaire incurvé proximal sur la VCI, qui est séparée de l’aorte et juste en dessous des veines rénales. Placez un microclip droit sur la CVI distale, qui est séparée de l’aorte et supérieure à la bifurcation de la CVI.
  7. Placez un 8-0 suture caudale en nylon à la veine rénale gauche centrée sur la surface antérieure de la VCI.
  8. Insérez un fil-guide aiguisé de 0,014 mm avec le ballonnet de veinoplastie chargé en arrière, rétrograde au flux sanguin dans la CVI infrarénale, caudale au micro-clip incurvé.
  9. Faites avancer le ballon au milieu de l’IVC en utilisant la technique Seldinger. Retirez le fil-guide aiguisé et gonflez le ballonnet de veinoplastie pendant 3 minutes avec un étirement excessif de 10 % à 15 % de la VCI à l’aide d’une seringue de gonflage de 20 ml pour générer une pression positive sur une plage de 0 à 30 Atm. Rincez tous les systèmes avec une solution saline stérile avant la canulation de la VCI pour éviter l’embolie gazeuse.
    REMARQUE : Une VCI de 2,8 mm subirait une veinoplastie à 3,22 mm (15 % d’étirement excessif). La pression de gonflage nécessaire pour atteindre l’étirement souhaité est déterminée par les caractéristiques du ballon et est disponible sur l’emballage du fabricant.
  10. Serrez le point en U lors du dégonflage et du retrait du ballonnet de veinoplastie. Retirez les micro-clips.
  11. Fermez le site de laparotomie de manière à deux couches. Utilisez une suture synthétique résorbable 5-0 polyglactine de manière continue pour fermer la paroi abdominale et la peau.
  12. Administrer la buprénorphine en suspension injectable à libération prolongée, 0,65 mg/kg par voie sous-cutanée (SC) en postopératoire comme analgésique pour les rats, car elle n’interfère pas avec les panels de biomarqueurs des molécules inflammatoires pour l’analyse des protéines.
  13. Récupérez les rats dans une cage individuelle, observez-les postopératoirement (30 min) sous une lampe chauffante (distance minimale - 24 pouces de la cage), puis retournez à leurs unités d’habitation d’origine.
  14. Pour les animaux fictifs de chaque groupe expérimental, effectuez uniquement la dissection, sans la ligature, la cautérisation et la canulation des branches IVC.
  15. Pour les affections post-thrombotiques, placez un micro-clip vasculaire droit proximal sur la VCI, qui est séparée de l’aorte, juste en dessous des veines rénales, pendant 24 h. Utilisez les mêmes techniques de dissection et de fermeture.
    1. Vérifiez les signes échographiques de l’occlusion de la VCI, qui comprennent la visualisation du clip de la VCI, la confirmation de la VCI distale sans écoulement et les veines iliaques communes distendues. Les points de suivi peuvent être personnalisés pour s’adapter aux spécifications de l’étude.
    2. Pour observer les changements physiologiques modélisés, sélectionnez des points dans les 72 premières heures pour la formation précoce de thrombus et de 3 à 7 jours après l’intervention pour une résolution ultérieure des thrombus. Les points de temps ultérieurs testés dans ce modèle incluent 7 à 28 jours 5,13.
  16. Utilisez les techniques des étapes 3.5 à 3.9 pour la veinoplastie post-thrombotique par ballonnet avec les mises en garde suivantes : Une pression d’insufflateur plus élevée peut être nécessaire pour obtenir l’étirement excessif souhaité, car le diamètre de la VCI augmente dans des conditions post-thrombotiques.
  17. Effectuez l’euthanasie conformément aux recommandations énoncées dans les directives actuelles de l’American Veterinary Medical Association sur l’euthanasie des rongeurs en effectuant deux méthodes de confirmation (prélèvement sanguin et prélèvement d’organe vital) pour s’assurer que l’animal ne revivra pas.

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Figure 1 : Distribution des mesures duplex transabdominales du diamètre transversal IVC (section infrarénale moyenne). La mesure a été effectuée en fonction du poids de l’animal. Aucune corrélation significative n’a été trouvée entre le poids et le diamètre de l’IVC. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

4. Préparation de l’échantillon

  1. Effectuer un transfert tissulaire de confirmation de ballonnets de veinoplastie enrobés de médicament à l’aide de la technique de dosage par chromatographie liquide à haute performance (HPLC).
  2. Disséquez la VCI et l’aorte et retirez-les en bloc pour l’intégration de paraffine fixée au formol et l’analyse histologique.
  3. Pour l’analyse des protéines, utilisez le tampon RIPA à une concentration de dilution de 60 000 μg/g d’échantillon, traitez avec un homogénéisateur de tissus dans une pièce à basse température à 4 °C et stockez-le à -80 °C après le traitement.

Résultats

Le VBM est un modèle qui évalue l’effet des ballonnets de veinoplastie dans le contrôle complet de l’hémostase. Tout d’abord, nous avons quantifié le diamètre IVC (section infrarénale moyenne), comme le montre la figure 1, pour une taille correcte du ballonnet. Deuxièmement, la technique microchirurgicale étape par étape développée est illustrée à la figure 2, et nous montrons également des exemples des étapes critiques à la figure 3. Remarquez l’approche rétrograde utilisée pour la canulation IVC avec le fil de guidage aiguisé.

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Figure 2 : Technique microchirurgicale pour l’essai de ballonnets de veinoplastie chez le rat. La technique utilisée est décrite ici. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 3 : Images in vivo de la technique de déploiement. (A) Contrôle hémostatique. (B) Couture en U sur la VCI infrarénale. (C) Insertion du fil à travers la couture en U avec ballon de 3 mm enduit de sirolimus. (D) Déploiement rétrograde de veinoplastie par ballonnet (revêtement de sirolimus). Abréviations : IVC = veine cave inférieure ; AO = Aorte ; CBV = Venoplastie par ballonnet enrobé. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

D’autres mesures normales des vaisseaux veineux et les distinctions entre la VCI et l’aorte sont mises en évidence à la figure 4. Les résultats de l’échographie thrombotique sont inclus dans la figure 5. Enfin, une comparaison entre le diamètre de l’échographie préopératoire et les mesures post-thrombotiques peut être observée sur la figure 6. La figure 7 montre la vitesse moyenne d’écoulement Doppler à ondes pulsées (mm/s) dans la veine cave inférieure avant et après la mise en place du clip du vaisseau.

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Figure 4 : Images duplex transabdominales représentatives, avec des exemples de calcul du diamètre d’une VCI transversale. (A) CIV proximale. (B) VCI mi-infrarénale. (C) IVC distale. Analyse Doppler couleur de (D) IVC mi-infrarénale et (E) de l’aorte abdominale. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Graphique 5. Images montrant des images avant et après le placement du clip. (A) Résultats de l’échographie post-pose du clip confirmant l’occlusion de la VCI. (B) Écoulement proximal et distal de l’aorte. (C) Écoulement IVC proximal. (D) Veines iliaques communes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Graphique 6. Images échographiques. L’échographie change avant et après 15 min, 30 min et 45 min, confirmant l’occlusion IVC. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 7 : Vitesse moyenne d’écoulement Doppler à ondes pulsées. Vitesse moyenne d’écoulement (mm/s) dans la veine cave inférieure avant et après la mise en place du clip (** : P ≤ 0,01, test de Mann-Whitney réalisé). Les barres d’erreur affichent l’erreur standard. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Pour analyser le résultat de différentes interventions de veinoplastie avec de nouveaux revêtements, nous recommandons la mesure de protéines efficaces qui peuvent démontrer l’effet sur cible du médicament d’intérêt. Pour le ballonnet de veinoplastie recouvert de sirolimus utilisé ici, nous avons mesuré les niveaux de protéine AKT phosphorylée (p-AKT) des lysats IVC de rat, confirmant l’inhibition de la voie mTOR puisque la p-AKT est une protéine en aval qui diminue en réponse au sirolimus14,15. Nous pouvons observer sur la figure 8 comment, après une veinoplastie par ballonnet recouvert (CBV), la p-AKT est significativement diminuée par rapport au groupe fictif.

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Figure 8 : Niveaux de protéine p-AKT. Niveaux de protéines des lysats IVC de rat de veinoplastie par ballonnet simulé par rapport à la veinoplastie par ballonnet enrobé (CBV) dans des conditions normales confirmant l’effet cible avec inhibition de la voie mTOR à l’aide de ballonnets recouverts de veinoplastie de sirolimus. (** : P ≤ 0,01, test de Mann-Whitney réalisé). Les barres d’erreur affichent l’erreur standard. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

Le VBM peut être effectué sur des rats ≥ 250 g à l’aide de ballons de 2,5 à 3,5 mm. Pour les rats dépassant 750 g, la technique est limitée par une plus grande quantité de tissu adipeux dans la cavité abdominale et la taille des organes plutôt que par des changements dans le diamètre de la VCI. D’après notre expérience, nous avons constaté qu’il faut 10 animaux ou plus par groupe pour obtenir une signification statistique entre les groupes pour l’analyse des protéines de la paroi veineuse ou les tests d’activité et l’histologie. Le contrôle périodique de la température et la surveillance de la fréquence respiratoire pendant les interventions chirurgicales sont très importants pour garantir le succès de la procédure, ainsi qu’une prise en charge postopératoire diligente.

La VBM est sûre (taux de survie de 91,2 %, procédures réalisées sur 83/91) et reproductible avec une durée moyenne de procédure de 30 min. La morbidité liée à l’intervention comprend les complications anesthésiques (1 %, 1/91), les effets indésirables des opioïdes (1 %, 1/91), les saignements (2,1 %, 2/91) et la thrombose (4,3 %, 4/91). Le saignement de la VCI a été considérablement réduit au cours du développement du modèle en utilisant une approche de canulation VCI rétrograde avec le point d’insertion à côté de la CVI infrarénale, qui offre un angle plus large pour l’insertion du fil avec moins d’interférence par les organes abdominaux. De plus, pendant les phases d’insertion et d’insufflation, nous recommandons un assistant chirurgical pour garantir la pression administrée correcte, le temps de gonflage et la rétraction aiguisée du fil-guide. Lors du dégonflage, la récupération correcte du ballonnet de veinoplastie doit être assurée pour éviter que la paroi IVC ne se déchire au point d’insertion. Les mesures de pression sont suivies par le fabricant pour éviter l’hypergonflage et la rupture du ballon. Dans l’ensemble, ces mesures contribuent à une approche plus stable, à la diminution des complications hémorragiques et à l’amélioration de la survie des animaux.

Les saignements IVC peuvent également être atténués avec les précautions suivantes. Tout d’abord, vérifiez la cautérisation complète des branches dorsales et les ligatures des branches latérales. Cela garantit également la reproductibilité des résultats basés sur l’analyse précédente de ligature-stase IVCchez les rongeurs 5,16,17. Deuxièmement, vérifiez l’occlusion correcte avec les clips proximaux et distaux pour garantir un contrôle hémostatique complet. Enfin, vérifiez l’occlusion complète de la suture en U lors du retrait du ballonnet avant de retirer les clips IVC. En cas de saignement, une légère pression sur la VCI avec un applicateur à embout de coton jusqu’à ce que le contrôle hémostatique soit obtenu arrêtera généralement le saignement. Des agents de contrôle hémostatiques supplémentaires, tels que de la poudre de gélatine résorbable, peuvent être utilisés en cas de saignement.

Les complications thrombotiques devraient être minimes si le gonflage du ballonnet, le dégonflage et le temps de fermeture de la suture en U sont inférieurs à 5 minutes. Une anticoagulation peut être administrée si nécessaire. À ce jour, il n’existe pas de procédure complètement percutanée pour imiter les veinoplasties par ballonnet mini-invasives qui sont actuellement pratiquées chez l’homme. La taille du vaisseau d’accès (veine fémorale du rat) est significativement plus petite (0,81 mm en moyenne)18 que le diamètre extérieur de la plus petite gaine 4F disponible dans le commerce (1,61 mm) qui serait nécessaire pour une procédure entièrement endovasculaire. Les limites comprennent le besoin de microchirurgiens qualifiés et le besoin d’équipement spécialisé.

En conclusion, le modèle VBM simule étroitement le scénario clinique de la veinoplastie veineuse profonde après TVP. Il s’agit d’un outil précieux pour étudier l’effet endovasculaire des ballons de veinoplastie sur la VCI avec différentes alternatives médicamenteuses à plusieurs points de temps. Les applications futures de cette technique comprennent les essais précliniques d’autres dispositifs médicaux, notamment des endoprothèses, des cathéters de thrombectomie, des revêtements de ballonnet et de nouvelles thérapies pharmacologiques.

Déclarations de divulgation

Aucun conflit d’intérêts n’a été déclaré.

Remerciements

Cette étude est soutenue par la subvention de recherche en sciences fondamentales 2023 de l’American Venous Forum (AVF) et Surmodics, Inc.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
3-0 DemeCRYLDemeTechG183019F4P12 par boîte
5-0 DemeCRYLDemeTechG285017B0P12 par boîte
7-0 DemeLENEDemeTechPM197011F13M 12 par boîte
8-0 DemeLONDemeTechNL868007C7P12 par boîte
Applicateur de clips coudésSCANLAN3795-01A7-1/4&Prime ; (18,5 cm)
Bouteille d’irrigation Baxter 0,9 % chlorure de sodiumBaxterSKU : 195-7124Bouteille de 1000mL
Bovie Cautery Low Temperature Fine TipSymmetry Surgical IncAA0010/bx
BuprénorphineFidelis Santé animaleSKU- 0991141.3mg/mL, 3mL
CD (Sprague Dawley) RatsCharles RiverCode de souche 001Mâle, 400 g
Clip-It Traceable TimerPRODUITS TRAÇABLESCat. N° 5046
Applicateur à embout cotonnier 3"Dukal Corporation922-00037BX1001000/BOX
Détergent pour instruments chirurgicaux enzymatiques et prétrempageMedlineMDS88000B91 gal
Lubrifiant pour les yeuxOptixcareSKU-06544120gm  ;
Gaymar T/Pump Stryker Système de thérapie de réchauffement/refroidissement localiséStrykerTP700
Heifetz Microclips 12mmx2.25mmSCANLAN3795-20Microclips
Heifetz droits 12mmx2.25mmSCANLAN3795-28Microclips Heifetz incurvés
8mmx1.75mm  ;SCANLAN3795-14
Microclips Heifetz droits 8mmx1.75mm  ;SCANLAN3795-18Appareil
gonflage incurvé.Merit MedicalIN4130BasixCOMPAK avec Affichage Analogique
IsofluraneMFR VETONESKU-501017100mL, Liquide pour Inhalation
Kit de microchirurgie contenant une pince à épiler et une pinceOxygène personnalisé
, E-tankMedlineMDM1630
Fil de guidage aiguiséPersonnalisé
Stérile Glad Press-n-SealGladSKU # PSS-140ETO Éponges
gaze non tissées stériles exposées 2s 4ply 4x4  ;MedlineSKU PRM21444H100Ct
Microscope chirurgical  ;ZeissS100 / OPMI pico
Gommage chirurgical & Lavage à la mainVetoquinolNDC : 17030-003-1616 oz
Gel à ultrasonsMedlineCTR0013058,5 oz, 12/CS
Système à ultrasonsSiemensACUSON Antares3-D, Couleur, Onde continue (CW), Onde pulsée (PW), Puissance CW/CW Ballon
de veinoplastiePersonnalisé
de de spectrale

Références

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