Article de méthode

Évaluation de la récupération fonctionnelle de l’activité du diaphragme eupnéique après une hémisection unilatérale de la moelle épinière cervicale chez le rat

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DOI :

10.3791/66828

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14 juin 2024

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1Department of Physiology and Biomedical Engineering, Mayo Clinic, 2Department of Anesthesiology and Perioperative Medicine, Mayo Clinic

Dans cet article

Résumé

Les complications respiratoires sont la principale cause de décès chez les personnes atteintes d’une lésion de la moelle épinière cervicale (SCI). Les modèles animaux de SCIc sont essentiels pour les évaluations mécanistes et les études précliniques. Ici, nous introduisons une méthode reproductible pour évaluer la récupération fonctionnelle de l’activité du muscle du diaphragme (DIAm) après une hémisection spinale unilatérale C2 (C2SH) chez le rat.

Résumé

Après une LMEC, l’activation du DIAm peut être affectée en fonction de l’étendue de la lésion. Le présent manuscrit décrit un modèle unilatéral d’hémisection C2 (C2SH) de cSCI qui perturbe l’activité électromyographique (EMG) du diaphragme ipsilatéral eupnéique (iDIAm) pendant la respiration chez le rat. Pour évaluer la récupération de la commande motrice DIAm, il faut d’abord établir clairement l’ampleur du déficit dû au C2SH. En vérifiant une perte initiale complète d’EMG iDIAm pendant la respiration, la récupération ultérieure peut être classée comme absente ou présente, et l’étendue de la récupération peut être estimée à l’aide de l’amplitude de l’EMG. De plus, en mesurant l’absence continue d’activité EMG iDIAm pendant la respiration après la période de choc rachidien aigu après C2SH, le succès de l’activité initiale C2SH peut être validé. La mesure de l’activité EMG du diaphragme controlatéral (cDIAm) peut fournir des informations sur les effets compensatoires du C2SH, ce qui reflète également la neuroplasticité. De plus, les enregistrements EMG DIAm d’animaux éveillés peuvent fournir des informations physiologiques vitales sur le contrôle moteur des DIAm après C2SH. Cet article décrit une méthode pour un modèleC2SH rigoureux, reproductible et fiable de cSCI chez le rat, qui constitue une excellente plate-forme pour étudier la neuroplasticité respiratoire, l’activité compensatoire de cDIAm et les stratégies thérapeutiques et pharmaceutiques.

Introduction

Il y a plus de 300 000 personnes atteintes de lésions de la moelle épinière (LME) aux États-Unis, dont environ la moitié ont des lésions cervicales1. Ces blessures entraînent une perte importante de bien-être et exercent une pression financière sur les individus, leurs familles et le système de santé. Heureusement, la majorité des lésions médullaires sont incomplètes, ce qui permet de renforcer les voies épargnées1. Cette neuroplasticité peut permettre la récupération d’au moins une partie de la fonction, y compris l’activité DIAm, qui est importante pour les comportements ventilatoires et non ventilatoires. Ainsi, la promotion de la neuroplasticité est une piste de recherche prometteuse pour aider les personnes atteintes de LME2.

Les modèles de LME chez les rongeurs ont le potentiel de contribuer de manière substantielle à la découverte de traitements visant à améliorer la santé humaine. L’un des modèles classiques de LME utilisés pour étudier la neuroplasticité est une transsection unilatérale (hémisection) de la moelle épinière en C2 (C2SH), qui laisse le côté controlatéral intact 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13. L’effet du C2SH sur le débit phrénique et l’importance des voies controlatérales épargnées ont été révélés pour la première fois il y a plus de cent ans par Porter12, dont l’article fondateur a jeté les bases des études modernes sur la neuroplasticité respiratoire. Le modèle C2SH interrompt les entrées descendantes du groupe respiratoire ventral rostral (rVRG) dans la moelle, qui contient les neurones prémoteurs responsables de la transmission de la production du rythme respiratoire14. Ces neurones prémoteurs rVRG transmettent également l’entraînement neuronal excitateur aux motoneurones phréniques (Figure 1). Plusieurs chercheurs ont adopté des approches différentes du modèle C2SH 10,11,15,16, ce qui peut expliquer en partie la variabilité de la récupération d’une étude à l’autre. En bref, les approches varient en termes d’épargne des funicules dorsaux, d’exécution d’une hémisection complète ou d’exécution d’une section partielle latérale qui n’interrompt pas complètement les entrées descendantes du rVRG ipsilatéral. En général, les modèles C2SH sont particulièrement utiles pour étudier la neuroplasticité respiratoire en raison des taux de récupération spontanée de l’activité électromyographique (EMG) eupnéique iDIAm au fil du temps, qui peuvent être améliorés par plusieurs facteurs, dont la signalisation neurotrophique 17,18,19,20,21. Cependant, une perte de fonction initiale, définie comme l’inhibition de l’activité eupnéique de l’EMG iDIAm, doit d’abord être établie avant que la récupération puisse être clairement classifiée. Cette validation de l’inactivité au moment deC2SH n’est pas faite dans plusieurs études 3,4,6,7,11,22,23.

Les évaluations histologiques de la moelle épinière excisée ne fournissent que des signes de dommages à l’emplacement approprié des voies bulbospinales excitatrices ipsilatérales innervant les motoneurones phréniques dans la moelle épinière, mais l’histologie ne remplace pas les preuves physiologiques (par exemple, DIAm EMG). De plus, les évaluations histologiques sont effectuées in ex vivo à des moments terminaux (souvent plusieurs semaines à quelques mois après la blessure) et ne fournissent pasd’informations en temps réel. Certains chercheurs ont noté que l’ampleur de la lésion est liée à la quantité de déficit fonctionnel ou à l’absence de déficit fonctionnel 5,24,25,26. Il est important de noter que la validité de telles affirmations dépend probablement fortement de la façon dont la « fonction » est classifiée (c’est-à-dire ce que sont les tâches fonctionnelles et comment elles sont quantifiées), et la variabilité entre les études met en évidence la difficulté de produire des lésions fonctionnellement identiques chez les animaux. En effet, les chercheurs ont souligné que la relation entre l’étendue de la blessure et la fonction locomotrice des muscles des membres (quantifiée par le score de Basso, Beattie et Bresnahan (BBB)24) n’est pas linéaire27,28. Dans des études antérieures, nous n’avons trouvé aucune relation entre l’étendue du C2SH et l’étendue de la récupération de l’activité EMG eupnéique iDIAm après une lésion 10,29,30,31, bien que d’autres chercheurs aient rapporté une relation entre la fonction ventilatoire et l’étendue de la substance blanche épargnant 5. Ainsi, dans le cas du modèle C2SH, une approche de validation fonctionnelle de l’inactivité iDIAm au moment de l’intervention et de préférence au début des expériences de lésions chroniques de la moelle épinière est à la fois bénéfique et nécessaire.

Le présent article souligne l’utilisation de l’EMG DIAm pour la confirmation en temps réel de la perte initiale d’EMG DIAm pendant la respiration après le C2SH ainsi que pour les évaluations de confirmation ultérieures 3 jours (jour 3) après la lésion 18,21,31,32,33. Dans des travaux antérieurs avec le modèle C2SH, des laparotomies répétées ont été effectuées pour enregistrer DIAm EMG 10,13,30,34. Cependant, des travaux plus récents ont utilisé des électrodes EMG chroniques, qui permettent d’enregistrer l’EMG chez des rats anesthésiés et éveillés. De plus, les électrodes chroniques réduisent le risque de pneumothorax et ne nécessitent pas de laparotomies répétées, ce qui peut entraîner une inhibition du DIAm35,36. Bien que des versions du modèle C2SH aient été utilisées par de nombreux chercheurs, la confirmation de l’inactivation de l’activité iDIAm n’a pas été faite au moment de la chirurgie 3,4,6,7,11,22,23. En l’absence d’une telle confirmation de l’inactivité, il est difficile de savoir quelle partie de la récupération ultérieure attribuer à la neuroplasticité des voies ipsilatérales par rapport aux voies controlatérales, qui peuvent avoir des impacts différentiels. Il s’agit d’une considération importante car l’entraînement neuronal inspiratoire du rVRG vers les motoneurones phréniques est principalement ipsilatéral, avec une perte d’environ 50% des entrées glutamatergiques excitatrices vers les motoneurones phréniques après C2SH33. Cependant, il reste des entrées excitatrices inspiratoires du rVRG controlatéral qui décussent sous le site de la lésion pour innerver les motoneurones phréniques ipsilatéraux et peuvent être renforcées par la neuroplasticité pour favoriser la récupération fonctionnelle. En supprimant l’entrée excitatrice ipsilatérale prédominante dans les motoneurones phréniques, l’activité EMG eupnéique iDIAm est perdue (au moins sous anesthésie), tandis que l’activité de la cDIAm se poursuit et est même améliorée. La perte d’activité EMG iDIAm pendant la respiration est donc une mesure de la réussite d’un C2SH (Figure 2).

Un certain niveau d’activité EMG iDIAm est présent dès 1 à 4 jours après C2SH chezles animaux éveillés23,37. De plus, chez les animaux décérébrés, l’activité iDIAm est présente dans les minutes à quelques heures qui suivent l’hémisection cervicale supérieure et est supprimée par l’anesthésie38. De plus, le succès du C2SH est validé en confirmant l’absence d’activité EMG iDIAm pendant la respiration (eupnée) chez les rats anesthésiés le 3e jour après la blessure. Des études d’imagerie confocale ont confirmé la perte d’entrées synaptiques glutamatergiques sur les motoneurones phréniques au cours de cette phase initiale de la lésion37. Au jour 3 après la blessure, s’il y a une activité résiduelle de l’EMG eupnéic iDIAm, cela est interprété comme une preuve d’élimination incomplète de l’entraînement inspiratoire descendant ipsilatéral du rVRG. Le présent article est divisé en trois sections : (1) enregistrements EMG DIAm chroniques, (2) C2SH et (3) acquisition de données EMG chez les animaux éveillés et anesthésiés. Ce protocole décrit un modèleC2SH rigoureux, reproductible et fiable de cSCI chez le rat, qui constitue une excellente plate-forme pour l’étude de la neuroplasticité respiratoire, de l’activité compensatoire de cDIAm, des stratégies thérapeutiques et pharmaceutiques.

Protocole

Ce protocole a été approuvé par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de la Mayo Clinic (numéro de protocole : A00003105-17-R23). Les animaux de la présente étude étaient un mélange de rats Sprague-Dawley mâles et femelles âgés d’environ 3 mois et pesant entre 200 g et 350 g. Les détails des réactifs et de l’équipement utilisés dans l’étude sont énumérés dans la table des matériaux.

1. Implantation d’électrodes

  1. Préparation des électrodes
    1. Assurez-vous que l’équipement mentionné est disponible : (1) fil d’acier inoxydable multibrin, (2) scalpel avec lame #11, (3) ciseaux, 4) microscope de dissection, (5) règle, (6) pinces, (7) aiguilles de 25 g, (8) 2 pinces (au moins une avec une zone de sertissage).
    2. Les détails du processus de fabrication des électrodes sont illustrés à la figure 3. Répétez ce processus au moins deux fois pour les électrodes d’enregistrement différentielles appariées.
    3. Tout d’abord, mesurez et coupez 18 cm du fil d’acier inoxydable.
    4. Faites un nœud simple de base à 4 cm d’une extrémité du fil, comme illustré à la figure 3 ; cela servira d’ancrage lorsque le côté court du fil sera implanté et suturé dans le DIAm.
    5. À l’aide d’un scalpel et d’un endoscope de dissection chirurgicale, dénudez soigneusement 2 mm d’isolant immédiatement adjacent au nœud sur le côté le plus court du fil. Faites très attention à ne pas couper les brins du fil multibrin.
      REMARQUE : Cette partie non isolée sert de surface conductrice de l’électrode. En général, la qualité du signal commence à se dégrader si trois brins ou plus sont coupés par inadvertance, et si c’est le cas, l’électrode est remplacée.
    6. Ensuite, dénudez une bande de ~5 mm de l’extrémité du côté court du fil, qui est ensuite inséré dans la lumière d’une aiguille de 25 G pour fabriquer un outil semblable à un fil de suture qui sera utilisé pour implanter l’électrode dans le DIAm.
      REMARQUE : Des aiguilles de calibre supérieur (par exemple, jusqu’à 28 G) peuvent également être utilisées selon les préférences personnelles. En raison du diamètre plus mince des aiguilles de calibre supérieur, le risque de pneumothorax peut potentiellement être réduit. Cependant, il peut également être plus difficile d’insérer les fils multibrins dans la plus petite lumière de l’aiguille.
    7. Pour ce faire, retirez une aiguille de 25 G de son emballage et, à l’aide des deux pinces, pliez soigneusement l’aiguille à ~1 cm de l’extrémité biseautée pointue d’un côté à l’autre jusqu’à ce qu’elle se brise.
      REMARQUE : Ce processus ne doit pas être précipité ; Sinon, les forces de cisaillement peuvent provoquer la fermeture de la lumière de l’aiguille, ce qui nécessite la répétition du processus.
    8. Insérez l’extrémité dénudée du fil dans la lumière de l’aiguille cassée de 1 cm, en vous assurant que l’aiguille repose immédiatement à côté de la partie isolée restante du fil.
    9. En vous assurant qu’il n’y a pas de partie non isolée entre l’aiguille et le côté le plus court restant du fil, sertissez l’aiguille pour la fixer au fil.
    10. Ensuite, utilisez les deux pinces pour plier soigneusement l’aiguille attachée afin de lui donner une courbure similaire à celle d’une aiguille de suture chirurgicale standard.
    11. Enfin, dénudez à ~5 mm de l’extrémité du côté long du fil (Figure 3). Une fois les électrodes suturées dans le DIAm, le côté long du fil sera tunnelisé pour un accès externe afin de permettre les enregistrements EMG DIAm.
    12. Répétez le processus pour fabriquer une deuxième électrode pour les enregistrements différentiels.
  2. Placement de l’électrode EMG du diaphragme
    1. Avant l’intervention chirurgicale, stérilisez ou autoclavez tout le matériel chirurgical, y compris (1) une tondeuse à poils de petits animaux, (2) un scalpel avec lame #11, (3) des ciseaux chirurgicaux, (4) une pince et (5) un porte-micro-aiguille.
    2. Procurez-vous une cage propre et fournissez-lui de la nourriture, de l’eau, de la litière et un enrichissement de l’environnement. Réserver sur un coussin chauffant. Cette cage servira à loger l’animal après l’opération.
    3. Stérilisez le champ opératoire avec un désinfectant approprié et mettez un équipement de protection individuelle (blouses, casquettes, masque et gants chirurgicaux). Placez les électrodes préalablement préparées dans une piscine d’alcool isopropylique à 70 %.
    4. Placez un coussin chauffant dans la zone chirurgicale pour maintenir la température corporelle du rat pendant l’anesthésie et la chirurgie. Couvrez le coussin chauffant avec une serviette chirurgicale stérilisée.
    5. Pesez le rat et calculez la dose d’anesthésique appropriée en fonction des directives de l’établissement en matière de soins et d’utilisation des animaux.
    6. Anesthésier le rat à l’aide d’une injection intramusculaire de kétamine (80 mg/kg) et de xylazine (10 mg/kg) ou d’un autre anesthésique approprié (selon les protocoles approuvés par l’établissement). Injecter de la buprénorphine à libération prolongée (1 mg/kg) et du carprofène (5 mg/kg) avant l’opération. Procéder une fois que l’animal ne répond plus au pincement des orteils.
    7. Utilisez une tondeuse pour raser le rat de l’apophyse xiphoïde jusqu’à environ la moitié des membres postérieurs. Rasez également le dos du rat où les électrodes seront extériorisées hors de la portée de l’animal (généralement autour des omoplates). Nettoyez l’excès de poils avec un morceau de gaze.
    8. Préparez la peau pour l’incision en la nettoyant avec de la gaze stérile trempée dans du gluconate de chlorohexidine (4 % en poids par volume).
    9. Placez l’animal en position couchée sur le coussin chauffant stérilisé. En commençant par le processus xiphoïde, utilisez le scalpel et une lame #11 propre pour faire une incision rostrocaudale de 4 à 5 cm. Cela devrait exposer les couches musculaires abdominales sous-jacentes.
    10. Faites une autre incision (3-4 cm) le long de la ligne médiane dans les couches musculaires pour exposer le contenu abdominal. Veillez à ne pas couper les organes abdominaux.
    11. Assurez-vous que la surface abdominale (c’est-à-dire inférieure) du DIAm est visible, bien que le côté droit de l’animal soit masqué par le foie.
    12. À l’aide d’un manche de scalpel ou d’un autre instrument contondant, enfoncez le foie et d’autres organes pour exposer la face abdominale du DIAm.
    13. Préparez l’électrode pour l’utilisation en la retirant de la piscine d’alcool isopropylique et en la lavant avec une solution saline stérile. Ensuite, à l’aide d’un porte-micro-aiguille, orientez l’une des électrodes préalablement préparées perpendiculairement aux fibres musculaires dans la région mi-costale du DIAm. Les fibres musculaires s’étendent radialement sur le DIAm.
      REMARQUE : Le DIAm est mince (~2 mm) et ne doit pas être perforé. L’objectif est plutôt d’intégrer la partie non isolée du fil d’électrode (Figure 3) dans le DIAm.
    14. Utilisez le microscope chirurgical pour insérer avec précaution le fil de suture de l’électrode (extrémité de l’aiguille) dans le DIAm. Laissez la courbure de l’aiguille guider l’électrode dans puis hors de la surface abdominale du DIAm, en veillant à ce que toute la partie non isolée du fil soit entièrement intégrée dans le muscle.
    15. Tirez doucement l’aiguille jusqu’à ce que le nœud du fil s’ancre dans le DIAm. Assurez-vous que la partie non isolée (2 mm) du fil de l’électrode est complètement à l’intérieur du DIAm, avec un nœud à l’endroit où l’aiguille est entrée pour la première fois dans le DIAm.
    16. Ensuite, coupez l’aiguille du fil de l’électrode et jetez-la dans un récipient pour objets tranchants.
    17. À l’aide de deux pinces, faites un nœud à l’endroit où l’aiguille de suture (3-0) est sortie du DIAm. Pour ce faire, attachez une boucle sur le côté court du fil, faites glisser la boucle vers la surface abdominale du DIAm et serrez soigneusement la boucle en un nœud. L’électrode (partie non isolée) doit maintenant être ancrée à son point d’entrée et de sortie.
    18. Coupez la partie excédentaire du côté le plus court du fil.
    19. Suivez les étapes 1.2.14 à 1.2.18 pour suturer une autre électrode du même côté du DIAm, à ~3 mm de la première.
    20. Effectuez l’implantation de la paire d’électrodes dans l’hémidiaphragme opposé de la même manière.
    21. Ensuite, assurez-vous que le côté le plus long des fils d’électrodes est entièrement à l’extérieur de la cavité abdominale et commencez à suturer (3-0) les couches musculaires pour fermer l’abdomen. Pour chaque paire d’électrodes, faites une boucle et ancrez-la.
      REMARQUE : Assurez-vous que 2-3 cm de fil sont laissés dans la cavité abdominale pour permettre au rat de s’étirer sans provoquer de tension sur le DIAm.
    22. Nettoyez l’excès de sang avec une solution saline, puis suturez (3-0) la couche musculaire de manière continue pour fermer le péritoine.
    23. Creusez un cathéter de 16 G de la peau dorsale médiale du rat jusqu’à la peau abdominale ouverte et tirez une paire de fils d’électrodes jusqu’à l’arrière du rat.
    24. Répétez le processus avec un deuxième cathéter de l’autre côté et tirez la deuxième paire de fils d’électrode à travers.
    25. Suturez la peau abdominale avec une suture 3-0 dans un motif de suture interrompu.
    26. Ensuite, pour chaque paire, faites un nœud avec les fils d’électrode et suturez-les en place.
    27. Fournir à l’animal une injection saline sous-cutanée (~1 ml pour 50 g de masse animale). Mettez l’animal dans une cage propre sur un coussin chauffant pour récupérer.
      REMARQUE : La laparotomie peut provoquer une inhibition de l’activité DIAm35,36. Attendez au moins 72 h avant l’analyse quantitative de toute mesure EMG.

2. Hémisection spinale cervicale

  1. Préparez la zone chirurgicale stérile comme précédemment.
  2. Avant la chirurgie, autoclavez ou stérilisez tout le matériel chirurgical. Matériel requis : (1) tondeuse à poils de petits animaux, (2) scalpel avec lame #11, (3) ciseaux chirurgicaux, (4) pinces, (5) rongeurs, (6) écarteurs, (7) couteau de dissection coudé.
  3. Environ 72 h après l’implantation de l’électrode DIAm EMG, peser le rat et calculer la dose d’anesthésique appropriée en fonction des directives institutionnelles de soins et d’utilisation des animaux.
  4. Avant d’anesthésier le rat, placez-le dans une cage de type Bowman et enregistrez l’EMG DIAm bilatéral comme indiqué à l’étape 3.2.
  5. Anesthésier le rat au moyen d’une injection intrapéritonéale de kétamine (80 mg/kg) et de xylazine (10 mg/kg) ou d’un autre anesthésique approprié, conformément au protocole du Comité institutionnel local de protection et d’utilisation des animaux. Injecter avant l’opération de la buprénorphine à libération prolongée (1 mg/kg) par voie sous-cutanée et du carprofène (5 mg/kg) par voie intrapéritonéale.
  6. Procéder une fois que l’animal ne répond plus au pincement des orteils. Vérifiez la profondeur de l’anesthésie avec un pincement des orteils environ toutes les 15 minutes.
  7. Avant de commencer l’opération, placez le rat en position couchée et enregistrez l’EMG chez le rat anesthésié comme indiqué à l’étape 3.3.
    REMARQUE : Assurez-vous que tous les enregistrements sont effectués avec le rat dans la même position.
  8. Rasez les poils du cou à peu près au niveau de l’oreille et jusqu’aux omoplates et retirez-les avec de la gaze humide.
  9. Nettoyez la peau avec du gluconate de chlorohexidine (4 % en poids par volume) et couvrez l’animal avec des couvercles chirurgicaux stériles (sauf pour le dos supérieur).
  10. À l’aide d’un scalpel, faites une incision rostro-caudale de 4 cm. Rétractez la peau et coupez le muscle acromiotrapèze. Ensuite, disséquez le muscle rhomboïde pour exposer les muscles rachidiens.
    REMARQUE : L’acromiotrapèze est le muscle trapèze moyen, et ses fibres musculaires sont à peu près parallèles à la colonne vertébrale. Le muscle rhomboïde est exposé dans le plan sous l’acromiotrapèze et ses fibres musculaires courent en diagonale.
  11. Rétracter les muscles rachidiens de C1 à C3.
    REMARQUE : Les muscles spinalis sont immédiatement adjacents à la colonne vertébrale.
  12. Effectuez soigneusement une laminectomie à C2 à l’aide d’un rongeur tout en regardant à travers un microscope chirurgical pour vous assurer qu’aucune artère ou nerf majeur n’est endommagé.
  13. Coupez et rétractez la dure-mère en C2.
  14. Connectez les fils d’électrodes exposés du dos du rat à l’amplificateur tout en effectuant l’hémisection vertébrale. Reportez-vous à l’étape 3 pour plus de détails.
  15. Pendant la surveillance de l’EMG DIAm, insérez le couteau de dissection coudé juste en dessous du point où la racine dorsale pénètre dans la moelle épinière et sectionnez jusqu’au milieu de la surface ventrale de la manière illustrée à la figure 2A.
    REMARQUE : Si vous utilisez un coussin chauffant électronique, il peut être nécessaire de l’éteindre pendant la surveillance de l’EMG pour éviter le bruit.
  16. Dans les secondes qui suivent cette section, assurez-vous que l’activité eupnéique DIAm EMG ipsilatérale à la lésion cesse et qu’une augmentation compensatoire de l’activité cDIAm EMG est évidente (Figure 2C).
  17. Si l’activité eupnéique de l’EMG iDIAm persiste, effectuez une autre incision avec le couteau à dissection, comme le montre la figure 2C. Cependant, ne coupez pas la ligne médiane ; La coupe du côté controlatéral entraînera très probablement la mort de l’animal.
  18. Suturez les muscles puis la peau avec des sutures stériles (3-0).
  19. Pour maintenir l’hydratation, injecter par voie sous-cutanée 1 mL de solution saline par 50 g de masse animale et placer l’animal dans une cage propre avec un coussin chauffant pour la récupération. Surveiller l’animal pendant qu’il se remet de l’opération.
  20. Environ 72 h plus tard (jour 3 post-C2SH), enregistrer l’activité EMG chez les rats éveillés conformément à l’étape 3.2 du protocole. Attention à ne pas abîmer les points de suture sur le dos du rat.
  21. Ensuite, anesthésie à nouveau le rat (en suivant les protocoles approuvés par l’établissement), en utilisant une dose d’anesthésique plus légère que celle qui serait nécessaire pour un avion chirurgical (entre 1/3 et 1/2 d’une dose normale). Des doses supplémentaires peuvent être administrées à condition que les rats présentent un réflexe cornéen intact et répondent au pincement des orteils.
  22. Surveillez l’activité de l’EMG DIAm en suivant l’étape 3 du protocole.
    REMARQUE : Placez le rat dans la même position que celle utilisée pour l’évaluation initiale de l’activité EMG iDIAm.
  23. Si l’activité eupnéique iDIAm EMG (c’est-à-dire l’activité en phase avec l’activité ECG inspiratoire cDIAm) est absente au jour 3, conclure que leC2SH initial a été réussi et inclure le même animal pour des analyses plus approfondies.

3. Acquisition et analyse des données

  1. Paramètres généraux et extraction des données
    1. Réglez les filtres passe-bande du préamplificateur sur 100 Hz (passe-haut) et 1000 Hz (passe-bas).
      REMARQUE : Ces paramètres de filtre éliminent les artefacts de mouvement et réduisent considérablement le bruit de 60 Hz et la contamination ECG (qui a une puissance de crête à ~75 Hz) tout en conservant la grande majorité du contenu fréquentiel du signal EMG DIAm intramusculaire. Basé sur la théorie de Nyquist, numériser avec une fréquence d’échantillonnage de 2000 Hz pour éviter le repliement et permettre une résolution adéquate pour noter l’activité de l’unité motrice dans l’EMG composé. Si vous effectuez des analyses spécialisées du contenu fréquentiel de la gamme de fréquences inférieures à 100 Hz, il est important de régler les paramètres de filtre du préamplificateur pour s’assurer que les fréquences d’intérêt ne sont pas filtrées.
    2. Surveillez deux canaux (EMG de l’hémidiaphragme gauche et de l’hémidiaphragme droit) dans un logiciel de visualisation sur un ordinateur et enregistrez les données dans un format approprié pour des analyses ultérieures.
    3. Collectez au moins 1 à 2 minutes d’enregistrements eupnéiques pour avoir suffisamment de données pour les analyses.
    4. Assurez-vous que les données sont collectées à trois moments ou plus :
      1. Avant C2SH, établir un enregistrement eupnéique de référence dans des conditions d’éveil et d’anesthésie.
      2. Au cours de la chirurgie C2SH pour établir le silençage de l’activité eupnéique iDIAm EMG dans des conditions anesthésiées.
      3. Au jour 3 post-C2SH pour confirmer que l’absence d’activité eupnéique iDIAm EMG persiste et établir un premier point de l’étendue du déficit chez les animaux éveillés qui n’est pas aussi influencé par le choc rachidien 2,39 ou l’administration de dépresseurs respiratoires comme la buprénorphine.
    5. Analysez les enregistrements DIAm EMG à l’aide de n’importe quel logiciel permettant d’effectuer des calculs sur des signaux numérisés (par exemple, Matlab, Python, R). Le processus de base est le suivant :
      1. Chargez les fichiers EMG bruts. Selon les paramètres de filtrage, il peut être nécessaire de tenir compte d’un décalage CC dans le signal.
        REMARQUE : Une solution simple consiste à soustraire la moyenne du signal EMG brut de lui-même.
      2. Calculez la valeur quadratique moyenne du signal EMG avec une fenêtre mobile de 50 ms. Cela peut être fait en déplaçant une fenêtre de calcul de 50 ms vers l’avant d’un point d’échantillonnage à la fois jusqu’à ce que la fin du signal soit atteinte.
        REMARQUE : Les analyses d’événements individuels de DIAm EMG fournissent la plus grande puissance statistique et permettent de regrouper l’activité eupnéique et non eupnéique. Ainsi, la détection de l’apparition et du décalage des respirations individuelles dans l’EMG DIAm est primordiale, comme souligné dans un précédent rapport40.
    6. Effectuez le filtrage de l’activité eupnéique en visualisant les histogrammes de la fréquence respiratoire instantanée et de la durée de l’éruption, comme indiqué dans un précédent rapport41.
  2. Enregistrements éveillés.
    1. Effectuez des enregistrements éveillés en plaçant des rats dans une cage à rongeurs de style Bowman. Une cage cylindrique de type Bowman peut accueillir des rats adultes pesant jusqu’à 750 g.
    2. Dévissez les tiges métalliques d’un côté de la cage de style Bowman et cajolez doucement le rat à l’intérieur. Revissez les tiges métalliques, piégeant le rat dans la cage cylindrique.
      REMARQUE : Acclimatez les rats à la cage pendant au moins 30 minutes avant de procéder à l’enregistrement. Si possible, il est préférable d’acclimater les rats à la cage de style Bowman pendant plusieurs jours avant toute mesure. Il est recommandé de fournir des friandises pendant que les rats sont dans la cage pendant cette phase d’acclimatation.
    3. Pour minimiser les stimuli visuels externes, utilisez une serviette en papier ou un objet similaire pour faire une tente autour de l’avant de la cage où se trouve la tête du rat. De plus, minimisez les bruits forts et assurez le confort physique du rat en tous points.
      REMARQUE : Les signes évidents d’inconfort comprennent l’agitation, la respiration rapide et la lutte contre la cage. Si l’un de ces signes est observé, il peut être nécessaire de ramener le rat dans la cage familiale et de tenter des enregistrements lorsque le rat est plus calme.
    4. Pour les rats plus petits (<300 g), insérez des matériaux de remplissage (p. ex. essuie-tout, boules de coton) dans des espaces supplémentaires de la cage pour décourager le rat de tourner à 180 degrés.
    5. Une fois le rat acclimaté, connectez soigneusement les fils sortant du dos du rat à un préamplificateur, qui alimente les signaux analogiques dans un convertisseur analogique-numérique, et suivez les procédures décrites à l’étape 3.1.
  3. Enregistrements anesthésiés
    1. Placez les rats dans la même position à chaque fois, de préférence enclins à imiter plus étroitement la posture du rat éveillé.
    2. Connectez les fils sortant du rat dorsum à un préamplificateur, qui alimente les signaux analogiques dans un convertisseur analogique-numérique, et suivez les procédures décrites à l’étape 3.1.
  4. Récupération d’animaux
    1. Placez les rats dans une cage à rats vide et propre, sans litière pour les récupérer.
    2. Placez la cage sur un coussin chauffant.
    3. Surveillez le rat à intervalles réguliers (<15 min) pendant les 3 premières heures ou jusqu’à ce qu’il commence à bouger. Surveiller à intervalles moins réguliers (30 min) jusqu’à ce que l’animal soit à nouveau réveillé.
    4. Une fois que le rat est ambulatoire, placez-le dans une cage propre avec de la litière, un accès à de la nourriture et de l’eau, et un enrichissement de l’environnement.
    5. Continuez à surveiller le rat au moins une fois par jour pendant toute la durée de l’expérience. Portez une attention particulière aux changements de poids/capacité à se nourrir ainsi qu’à l’intégrité des sites d’incision et des sutures.

Résultats

L’approche présentée dans cet article minimise la variabilité inter-opérateurs en établissant des critères clairs pour l’évaluation de l’EMG DIAm dans un modèle deC2SH chez le rat. Tout d’abord, l’arrêt de l’activité eupnéique de l’EMG iDIAm immédiatement après C2SH doit être observé, comme le montre la figure 2. Si ce n’est pas le cas, une section secondaire peut être effectuée jusqu’à ce que l’activité eupnéique iDIAm disparaisse. Deuxièmement, au jour 3 post-C2SH, l’absence continue d’EMG eupnéique iDIAm doit être vérifiée pendant l’anesthésie des animaux. La figure 4A montre un exemple deC2SH réussi, déterminé par l’absence continue d’activité EMG eupnéique iDIAm sous anesthésie le jour 3 après la blessure. La figure 4B montre l’activité EMG DIAm chez le même animal dans des conditions d’éveil non anesthésié, mettant en évidence la réduction, mais pas l’absence, de l’activité iDIAm par rapport à la ligne de base avant la blessure. Notamment, l’activité EMG cDIAm est augmentée dans des conditions éveillées et anesthésiées. Les enregistrements anesthésiés du jour 3 confirment que leC2SH initial a réussi, mais des analyses quantitatives doivent être effectuées chez les animaux éveillés. Chez les animaux éveillés, l’activité DIAm EMG au jour 3 post-C2SH représente le point de départ de la récupération. La figure 4B montre que l’activité EMG iDIAm est réduite, mais pas absente, au jour 3 chez les rats éveillés.

Dans certains cas, le C2SH n’est pas accompagné d’un arrêt total de l’activité eupnéique de l’EMG iDIAm (Figure 5A). Un C2SH inadéquat se produit dans moins de 5 % de tous les cas en utilisant l’approche décrite dans le présent manuscrit ; cependant, il est essentiel qu’une évaluation de l’activité de l’EMG DIAm au jour 3 après le C2SH soit effectuée sur chaque rat pour valider le succès du C2SH. La figure 5A montre un exemple d’activité EMG DIAm chez un rat le jour 3 après la blessure, dans lequel le C2SH n’a pas réussi à éliminer l’activité eupnéique de l’EMG iDIAm au jour 3. Il est important de noter que la validation de l’efficacité du C2SH a été effectuée pendant l’anesthésie de l’animal. L’activité continue de l’EMG eupnéique suggère qu’au moins une partie de la voie bulbospinale ipsilatérale descendante a été épargnée, ce qui peut compliquer l’interprétation des résultats. La figure 5B montre que l’activité EMG d’iDIAm est réduite, mais pas absente, au jour 3 chez les rats éveillés. Cependant, l’épargne des intrants descendants ipsilatéraux peut réduire le déficit initial.

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Figure 1 : Cadre conceptuel. Le groupe respiratoire ventral rostral (rVRG) envoie des entrées descendantes aux motoneurones phréniques de la moelle épinière cervicale (C3-C 5). La majorité de ces axones descendants innervent le pool de motoneurones phréniques ipsilatéraux, mais une petite fraction traverse la ligne médiane pour activer le pool de motoneurones controlatéral. Immédiatement après un C2SH, les entrées descendantes du rVRG vers le pool de motoneurones phréniques ipsilatéral sont perturbées. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 2 : Activité représentative des EMG C2SH et DIAm. (A) La vue transversale de la moelle épinière du rat et du site trans (en rouge) avec les structures importantes étiquetées est illustrée. La lésion vertébrale est réalisée en insérant un couteau de dissection juste en dessous du point d’entrée de la racine dorsale et en coupant jusqu’à environ la ligne médiane (zone rouge translucide ombrée). Notez la section des principaux tractus moteurs dans les funicules latéraux et ventraux, mais l’épargne des funicules dorsaux. (B) La vue longitudinale, décrivant le silençage de l’activité ipsilatérale des motoneurones, complète les traces EMG brutes utilisées pour la confirmation en temps réel d’une lésion satisfaisante (C). Lorsque la moelle épinière est lésionnée, l’activité eupnéique de l’EMG iDIAm cesse, ce qui suggère que les entrées ipsilatérales vers les motoneurones phréniques ont été sectionnées ; pendant ce temps, l’EMG cDIAm augmente immédiatement son activité comme indiqué. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 3 : Fabrication des électrodes. Le processus de fabrication des électrodes EMG DIAm est présenté. Le processus de base consistait à mesurer et à couper une longueur de fil appropriée (étape 1), à faire un nœud d’ancrage et à dénuder l’isolant pour exposer l’électrode (étape 2), à fixer une aiguille de calibre 25 au fil (étapes 3 et 4), à plier l’aiguille pour lui donner une courbure similaire à celle d’une aiguille de suture chirurgicale (étape 5), et le démontage de l’isolant pour exposer une partie du fil qui sera connecté à l’amplificateur pour l’enregistrement EMG (étape 6). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 4 : Hémisection vertébrale réussie. (A) L’activité de l’EMG DIAm est démontrée chez un rat anesthésié avant C2SH et au jour 3 après la blessure. Il n’y a aucun signe d’activité eupnéique iDIAm EMG chez ce rat au 3e jour après la blessure, ce qui indique que l’étude initiale enC2SH a été couronnée de succès. Notez l’augmentation compensatoire de l’activité EMG cDIAm et l’augmentation de la fréquence respiratoire par rapport à l’état pré-lésionnel. (B) L’activité EMG DIAm est montrée chez le même rat dans des conditions d’éveil non anesthésiées le jour 3 post-C2SH. Il existe des preuves évidentes d’une activité EMG iDIAm réduite, mais pas complètement réduite au silence. Notez l’augmentation compensatoire de l’activité EMG cDIAm et l’augmentation de la fréquence respiratoire par rapport à l’état pré-lésionnel. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 5 : Hémisection vertébrale infructueuse. (A) L’activité EMG DIAm est mise en évidence chez un rat anesthésié avant C2SH et au jour 3 après la blessure. Chez ce rat, l’activité eupnéique de l’EMG iDIAm a persisté au jour 3 après la blessure, ce qui indique que leC2SH initial était insuffisant. Par conséquent, ce rat a été exclu d’analyses ultérieures de la récupération fonctionnelle. Notons l’augmentation compensatoire de l’activité EMG de la cDIAm malgré unC2SH infructueux, mais une augmentation minime de la fréquence respiratoire. (B) L’activité de l’EMG DIAm est démontrée dans la même série dans des conditions d’éveil non anesthésié le jour 3 post-C2SH. Il existe des signes de réduction de l’EMG iDIAm, d’augmentation de l’activité EMG cDIAm et d’une légère augmentation de la fréquence respiratoire. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

C2 hémisection spinale
La procédure décrite dans cet article met l’accent sur les évaluations de l’activité EMG DIAm qui servent à valider une lésion vertébraleC2 qui traverse les funicules latéraux et ventraux tout en épargnant les funicules dorsaux (Figure 2A). L’approche chirurgicale proposée présente deux avantages majeurs. Tout d’abord, il épargne les funicules dorsaux, qui préservent la fonction ambulatoire chez les rats, tout en coupant les entrées ipsilatérales vers les motoneurones phréniques. Deuxièmement, en surveillant l’EMG DIAm, nous pouvons valider l’efficacité de la lésionC2 dans l’élimination de l’activité EMG eupnéique iDIAm initialement pendant la chirurgie pendant que les animaux sont anesthésiés. Au jour 3 après la blessure, pendant que les animaux sont anesthésiés, nous vérifions qu’il y a bien un silence continu de l’activité eupnéique iDIAm EMG. Il a été précédemment démontré que les entrées excitatrices rVRG sur les motoneurones phréniques et l’expression des récepteurs NMDA dans les motoneurones phréniques sont réduites 3 à 7 jours après la blessure et que l’entrée synaptique glutamatergique et l’expression des récepteurs NMDA augmentent au fil du temps après 7 jours après la blessure33,42. Ces données, combinées à la confirmation histologique de la lésion C2 10,13,29,30,33, suggèrent que l’inactivité continue sous anesthésie le jour 3 après la blessure fournit des informations sur l’efficacité du C2SH initial. Dans les études menées sur plusieurs années, des taux relativement stables de récupération spontanée sous anesthésie entre 30 % et 40 % ont été observés 14 jours après C2SH 18,19,20,29,31,43, ce qui suggère que cette méthode de vérification du succès du C2SH est reproductible et fiable.

La procédure C2SH comporte plusieurs étapes critiques. Il est important de noter que le modèle C2SH proposé ici épargne les funicules dorsaux et n’entraîne donc pas de déficits moteurs des membres. Dans les modèles d’hémisection spinale C2 impliquant les funicules dorsaux, les déficits moteurs des membres sont considérablement plus importants 3,4,5,6,7,37. Ainsi, un avantage supplémentaire du modèle C2SH (figure 2A) est qu’en plus de l’inhibition de l’activité EMG eupnéique iDIAm chez les rats anesthésiés atteints deC2 lésionnés, les rats sont fonctionnellement similaires aux rats de laminectomie simulée en termes de déambulation et d’autres fonctions. En conséquence, ils sont généralement capables de se nourrir et de se toiletter eux-mêmes, ce qui réduit le fardeau des soins tout en permettant des études sur le contrôle neuromoteur DIAm et la neuroplasticité respiratoire. Pour s’assurer que le modèle C2 est mis en œuvre de manière appropriée, il faut faire très attention à éviter des lésions excessives. Insérer le couteau de dissection juste en dessous de l’endroit où la racine dorsale pénètre dans la moelle épinière et couper la partie ventrale avec parcimonie sont deux règles empiriques utiles. L’objectif est de s’assurer que l’activité eupnéique iDIAm EMG cesse ; Cela peut être fait avec plusieurs petites coupes si nécessaire. En effet, dans la semaine qui suit le C2SH, il deviendra clair s’il y a eu des dommages excessifs à la moelle épinière si les animaux ont de la difficulté à se déplacer et à atteindre les granulés de nourriture.

Placement des électrodes et enregistrements EMG
Les électrodes EMG DIAm chroniques présentent plusieurs avantages évidents par rapport aux autres approches. Les électrodes peuvent (et doivent) être implantées plusieurs jours avant l’interventionC2SH, ce qui laisse suffisamment de temps pour la récupération et ne nécessite pas de laparotomie et deC2SH au cours de la même séance chirurgicale. Ceci est important car il est bien accepté que la laparotomie provoque l’inhibition de l’IM35,36. En implantant des électrodes DIAm chroniques, il n’est pas non plus nécessaire de recourir à des laparotomies répétées, qui ont été réalisées lors de travaux antérieurs10,13 ; il y a également un risque réduit de pneumothorax car les électrodes ne sont pas insérées dans le DIAm pendant chaque séance. Cependant, plusieurs événements indésirables potentiellement graves peuvent survenir à la suite de la mise en place d’électrodes. Bien que le risque de pneumothorax soit réduit en évitant les insertions répétées d’électrodes, il n’est pas complètement annulé et, en effet, le pneumothorax peut survenir, causant soit la mort immédiate, soit des problèmes prolongés. Afin de réduire ce risque, il est préférable de s’assurer que l’aiguille qui est enfilée à travers le DIAm ne perfore pas la surface supérieure du DIAm. De plus, évitez d’utiliser des pinces tranchantes qui pourraient infliger des dommages au DIAm lors de la manipulation des fils d’électrode. À l’occasion, les rats peuvent mâcher les points de suture de leur abdomen, ce qui peut se éventrer s’ils sont laissés à eux-mêmes. Les rats doivent être observés à intervalles réguliers après le placement des électrodes pour détecter ces types de comportements à un stade précoce. Dans certains cas, il peut être possible d’anesthésier les rats pour réparer les dommages causés aux points de suture. Cependant, il est préférable d’atténuer ce comportement en fournissant un soulagement adéquat de la douleur pendant et après la chirurgie et en s’assurant que le champ stérile n’est pas brisé pendant la chirurgie. Dans les cas extrêmes, il peut être nécessaire d’euthanasier les rats qui enlèvent leurs points de suture à plusieurs reprises.

L’enregistrement et l’analyse des signaux EMG ne sont pas l’objectif principal de la présente étude et dépendent fortement de l’équipement et des logiciels spécifiques disponibles dans chaque laboratoire. Bien que les informations sur l’équipement soient fournies dans la table des matériaux, il existe une grande variété d’options matérielles pour amplifier et enregistrer l’activité EMG, et les spécificités dépendront d’un mélange de fonctionnalités, de disponibilité et d’abordabilité pour chaque laboratoire. Cependant, il existe certains principes généraux de l’enregistrement EMG qu’il est important de mentionner. Un problème potentiel est le mouvement ou la destruction des électrodes implantées, ce qui peut limiter les évaluations quantitatives de l’EMG DIAm. Si les électrodes se sont délogées du DIAm, ou si les rats ont réussi à consommer ou à endommager les fils extériorisés, il peut être impossible d’enregistrer l’activité EMG, ou le niveau de bruit peut changer. Cela peut être évité en vérifiant que les électrodes sont fermement fixées dans le DIAm, et qu’un signal avec un rapport signal/bruit (SNR) élevé peut être enregistré à partir d’elles pendant la chirurgie de pose d’électrodes DIAm. De plus, l’externalisation des fils d’électrodes en haut du dos et la coupure de l’excès de fil de sorte que les rats ne puissent pas accéder aux fils d’électrodes sont toutes deux propices au succès des électrodes chroniques. Comme alternative aux fils externalisés, les capuchons de tête37 ou la télémétrie44,45 peuvent être des options raisonnables. Les deux approches permettent d’obtenir plus facilement des enregistrements chez les animaux éveillés, mais peuvent être légèrement plus difficiles à mettre en œuvre que la simple extériorisation des fils multibrins. Toutes les sources électroniques à proximité peuvent potentiellement être des sources de bruit. Il est primordial que tout l’équipement soit mis à la terre de manière appropriée, que des câbles blindés soient utilisés et que les rats ne soient pas touchés pendant les enregistrements actifs. En plus de désactiver les coussins chauffants électroniques pendant l’enregistrement, les lumières, les équipements à proximité, les tables chirurgicales électriques et d’autres appareils de ce type peuvent devoir être temporairement éteints pour réaliser des enregistrements à faible bruit. Pour minimiser les influences environnementales, les équipements électroniques qui n’ont pas besoin d’être allumés pour les enregistrements EMG DIAm doivent être éteints. Dans la mesure du possible, les enregistrements doivent être effectués dans une pièce protégée par un blindage électrique. Au fil du temps, la cicatrisation tissulaire et la fibrose autour des électrodes EMG DIAm peuvent diminuer la conductivité de l’électrode, réduisant ainsi le SNR. De plus, même de légers changements de posture peuvent avoir des impacts importants sur le signal EMG DIAm ; ainsi, pour minimiser ces problèmes potentiellement compliqués, l’EMG DIAm doit être enregistré avec les rats dans la même posture pendant toutes les sessions d’enregistrement.

Une autre considération importante est les paramètres de filtrage et d’échantillonnage. Le type d’électrode (c’est-à-dire intramusculaire ou œsophagienne/surface) est extrêmement pertinent lorsqu’il s’agit de déterminer le contenu en fréquence d’un signal et, par conséquent, les filtres passe-haut et passe-bas appropriés. Des efforts considérables ont été déployés pour déterminer les filtres optimaux pour le DIAm EMG46 de surface/œsophage. Des études similaires n’ont pas été réalisées chez le rat, mais auparavant, nous avons montré qu’effectivement, la totalité du contenu fréquentiel de l’EMG DIAm enregistré à l’aide d’électrodes intramusculaires chroniques chez le rat était inférieure à 1000 Hz, avec la fréquence centroïde autour de 300 Hz47. Dans une comparaison directe des fréquences moyennes et médianes du spectre de puissance de l’EMG du biceps brachial chez l’homme obtenu à l’aide d’électrodes de surface et intramusculaires, Christensen et coll.48 ont constaté que les fréquences moyennes et médianes étaient environ 3 fois plus élevées pour les électrodes intramusculaires que pour les électrodes de surface. Dans le DIAm, les chercheurs ont signalé des fréquences centroïdes d’environ 100 Hz lors de l’utilisation d’électrodes œsophagiennes bipolaires 49,50,51,52,53,54, ce qui suggère que les 300 Hz, qui ont été précédemment déterminés pour les électrodes intramusculaires, correspondent à peu près à la même tendance montrée par Christensen et al.48. Malgré cela, de nombreuses études publiées utilisant l’EMG DIAm intramusculaire dans des modèles de rongeurs ont placé leurs filtres passe-haut à 300 Hz 4,37,55,56 et certains sont même allés jusqu’à 500 Hz 57. Il n’est pas contesté qu’une telle approche de filtrage réduirait considérablement l’amplitude du signal EMG DIAm d’au moins la moitié. Nous proposons une approche beaucoup moins destructrice : (1) un filtrage passe-haut à 100 Hz car la majorité du spectre de puissance de l’ECG est inférieure à 100 Hz alors que comparativement peu du spectre de puissance de l’EMG DIAm est inférieure à 100 Hz51,52, et (2) la suppression ultérieure de l’ECG restant par correspondance de forme d’onde58. Ainsi, les filtres appropriés pour l’EMG DIAm pour la plupart des études peuvent être réglés entre 100 Hz et 1000 Hz, avec une fréquence d’échantillonnage d’au moins 2000 Hz pour capturer toutes les caractéristiques pertinentes dans les données. Des analyses détaillées de l’EMG DIAm peuvent ensuite être effectuées à l’aide des techniques publiées dans les rapports précédents 40,41,47,58.

Animaux éveillés et anesthésiés
Notamment, certaines études ont mis en évidence que les modèles C2SH de cSCI ne conduisent pas à une inactivité complète de l’eupneic iDIAm EMG23,37. Dans un sens, ce n’est pas surprenant, car il a été noté précédemment qu’une activité de « percée » se produit lors de comportements nécessitant une motivation plus élevée (par exemple, des respirations profondes et la réponse à l’occlusion des voies respiratoires)4,7,29,42. Ces données suggèrent qu’il n’est probablement pas approprié de considérer le modèle C2SH comme un véritable modèle d’inactivité continue. En effet, il semble que la pulsion soit suffisamment élevée chez les animaux éveillés pour que l’activité eupnéique iDIAm EMG soit présente dès quatre jours après un C2SH37 complet, bien qu’elle ne soit pas présente de manière constante un jour après la blessure23. Dans tous les cas, l’anesthésie supprime l’activité de l’iDIAm après l’hémisection vertébrale cervicale supérieure, comme souligné dans les rapports précédents23,38 et illustré dans les figures 4 et 5. Il n’y a pas de données publiées disponibles sur l’activité de l’EMG DIAm chez les rats éveillés avec le C2SH avec les funicules dorsaux épargnés proposés dans le présent manuscrit (Figure 2A). Les travaux futurs devraient fournir une caractérisation détaillée de l’évolution temporelle de l’activité de l’EMG DIAm chez les animaux éveillés avec ce modèle C2SH. Cela dit, il est toujours prudent d’effectuer une validation de l’absence continue d’inactivité eupnéique iDIAm le jour 3 après la blessure sous anesthésie pour imiter les conditions expérimentales au cours desquelles la moelle épinière a été initialement lésionnée/transectée. Lorsque l’activité eupneic iDIAm EMG chez les animaux éveillés au jour 3 après la blessure peut être présente, il est noté que même des demi-doses d’anesthésiques conduisent généralement à un arrêt complet de l’activité eupneic iDIAm EMG. Avec ces doses, les animaux sont calmes et sédatifs. En plus de vérifier l’inhibition de l’activité eupnéique iDIAm EMG pendant le C2SH et au jour 3 après la lésion, il est recommandé d’extraire la moelle épinière après l’expérience terminale pour effectuer une confirmation histologique du site et de l’étendue du C2SH 9,29,59. La confirmation histologique de la lésion, lorsqu’elle est associée à la confirmation fonctionnelle de l’activité EMG eupnéique iDIAm silencieuse, fournit des preuves solides de la réussite d’un C2SH.

Le présent article présenteun C2SH de cSCI chez le rat qui conduit à l’inhibition immédiate de l’activité eupnéique iDIAm EMG avec un inactivation continue sous anesthésie au jour 3 après la blessure. En raison de l’épargne du funicule dorsal dans le modèle C2SH proposé dans le présent manuscrit, la fonction motrice des membres est préservée, évitant ainsi les effets hors cible. Cela permet d’effectuer des études longitudinales des effets d’une lésion cervicale haute sur le contrôle neuromoteur DIAm chez des rats qui sont par ailleurs relativement en bonne santé, ajoutant ainsi un fardeau minimal pour les chercheurs. La validation de l’inactivité sous anesthésie au jour 3 après la blessure permet d’établir une base de référence claire pour évaluer l’étendue ultérieure de la récupération de l’EMG eupnéique iDIAm. Cette approche fournit une méthode rigoureuse, fiable et reproductible pour effectuer un C2SH chez le rat. Ce modèle a le potentiel d’améliorer considérablement la compréhension de l’évolution temporelle de la neuroplasticité respiratoire et de son intersection avec des stratégies thérapeutiques potentielles.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Remerciements

Les auteurs mentionnent la source de financement des NIH (NIH R01HL146114).

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Aiguille 25 GCardinal Health1188825100Covidien Monoject Hypdermic Standard Aiguilles : 25 G x 1" (0,508 mm x 2,5 cm) A
3-0 Vicryl Violet BraidedEthiconJ774D3-0 Suture
Adson-Brown ForcepsFine Science Tools11627-12Forme de la pointe : droite, pointes : dents de requin, Largeur de la pointe : 1,4 mm, Dimensions de la pointe : 2 x 1,4 m, alliage / matériau : acier inoxydable, longueur : Cage de style Bowman de 12 cm
Braintree ScientificPOR-530 Gamme depoids : 250 à 750 g ; Longueur maximale : 9" (228 mm) ; L’unité de base est construite en acrylique bijouté de 123 mm (0,5 po).
Castroviejo Porte-aiguillesOutils pour les sciences fines12565-14 Forme depointe : droite, Largeur de la pointe : 1,5 mm, Longueur de serrage : 10 mm, Serrure : Oui, Ciseaux : Non, Alliage / Matériau : Acier inoxydable, Longueur : 14 cm, Dentelé :
Oui, Caractéristique : Plomb de clip en carbure de tungstène
1m TP blindéBiopac Systems, IncLEAD110SFils conducteurs blindés pour
logiciel d’acquisition de donnéesLabChart LabChart7.3.8Logiciel d’enregistrement, de visualisation et d’analyse de données pour les enregistrements multicanaux et les évaluations en temps réel
Logiciel d’analyse de données - Matlab 2023bMathworks, Inc.Version 23.2Langage de programmation à usage général pour l’analyse post-hoc
Couteau de dissectionOutils de science fine10056-12Tranchant : 4 mm, Épaisseur : 0,5 mm, Alliage / Matériau : Acier inoxydable, Longueur : 12,5 cm, Forme de la lame : Coudé 30 & deg ;
Dumont #3 ForcepsFine Science Tools11293-00Style : #3, Forme de la pointe : droite, Pointes : Standard, Dimensions de la pointe : 0,17 x 0,1 mm, Longueur : 12 cm, Alliage / Matériau : Dumostar
Electromyogram AmplifierBiopac Systems, IncEMG100CAmplificateur EMG
Friedman RongeurFine Science Tools16000-14pointe : Courbée, Taille de la tasse : 2,5 mm, Alliage / Matériau : Acier inoxydable, Longueur : 13cm, Action articulaire : Simple
Friedman-Pearson RongeursFine Science Tools16021-14Alliage / Matériau : Acier inoxydable, Longueur : 14 cm, Action articulaire : Unique, Taille de la coupelle : 1 mm, Forme de l’embout :
Module d’alimentation isoléBiopac Systems, IncIPS100CExploite des modules d’amplification de la série 100 indépendamment du système d’acquisition de données de la série MP de Biopac Systems, Inc.
HemostatsFine Science Tools13019-14Pointes : Dentelées, Largeur de la pointe : 1,5 mm, Longueur de serrage : 22 mm, Alliage / Matériau : Acier inoxydable, Longueur : 14 cm, Forme de la pointe : Couteau incurvé
CuretteV. MuellerVM101-4414Pointe : Tranchante, Diamètre de la pointe : 2 mm
Micro Ciseaux de dissectionBiomedical Research Instruments, Inc.11-2420Longueur : 4", Angle : Droit, Longueur de la lame : 23 mm
Fil d’acier inoxydable multibrinsCooner Wire, Inc.AS 631AWG 40 ; Diamètre total : 0,011 mm (avec isolation), 0,008 mm (sans isolation).
PowerLab 8/35ADInstrumentsPL3508Système d’acquisition de données
Lame de scalpel #11Fine Science Tools10011-00Forme de la lame : Inclinée, Tranchant : 20 mm, Épaisseur : 0,4 mm, Alliage / Matériau : Acier au carbone
Manche de scalpel #3Outils de science fine10003-12Alliage / Matériau : Acier inoxydable, Longueur : 12 cm
Sprague Dawley RatInotivCode de commande : 002Sprague Dawley rats consanguins (femelles et mâles)
Microscope chirurgicalOlympusSZ61Microscope chirurgical  ;
Ciseaux de coupe de sutureGeorge Tiemann & Co.110-1250SBAlliage / Matériau : Acier inoxydable, Forme de l’embout : Droite, Pointes : Tranchantes/émoussées, Longueur : 4,5 « 
Ciseaux à ressort VannasFine Science Tools15000-08Pointes : Tranchante, Tranchant : 2,5 mm, Diamètre de l’embout : 0,05 mm, Longueur : 8 cm, Alliage / Matériau : Acier inoxydable, Dentelé : Non, Forme de l’embout : droit
Weitlaner RetractorCodman50-5647Broches : 2 x 3 émoussées, Longueur : 4,5
la EMG Forme de la incurvé Kelly  »

Références

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