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Article de méthode

Isolement de cellules souches mésenchymateuses dérivées du cordon ombilical à haut rendement et à faible dommage

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DOI :

10.3791/66835

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5 juillet 2024

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1Beijing University of Chinese Medicine, 2Department of Central Laboratory, Shenzhen Hospital, Beijing University of Chinese Medicine, 3Obstetrical Department, Longgang District Maternity & Child Healthcare Hospital of Shenzhen City, 4Longgang Maternity and Child Institute of Shantou University, Medical College

Dans cet article

Résumé

Cette étude présente une procédure unique de dissection contondante pour préserver l’intégrité de la gelée de Wharton (WJ), ce qui permet d’obtenir moins de WJ endommagés et une plus grande quantité et viabilité des cellules souches mésenchymateuses (CSM) récoltées. La méthode démontre un rendement et une capacité de prolifération supérieurs par rapport aux méthodes conventionnelles de dissection tranchante.

Résumé

Les cellules souches mésenchymateuses (CSM) sont une population de cellules multipotentes dotées de propriétés régénératives et immunomodulatrices remarquables. La gelée de Wharton (WJ) du cordon ombilical (UC) a suscité un intérêt croissant dans le domaine biomédical en tant que source exceptionnelle de CSM. Cependant, des défis tels que l’approvisionnement limité et le manque de normalisation des méthodes existantes sont apparus. Cet article présente une nouvelle méthode pour améliorer le rendement des CSM en disséquant le WJ intact du cordon ombilical. La méthode utilise la dissection émoussée pour enlever la couche épithéliale, ce qui permet de maintenir l’intégrité de l’ensemble du WJ et d’augmenter la quantité et la viabilité des CSM récoltées. Cette approche réduit considérablement les déchets de WJ par rapport aux méthodes conventionnelles de dissection tranchante. Pour garantir la pureté des WJ-MSC et minimiser l’influence cellulaire externe, une procédure utilisant la tension interne pour décoller l’endothélium après avoir retourné la CU a été effectuée. De plus, la boîte de Pétri a été inversée pendant une courte période pendant la culture d’explants pour améliorer l’attachement et la croissance cellulaire. L’analyse comparative a démontré la supériorité de la méthode proposée, montrant un rendement plus élevé des WJ et des WJ-MSC avec une meilleure viabilité que les méthodes traditionnelles. La morphologie et le modèle d’expression similaires des marqueurs de surface cellulaire dans les deux méthodes confirment leur caractérisation et leur pureté pour diverses applications. Cette méthode fournit une approche à haut rendement et à haute viabilité pour l’isolement des CSM-WJ, démontrant un grand potentiel pour l’application clinique des CSM.

Introduction

Depuis le premier isolement de cellules souches mésenchymateuses (CSM) à partir de gelée de Wharton (WJ) en 1991, ces cellules souches multipotentes ont attiré l’attention des chercheurs en raison de leurs propriétés régénératrices et de leur capacité de différenciation multilignée1. Les CSM peuvent être isolées à partir de diverses sources, notamment la moelle osseuse, le sang périphérique, la pulpe dentaire, le tissu adipeux, le fœtus (avortement humain) et les tissus liés à l’accouchement2. Le cordon ombilical (CU) est apparu comme un réservoir prometteur en raison de sa nature non invasive, de son rendement cellulaire abondant et de sa capacité de différenciation, présentant un taux élevé de prolifération, un potentiel de différenciation et des propriétés de modulation immunitaire3. Les CSM fœtales présentent de fortes propriétés souches et immunitaires, ce qui en fait le principal centre d’intérêt des essais cliniques et de la recherche fondamentale menés au cours des deux dernières décennies 2,4,5. Les CSM dérivées de la CU ont un potentiel thérapeutique supérieur à celui d’autres sources de CSM, telles que la moelle osseuse ou le tissu adipeux 6,7.

La CU est composée d’un épithélium amniotique, de trois vaisseaux (deux artères et une veine) et de la substance gélatineuse connue sous le nom de WJ3. Curieusement, la CU constitue un système vasculaire simple, composé uniquement de l’endothélium et du mésothélium, mais pas de la tunique adventice ; le WJ ne contient ni lymphe ni nerfs8. L’UC présente une structure unique idéale pour la séparation segmentaire. Les UC-MSC sont principalement situés dans le WJ. Les CSM ont pu être isolées à partir de différents compartiments du WJ, y compris l’amnion, le subamnion (l’amnion et le subamnion également désignés comme région de la muqueuse du cordon) et la zone périvasculaire du WJ8. Chaque région du WJ a sa propre structure, ses caractéristiques immunohistochimiques et sa fonction 3,6.

Les CSM isolées du WJ de l’UC sont largement considérées comme ayant une utilité clinique supérieure à celles d’autres régions3. Les WJ-MSCs ont été largement étudiées dans des contextes précliniques et cliniques pour le traitement de diverses maladies en raison de leur potentiel de différenciation multiligne, de leurs propriétés immunomodulatrices, de leurs effets paracrines, de leurs effets anti-inflammatoires et de leurs propriétés immunitairesprivilégiées 2,3. Il a été prouvé que les WJ-MSC sont prometteurs dans le traitement d’une gamme de maladies, notamment la maladie du greffon contre l’hôte (GvHD), le rejet de greffe, la maladie de Crohn, les maladies auto-immunes et les maladies cardiovasculaires 9,10,11,12,13,14. Alors que la demande clinique de CSM-WJ continue d’augmenter, la pénurie de cordons ombilicaux est actuellement un obstacle à leurs applications généralisées.

Le rendement des WJ-MSC dépend de la méthode utilisée pour l’extraction cellulaire15. Alors que les WJ-MSCs peuvent être isolées par culture d’explants ou digestion enzymatique, cette dernière méthode a un temps de propagation plus long qui peut augmenter le risque de dommages cellulaires et diminuer la viabilité cellulaire16. Cependant, de nombreuses études ont montré que la méthode de culture d’explants augmente les rendements cellulaires et la viabilité, et que les facteurs paracrines libérés par les tissus d’explant contribuent également à favoriser la prolifération cellulaire17,18.

Cette étude a appliqué une approche de dissection unique pour obtenir des WJ entiers, produisant des CSM avec une capacité de prolifération, une viabilité et une quantité accrues, tout en minimisant les dommages au WJ. Cette méthode innovante offre une stratégie rationalisée pour isoler les WJ-MSC, répondant ainsi aux besoins critiques des applications MSC.

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Protocole

Des échantillons ont été prélevés auprès de donneurs consentants et en bonne santé de l’hôpital de maternité et de santé infantile du district de Shenzhen Longgang, dans le Guangdong, en Chine. L’utilisation d’échantillons humains pour l’étude a été approuvée par le comité d’éthique de l’hôpital de Shenzhen, de l’Université de médecine chinoise de Pékin (SZLDH2020LSYM-095) et le comité d’éthique médicale de l’hôpital de maternité et de santé infantile du district de Shenzhen Longgang (LGFYYXLLS-2020-005). Toutes les expériences ont été menées conformément aux directives approuvées. Les détails des réactifs et de l’équipement utilisé sont répertoriés dans la table des matériaux.

1. Prélèvement du cordon ombilical humain

  1. Obtenir des échantillons de cordon ombilical humain de l’hôpital coopératif dans des conditions stériles.
    REMARQUE : Choisissez un donneur de moins de 35 ans, de préférence un primipare, sans antécédents d’hépatite, de maladies sexuellement transmissibles ou de troubles génétiques. Les résultats de l’examen d’admission pour le virus de l’hépatite B, le virus de l’hépatite C et le cytomégalovirus doivent être négatifs. Choisissez la césarienne comme mode d’accouchement.
  2. Sélectionnez un morceau droit et intact de UC d’environ 10 à 15 cm de longueur.
  3. Fermez les deux extrémités avec une pince hémostatique et ligaturez avec des nœuds chirurgicaux à l’extrémité intérieure entre les pinces juste après l’accouchement d’un nouveau-né à terme par césarienne. (CU collecté comme le montre la figure 1, étape 1).
    REMARQUE : Le fonctionnement de la césarienne garantit que le prélèvement est stérile. Utilisez des nœuds chirurgicaux de taille 0 ou 2-0 pour une meilleure résistance à la traction.
  4. Coupez le cordon ombilical attaché entre la pince et les nœuds à l’aide de ciseaux chirurgicaux (Figure 1, étape 1).
  5. Rincez-le avec une solution saline pour éliminer tous les caillots sanguins contaminants à la surface et transférez-le rapidement dans un tube en plastique stérile de 50 ml contenant 20 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) stérile.
    REMARQUE : Aucun antibiotique n’a été utilisé pendant le transfert.
  6. Scellez le tube. Placez-le sur de la glace dans une boîte en polystyrène et stockez-le à 4 °C avant de le transporter au laboratoire.
    REMARQUE : Disséquez le cordon dans les 4 heures suivant le prélèvement.

2. Isolement de la gelée de Wharton du cordon ombilical

  1. Traitez le cordon ombilical en suivant les étapes ci-dessous :
    1. Préparez un plateau stérilisé avec des instruments chirurgicaux, des boîtes de 90 mm emballées de manière aseptique, des pipettes de 1000 μL, du PBS stérile, une solution d’éthanol à 75 % et un milieu de culture de CSM humaine sans xéno.
      REMARQUE : Les pinces dentées et les pinces anti-moustiques permettent de traiter efficacement le cordon ondulant.
    2. Décontaminer la surface des articles requis et la zone de travail avant de les placer dans l’enceinte de sécurité biologique.
      REMARQUE : Laissez l’air de la zone de travail se purger pendant quelques minutes avant de commencer le travail.
    3. Désinfectez la surface du tube et retirez l’échantillon dans une boîte de Pétri dans l’enceinte de biosécurité. Immergez l’échantillon avec les nœuds dans de l’éthanol à 75 % pendant 30 secondes, puis rincez-le plusieurs fois avec du PBS stérile dans une nouvelle boîte de Pétri.
      REMARQUE : Le cordon doit être ligaturé avant d’être immergé dans de l’éthanol à 75%, et le temps d’immersion doit être limité à 30 s à 1 min pour désinfecter complètement le cordon sans l’endommager.
    4. Coupez les nœuds et coupez le cordon entre deux nœuds transversalement en petits morceaux d’environ 2 cm de long avec des ciseaux chirurgicaux et des pinces.
      REMARQUE : Les extrémités du cordon avec des nœuds doivent être jetées. La longueur de la CU ne doit être ni trop longue ni trop courte ; Les deux conditions peuvent augmenter la difficulté de l’opération.
    5. Perfuser la veine (vaisseau plus gros) avec du PBS à l’aide de pipettes de 1000 μL jusqu’à ce que le liquide sortant de l’autre extrémité du cordon devienne complètement transparent19.
  2. Disséquez le cordon ombilical.
    1. Transférez l’un des morceaux déjà coupés dans une nouvelle boîte de Pétri.
      REMARQUE : Deux artères et une veine doivent être exposées de manière visible sur la coupe transversale8 (Figure 2B).
    2. Ajoutez la quantité appropriée de PBS pour garder le cordon mouillé tout au long de l’opération.
    3. Saisissez le cordon à l’aide d’une pince et tirez les artères le long de son grand axe à l’aide de pinces anti-moustiques.
      REMARQUE : Essayez de tirer de l’autre extrémité du cordon si l’artère a été arrachée, car la paroi de l’artère a une grande élasticité.
    4. Fixez le cordon horizontalement avec le côté le plus épais vers le haut en insérant une lame de la pince dans la veine ombilicale, puis en serrant fermement, en veillant à ce que la pince se bloque du côté le plus épais.
    5. Faites une incision linéaire sur la couche de l’épithélium amniotique d’une extrémité à l’autre le long du bord de l’autre lame de la pince à l’aide d’un scalpel (Figure 3).
      REMARQUE : Préservez l’intégrité de la gelée de Wharton en coupant le moins de WJ possible.
    6. Commencez par un coin de l’espace de coupe. Soulevez le coin de l’épithélium amniotique à l’aide de pinces dentées et continuez à couper horizontalement un peu plus loin avec des ciseaux cornéens le long de la surface interne de l’épithélium.
      1. Séparez la gelée de Wharton et l’épithélium amniotique à l’aide de pinces et étendez-vous progressivement à l’ensemble du cercle d’une extrémité de la CU. Décollez la couche épithéliale dans le sens de la longueur (Figure 3).
        REMARQUE : La gelée de Wharton est un tissu conjonctif muqueux entouré par l’épithélium amniotique dense8. L’ensemble de l’opération devrait se dérouler sans heurts, mais des pinces anti-moustiques pourraient être utilisées pour la dissection émoussée si l’on rencontre des difficultés lors de l’épluchage.
    7. Insérez les deux lames de la pince à l’intérieur de la veine, clampez une partie de WJ, puis retournez-la pour exposer l’épithélium de la veine ombilicale (Figure 3).
    8. Décollez facilement l’épithélium de la veine, car la tension interne crée une séparation entre l’épithélium de la veine et le WJ périvasculaire (Figure 3).
  3. Disséquer la CU à l’aide de la méthode conventionnellede comparaison 20.
    1. Choisissez un autre échantillon déjà coupé et presque du même poids que le cordon précédent et transférez-le dans une nouvelle boîte de Pétri.
    2. Coupez le long de la veine ombilicale longitudinalement avec des ciseaux et étalez le CU pour exposer les vaisseaux et WJ.
    3. Retirez la veine ombilicale et deux artères, et dégagez le WJ de la couche endothéliale avec des ciseaux et un scalpel.

3. Isolement et culture des UC-MSCs

  1. Placez le WJ collecté dans une boîte de Pétri de 90 mm pré-étiquetée et coupez-le en morceaux de 1 à 3 mm avec des ciseaux et des pinces.
  2. Retournez le plat avec le capuchon sur le fond et placez-le dans un incubateur à 5 % de CO2 à 37 °C pendant 30 min pour renforcer la fixation entre les morceaux et la surface en plastique.
  3. Retournez le plat et ajoutez doucement une quantité appropriée de milieu de culture MSC humain pour une culture ultérieure.
    REMARQUE : Utilisez la vitesse la plus basse pour vous assurer que les pièces sont toujours attachées.
  4. Changer le milieu de culture MSC humain tous les 3 jours. Échangez les deux tiers du milieu et observez l’apparition d’une excroissance des cellules fibreuses tous les 2 jours pendant les 7 premiers jours, changez le milieu complet et observez-le quotidiennement par la suite.
    REMARQUE : Évitez de déplacer la boîte de Pétri pendant les 7 premiers jours. L’excroissance distinguée de cellules semblables à des fibroblastes a été observée en 4 jours environ.
  5. Sous-culture jusqu’à ce que la confluence atteigne 80%.
    REMARQUE : Cette étape prend 7 à 10 jours.
    1. Préchauffer le PBS, la trypsine à 0,25 % et le milieu de culture de CSM humaines sans xéno à 37 °C dans un bain-marie.
    2. Rincer avec du PBS après avoir aspiré le surnageant avec des pipettes, et détacher les cellules avec de la trypsine préchauffée à 0,25 % jusqu’à ce qu’elles puissent être délogées en tapotant la boîte de Pétri.
    3. Inactiver la trypsine en mélangeant le milieu de culture MSC préchauffé dans un rapport de 4:1, recueillir la suspension cellulaire et centrifuger à 300 x g pendant 5 min à 4 °C.
      REMARQUE : Ces cellules sont considérées comme le passage 0 (P0).
    4. Jeter le surnageant à l’aide d’une pipette, remettre les cellules en suspension dans le milieu de culture humain des CSM et inoculer dans de nouvelles boîtes de Pétri à une densité d’ensemencement de 1 x 104 cellules/cm2 pour la propagation.
  6. À l’aide d’un hémocytomètre, comptez le nombre total de cellules des deux méthodes après amplification au premier, deuxième et troisième passage. Déterminez la morphologie cellulaire au microscope dans les premier, troisième et cinquième passages.
    REMARQUE : La morphologie de ces cellules doit être similaire à celle des cellules P0.
  7. Utilisez des cellules au cinquième passage pour la cytométrie en flux et d’autres expériences.

4. Expression de marqueurs de surface cellulaire par cytométrie en flux

  1. Détachez les cellules de passage 5 (P5) avec de la trypsine à 0,25 %, lavez les cellules avec un tampon de coloration cellulaire et centrifugez-les à 300 x g pendant 5 min à 4 °C. Remettre les pastilles en suspension avec un tampon de coloration cellulaire à 100 μL chacune.
  2. Étiquetez chaque tube et ajoutez les quantités appropriées d’anticorps, qui ont été conjugués avec de l’allophycocyanine (APC), de l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC) ou de la phycoérythrine (PE) : CD44-APC, CD73-APC, CD90-FIFC, CD105-FIFC, CD11B-PE, CD19-PE, CD43-PE, HLA-DR-PE en suivant les instructions du fabricant21. Incuber pendant 15-20 min dans l’obscurité à température ambiante.
  3. Centrifuger les cellules colorées à 300 x g pendant 5 min à 4 °C, aspirer le surnageant à l’aide d’une pipette et laver une fois avec un tampon de coloration cellulaire.
  4. Répétez la centrifugation et la remise en suspension des cellules avec 300 μL de tampon de coloration cellulaire.
  5. Faites passer les cellules dans le cytomètre en flux et analysez les cellules colorées par des anticorps selon les instructions du fabricant.

5. Détermination de la courbe de croissance cellulaire par la méthode de comptage cellulaire

  1. Préparez une suspension unicellulaire de cellules P5 en utilisant deux méthodes en les diluant dans un milieu de culture MSC humain.
  2. Ensemencez 8 000 cellules par puits dans une plaque de 24 puits, avec un total de 21 puits de chaque méthode ensemencés.
    REMARQUE : Mélangez doucement les cellules en soufflant et en aspirant avec des pipettes avant l’ensemencement.
  3. Récoltez les cellules de trois puits après 24 h de semis. Effectuez le comptage des cellules à l’aide d’un hémocytomètre pour calculer la valeur moyenne.
    REMARQUE : Secouez la plaque avant de compter les cellules. La durée de l’agitation peut être prolongée pour éviter la formation d’agrégats cellulaires.
  4. Répétez le comptage cellulaire toutes les 24 heures pendant une durée totale de 7 jours. Tracez une courbe de croissance en utilisant le temps (d) sur l’axe des X et le nombre de cellules (x104/mL) sur l’axe des Y.

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Résultats

Les procédures de collecte et d’élevage des UC-MSC, ainsi que leur analyse ultérieure, sont résumées à la figure 1. L’UC a été soigneusement disséqué en plusieurs sections à l’aide de la méthode unique ; le schéma de fonctionnement spécifique des procédures principales est illustré à la figure 2. La croissance des cellules des cultures d’explants a été régulièrement surveillée et enregistrée. Des cellules adhérentes en forme de fuseau ont été observées environ 4...

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Discussion

Les CSM représentent un domaine de recherche dynamique qui a de profondes implications pour la médecine régénérative22. Leurs propriétés uniques en font un point central pour la recherche scientifique et ont le potentiel de révolutionner le traitement d’un large éventail de maladies et de blessures7. Les CSM-WJ sont un sous-ensemble distinct des CSM, qui peuvent être obtenues à partir du tissu conjonctif gélatineux au sein de la CU situé entre l’épithélium intervasculaire e...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne signalent aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Ce travail a été soutenu financièrement par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (82172107), la Fondation des sciences naturelles de la province du Guangdong, Chine (2021A1515011927, 2021A1515010918, 2020A1515110347), le Fonds de recherche médicale de Shenzhen (SMRF. D2301015), le Comité municipal d’innovation scientifique et technologique de Shenzhen (JCYJ20210324135014040, JCYJ20220530172807016, JCYJ20230807150908018, JCYJ20230807150915031) et le Fonds spécial du district de Longgang pour le développement économique et technologique (LGKCYLWS2022007).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Anticorps anti-CD44 humain APC  ;Biolegend  ;
plaques de culture cellulaire à 24 puitsThermo Scientific142475
APC anti-humain CD73 (Ecto-5'-nucléotidase) Anticorps  ;Biolegend  ;
souris APC IgG1, &kappa ; Biologie de l’anticorps de l’isotype Ctrl (FC)  ;
AutoclaveHIRAYAMAHVE-50
Compteur de cellules automatiqueCountstarFL-CD
BAMBANKER Solution de cryoconservationWako302-14681
Tampon de coloration cellulaireBiolegend  ;
Machine centrifugeEppendorf5424R
Banc propreShanghai ZhiChengC1112B
CO2 IncubateurThermo ScientificHERAcell 150i
D-PBSSolarbioD1040
Four de sablage électro-thermostatiqueShanghai JingHongDHG-9423A
Anticorps anti-CD105 humain FITC  ;Biolegend  ;
Anticorps anti-CD90 (Thy1) humain FITC  ;Biolegend  ;
FITC souris IgG1, &kappa ; Biologie de l’anticorps de l’isotype Ctrl (FC)  ;400110
Cytométrie en fluxBeckmanCytoFLEX
hémocytomètresupérieur Marienfeld640410
Tampon de lavage de perméabilisation de coloration intracellulaire (10× ;)  ;Biolegend  ;
Microscope biologique inverséZEISSAxio Vert. A1
Réservoir de stockage d’azote liquideThermo ScientificCY50935-70
Saline normale (NS)MeilunbioMA0083
PBSSolarbioP1032
PE anti-humain CD11bAnticorps Biolegend  ;
Anticorps CD19 humain contre l’EPBiolegend  ;
PE anti-anticorps CD34 humainBiolegend  ;
PE anti-anticorps CD45 humainBiolegend  ;368510
Anticorps anti-HLA-DR humain PE  ;Biolegend  ;
Souris PE IgG1, &kappa ; Biologie de l’anticorps de l’isotype Ctrl (FC)  ;
Souris PE IgG2a, &kappa ; Biologie de l’anticorps de l’isotype Ctrl (FC)  ;
Balance électronique de précisionSatoriusPRACTUM313-1C
MACHINE À GLACE FLOCON DE NEIGEZIEGRAZBE 30-10
stérilisé 50 mL tube en plastiqueGreniner227270
Bain-marie thermostatiqueShanghai YiHengHWS12
Trypsin 1:250SolarbioT8150
UltraGRO-AdvancedHelios·
Système de purification d’eau ultra-pure et pureMilli-QRéférence
Milieu de culture MSC humain sans xénoFUKOKU  ;
338806344006400122 420201 323204328108421002393112392506343606307606400114400214HPCFDCGL50Milli-QT2011301

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