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Détection efficace des cellules de la population du côté de Hoechst par cytométrie en flux

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DOI :

10.3791/67012

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23 août 2024

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1Institute of Hematology, Department of Hematology, State Key Laboratory of Biotherapy, West China Hospital, Sichuan University, 2The Lab of Aging Research, State Key Laboratory of Biotherapy, National Clinical Research Center for Geriatrics, West China Hospital, Sichuan University, 3Precision Medicine Research Laboratory, West China Hospital, Sichuan University

Dans cet article

Résumé

Ici, nous montrons que les lasers haute puissance de 375 nm et 405 nm peuvent exciter efficacement Hoechst 33342 et servir d’alternative viable au laser 355 nm pour la détection de cellules de population latérale (SP), élargissant ainsi la gamme de lasers disponibles dans les applications de cytométrie en flux.

Résumé

Les cellules de la population latérale (SP) sont identifiées par coloration Hoechst 33342 et analysées par cytométrie en flux (FCM). La méthode SP de Hoechst est utilisée pour l’isolement des cellules souches en fonction des propriétés d’efflux de colorant des transporteurs de cassette de liaison à l’ATP (ABC). La méthode a d’abord été utilisée pour l’identification et l’isolement des cellules souches hématopoïétiques (CSH), mais elle a maintenant évolué pour se concentrer principalement sur l’identification et l’isolement des cellules souches cancéreuses (CSC). La méthode de détection traditionnelle de la FCM utilise un laser de 355 nm pour exciter le colorant afin de détecter les cellules SP. Grâce à cette étude, nous avons réussi à identifier des approches alternatives pour l’excitation du colorant qui peuvent remplacer efficacement la détection des cellules SP à l’aide d’un laser de 355 nm. Ceci est réalisé grâce à l’utilisation de lasers haute puissance de 375 nm ou 405 nm. Cela nous permet d’exercer une sélectivité accrue dans la détection des cellules SP plutôt que de nous limiter uniquement à la cytométrie en flux laser de 355 nm.

Introduction

Les cellules de la population latérale (SP) sont identifiées par coloration Hoechst 33342 et analysées par cytométrie en flux (FCM). Les cellules SP sont caractérisées par le pompage du colorant d’ADN fluorescent hors des cellules par le biais deleur transporteur 1,2 de la cassette de liaison à l’ATP (ABC). La méthode a été établie à l’origine pour isoler les cellules souches hématopoïétiques (CSH) de la moelle osseuse murine1. Les cellules SP de la moelle osseuse ont été enrichies d’une population de CSH caractérisée par unefaible expression de CD117+Sca-1+Lin-Thy1 3,4. Par la suite, la méthode a été largement utilisée pour isoler et enrichir les cellules souches d’autres tissus, notamment le muscle cardiaque5, le foie6, le poumon7, le rein8 et le cerveau antérieur9. En particulier, la méthode a été appliquée pour isoler des cellules souches cancéreuses (CSC) au cours de la dernière décennie. Les CSC représentent une petite population de cellules qui possèdent les propriétés d’initiation tumorale, d’auto-renouvellement, de résistance à la chimiothérapie et de potentiel métastatique10. Les CSC ont d’abord été identifiés dans les tumeurs malignes hématopoïétiques11 et ont ensuite été observés dans diverses tumeurs solides telles que les carcinomes de la prostate12, de l’ovaire13, de l’estomac14, du sein15 et du poumon16. Malgré la disponibilité de diverses techniques d’identification des CSC, la technique SP reste un choix privilégié en raison de sa large applicabilité à divers tissus et lignées cellulaires. De plus, il s’agit d’une technique précieuse qui isole les CSC à l’aide du tri cellulaire activé par fluorescence (FACS)16,17,18. Les résultats expérimentaux démontrent que les cellules SP présentent une tumorigénicité prononcée et des niveaux d’expression élevés des gènes associés aux cellules souches19,20. Notre étude précédente21 a également démontré que l’analyse transcriptomique des cellules SP isolées dans le myélome multiple révèle un enrichissement des voies de signalisation associées aux cellules souches, telles que la voie du hérisson. Pendant ce temps, nous avons effectué des analyses d’enrichissement des voies sur les gènes exprimés de manière différentielle dans les cellules SP de la leucémie myéloïde aiguë22. Les gènes modifiés ont été enrichis dans des voies liées aux cellules souches (Wnt/β-caténine, TGF-β, Hedgehog, Notch). Nous avons constaté que 1 x 105 cellules SP pouvaient former des tumeurs chez les souris nulles BALB/c22, alors que les cellules non SP ne le pouvaient pas, ce qui indique que les cellules SP présentaient des caractéristiques des cellules souches de leucémie. L’efficacité de la méthode SP de Hoechst dans l’identification des CSC est évidente.

Le protocole Hoechst SP a été affiné et amélioré au fur et à mesure de la progression de la recherche. Le protocole implique un contrôle rigoureux de la concentration du colorant, de la densité cellulaire, de la température et de la durée d’incubation, de la composition du tampon et de la valeur du pH. Les échantillons de cellules préparés conformément à ce protocole ont été soumis à une analyse par cytométrie en flux. En raison de l’excitation du colorant Hoechst avec un laser UV à 355 nm et de la détection de son émission de fluorescence à l’aide d’un filtre 690/50 nm (Hoechst Red) et d’un filtre 450/50 nm (Hoechst Blue), un laser 350 nm est nécessaire pour FCM. Cependant, les lasers 350 nm ne sont pas couramment équipés dans la plupart des FCM en raison de leur coût élevé. Par conséquent, nous avons tenté de trouver une approche alternative pour l’excitation du colorant afin de détecter efficacement les cellules SP par cytométrie en flux. Dans cette étude, la capacité des lasers de 375 nm et de 405 nm à détecter les cellules SP a été évaluée et comparée à celle du laser de 355 nm. Nos résultats démontrent une similitude remarquable entre les cellules SP détectées par les lasers de 355 nm, 375 nm et 405 nm. Ces résultats suggèrent que les lasers haute puissance de 375 nm et 405 nm peuvent servir d’alternatives réalisables au laser 355 nm pour la détection de cellules SP. L’inclusion de sources lumineuses d’excitation supplémentaires pour Hoechst 33342 facilite l’utilisation d’un plus grand nombre de modèles de cytométrie en flux.

Protocole

Les expériences de cette étude ont utilisé un total de 10 souris C57BL/6 âgées de 8 à 12 semaines. Les opérations expérimentales ont été menées conformément à un protocole approuvé par le Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux de l’Université du Sichuan (#201609309). Les matériaux expérimentaux et les paramètres de cytométrie en flux utilisés dans cet article sont répertoriés dans la Table des matériaux.

1. Isolement et prélèvement de cellules de moelle osseuse de souris

  1. Euthanasier les souris en stricte conformité avec les directives de l’établissement. Pour induire une perte de conscience chez la souris, administrer des anesthésiques par inhalation en commençant par 2 % d’isoflurane, suivi d’une augmentation progressive de la dose à 5 % d’isoflurane jusqu’à l’arrêt de la respiration.
  2. Disséquez les souris dans le bloc opératoire ou dans le placard à fumée. Nettoyez et stérilisez les souris avec de l’éthanol à 70 %.
  3. Coupez complètement la peau et le muscle de la jambe avec des ciseaux tranchants et disséquez les fémurs.
  4. Écrasez doucement le fémur avec une tige de broyage dans un mortier et rincez les cellules de la moelle osseuse avec un milieu DMEM jusqu’à ce que l’os devienne blanc.
  5. Filtrer les cellules de moelle osseuse obtenues à l’aide d’un filtre de 100 μm dans des tubes de 15 mL. Centrifugeuse à 800 x g pendant 5 min à 4 °C.
  6. Jeter le surnageant et lyser les globules rouges résiduels avec 1 mL de tampon de lyse des globules rouges pendant 1 min à 4 °C. Centrifugeuse à 800 x g pendant 5 min à 4 °C. Après centrifugation, laver à nouveau avec un milieu DMEM.
  7. Remettre les cellules en suspension dans 2 mL de solution d’incubation (milieu DMEM + 5 % FBS), compter les cellules à l’aide d’un compteur automatique de cellules et ajuster la concentration cellulaire à 1,0 x 106 cellules/mL avec la solution d’incubation.

2. Coloration cellulaire

  1. Compléter 2 mL de suspension de cellules de moelle osseuse de chaque souris avec 5 μg/mL de Hoechst 33342. À 1 mL d’aliquote supplémentaire, ajouter 100 μM de vérapamil comme témoin négatif.
  2. Incuber au bain-marie à 37 °C pendant 90 min avec une légère agitation toutes les 30 min.
  3. Après l’incubation, refroidissez les cellules sur de la glace pendant 5 min, puis centrifugez-les à 250 x g pendant 5 min à 4 °C. Remettre les cellules en suspension dans une solution à froid (HBSS + 2 % FBS). Centrifuger à 4 °C pendant 5 min et jeter le surnageant.
  4. Remettre en suspension la pastille cellulaire obtenue dans 500 μL de solution courante par échantillon. Avant l’analyse FCM, compléter les cellules avec 2 μg/mL d’iodure de propidium (IP) et les placer sur de la glace pendant environ 5 min.

3. Cytométrie en flux

REMARQUE : Pour un résumé des différents systèmes et configurations utilisés, veuillez consulter le Tableau 1.

  1. Étalonnez les valeurs du coefficient de variation (CV) des canaux requis à l’aide de fluorosphères de contrôle de la qualité (CQ) quotidiennes dans les FCM et effectuez des tests d’échantillons après la réussite du contrôle de la qualité.
    1. Sélectionnez le raccourci du logiciel sur le bureau et lancez-le.
    2. Sélectionnez Démarrer le contrôle qualité/normalisation dans le menu Contrôle qualité/Normalisation pour accéder à l’expérience de contrôle qualité.
    3. Insérez le tube d’échantillon de fluorosphères QC dans le support de tube.
    4. Sélectionnez Démarrer pour charger l’échantillon et commencer à exécuter la procédure de contrôle qualité. Les FCM sont prêts à l’emploi après le passage du contrôle qualité.
  2. Excitez le colorant Hoechst 33342 des mêmes échantillons avec un laser de 355 nm, 375 nm et 405 nm, respectivement, pour la détection du rouge Hoechst dans le canal 690/50 nm et du bleu Hoechst dans le canal 450/50 nm.
    1. Créez une nouvelle expérience en sélectionnant Nouvelle expérience dans le menu Fichier, spécifiez le chemin d’accès au fichier et enregistrez l’expérience.
    2. Sélectionnez Définir la chaîne dans le menu Paramètres. Cochez la case du signal de canal (Y585, V450, V660, NUV450, NUV660, UV450, UV660), puis ajoutez le nom du réactif dans la colonne Étiquette (Y585 : PI ; V450 : Bleu Hoechst-405 mn ; V660 : rouge Hoechst-405 mn ; NUV450 : Bleu Hoechst-375 mn ; NUV660 : Bleu Hoechst-375 mn ; UV450 : Bleu Hoechst-355 nm ; UV660 : Bleu Hoechst-355 nm).
    3. Cliquez sur les icônes Pseudo Color Plots dans la zone de tracé pour créer des tracés. Sélectionnez un nom d’axe pour modifier le canal affiché.
    4. Cliquez sur Ajouter un tube dans l’écran Tube à essai pour créer de nouveaux tubes d’échantillon et modifier leurs noms.
    5. Sélectionnez Exécuter pour charger l’échantillon, afficher les tracés et établir les portes. Ajustez les paramètres de gain et de seuil. Sélectionnez Enregistrer pour enregistrer les données.
  3. Concevez la logique de réglage des portes.
    1. Pour le premier graphique, cliquez sur l’axe X pour sélectionner FSC-W et cliquez sur l’axe Y pour sélectionner FSC-A. Sélectionnez Porte polygonale pour dessiner la porte A afin d’entourer la cellule individuelle et d’exclure les cellules adhérentes (Figure 1A).
    2. Pour le deuxième graphique, cliquez sur l’axe des X pour sélectionner FSC-A et cliquez sur l’axe des Y pour sélectionner SSC-A. Sélectionnez Porte polygonale pour dessiner la porte B afin de séparer les cellules non fragmentaires et d’exclure les débris cellulaires (Figure 1B).
    3. Pour le troisième graphique, cliquez sur l’axe X pour sélectionner PI-A et cliquez sur l’axe Y pour sélectionner SSC-A. Sélectionnez la porte polygonale pour dessiner la porte D. Sélectionnez Cellules actives présentant un PI négatif (Figure 1C) et dessinez la porte C pour obtenir des cellules actives.
    4. Pour le quatrième graphique bidimensionnel, cliquez sur l’axe X pour sélectionner Hoechst Red et cliquez sur l’axe Y pour sélectionner Hoechst Blue. Cliquez avec le bouton droit de la souris sur le tracé et sélectionnez Propriété dans le menu déroulant. Sélectionnez Format linéaire fou les axes X et Y. Sélectionnez Porte polygonale pour dessiner la porte SP afin d’obtenir les cellules SP (Figure 1D).
  4. Pour évaluer l’éligibilité de l’échantillon, utilisez 355 nm d’un cytomètre en fluxspécifique 23 pour la détection des cellules SP.
  5. Utilisez simultanément les lasers 355 nm (puissance laser : 20 mW) et 405 nm (puissance laser : 80 mW) pour détecter à la fois les cellules de contrôle (avec l’ajout de vérapamil) et les cellules expérimentales.
  6. Acquérir des signaux de fluorescence sur les canaux 690/50 nm et 450/50 nm correspondant aux deux lasers. Observez la stimulation efficace du colorant Hoechst 33342 par des lasers de 355 nm et 405 nm avec des cellules SP transparentes (Figure 2B-C).
  7. Pour les mêmes échantillons, utilisez les lasers 375 nm (puissance laser : 60 mW) et 405 nm (puissance laser : 80 mW) pour la détection des cellules.

Résultats

Dans la figure 2, le groupe témoin a été traité avec du vérapamil, qui bloque les transporteurs ABC dans les cellules souches pour empêcher l’élimination de Hoechst 33342. Ainsi, les cellules souches du groupe non-vérapamil expulsent Hoechst 33342 et forment une population cellulaire négative connue sous le nom de cellules SP. Le laser de 355 nm a efficacement excité le colorant Hoechst 33342, ce qui a permis une observation claire des cellules SP de la moelle osseuse (Figure 2A). Les cellules SP des mêmes échantillons détectés par le laser de 355 nm et le laser de 405 nm se sont révélées essentiellement identiques (Figure 2D).

À partir de la figure 2 et de la figure 3, nous avons vu que d’autres modèles de débitmètres non traditionnels peuvent également identifier les cellules SP. Les résultats indiquent que les lasers de 375 nm et de 405 nm ont efficacement excité Hoechst 33342 pour obtenir des cellules SP (Figure 3A-B). Lorsqu’il est nécessaire de détecter ou d’isoler des CSC ou des HSC, on peut opter pour un laser 375 nm ou 405 nm au lieu d’un laser 355nm.

figure-results-1
Figure 1 : Logique de réglage de la porte basée sur la cytométrie en flux pour la détection des cellules SP. (A) FSC-A et FSC-W ont été utilisés pour exclure les cellules adhérentes. La porte A représente le cluster à cellule unique. (B) Les paramètres FSC-A et SSC-A ont été utilisés pour l’élimination des débris cellulaires. La porte B représente l’amas de cellules non fragmentaires. (C) Des cellules vivantes présentant un iodure de propidium (PI) négatif ont été sélectionnées. La porte C représente l’amas de cellules vivantes. (D) Les signaux de fluorescence ont été acquis par les canaux 690/50 nm (Hoechst-rouge) et 450/50 nm (Hoechst-bleu). La porte SP représente le cluster de cellules SP. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-2
Figure 2 : Le laser haute puissance de 405 nm détecte les cellules SP aussi efficacement que le laser de 355 nm. (A) Le colorant Hoechst 33342 a été excité par le laser de 355 nm d’un cytomètre en flux conventionnel pour détecter les cellules SP de la moelle osseuse. (B, C) Les cellules SP de la moelle osseuse ont été identifiées par les lasers 355 nm et 405 nm du même FCM. (D) Les cellules SP des mêmes échantillons détectées par le laser de 355 nm et le laser de 405 nm se sont révélées essentiellement identiques. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-3
Figure 3 : Les lasers haute puissance de 375 nm et 405 nm sont capables de détecter les cellules SP. (A) Le laser haute puissance de 375 nm peut détecter les cellules SP. (B) Les cellules SP de la moelle osseuse peuvent également être détectées à l’aide des lasers de 405 nm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Type laserLongueur d’onde laser (nm)Puissance laser (mW)Filtre rouge Hoechst (nm)Filtre bleu Hoechst (nm)
Moflo Astrios EQGaz argon355100692/75448/59
CytoFLEX LXSemi-conducteur35520690/50450/50
40580690/50450/50
CytoFLEX SSemi-conducteur37560690/50450/50
CytoFLEX SRTSemi-conducteur40580690/50450/50

Tableau 1 : Résumé des configurations de cytomètres en flux.

Discussion

Nous avons utilisé le protocole décrit pour mener trois expériences, chaque essai impliquant 3 à 4 souris, ce qui a donné un total de 10 souris. La proportion de cellules SP variait de 0,05 % à 0,76 %. Il est important de noter que des variations individuelles ont été observées chez les souris. Nous avons utilisé quatre cytomètres en flux pour analyser les échantillons de Hoechst. On observe que l’excitation du colorant Hoechst par un laser de 20 mW 355 nm sur la nouvelle version de la cytométrie en flux est équivalente à celle d’un laser de 100 mW 355 nm sur la cytométrie en flux à l’ancienne. Ce phénomène peut être attribué à la variation des types de laser utilisés dans les deux systèmes. La raison potentielle de l’effet observé des lasers de 375 nm et de 405 nm pourrait être attribuée à la puissance de sortie substantielle des deux lasers en conjonction avec l’utilisation du détecteur de photodiode d’avalanche (APD). Le canal Hoechst Red-A a capturé la longue longueur d’onde proche du rouge de 690 nm, où l’efficacité de conversion photoélectrique du tube photomultiplicateur (PMT) était relativement faible. Cependant, l’APD a démontré un rendement de conversion photoélectrique environ dix fois supérieur à celui du PMT24. Par conséquent, lorsqu’ils sont combinés avec des lasers haute puissance de 375 nm et 405 nm, les détecteurs APD distinguent efficacement les cellules SP. Le laser de 405 nm détecte non seulement efficacement les cellules SP, mais présente également une capacité supérieure à distinguer un sous-ensemble de populations faiblement positives au rouge de Hoechst par rapport au laser de 355 nm.

L’étape critique du protocole consiste à utiliser la cytométrie en flux avec un laser de 375 nm ou un laser de 455 nm pour détecter les cellules avec des canaux 690/50 nm (Hoechst-rouge) et 450/50 nm (Hoechst-bleu). Alors que la technique détecte les cellules SP avec des lasers de 375 nm et 405 nm au lieu du laser 355 nm (laser traditionnel pour l’analyse des cellules SP1), qui sont plus courants dans les FCM, des lasers haute puissance de 375 nm et 405 nm sont nécessaires. Cela conduit aux limites de cette technologie. L’importance de la méthode est d’élargir la gamme de lasers utilisés pour détecter les colorants de Hoechst afin que d’autres modèles de cytométrie en flux puissent être utilisés pour la détection des cellules SP.

Déclarations de divulgation

Aucun conflit d’intérêts n’a été déclaré.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par les subventions accordées à J.H. par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (n° 81800207). L’aide de Beckman Coulter, Inc. pour fournir un soutien pour la cytométrie en flux et l’étalonnage des paramètres est grandement appréciée. Nous remercions Jiao Chen du Laboratoire clé d’État des maladies bucco-dentaires de l’Hôpital de stomatologie de l’Ouest de la Chine de l’Université du Sichuan, et Yu Qi du Centre de recherche en médecine régénérative de l’Hôpital de l’Ouest de l’Université du Sichuan pour leur aide dans l’acquisition de données de cytométrie en flux.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Compteur de cellules automatiqueCountstar1M1200
Filtre de cellules (100 µ ; m)BIOFILCSS-013-100
Contrôle de qualité quotidien fluorosphèresBeckman CoulterB5230
Modification par Dulbecco du milieu d’Eagle avec 4,5 g/L de glucose (milieu DMEM)CORNING10-013-CVRC
Sérum fœtal bovinCORNING35-081-CV
HBSSHycloneSH30030.02
Hoechst 33342Sigma-AldrichB2261
Iodure de propidium (PI)Sigma-AldrichP4170
Tampon de lyse des globules rougesBeyotimeC3702
VerapamilSigma-AldrichV4629

Références

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Réimpressions et autorisations

Mots-clés

Coloration au Hoechst 33342cellules souches canc reusesisolement de cellules souchesefflux de coloranttransporteurs ABCcellules de la moelle osseuseexcitation laseriodure de propidium
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