Respirométrie à haute résolution dans une chambre de petit volume

Résumé

Ici, nous montrons que la chambre de 0,5 mL pour la respirométrie à haute résolution montre des résultats qui sont cohérents avec la chambre de 2,0 mL si une correction instrumentale appropriée du bruit de fond O₂ est appliquée. Il nécessite moins d’échantillon, ce qui est avantageux pour les études dont la disponibilité est limitée ou dont les capacités respiratoires sont faibles.

Résumé

L’étude des flux respiratoires est décisive pour comprendre l’interaction complexe entre les processus métaboliques. Les études sur des cellules et des tissus dont la disponibilité d’échantillons est limitée et où la fréquence respiratoire est faible peuvent bénéficier de petits volumes expérimentaux. Nous avons examiné si la chambre de 0,5 mL donne des résultats cohérents avec la chambre de 2,0 mL à des concentrations d’échantillon identiques à celles utilisées en respirométrie à haute résolution avec l’Oroboros. Le flux de fond O₂ était 4 fois plus élevé dans les chambres de 0,5 ml que dans les chambres de 2,0 ml à saturation en air, mais était reproductible, ce qui permettait une correction précise de l’arrière-plan. La vitesse d’agitation optimale se situait entre 550 rotations par minute (tr/min) et 750 tr/min dans la chambre de 0,5 ml. Les flux respiratoires dans les cellules vivantes, les cellules perméabilisées et les mitochondries isolées ont été mesurés en parallèle dans les chambres de 0,5 ml et de 2,0 ml, à l’aide de protocoles de titrage substrat-découpleur-inhibiteur avec 14 à 20 titrages. Les flux O₂ dans les différents types de chambres étaient identiques dans les limites de détection. La chambre de 0,5 ml, qui nécessite près de quatre fois moins d’échantillons que la chambre de 2,0 ml, offre un avantage significatif pour les études avec des quantités limitées d’échantillons ou de faibles capacités respiratoires.

Introduction

L’étude des voies respiratoires mitochondriales est essentielle pour faire la lumière sur les mécanismes métaboliques sous-jacents à diverses maladies, au vieillissement ou aux réponses au stress, fournissant ainsi des cibles potentielles pour des interventions thérapeutiques et améliorant les capacités de diagnostic ^1,2,3. La respirométrie à haute résolution (HRR) permet une analyse détaillée de la voie mitochondriale et du contrôle du couplage dans la phosphorylation oxydative (OXPHOS) à travers une variété de types d’échantillons et de préparations⁴. Le volume de la chambre expérimentale est une caractéristique fondamentale de la conception des instruments respiratoires. Le volume de la chambre précédemment établi est de 2,0 mL dans l’Oroboros. Ce volume a été optimisé pour entraîner un faible flux de fond instrumental O₂ et assurer l’homogénéité du milieu agité. Ce sont là quelques-uns des critères de qualité clés pour une mesure précise de la respiration dans des conditions de faible teneur en oxygène et d’hyperoxie requises pour la cinétique de l’oxygène mitochondrial et les fibres musculaires perméabilisées, respectivement 5,6,7,8,9. De plus, plusieurs insertions multicapteurs¹⁰ nécessitent l’espace de la chambre de 2,0 ml (tableau 1).

Dans la présente étude, nous avons examiné la faisabilité de réduire le volume de la chambre pour la HRR de 2,0 mL à 0,5 mL. Peut-on appliquer un nombre de cellules ou des quantités de tissu plus faibles dans des tests respiratoires dans une chambre plus petite sans compromettre la précision ? Il est important de clarifier cette question pour l’étude des biopsies de tissus et de liquides humains, des cellules primaires et des cultures cellulaires à croissance lente¹. De même, une réduction du volume de la chambre est potentiellement avantageuse dans les études d’échantillons à faible activité respiratoire dans les mitochondries défectueuses¹¹ et les voies mitochondriales avec des capacités intrinsèquement faibles, telles que l’oxydation des acides gras dans le cerveau¹². Cependant, la résolution peut être diminuée à une chambre de faible taille en raison de l’augmentation disproportionnée des artefacts de rétrodiffusion de O₂ et d’un étalonnage de volume imprécis^13,14. Par conséquent, nous avons analysé la performance instrumentale de l’Oroboros avec la chambre de petit volume (sV) calibrée à un volume expérimental minimal de 0,5 mL, par rapport à la chambre de volume classique (cV) calibrée à 2,0 mL. En particulier, nous avons analysé le fond instrumental O₂ flux et la vitesse d’agitation optimale.

Les protocoles de titrage substrat-découpleur-inhibiteur (SUIT) sont utilisés pour évaluer les fréquences et les états respiratoires dans l’analyse OXPHOS. Les protocoles SUIT comprenaient 14 à 20 titrages par test respiratoire et impliquaient des flux respiratoires d’O₂ allant de quelques pmol∙^s-1∙^mL-1 à des centaines de pmol∙^s-1∙^mL-1. Les états de couplage-contrôle comprennent le taux de fuite L, c’est-à-dire la composante dissipative de la respiration, qui n’est pas disponible pour phosphoryler l’adénosine-5'-diphosphate (ADP) en adénosine-5'-triphosphate (ATP) et résulte d’une fuite de protons, d’un glissement de protons, d’un cycle cationique et d’une fuite d’électrons. La capacité P d’OXPHOS rend compte de la respiration des mitochondries lorsque le transfert d’électrons mesuré par la consommation de O₂ (oxydation) est couplé à la synthèse d’ATP (phosphorylation) en présence d’ADP. La capacité de transfert d’électrons E à l’état découplé est quantifiée par des titrages d’un protonophore en présence de substrats mitochondriaux¹⁵. La consommation résiduelle d’oxygène rox est déterminée après l’ajout de la roténone et de l’antimycine A, inhibiteurs du complexe I et du complexe III.

Nous avons mesuré la respiration des cellules et des préparations mitochondriales dans les chambres s sV et cV. Les plaquettes sont des fragments cytoplasmiques anucléés de mégacaryocytes et représentent une source facilement accessible de mitochondries humaines. Par conséquent, les plaquettes ont été appliquées comme modèle pour des cellules vivantes (ou des particules cellulaires) avec des membranes plasmiques intactes. La respiration des cellules sanguines sert de biomarqueur des maladies mitochondriales systémiques et est corrélée avec la valeur bioénergétique des organes métaboliquement actifs 16,17,18,19, bien que ces résultats ne puissent pas être généralisés 20,21,22^. Les fibroblastes humains ont été choisis pour leur application en tant que modèle cellulaire de la dysfonction mitochondriale 1,23,24,25. L’intégrité des membranes plasmiques est nécessaire à la viabilité cellulaire, mais sa perméabilisation sélective permet l’échange de molécules entre le cytosol et le milieu environnant. Par conséquent, les fibroblastes avec des membranes plasmiques chimiquement perméabilisées ont été étudiés comme exemple de cellules perméabilisées, par rapport aux mitochondries isolées utilisées pour évaluer la fonction mitochondriale et nécessaires pour séparer les sous-populations mitochondriales^26,27.

Protocole

Pour l’étude sur les plaquettes humaines, huit volontaires ont fourni un consentement éclairé écrit pour participer à l’étude, qui a été approuvé par l’Autorité suédoise d’examen éthique (n° 2013/181). Deux lignées cellulaires de fibroblastes de peau humaine provenant de nouveau-nés de sexe masculin ont été achetées à l’ATCC et utilisées conformément à l’approbation éthique du ministère de la Santé de la République tchèque (projet : AZV MZ CR NU22-07-00474). Les procédures impliquant des souris ont été menées conformément à la loi autrichienne sur l’expérimentation animale et à la Convention européenne pour la protection des animaux vertébrés utilisés à des fins expérimentales ou à d’autres fins scientifiques (Tierversuchsgesetz 2012 ; la directive 2010/63/UE ; BMWFM-66.011/0128-WF/V/3b/2016). Le principe des 3R a été appliqué pour minimiser le nombre d’animaux de laboratoire.

1. Étalonnage du volume

1. Montez les chambres de petit volume (sV) ou les chambres de volume classique (cV) sur l’Oroboros (Figure 1A,B ; Tableau 1).
2. Allumez l’Oroboros et connectez-vous à DatLab.
3. Séchez les chambres.
4. Pipeter 0,54 mL de H₂O dans leV s (volume expérimental effectif de 0,50 mL plus volume mort capillaire de 0,04 mL) ou 2,07 mL de H₂O dansle V c (volume effectif de 2,00 mL plus volume mort capillaire de 0,07 mL).
   REMARQUE : Pour éviter toute perte de liquide entre le haut du cylindre en verre et le support de chambre en polyoxyméthylène (POM), insérez la pointe de la pipette suffisamment profondément pour toucher la paroi de la chambre en verre.
5. Allumez les touillettes.
6. Avant de fermer la chambre, humidifiez les joints toriques des bouchons tout en gardant leur capillaire sec. Desserrez les bagues d’étalonnage du volume et insérez les bouchons vers le bas jusqu’à ce que le liquide remplisse le capillaire du bouchon et qu’une petite goutte apparaisse dans le récipient à l’extrémité supérieure du capillaire (tableau 1).
7. Serrez les bagues d’étalonnage du volume pour fixer leur position de sorte que le volume calibré soit obtenu par insertions consécutives des bouchons.

2. Réglage général d’Oroboros

1. Démarrez le logiciel DatLab .
2. Réglez la température expérimentale (37 °C) et la vitesse de rotation de l’agitation à 550 tr/min (9,2 Hz ou rotations par s) dans la chambre sV ou 750 tr/min (12,5 Hz) dans la chambre cV. Réglez l’intervalle d’échantillonnage des données à 2 s avec un lissage sur 80 s (40 points de données) dans les tests de fond instrumentaux O₂ ou 40 s (20 points de données) pour la respirométrie.
   REMARQUE : Les barres d’agitation magnétiques (AlNiCo revêtues de difluorure de polyvinylidène [PVDF] ; Tableau 1) sont agités par un champ magnétique rotatif pulsé d’une intensité de champ de 3,5 mT au niveau de l’agitateur dans la chambre.
3. Effectuer l’étalonnage de l’air²⁸ dans MiR05 ou dans le même milieu d’incubation que celui utilisé dans les expériences ultérieures.
4. Effectuez des étalonnages d’oxygène zéro de temps en temps, mais jamais immédiatement avant de commencer les expériences.
   1. Préparez une solution mère de Na-dithionite fraîche en dissolvant la poudre O_2-Zero dans un tampon phosphate de 50 mM (pH 8,0) à une concentration de 2,5 mM ou 10 mM pour les chambres s sV ou cV , respectivement.
   2. Titrer la Na-dithionite en excès pour obtenir le signal brut R0 ou courant nul [μA] à O₂ concentration 0 μM^14,28.

3. Test de fond O₂ instrumental

1. Chambre sV
   1. Après l’étalonnage de l’air, fermez la chambre. Surveiller le signal d’oxygène pendant environ 60 minutes jusqu’à ce que la concentration en O₂ diminue de la saturation de l’air à environ 150 μM. Fixer quatre repères J°₁ à J°₄ sur le graphique « O₂ pente négative ».
      REMARQUE : Effectuez ce test de fond instrumental O₂ tous les jours avant de commencer une expérience.
   2. FACULTATIF : À l’aide d’une seringue Hamilton, titrer la Na-dithionite préparée selon l’étape 2.4.1 pour atteindre_{une concentration en} O2 de 100 μM (figure 1C).
      REMARQUE : Dans un autre protocole, la na-dithionite est titrée dans la chambre à l’aide de la micropompe de titrage-injection (TIP2k ; Figure supplémentaire 1 et Figure supplémentaire 2) pour comparaison avec une méthode standard de détermination du fond instrumental O₂ flux²⁸.
2. Chambre cV
   1. Après le calibrage de l’air, fermez la chambre, attendez la stabilisation de la pente O₂, et réglez le repère J°₁ sur le tracé 'Pente O2 neg.'²⁸. À l’aide d’une seringue Hamilton, titrer la Na-dithionite préparée selon l’étape 2.4.1. par paliers de 0,7 μL pour correspondre au régime d’oxygène de la chambre ss V et abaisser la concentration de O₂ à 150 μM.
   2. Ajoutez une autre étape de titrage de Na-dithionite (environ 7 μL) pour abaisser la concentration d’O₂ à 100 μM (Figure 1D).
3. Analyse des données de fond de l’Instrumental O₂
   1. Calculez la pente de fond instrumentale O₂ dans DatLab²⁸. Sélectionnez Flux/Pente dans le menu supérieur.
   2. Ouvrez la fenêtre de correction d’arrière-plan O₂. Sélectionnez Fichier actif comme source de l’arrière-plan O₂ et sélectionnez les repères J° à utiliser pour le calcul de la régression linéaire. Appliquez la correction d’arrière-plan O₂.

Figure 1 : Chambres de petit volume (sV) et de volume classique (cV) et test de fond instrumental O₂. (A)Chambre c. B) Chambre cV. (C) Traces représentatives de pente négative et marques J°₁, sV (0,5 mL ; vert) et cV (2,0 mL ; bleu). (D) Concentration d’oxygène correspondante et marques R1. Trois titrages manuels de Na-dithionite (environ 0,7 μL, 10 mM ; cV) et un titrage final de 7,0 μL de 2,5 mM et 10 mM dans les chambres s sV et cV, respectivement. Les pics causés par les titrages ont été éliminés. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

4. Ajout d’échantillon aux chambres d’Oroboros

REMARQUE : L’échantillon peut être ajouté dans la chambre par deux méthodes : le remplacement partiel du volume (plaquettes et fibroblastes dans la présente étude) ou le remplacement complet du volume (mitochondries isolées dans la présente étude).

1. Remplacement partiel du volume
   1. Retirez le bouchon complètement inséré. Pipeter et jeter un volume V_de MiR05. V_out est de 60 à 70 μL pour les plaquettes et de 80 à 150 μL pour les fibroblastes, calculée en fonction des concentrations cellulaires dans la suspension cellulaire.
   2. Pour l’équivalent de V_out, pipeter le même volume V_J.i de suspension de cellules mères (avec la concentration cellulaire connue) dans la chambre (Figure 2).
   3. Calculez la concentration de la cellule expérimentale dans le volume réel V' (0,54 mL et 2,07 mL), supérieure au volume expérimental efficace V (0,5 mL et 2,0 mL).
      REMARQUE : Les concentrations de la suspension de la cellule mère et de la concentration de la cellule expérimentale doivent être planifiées de manière à obtenir des volumes de V_J.i = V_sortant qui soient compatibles avec une petite erreur de titrage. Dans les expériences avec les plaquettes, un prototype de bouchon a été utilisé pour la chambreV avec un volume mort capillaire de 0,05 mL.
2. Remplacement complet du volume
   1. Siphonnez tout le milieu de la chambre et remplacez-le par au moins 0,54 mL ou 2,07 mL de solution mère de mitochondries isolée à la concentration de l’échantillon expérimental dans les chambres s sV ou cV, respectivement.
   2. Fermez la chambre et siphonnez l’excès de solution mitochondriale du réceptacle du bouchon.
      REMARQUE : Le remplacement complet du volume exclut toute variabilité de la concentration mitochondriale qui peut être provoquée par le titrage dans la chambre fermée à travers le capillaire bouchon avec une seringue Hamilton. Cette dernière méthode s’applique aux échantillons de petit diamètre préparés dans des suspensions mères concentrées (p. ex., mitochondries isolées) ; cependant, il expose les cellules fragiles à des dommages potentiels des membranes plasmiques par les forces de cisaillement exercées dans l’aiguille de 51 mm de long de la seringue de Hamilton (0,41 mm de diamètre intérieur). Ceci est évité en retirant le bouchon et en pipetant l’échantillon dans la chambre par remplacement partiel ou complet du volume. Trois types de préparations mitochondriales ont été étudiés. Les préparations d’échantillons sont décrites dans le Dossier supplémentaire 1 1,26,29,30.
3. Cellules vivantes : plaquettes humaines
   1. Insérez les cryoflacons contenant les plaquettes dans un bain-marie à 37 °C et décongelez le contenu jusqu’à ce qu’il ne reste plus que de glace.
   2. Ouvrez les cryoflacons et ajoutez 1 ml de fluide préchauffé (DPBS + 10 mM EGTA, 37 °C) lentement par gouttes.
   3. Mélangez délicatement les plaquettes et transférez-les dans un tube à centrifuger de 50 ml avec un volume total de 10 ml de milieu préchauffé (DPBS + 10 mM EGTA, 37 °C). Centrifugeuse à 1000 g pendant 10 min à température ambiante (RT) à l’aide d’un rotor pivotant (accélération 6, frein 2).
   4. Remettre les plaquettes en suspension dans 0,25 mL de DPBS + 10 mM EGTA (RT) et les ajouter dans les chambres par remplacement partiel du volume jusqu’à une concentration cellulaire expérimentale initiale allant de 157 · 10⁶ à 210 · 10⁶ x·^mL-1 dans la chambre de 0,5 mL et à partir de 164 · 10⁶ à 220 · 10⁶ x·^mL-1 dans la chambre de 2,0 mL (voir³¹ pour plus de détails sur l’unité élémentaire x).
      REMARQUE : Un Oroboros était équipé des chambres sV et cV aux positions A et B, respectivement, utilisées en parallèle, tandis qu’un autre Oroboros était équipé des chambres sV et cV aux positions B et A, respectivement.
4. Cellules perméabilisées : fibroblastes humains
   1. Ajouter les cellules aux chambres Oroboros par remplacement partiel du volume jusqu’à une concentration nominale de cellules de 0,75 · 10⁶ x·^mL-1 dans les deux types de chambres et calculer la concentration réelle (étape 4.1.3).
      REMARQUE : Différents instruments Oroboros ont été utilisés en parallèle, chacun équipé des chambres s sV ou cV .
5. Mitochondries isolées : cœur de souris
   1. Ajoutez 15 μL de suspension mitochondriale à 5985 μL de milieu de respiration mitochondriale (MiR05), ce qui permet d’obtenir une concentration de protéines mitochondriales de base allant de 0,013 à 0,026 mg∙^mL-1.
   2. Ajouter la suspension mitochondriale dans les chambres d’Oroboros par remplacement complet du volume.
      REMARQUE : Un Oroboros était équipé des chambres sV et cV dans les positions A et B, respectivement, utilisé en parallèle avec un autre Oroboros équipé des chambres s sV et cV dans les positions B et A, respectivement.

Figure 2 : Ajout de la suspension cellulaire par remplacement partiel du volume. (A) l’ajout dans la chambre de 0,5 mL sV et (B) la chambre de 2,0 mL cV. (1) Chambre fermée avec volumes de milieu respiratoire V et bouchon capillaire V _stc rempli, pour la mesure du fond instrumental O₂ flux J_O2°. (2) Le bouchon a été retiré, V_stc a été drainé dans la chambre, ce qui a donné un volume total V' = V+V_stc. (3) Suppression partielle du milieu V_out = -V _J.i. Un volume V''= V'+V_out reste dans la chambre. (4) Pipetage d’un sous-échantillon avec le volume V _J.i de suspension cellulaire respirométrique dans la chambre, ce qui permet d’obtenir un volume total V^# = V+V_stc de suspension cellulaire diluée. (5) Chambre fermée avec capillaire à bouchon rempli (volume mort V_stc) pour la mesure du flux O₂ spécifique au volume J,_{V, O2} dans un volume expérimental V. Cette figure a été modifiée de la figure 2A dans Numération cellulaire et normalisation dans HRR⁴¹. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

5. Protocoles SUIT

1. Titrer les solutions mères des produits chimiques énumérés dans le tableau supplémentaire 1 dans les chambres à l’aide de microseringues Hamilton, en ajustant les volumes de titrage pour obtenir les mêmes concentrations expérimentales dans les chambres s sV et cV (voir les légendes des figures 6, 8 et 10).
2. Sélectionnez le protocole SUIT-003_D018 ^32,33 (pour les plaquettes dans la présente étude).
3. Sélectionnez les protocoles SUIT-001_D004 4,15,34,35 et SUIT-002_D007 ^4,15,35,36 (pour les fibroblastes dans la présente étude).
4. Sélectionnez le protocole SUIT-002_D005 4,15,35,37 (pour les mitochondries isolées dans la présente étude).

6. Analyse des données SUIT

1. Dans DatLab, définissez des repères pour définir des sections des tracés sélectionnés.
2. Sélectionnez Flux/Pente dans le menu supérieur. Ouvrez la fenêtre Flux/Pente . Appliquer la correction du volume de titrage pour la dilution des échantillons en suspension par chaque titrage dans le protocole SUIT.
3. Sélectionnez Marques dans le menu supérieur. Ouvrez Statistiques de repère pour afficher la médiane des points de données marqués corrigée de la ligne de base par soustraction de la consommation d’oxygène résiduelle (rox).
4. Calculez l’ordonnée à l’origine et la pente entre les résultats appariés obtenus dans les chambres s sV et cV par analyse de régression inversée^25,28 à l’aide d’une feuille de calcul.
5. Comparez les fréquences respiratoires à l’état rox (flux minimum O₂) dans les chambres s sV et cV par un test t de Student apparié à l’aide du logiciel jamovi 2.3.13³⁸.
   REMARQUE : Étant donné que les deux chambres d’un instrument Oroboros sont fonctionnellement indépendantes (à l’exception de la température et des intervalles d’enregistrement DatLab), les mesures dans chaque chambre peuvent être considérées séparément, comme si vous utilisiez des instruments différents. Les résultats finaux peuvent être présentés sous forme de médianes ou de moyennes de plusieurs chambres avec des informations sur leur variabilité.

Résultats

Les signaux bruts R1 [μA] des capteurs d’oxygène (POS) devraient être indépendants du volume de la phase aqueuse en équilibre avec la phase gazeuse de l’air dans la chambre « ouverte », comme l’a confirmé la Tableau supplémentaire 2. Dans la chambre fermée, cependant, l’arrière-plan instrumental O₂flux proche de la saturation de l’air J°₁[pmol∙s^-1∙mL^-1] dépend du volume V (Tableau supplémentaire 2). L’O₂Consommation du capteur [pmol∙s^-1] peut être prédit à partir du flux d’électrons mesuré comme le signal brut corrigé du zéro R1-R0 [μA], le nombre de charge 4 e^-/O₂et la constante de Faraday F = 96 485,33 C∙mol^-1. 1 μA équivaut à un flux d’électrons (e^-) de 10,36 pmol∙s^-1. En divisant par le numéro d’accusation, on obtient un O₂couler^15,39 de 2,591 pmol∙s^-1·μA^-1. La médiane enregistrée de R1-R0 était de 2,09 μA et de 1,98 μA dans les chambres de 0,5 mL et de 2,0 mL, respectivement (Tableau supplémentaire 2; R0 = 0,006 ± 0,007 μA dans le sV et R0 = 0,004 ± 0,003 μA dans le cV chambres), correspondant théoriquement à O₂Taux de consommation de 5,41 pmol∙s^-1et 5,13 pmol∙s^-1. L’O₂Le débit du capteur est converti en flux spécifique au volume attendu à la saturation de l’air (J°_R1) en 5,41 pmol∙s^-1/0,5 mL = 10,82 pmol∙s^-1∙mL^-1et 5,13 pmol∙s^-1/2,0 mL = 2,56 pmol∙s^-1∙mL^-1dans les annéesV et cV chambre, respectivement. Avec le même type de capteurs d’oxygène polarographiques dans les chambres de 2,0 ml et 0,5 ml, l’arrière-plan spécifique au volume O₂flux - calculé à partir du courant R1-R0 (J°_R1) - augmente théoriquement de 4 fois en proportion inverse du volume de la chambre. J°_air (à saturation en air, où la rétrodiffusion est nulle ; comparer Table 2 et Tableau supplémentaire 3) a été calculée pour le O₂concentration à saturation en air à partir de la régression linéaire de l’essai expérimental de fond (Graphique 3). J°_air s’est approché des valeurs théoriquement attendues J°_R1 pour les deux chambres (Table 2). Le J°_air / J°_R1était de 0,85 ± 0,04 et de 0,92 ± 0,12 dans leV et cV chambre, respectivement, conformément à une série indépendante de 52 mesures dans la chambre de 2,0 mL, dans laquelle ce rapport était de 0,95 ± 0,12 (Tableau supplémentaire 4). J°_air était 3,9 fois plus élevée dans la chambre de 0,5 ml que dans la chambre de 2,0 ml. Le net O₂Diffusion arrière J°₅₀, calculé à 50 μM O₂de la régression linéaire de l’essai expérimental de fond, n’était que trois fois plus élevée dans la chambre de 0,5 mL (Table 2). La variabilité du fond instrumental O₂les flux étaient presque identiques dans les deux volumes de chambre différents, avec un écart-type (ET) de 0,5 et 0,3 pmol∙s^-1∙mL^-1pour J°_air et 0,9 et 0,8 pmol∙s^-1∙mL^-1 pour J°₅₀dans les annéesV et cV chambre, respectivement (Table 2). Malgré le fond instrumental plus élevé O₂pentes dans la chambre de 0,5 mL, la dépendance du bruit de fond O₂flux sur c_O2était hautement reproductible dans les deux types de chambres (Figure 3D). Il en résulte de faibles valeurs des valeurs résiduelles <±1 pmol∙s^-1∙mL^-1pour les deux chambres (Tableau supplémentaire 5), conformément à la limite de détection de l’Oroboros²⁸.

Nous avons quantifié l’effet de la vitesse d’agitation sur le signal brut d’étalonnage R1 du POS entre 350 tr/min (5,8 Hz) et 950 tr/min (15,8 Hz) par pas de 100 tr/min (1,7 Hz) avec la chambre en configuration 'ouverte'. Dans cette configuration, l’O₂ dissous dans le milieu est en équilibre avec la phase gazeuse ; par conséquent, les variations du signal brut (microampères [μA]) en fonction de la vitesse d’agitation ne reflètent pas les différences réelles de c_O2. Les capteurs d’oxygène ont réagi à un changement de vitesse d’agitation par un léger écart par rapport à R1 à la vitesse par défaut de 750 tr/min, indépendamment du volume de la chambre (Figure 4). Dans la configuration « ouverte », le bruit de la pente O₂, défini comme SD pour chaque pas après stabilisation du signal, était le plus faible à 850 tr/min dans les deux types de chambres et augmentait lorsque la vitesse d’agitation s’écartait de cette valeur dans un sens ou dans l’autre (Figure 5A). En dessous de 550 tr/min, le bruit de la pente O₂ dépassait le seuil de ±4 pmol∙^s-1∙^mL-1, définissant la vitesse minimale d’agitation pratique. En raison de limitations techniques, la limite supérieure n’a pas été atteinte, ce qui fait que la vitesse d’agitation maximale pratique est de 950 tr/min (figure 5A). Dans cette plage, l’écart entre le signal O₂ et R1 était de <2,5 %. La fermeture des chambres n’a pas modifié la relation entre le bruit et la vitesse d’agitation (Figure 5B). La constante de temps exponentielle τ était de 2,53 ± 0,05 s à 550 tr/min et de 2,50 ± 0,05 s à 750 tr/min pour la chambre de 0,5 mL (figure supplémentaire 3).

Le protocole SUIT-003_D018 appliqué aux plaquettes comprend jusqu’à 14 étapes de titrage. Il est conçu pour étudier le contrôle du couplage des cellules vivantes, ce, et la perméabilité de la membrane plasmique en tant qu’indice de viabilité cellulaire³². Le débit d’oxygène mesuré dans les deux types de chambres (figure 6) était étroitement adapté dans tous les états respiratoires (figure 7). Des réoxygénations intermittentes sont nécessaires pour éviter l’hypoxie fonctionnelle ou limiter la concentration expérimentale d’O₂ à une plage définie. Les réoxygénations ont été effectuées en ouvrant la chambre en position « ouverte » après le titrage de Rot. À la fermeture de la chambre, le flux d’O₂ s’est stabilisé en 4 minutes dans la chambre de 2,0 ml, mais il a fallu environ 10 minutes dans la chambre de 0,5 ml avant de stabiliser et d’établir le nouveau repère (figure 6 et figure supplémentaire 4). La réoxygénation à l’état rox lorsque les flux d’O₂ sont faibles permet d’éviter une baisse de la concentration en O₂ pendant le temps nécessaire à la stabilisation. Le rox inhibé par la roténone était de 0,9 ± 0,6 et de 2,0 ± 0,6 pmol∙^s-1∙^mL-1 à 98 ± 17 et 94 ± 17 μM O₂ (± SD moyen) dans les chambres s sV et cV, respectivement. Rox a augmenté de 3,1 ± 0,9 et 0,9 ± 0,4 pmol∙^s-1∙^mL-1 lors de la réoxygénation à 159 ± 8 et 147 ± 11 μM O₂ dans les chambres s sV et cV, respectivement. La dépendance à l’oxygène de rox observée dans les plaquettes est en accord avec les résultats obtenus sur les fibroblastes humains et les cellules endothéliales de la veine ombilicale⁴⁰.

Pour l’analyse d’OXPHOS dans les fibroblastes perméabilisés, nous avons utilisé deux protocoles SUIT avec jusqu’à 17 et 20 étapes de titrage (SUIT-001 et SUIT-002, respectivement³⁵ ; Figure 8) ; ainsi, la correction du volume de titrage est particulièrement importante puisqu’à la fin de SUIT-002, la dilution s’élevait au maximum à 14 % et 10,5 % dans les chambres s sV et cV, respectivement. Des numérations de cellules de fibroblastes de 0,35,10⁶ x et de 1,44,10⁶ x dans les chambres de 0,5 mL et de 2,0 mL, respectivement, ont donné la même concentration cellulaire de 0,75,10⁶ x∙^mL-1. La combinaison de SUIT-001 et de SUIT-002 a porté sur 20 états respiratoires, qui étaient tous étroitement corrélés dans les types à deux chambres (r² = 0,950 pour SUIT-001 et r² = 0,959 pour SUIT-002). Dans les deux protocoles, le Complexe IV avait une diffusion relativement élevée (Figure 9). La réoxygénation n’a pas été nécessaire dans SUIT-001 à partir d’un faible flux d’O₂ spécifique au volume de 18,7 ± 7,0 pmol∙^s-1∙^mL-1 à l’état de routine (moyenne ± SD), ce qui a permis à la concentration d’O₂ de diminuer à 56 μM jusqu’à la section du protocole liée au CIV (Figure 8A ; 8Ama). Cependant, dans l’étude SUIT-002, la réoxygénation a été effectuée avant les titrages du découplage, ce qui a permis d’augmenter la concentration d’O₂ de 100 μM à 180 μM (Figure 8B ; 6Gp). Compte tenu du long temps nécessaire à la stabilisation du flux après réoxygénation, la réoxygénation lors des titrages de découplage doit être évitée.

Un protocole SUIT raccourci a été appliqué à des mitochondries isolées (Figure 10). La concentration en protéines mitochondriales a été déterminée après le test respiratoire, ce qui rend impossible de définir à l’avance la concentration précise de l’échantillon dans la chambre. Le flux respiratoire spécifique au volume varie en fonction de la concentration mitochondriale. Par conséquent, les données ont été présentées sous forme de flux spécifiques au volume et à la masse protéique (figure 11). Les deux représentations montrent la corrélation étroite entre les mesures obtenues dans les chambres de 0,5 mL et de 2,0 mL (figure 11).

Le rox de consommation d’oxygène résiduel mesuré après inhibition du complexe III par l’antimycine A peut être utilisé comme indice de performance instrumentale à des fréquences respiratoires très basses. Dans toutes les séries expérimentales, rox était comparable entre les chambres de 0,5 mL et de 2,0 mL (plaquettes : t₍₅₎ = -0,34, p = 0,74 ; fibroblaste : SUIT-001 : t₍₁₀₎ = 20,00, p = 0,06 ; SUIT-002 : t₍₁₀₎ = 11,00, p = 0,96 ; Mitochondries isolées : t₍₄₎ = -1,18, p = 0,27). La dispersion des données correspondait en grande partie à l’incertitude instrumentale de ±1 pmol∙^s-1∙^{mL-1 13,28}, comme illustré à la figure 12. Les fichiers originaux sont disponibles en libre accès dans le dépôt Zenodo : 10.5281/zenodo.11634408. 

Figure 3 : Fond instrumental du flux O₂ pour la chambre s sV (0,5 mL ; vert et noir) et cV (2,0 mL ; bleu). O₂ : plage de concentration allant de la saturation en air (environ 180 μM) à environ 50 μM. Symboles ouverts : O₂ : concentrations obtenues sans Na-dithionite. Symboles solides : Concentrations en O₂ contrôlées par titrages manuels de Na-dithionite. Cercles noirs : concentrations d’O₂ contrôlées par titrage de Na-dithionite à l’aide du TIP2k dans la chambre de 0,5 mL (N = 8). Les résultats des essais instrumentaux de fond ont été regroupés à partir de (A) la série 1 (sV : N = 2 ; cV : N = 2) avant d’utiliser des cellules vivantes (ce) ; (B) Série 2 (sV : N = 38 ; cV : N = 50) avant d’utiliser des cellules perméabilisées (pce) ; (C) Série 3 (sV : N = 10 ; cV : N = 10) avant d’utiliser des mitochondries isolées (imt). (D) Données superposées des panneaux A à C. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Effet de la vitesse de rotation de l’agitation sur le signal POS à la saturation en air (chambre « ouverte ») dans la chambre de 0,5 mL (vert) et la chambre de 2,0 mL (bleu). Réponse [ %] par rapport aux signaux d’étalonnage de l’air corrigés R0 R1-R0 [μA] à 750 tr/min (sV : N = 4 ; cV : N = 4). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Bruit de la pente O₂ en fonction de la vitesse de rotation de l’agitation. Bruit exprimé en écart-type dans (A) chambre « ouverte » ; (B) chambre fermée (0,5 ml, vert ; 2,0 ml, bleu). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6 : Consommation d’O2 de plaquettes humaines cryoconservées dans la chambre de 0,5 mL. Traces représentatives de la concentration d’O₂ [μM] (lignes bleues) et du débit d’O₂ par cellule [amol∙^s-1∙^x-1] calculées comme le flux d’O₂ [pmol∙^s-1∙^mL-1] divisé par la concentration cellulaire de 157∙10⁶ x∙^mL-1 (lignes rouges, corrigées pour le flux d’O₂ de fond instrumental ; les pics causés par les titrages ont été éliminés). La concentration en O₂ a été maintenue au-dessus de 50 μM par des réoxygénations intermittentes (air, chambre « ouverte », teinte bleue). Séquence des états respiratoires (titrages et cadences ; protocole SUIT-003_D018) : ce1, respiration de routine R des cellules vivantes. ce1P, pyruvate 5 mM comme substrat externe. ce2Omy10 (panneau A), titrages Omy par pas de 5 nM ; fuite respiration L. ce3U0,3 (panneau A) et ce3U0,1 (panneau B), titrages de découplage à une concentration CCCP optimale de 0,3 et 0,1 μM, respectivement ; ET capacité E. ce3Glc, glucose 11 mM ; E progressivement inhibé par le découplage. ce4Rot, roténone 0,5 μM inhibiteur de l’IC ; Consommation d’oxygène résiduel Rox. ce5S, succinate 10 mM ; stimulation de l’E dans les cellules perméables à la membrane plasmique. 1Dig15 (panneau A) et 1Dig10 (panneau B), titrages de digitonine par paliers de 5 μg·^mL-1 jusqu’à des concentrations optimales de 15 et 10 μg·^mL-1, respectivement pour une perméabilisation complète de la membrane plasmique ; capacité ET de la voie succinate S_E. 1c, cytochrome c 10 μM ; Test de l’intégrité de la membrane externe mitochondriale. 2Ama, antimycine A 2,5 μM inhibiteur de l’ICII ; rox. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7 : Corrélation de la respiration de plaquettes humaines cryoconservées mesurées dans les chambres de 0,5 mL et de 2,0 mL. Le débit d’O₂ corrigé au Rox a été évalué dans le protocole SUIT-003_D018 (Figure 6) ; N = 6. (A) Avec l’oligomycine Omy ; (B) sans Omy. Pentes moyennes et points de régression des moindres carrés inversés et coefficients de détermination r² calculés à partir de toutes les données. Les lignes noires pointillées représentent les lignes identitaires. Les lignes rouges représentent les lignes de régression calculées. Les flux d’O₂ dans l’état après l’ajout de glucose ont été exclus (voir Figure 6). Les protocoles avec et sans oligomycine sont séparés dans les panneaux A et B pour éviter le chevauchement des points de données. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 8 : Consommation de fibroblastes d’O₂ dans la chambre de 0,5 mL. Traces représentatives de c_O2 (lignes bleues [μM]) et de flux O₂ par cellule calculées comme le flux O₂ [pmol∙^s-1∙mL-1] divisé par la concentration cellulaire (0,75·10⁶ x∙^mL-1), corrigées pour le flux O₂ de fond instrumental (les lignes rouges, les pointes causées par les titrages ont été éliminées). La concentration en O₂ a été maintenue au-dessus de 50 μM par des réoxygénations intermittentes (air, chambre « ouverte », teinte bleue). Séquence des états respiratoires (titrages et fréquences). (A) Protocole SUIT-001_D004 : ce1, respiration de routine R. +Dig, digitonine 10 μg·^mL-1 (ce à pce), respiration endogène résiduelle ren. 13h, pyruvate 5 mM et malate 2 mM ; Voie N fuite respiration N_L. 2D, ADP 2,5 mM ; N-voie OXPHOS capacité N_P. 2c, cytochrome c 10 μM ; Test de l’intégrité de la membrane externe mitochondriale. 3U1.5, titrages de découpleur à la concentration optimale CCCP 1,5 μM ; Capacité ET liée au NADH N_E. 4G, glutamate 10 mM ; N(PGM)_E. 5S, succinate 10 mM ; NS-pathway ET capacité NS_E. 6Rot, roténone 0,5 μM ; capacité ET de la voie succinate S_E. 7Gp, glycérophosphate 10 mM ; SGp_E. 8Ama, antimycine A 2,5 μM ; rox. 9AsTm, ascorbate 2 mM et TMPD 0,5 mM ; substrats pour la stimulation CIV ; La chambre a été maintenue ouverte pendant 20 minutes pour permettre l’équilibrage redox sans appauvrissement en oxygène⁴ ; O₂ flux hors échelle après la fermeture de la chambre (205 amol·^s-1·^x-1). 10Azd, azoture 100 mM ; Flux de fond chimique dépendant de l’oxygène CHB. (B) Protocole SUIT-002_D007 : ce1, R. +Creuser, ren. +D, stimulant ren. +M.1, malate 0,1 mM et 1Oct, octanoylcarnitine 0,5 mM ; Capacité d’OXPHOS du trajet F, F_P = J(1Oct)-J(+M.1). 1c. 2M2, malate 2 mM soutenant la voie N anaplérotique ; F(N)_P. 3P et 4G, activation progressive jusqu’à FN_P. 5S, FNS_P. 6Gp, FNSGp_P. 7U1.5, FNSGp_E. 8Rot, SGp_E. 9Ama, rox. 10AsTm O₂ flux hors échelle 207 amol·^s-1·^x-1. 11Azd, chb. En général, l’activité du complexe IV est la différence de taux, J(AsTm)-J(Azd) à des concentrations d’O₂ étroitement adaptées. Voir la figure 6 pour plus de détails. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 9 : Corrélation de la respiration des fibroblastes perméabilisés dans les chambres de 0,5 mL et de 2,0 mL. Débit d’O₂ corrigé au Rox dans (A) SUIT-001_D004 et (B) SUIT-002_D007 (N = 6). Pente moyenne et ordonnée à l’origine de la régression des moindres carrés inversés et coefficient de détermination r² calculés à partir de toutes les données. La ligne noire pointillée représente la ligne d’identité. Les lignes rouges représentent les lignes de régression calculées. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 10 : Consommation d’O₂ de mitochondries cardiaques de souris isolées dans des chambres de 0,5 mL (vert) et de 2,0 mL (bleu). Traces représentatives de (A) flux d’O₂ spécifique à la masse à une concentration de protéine mitochondriale de 0,023 mg∙^mL-1 (corrigée du flux d’O₂ de fond instrumental, les pics causés par les titrages ont été éliminés) et (B) concentration d’O₂ [μM]. Séquence des états respiratoires (titrations et fréquences) suivant le protocole SUIT-002_D005 : imt, respiration endogène résiduelle ren. +D, ADP 2,5 mM ; stimulant ren. +M.1, malate 0,1 mM et 1Oct, octanoylcarnitine 0,5 mM ; Capacité d’OXPHOS du trajet F, F_P = J(1Oct)-J(+M.1). 1c, cytochrome c 10 μM ; Test de l’intégrité de la membrane externe mitochondriale. 2M2, malate élevé 2 mM soutenant la voie N anaplérotique ; F(N)_P. 3P, pyruvate 5 mM ; FN_P. 4G, glutamate 10 mM ; FN_P. 5S, succinate 10 mM ; FNS_P. 6Gp, glycérophosphate 10 mM ; FNSGp_P. 7U0.5, titrage du découplage à la concentration optimale CCCP 0,5 μM ; FNSGp_E. 8Rot, roténone 0,5 μM inhibant l’IC ; SGp_E. 9Ama, antimycine A 2,5 μM inhibiteur de l’ICII ; Consommation d’oxygène résiduel Rox. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 11 : Corrélation de la respiration de mitochondries cardiaques de souris isolées mesurées dans les chambres de 0,5 mL et de 2,0 mL. O₂ flux dans le protocole illustré à la figure 10 (N = 4). (A) Flux O₂ spécifique au volume. (B) Flux d’O₂ corrigé au Rox divisé par la concentration en protéines mitochondriales (0,013 - 0,026 mg∙^mL-1). Pente moyenne et ordonnée à l’origine de la régression des moindres carrés inversés et coefficient de détermination r² calculés à partir de toutes les données. Les lignes noires pointillées représentent la ligne d’identité. Les lignes rouges représentent la ligne de régression calculée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 12 : Consommation résiduelle d’oxygène dans les chambres de 0,5 mL et de 2,0 mL. Flux par volume mesuré après l’ajout d’antimycine A, combiné à partir d’expériences avec des cellules vivantes (ce, carrés), des cellules perméabilisées (pce, cercles) et des mitochondries isolées (imt, triangles). Pente moyenne et ordonnée à l’origine de la régression des moindres carrés inversés. Ligne pointillée : ligne d’identité. Ligne rouge : ligne de régression calculée. Ombre : plage de résolution instrumentale. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Module	sV	cV
Chambre expérimentale volume V	0,5 mL	2,0 ml
Diamètre intérieur du cylindre de verre	12,0 millimètre	16,0 millimètre
Diamètre extérieur du cylindre de verre	24,0 millimètre	24,0 millimètre
Épaisseur de la paroi vitrée	6,0 millimètre	4,0 millimètre
Barre d’agitation revêtue de PVDF	11,5 x 6,2 millimètre	15,0 x 6,0 millimètre
Diamètre capillaire du bouchon	1,00 millimètre	1,30 millimètre
Section transversale capillaire du bouchon	0,79 millimètre2	1,33 millimètre2
Longueur capillaire du bouchon	50,64 millimètre	48,86 millimètre
Volume capillaire du bouchon	39,8 μL	64,9 μL
Bouchon capillaire volume mort Vstc comprenant une petite gouttea	0,04 mL	0,07 mL
Volume V' pour l’étalonnage du volume	0,54 ml	2,07 ml

^unLa chute doit correspondre à 5 μL pour la chambre cV et à près de 0 μL pour la chambre sV.
Tableau 1 : Dimensions des modules de petit volume (sV) et de volume classique (cV) avec bouchons en polyéther éther cétone (PEEK).

	J°air / [pmol∙s-1∙mL-1]		J°50 / [pmol∙s-1∙mL-1]
Chambre expérimentale volume V	0,5 mL	2,0 ml	0,5 mL	2,0 ml
Méchant	9.22	2.37	-3.17	-1.17
Médian	9.25	2.36	-3.08	-1.04
Écart type	0.49	0.34	0.93	0.83
Minimum	8.20	1.79	-5.11	-3.72
Maximum	10.41	3.42	-0.82	0.67

Tableau 2 : J°_air extrapolé à la saturation en air et J°₅₀ calculé à une concentration de 50 μM O₂ . Données regroupées d’essais de fond instrumental dans les séries 2 (pce) et 3 (imt) et avant les titrages TIP2k (0,5 mL : N = 48 ; TIP2k : N = 8 ; 2,0 mL : N = 60).

Dossier supplémentaire 1 : Préparations d’échantillons. Plaquettes humaines, fibroblastes humains et mitochondries isolés dans des cœurs de souris. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 1 : Test de fond O₂ instrumental à l’aide du TIP2k. Traces représentatives de l’essai réalisé à l’aide du TIP2k pour titrer la Na-dithionite (2,5 mM) dans la chambre de 0,5 mL. Fluide : MiR05, température : 37 °C, vitesse d’agitation : 750 tr/min. Les pics causés par les titrages ont été éliminés. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 2 : Fond instrumental O₂ flux J°₁ en fonction de la concentration de O₂ . Chambre sV (0,5 mL ; verte, N = 48) et Chambre cV (2,0 mL ; bleue, N = 60) dans les séries 2 (pce, cercles) et 3 (imt, triangles), et avant les titrages TIP2k dans la chambre de 0,5 mL (cercles noirs, N = 8). Lignes rouges : médiane ± écart-type. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 3 : Constante de temps exponentielle τ en fonction de la vitesse de rotation de l’agitation. Valeurs individuelles τ pour la chambre de 0,5 mL à 37 °C (N = 2). Dans la chambre de 0,5 mL, τ était de 2,53 ± 0,05 s à 550 tr/min, de 2,50 ± 0,05 s à 750 tr/min et de 2,47 ± 0,04 s à 850 tr/min. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 4 : Consommation_d’O2 de plaquettes humaines cryoconservées dans la chambre de 2,0 ml. Trace représentative du protocole SUIT-003_D018, y compris les titrages d’oligomycine (Omy). Le flux [pmol∙^s-1∙^mL-1] a été corrigé pour le fond instrumental O₂ flux et divisé par la concentration cellulaire (164∙10⁶ x∙^mL-1). Les pics causés par les titrages ont été éliminés. c_O2 a été maintenu au-dessus de 60 μM par des réoxygénations intermittentes (air, chambre « ouverte », teinte bleue). Séquence des états respiratoires (titrages et fréquences) : ce1, respiration de routine R des cellules vivantes. ce1P, pyruvate comme substrat externe. ce2Omy10, titrages Omy par pas de 5 nM ; fuite respiration L. ce3U2.0, titrage du découplage à des concentrations optimales de 2 μM ; ET capacité E. ce3Glc, glucose 11 mM ; E progressivement inhibé par le découplage. ce4Rot, roténone 0,5 μM inhibant l’IC ; Consommation d’oxygène résiduel Rox. ce5S, succinate 10 mM ; stimulation de l’E dans les cellules perméables à la membrane plasmique. 1Dig20, titrage des digitonines à des concentrations optimales de 20 μg·^mL-1, pour une perméabilisation complète de la membrane plasmique ; capacité ET de la voie succinate S_E. 1c, cytochrome c 10 μM ; Test de l’intégrité de la membrane externe mitochondriale. 2Ama, antimycine A 2,5 μM inhibiteur de l’ICII ; rox. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau supplémentaire 1 : Produits chimiques utilisés dans les protocoles SUIT (substrat-inhibitor-uncoupler-titration). Abréviations et concentrations en solution mère pour les chambres s sV et cV . Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau supplémentaire 2 : Comparaison de R1-R0 et J°₁ dans les chambres de 0,5 mL et de 2,0 mL. Données regroupées d’essais de fond instrumental dans les séries 2 (pce) et 3 (imt) et avant les titrages TIP2k (0,5 mL : N = 48 ; TIP2k : N = 8 ; 2,0 mL : N = 60). La moyenne des données a été calculée à partir des séries expérimentales 2 (pce) et 3 (imt) uniquement, qui ont été réalisées à une pression barométrique moyenne de 94,9 kPa (Innsbruck, Autriche), à l’exclusion des données de la série 1 (ce) obtenues au niveau de la mer. Le même type de point de vente individuel, mais différent, a été utilisé dans les chambres de 0,5 ml et de 2,0 ml. Par conséquent, la variabilité entre les capteurs doit être prise en compte lors de la comparaison des chambres s sV et cV . Alors que J°₁ = 2,26 ± 0,41 pmol∙^s-1∙^mL-1 obtenus expérimentalement pour la chambre de 2,0 mL correspondaient étroitement à la valeur calculée, le J°₁ expérimental = 8,48 ± 0,53 pmol∙^s-1∙^mL-1 pour la chambre de 0,5 mL était plus faible que prévu. Cela s’explique par les observations suivantes. Après la fermeture de la chambre, le flux de fond O₂ plus élevé dans la chambre de 0,5 mL abaisse les concentrations d’O₂ aux repères de J°₁ fixés à des intervalles de temps comparables (Figure 1). La concentration en oxygène à J°₁ était en moyenne de 4,06 % et 1,72 % inférieure à la saturation de l’air dans les chambres de 0,5 mL et 2,0 mL, respectivement (figure supplémentaire 2, tableau supplémentaire 2). À un c_O2 inférieur, la consommation réduite d’O₂ par le capteur et une partie de la rétrodiffusion de O₂ réduisent le J°₁ déterminé expérimentalement. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau supplémentaire 3 : Concentration d’oxygène [μM] à laquelle l’étalonnage (R1) et J°₁ ont été obtenus et leur différence en %. Données regroupées d’essais de fond instrumental dans les séries 2 (pce) et 3 (imt) et avant les titrages TIP2k (0,5 mL : N = 48 ; TIP2k : N = 8 ; 2,0 mL : N = 60). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau supplémentaire 4 : J°₁ mesuré et prévu dans la chambre de 2,0 ml. Série indépendante d’essais instrumentaux de fond avec O2k série A (avec bouchons en titane¹³), V = 2,0 mL (37 °C, solution de NaCl avec facteur de solubilité O₂ 0,92 ; N = 52). n_O2/Q_e = 10⁶/(96485.33·4) = 2.591 pmol∙^μC-1 = 2.591 pmol∙^s-1∙^μA-1. Basé sur l’hypothèse que la rétrodiffusion de O₂ est négligeable à c_O2,1, ce qui n’est vrai qu’à c_O2,1 ~ c_O2*. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau supplémentaire 5 : Résidus de régression linéaire (valeurs absolues [pmol O₂∙^s-1∙^mL-1]) calculés pour chaque test de fond instrumental O₂. Données regroupées d’essais instrumentaux de fond dans les séries 2 (pce) et 3 (imt) et avant les titrages TIP2k. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

La quantité d’échantillon disponible pour la respirométrie est souvent limitée, par exemple dans les études de biopsies, de cellules primaires ou de cultures cellulaires à croissance lente avec un faible nombre de cellules¹. De plus, les activités respiratoires sont déprimées en raison de lésions mitochondriales¹¹ ou lors de l’étude de voies mitochondriales de faibles capacités, telles que l’oxydation des acides gras¹². Dans ces cas, un faible volume de chambre respiratoire offre des avantages pour la résolution du flux d’O₂. Cependant, les flux de fond instrumental en O₂ augmentent à des volumes de chambre inférieurs et induisent des erreurs lorsqu’ils ne sont pas mesurés de manière fiable et ne sont pas correctement corrigés en fonction de la concentration en O₂. La reproductibilité des tests d’arrière-plan instrumentaux O₂ et les corrections d’arrière-plan sont particulièrement importantes pour les faibles volumes de chambre. Des valeurs presque identiques du flux théorique (J°_R1) et expérimental (J°_air) O₂ fournissent des preuves de la précision de la mesure polarographique avec 4 e^-/O₂ à la réaction cathodique du POS. La différence entre J°_R1 et J°_air était de 1,64 ± 0,43 et de 0,22 ± 0,31 pmol∙^s-1∙mL-1 dans les chambres s V et cV, respectivement, indiquant une précision dans les mesures qui se situe dans la limite de détection de la chambre de 2,0 mL (±1 pmol∙^s-1∙mL-1)²⁸. Avec le même type de capteurs d’oxygène polarographiques dans les chambres de 2,0 mL et 0,5 mL, le flux de fond O₂ spécifique au volume a été multiplié par 4 en proportion inverse du volume de la chambre, et la variabilité était presque identique dans les deux volumes de chambre, avec un ^écart-type de 0,5 et 0,3 pmol∙^s-1∙mL-1 pour J°_air et de 0,9 et 0,8 pmol∙^s-1∙^mL-1 pour J°₅₀ dans les sV et cV chambre (tableau 2). Au cas d’activités respiratoires minimales - pour lesquelles la chambre de petit volume a été conçue - même de petits effets de fond deviennent significatifs (tableau supplémentaire 3 ; Figure supplémentaire 2). Par conséquent, une évaluation régulière du flux de fond instrumental O₂ (Figure 1) est nécessaire pour appliquer la correction^{appropriée 28}.

Une agitation élevée et constante du fluide est nécessaire pour maintenir un système homogène et garantir un signal d’oxygène stable. La vitesse d’agitation de 750 tr/min est établie pour la chambre de 2,0 ml, mais la vitesse optimale n’était pas connue dans la chambre de 0,5 mL. Les différentes géométries de la chambre en verre et de la barre d’agitation (tableau 2) nécessitent une évaluation indépendante de la vitesse d’agitation optimale. Les capteurs d’oxygène ont réagi aux changements de vitesse d’agitation entre 550 tr/min et 950 tr/min, avec un petit écart par rapport au signal O₂ R1 à 750 tr/min, indépendamment du volume de la chambre. La constante de temps exponentielle τ évaluée pour la chambre sV était en accord avec τ rapportée pour la chambre de 2,0 mL à la même vitesse d’agitation¹³. Ces résultats suggèrent que l’agitation est tout aussi efficace dans les deux géométries de chambre et que la vitesse d’agitation par défaut de 750 tr/min (chambre de 2,0 ml) peut être appliquée à la chambre de 0,5 ml. Dans les configurations de chambre « ouverte » et « fermée », la chambre de 0,5 mL présentait un rapport signal/bruit plus élevé, ce qui suggère qu’une plus grande précision est un avantage de la chambre de 0,5 mL (figure 5), bien que l’effet de la variabilité individuelle du POS ne puisse être exclu. Étant donné que le bruit n’a pas augmenté lors de la réduction de la vitesse d’agitation de 750 tr/min à 550 tr/min, la réduction de la vitesse d’agitation à 550 tr/min dans la chambre de 0,5 mL peut être bénéfique pour minimiser les contraintes de cisaillement sans compromettre le rapport signal/bruit.

Des taux de consommation_d’O2 presque identiques ont été mesurés dans les chambres de 0,5 mL et de 2,0 mL dans trois modèles expérimentaux lorsque la correction de fond appropriée a été appliquée. Les résultats obtenus avec de petites plaquettes de 2 m de diamètre⁴², des fibroblastes vivants et perméabilisés, et des mitochondries isolées suggèrent que l’on peut s’attendre à ce que des fréquences respiratoires constantes soient obtenues dans les chambres de 0,5 mL et de 2,0 mL dans un large éventail de types de cellules et de préparations mitochondriales. Les fibres musculaires perméabilisées, cependant, n’ont pas été testées dans la présente étude. Une mesure précise du rox nécessite un contrôle des niveaux d’oxygène⁴⁰ et une résolution instrumentale élevée¹. Le flux O₂ spécifique au volume de rox peut être aussi bas que la limite de détection. Les réoxygénations ne sont pas nécessaires lorsque le nombre de cellules est faible ou que des quantités généralement faibles d’échantillons sont utilisées dans une expérience. Si nécessaire, cependant, il est recommandé d’effectuer des réoxygénations dans les états respiratoires avec un faible flux d’O₂ pour éviter une baisse rapide de la concentration d’O₂ pendant la période nécessaire à la stabilisation du flux d’O₂. La stabilisation du flux d’O₂ après réoxygénation prend plus de temps dans la chambre de 0,5 ml.

Afin de contribuer au contrôle de la qualité, une attention particulière doit être accordée à la dilution de l’échantillon en suspension lors du remplacement partiel du volume. Après retrait du bouchon complètement inséré, le volume total V' de milieu respiratoire dans la chambre est donné par le volume expérimental V et le volume V capillaire du bouchon _stc (tableau 2). Par conséquent, le volume de base V _J.i est dilué dans le volume réel V', qui est supérieur à V, ce qui donne un facteur de dilution V/V' de 0,5/0,54 = 0,926 et 2,0/2,07 = 0,966 dans les chambres de 0,5 mL et de 2,0 mL, respectivement (figure 2). Dans les expériences avec les plaquettes, un prototype debouchon a été utilisé pour la chambre V avec un volume mort capillaire de 0,05 mL, correspondant à un facteur de dilution de 0,909.

Près de quatre fois plus faibles de cellules vivantes, de cellules perméabilisées et de mitochondries isolées sont nécessaires dans la chambre de 0,5 mL que dans la chambre de 2,0 mL à des concentrations d’échantillon identiques (quantité par volume), ce qui donne des résultats quantitativement comparables de consommation d’O₂ respiratoire normalisés pour le nombre de cellules ou la masse protéique. Cela indique que la chambre V est un outil précieux pour les études dans lesquelles la quantité d’échantillons disponibles est limitée. D’autre part, l’application d’une quantité identique d’échantillon dans la chambre sV augmente le flux d’O₂ spécifique au volume et réduit ainsi l’incertitude des mesures lorsque les activités respiratoires sont faibles.

Le régime d’oxygène dans la présente étude a été limité à la gamme O₂ de la saturation de l’air à 30 μM. L’applicabilité à des niveaux d’oxygène au-delà de cette plage nécessite une évaluation plus approfondie pour étudier la fonction mitochondriale à la normoxie tissulaire ou à l’hypoxie⁴³ et les tissus perméabilisés à l’hyperoxie⁹. Plusieurs configurations multicapteurs des modules Oroboros NADH et Q ; électrodes pH, NO et TPP^{+ 10,44} - ne peuvent pas être logées dans la chambre sV et nécessitent la chambre de 2,0 ml.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Anaconda3	Anaconda Software Distribution	https://www.anaconda.com/	software
ADP	Merck, Allemagne	117105
Antibiotiques-antimycosiques 100x	Biosera, France	XC-A4110	ATTENTION H317 Peut provoquer une réaction allergique cutanée
Antimycine A	Sigma-Aldrich, États-Unis	A8674	MISE EN GARDE H300 Mortel en cas d’ingestion, H400 danger aquatique à court terme (aigu)
Ascorbate	Sigma-Aldrich, États-Unis	A7631
ATP	Sigma-Aldrich, États-Unis	; A 2383
BSA sans acides gras	Sigma-Aldrich, États-Unis	A 6003	Albumine sérique bovine
CaCO3	Sigma-Aldrich, États-Unis	C 4830
CCCP	Sigma-Aldrich, États-Unis	C2759	Cyanure de carbonyle m-chlorophénylhydrazone ATTENTION H301 + H311 + H331 Toxique en cas d’ingestion, de contact avec la peau ou d’inhalation
Comtesse Compteur automatisé de cellules  ;	Thermo Fisher Scientific, États-Unis	AMQAX100
Cytochrome c	Sigma-Aldrich, États-Unis	C7752
DatLab  ;	Oroboros Instruments, Autriche	Version 7.4	Logiciel pour l’acquisition et l’analyse de données
DatLab  ;	Oroboros Instruments, Autriche	Version 8.1 Logiciel	d’acquisition et d’analyse de données
DC Protein Assay	Bio-Rad, États-Unis	5000112	Kit de dosage des protéines ; ATTENTION H314 Provoque de graves brûlures cutanées et lésions oculaires
Digitonin	Sigma-Aldrich, USA	D5628	ATTENTION H301 Toxique en cas d’ingestion
Dithiothreitol	Sigma-Aldrich, USA	D 0632	ATTENTION H318 Provoque de graves lésions oculaires
DMEM	Pan Biotech, Allemagne	P04-05551	Dulbecco' Eagle modifié' s medium
DMSO	Sigma-Aldrich, USA	D2650	diméthylsulfoxyde
DPBS	Lonza Bioscience, Suisse	LONBE17-512F	Sans calcium Dulbecco' s solution saline tamponnée au phosphate
EGTA	Sigma-Aldrich, États-Unis	E 4378
FBS	Thermo Fisher Scientific, États-Unis	A5256701	sérum fœtal bovin
Glucose	Sigma-Aldrich, États-Unis	; G7528
Glutamate  ;	Sigma-Aldrich, États-Unis	G1626
Glycérophosphate	Santa Cruz Biotechnology	sc-215789
Heraeus Multifuge 3s Large	Thermo Fisher Scientific, États-Unis	HM3S	centrifugeuse
Hettich Rotina 380R  ;	Andreas Hettich GmbH & Co. KG, Allemagne	1701
centrifugeuse Imidazole	Honeywell Fluka, Autriche	56750	ATTENTION H302 Nocif en cas d’ingestion, H314 Provoque de graves brûlures de la peau et des lésions oculaires, H360D Peut endommager l’enfant à naître
jamovi  ;	Le projet jamovi	Version 2.3.13	logiciel
K+-MES	Sigma-Aldrich, USA	M 8250
Tube de leucosp ;	Greiner Bio-One GmbH, Autriche	Tube à centrifuger Z642843-300EA	avec barrière en polyéthylène
Malate  ;	Sigma-Aldrich, États-Unis	M1000	ATTENTION H319 Provoque une grave irritation des yeux.
Mannitol	Sigma-Aldrich, États-Unis	M 4125
MgCl2  ;	Scharlau, Espagne	MA 0036
MiR05-Kit	Oroboros Instruments, Autriche	60101-01	milieu de respiration mitochondriale
Mixeur  ;	Swelab Instruments, Suède	440S	Table à bascule
Mr. Frosty Conteneur de congélation	Thermo Fisher Scientific, États-Unis	5100-0001	Conteneur de congélation
Oroboros	Oroboros Instruments, Autriche		le NextGen-O2k et le O2k sont désignés collectivement par le terme ' Oroboros
Chambre Oroboros cV	Oroboros Instruments, Autriche	23100-01	chambre à volume classique
Chambre Oroboros sV	Oroboros Instruments, Autriche	33100-01	chambre à petit volume
Oroboros TIP2k-Module	Oroboros Instruments, Autriche	11100-03	Titration-Injection
microPump O2-Zero Powder	Oroboros Instruments, Autriche	26600-02	; Na-dithionite ATTENTION H251 Auto-échauffement : peut prendre feu, H302 Nocif en cas d’ingestion, H319 Provoque une irritation oculaire grave
octanoylcarnitine	Biotrend - APExBIO Technology, Allemagne	B6371
Oligomycine	Sigma-Aldrich, États-Unis	O4876
Phosphocréatine	Sigma-Aldrich, États-Unis	P 7936
Pyruvate	Sigma-Aldrich, États-Unis	P2256	ATTENTION H317 Peut provoquer une réaction cutanée allergique
Rotenone	Sigma-Aldrich, USA	R8875	ATTENTION H300 Mortel en cas d’ingestion
Lignées cellulaires de fibroblastes cutanés  ;	; ATCC, États-Unis
Azoture de sodium	Sigma-Aldrich, États-Unis	S2002	ATTENTION H300 + H310 + H330 Mortel en cas d’ingestion, de contact avec la peau ou
d’inhalation Subtilisin A	Sigma-Aldrich, États-Unis	P 5380	ATTENTION H318 - Provoque des lésions oculaires graves, H334 - Peut provoquer des symptômes d’allergie ou d’asthme ou des difficultés respiratoires en cas d’inhalation
Succinate	Sigma-Aldrich, États-Unis	S2378
Sucrose	Sigma-Aldrich, États-Unis	S 7903
Compteur de cellules sanguines Swelab Alfa  ;	Boule Diagnostics AB, Suède	1420041
Taurine  ;	Sigma-Aldrich, États-Unis	T 0625
Tecan Infinite TM F200	Spectrophotomètre	Tecan, Suisse
TMPD	Sigma-Aldrich, États-Unis	T3134	N,N,N',N'-Tetramethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride ATTENTION H315 Provoque une irritation cutanée, H319 Provoque une irritation oculaire grave
Trypsin	Sigma-Aldrich, USA	T4799	ATTENTION H334 Peut provoquer des symptômes d’allergie ou d’asthme ou des difficultés respiratoires en cas d’inhalation
Vacuette	Greiner Bio-One GmbH, Autriche	15452520