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Article de méthode

Dérivation d’un organoïde du cerveau humain avec développement de la microglie

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DOI :

10.3791/67491

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17 janvier 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Translational Neuroscience Center, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health, 2Cancer Genetics and Comparative Genomics Branch, National Human Genome Research Institute, National Institutes of Health

Dans cet article

Résumé

Nous présentons un protocole pour générer un organoïde cérébral humain avec une microglie résidente en incorporant des cellules progénitrices hématopoïétiques (HPC) dérivées de cellules souches pluripotentes induites (iPSC) dans le développement d’organoïdes.

Résumé

Les cultures tridimensionnelles (3D) d’organoïdes cérébraux dérivées de cellules souches pluripotentes induites (iPSC) constituent un outil in vitro alternatif important pour l’étude du développement du cerveau humain et de la pathogenèse des maladies neurologiques. Cependant, le manque d’incorporation de la microglie dans les organoïdes du cerveau humain reste un obstacle majeur pour les modèles 3D de neuroinflammation. Les approches actuelles comprennent soit l’incorporation de microglies entièrement différenciées dans des organoïdes cérébraux matures, soit l’induction de la différenciation microgliale à partir du stade précoce des corps embryoïdes (EB) dérivés d’iPSC. La première approche manque l’étape où la différenciation microgliale interagit avec l’environnement neuronal adjacent, et la dernière approche est techniquement difficile, entraînant une incohérence entre les organoïdes finaux en termes de quantité et de qualité de la microglie. Pour modéliser des organoïdes cérébraux avec des cellules microgliales afin d’étudier les interactions précoces entre le développement microglial et neuronal, des cellules progénitrices hématopoïétiques (HPC) hautement pures différenciées des iPSC humaines ont été incorporées dans des EB dérivées d’iPSC pour fabriquer des organoïdes cérébraux. En utilisant l’immunocoloration et l’analyse de séquençage de l’ARN unicellulaire (sc-RNA-seq), nous avons confirmé que les HPC étaient incorporés dans les organoïdes 3D, qui se sont finalement développés en organoïdes cérébraux avec à la fois des microglies et des neurones. Par rapport aux organoïdes cérébraux sans HPC, cette approche produit une incorporation microgliale significative dans les organoïdes cérébraux. Ce nouveau modèle organoïde 3D, qui comprend à la fois des propriétés de développement microglial et neuronal, peut être utilisé pour étudier les interactions précoces entre le développement du système immunitaire inné et du système nerveux et potentiellement comme modèle pour la neuroinflammation et les troubles neuroinfectieux.

Introduction

Les microglies sont des cellules immunitaires résidentielles dans le cerveau, jouant un rôle essentiel dans le développement du cerveau et l’homéostasie 1,2. L’activation de la microglie entraîne la production de facteurs pro-inflammatoires, une phagocytose élevée et un stress oxydatif réactif, qui élimine les agents pathogènes envahissants et les cellules compromises. Cependant, une suractivation ou une activation prolongée de la microglie peut, d’autre part, provoquer une neurodégénérescence en tant que mécanisme de pathogenèse dans de nombreux troubles neurologiques, y compris la maladie de Parkinson 3,4. Il est important que les microglies soient incluses dans les modèles pertinents pour l’étude des troubles neurologiques humains. Ces dernières années, les cellules souches humaines ont été utilisées pour développer des organoïdes 3D sous forme de modèles in vitro comme alternative aux modèles animaux et aux études sur des sujets humains5. Idéalement, les organoïdes humains constituent plusieurs types de cellules et de structures tissulaires similaires aux organes humains correspondants, représentant mieux la physiologie et la pathogenèse humaines que les modèles animaux, mais sans les préoccupations éthiques impliquées dans les études directes des individus humains. Ils peuvent représenter l’avenir de la modélisation des maladies humaines pour l’étude de la pathogenèse et le développement de médicaments et pour l’orientation de thérapies individualisées6. À titre d’exemple, les organoïdes cérébraux humains en 3D dérivés de cellules souches pluripotentes induites humaines (iPSC) ont prévalu dans le domaine de la recherche en neurosciences, modélisant les maladies infectieuses neuronales, notamment ZIKA, le SRAS-CoV-27, et les maladies neurodégénératives, notamment la sclérose latérale amyotrophique (SLA) et la maladie d’Alzheimer 8,9. Cependant, les organoïdes neuronaux 3D conventionnels utilisant l’inhibition dual-SMAD pour induire la différenciation neuronale10 produisent des organoïdes cérébraux dépourvus de microglie, car ils sont dérivés de progéniteurs recrutés dans le sang au lieu de la lignée neuroectodermique dont les neurones sont issus11,12. Sans la présence de microglie, les organoïdes sont inadéquats pour modéliser les infections du SNC, l’inflammation et la neurodégénérescence associée.

Pour résoudre ce problème critique, des tentatives ont été faites pour incorporer la microglie différenciée dans les organoïdes cérébraux13 ou induire la différenciation microgliale au sein des organoïdes dès le début en utilisant des approches alternatives au lieu de l’inhibition duale de la SMAD13. Cependant, en incorporant des microglies différenciées dans les organoïdes cérébraux, les interactions précoces entre le développement neuronal et microglial sont manquées. Cela pourrait être important dans le développement du SNC ou dans la pathogenèse de troubles neuro-infectieux ciblant le développement du cerveau du nourrisson, comme dans l’infection par le virus ZIKA14. D’autre part, la différenciation de la microglie innée au sein d’organoïdes cérébraux dérivés d’iPSC sans stades intermittents implique un processus prolongé et présente une variabilité plus élevée dans les produits finaux15. Dans ce protocole, nous avons incorporé les cellules progénitrices hématopoïétiques (HPC) dérivées d’iPSC dans les iPSC pour créer des corps embryoïdes (EB), qui ont été différenciés en organoïdes 3D, y compris les neurones et la microglie.

Notre protocole fournit une approche simple qui peut être adoptée pour étudier le système nerveux central humain impliquant des interactions neurones-microgliales précoces et la pathogenèse des troubles infectieux neuronaux et de la neuroinflammation impliquant l’activation microgliale.

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Protocole

Les échantillons de sang originaux de donneurs adultes en bonne santé ont été prélevés à la Transfusion Medicine Blood Bank des NIH, et des formulaires de consentement éclairé signés ont été obtenus conformément au NIH Institutional Review Board.

1. Produire des cellules progénitrices hématopoïétiques (HPC) à partir d’iPSC humaines

REMARQUE : Les cellules iPSC humaines 510 et 507 ont été utilisées pour produire les résultats représentatifs. Les méthodes de génération et de maintenance des iPSC ont été trouvées dans une publication précédente16.

  1. Jour 0 : Enduire une plaque cellulaire de 12 puits en ajoutant 500 μL/puits de solution glacée de Matrigel (matrice de membrane basale [BMM]) diluée dans un milieu DMEM/F12 et l’incuber pendant au moins 30 minutes à température ambiante (RT).
  2. Retirer complètement le surnageant de revêtement et le remplacer par 1 mL de milieu E8 Flex par puits.
  3. Vérifiez la culture d’iPSC dans une plaque de 6 puits au microscope pour confirmer que les iPSC sont de haute qualité et sans signe de différenciation. Choisissez une colonie de taille moyenne en la marquant à l’aide d’un marqueur sous le bas de la plaque.
  4. Retirer le milieu de la culture d’iPSC et ajouter 500 μL de tampon de dissociation de l’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) (0,5 mM d’EDTA, 0,45 g/L de NaCl dans le DPBS) dans le puits.
  5. Observez au microscope des signes de dissociation cellulaire lorsque trois à quatre rangées de cellules des bords de la colonie commencent à rétrécir, avec un espace vide apparaissant entre les cellules. Cela prend généralement 1 à 3 min.
  6. Jetez complètement la solution EDTA. Délogez la colonie d’iPSC marquée en pipetant 1 mL de milieu E8 Flex avec force et directement sur celle-ci. Assurez-vous que la colonie se détache complètement en patchs cellulaires contenant 20 à 50 cellules chacun après 1 à 3 fois de pipetage.
  7. Prélevez le surnageant contenant des patchs cellulaires et ajoutez-le dans le premier puits des puits recouverts de la plaque à 12 puits.
  8. Mélangez le puits en pipetant une ou deux fois et transférez 1 mL des cellules dans le deuxième puits qui contient 1 mL de milieu.
  9. Répétez l’étape 1.8 deux fois pour faire des cultures d’iPSC diluées en série dans un total de quatre puits.
  10. Incuber la plaque dans un incubateur à 37 °C et 5 % de CO2.
  11. Après 24 h, le jour 1, vérifiez les colonies au microscope et comptez le nombre de colonies en parcourant tous les champs dans un puits en continu. Choisissez un puits qui contient 10 à 20 colonies d’iPSC.
  12. Remplacez le milieu par 1 mL de milieu A de la trousse hématopoïétique. Remettez la plaque dans l’incubateur pendant 48 h.
  13. Le jour 3, prélever 500 μL de milieu épuisé et ajouter 500 μL de milieu frais A.
  14. Le jour 4, observez au microscope et remarquez une croissance cellulaire et une différenciation significatives à partir des colonies d’iPSC. Remplacer le milieu par 1 mL de milieu B.
  15. Surveillez la différenciation cellulaire au microscope et effectuez un changement à mi-moyen avec 500 μL de milieu B tous les deux jours. Les cellules de type HPC apparaissent les jours 6 et 7.
  16. Le 10e jour, observez au microscope des cellules rondes uniques brillantes avec la morphologie des HPC normaux flottant dans le milieu ou faiblement attachées à la couche inférieure unique des cellules plates, avec quelques agrégats de cellules lâches.
    REMARQUE : Les HPC différenciés sont prêts à être collectés pour une caractérisation ou une expérience plus approfondie.
  17. Collectez tous les HPC différenciés en pipetant trois fois vers le haut et vers le bas à l’aide d’une pointe de pipette de 1 mL pour briser les agrégats cellulaires et détacher les HPC de la surface de la plaque.
  18. Ajouter les cellules dans un tube de 15 mL et centrifuger les cellules à 300 x g pendant 5 min. Retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille de cellule dans 1 mL de milieu B.
  19. Comptez les cellules et ajustez la concentration à 1 million de cellules/ml. À ce stade, plus d'1 million de HPC sont générés. Lors de la cytométrie en flux, assurez-vous que la pureté est supérieure à 85 % des cellules avec CD34+/CD43+. Assurez-vous qu’aucune cellule morte importante (plus de 5 %) n’est remarquée.

2. Développement de corps embryoïdes à partir d’iPSC et de HPC mixtes

  1. Le jour même de la collecte des HPC, assurez-vous qu’une culture d’iPSC atteint également une confluence de 80 % dans un puits d’une plaque de 6 puits (ou deux puits dans une plaque de 12 puits).
  2. Traitez un puits de la plaque de culture à micropuits pour la formation d’EB avec 500 μL de solution de rinçage anti-adhérence en l’ajoutant pour minimiser les bulles.
  3. Faites tourner la plaque à 2000 x g pendant 5 min dans un rotor à godet oscillant équipé de porte-plaques pour éliminer les éventuelles bulles.
  4. Retirer complètement la solution de rinçage par pipetage et laver les puits deux fois avec 1 mL de DPBS, puis 1 mL de DMEM/F12 sans générer de bulles.
  5. Dissocier les iPSC de la plaque en traitant les cellules avec 1 mL de solution d’Accutase.
  6. Observez au microscope jusqu’à ce que les cellules montrent des signes de séparation mais soient toujours attachées au fond. Cela se produit généralement dans les 1 à 3 minutes suivant le traitement par Accutase. Ne digérez pas trop les iPSC.
  7. Retirer complètement la solution d’Accutase sans déranger les cellules et ajouter 1 mL de milieu DMEM/F12 dans les puits. De plus, dissociez les cellules en cellules uniques en pipetant de haut en bas à quelques reprises à l’aide d’un embout de 1 ml.
  8. Rassemblez les cellules dans un tube de 15 ml et remplissez-le à 5 ml avec un milieu DMEM/F12. Faites tourner les cellules à 300 x g pendant 5 min.
  9. Retirer le surnageant par pipetage et remettre les cellules en suspension dans 1 mL de milieu E8 Flex. Comptez les cellules et ajustez la concentration cellulaire à 1 million de cellules par ml dans le milieu E8 Flex.
  10. Mélangez des iPSC avec des HPC dans un rapport de 2:1 en additionnant 1 million d’iPSC (1 ml) et un demi-million de HPC (500 μL). Ajouter toutes les cellules mélangées dans le puits préalablement traité de la plaque de culture du micropuits.
  11. Ajouter 1 μL de solution mère d’inhibiteur de roche Y27632 (1 mM) par milieu de 1 mL dans le surnageant. Secouez la plaque d’un côté à l’autre plusieurs fois pour répartir uniformément les cellules.
  12. Faites tourner la plaque de culture à micropuits à 300 x g pendant 5 min dans un rotor à godets oscillants équipé de porte-plaques. Observez au microscope pour voir si les cellules se sont installées dans les micropuits. (Figure supplémentaire 1A).
  13. Sans déranger les cellules, placez la plaque dans un incubateur à cellules à 37 °C, 5 % CO2 .
  14. Le jour 2, 48 h plus tard, observez les cellules au microscope pour la formation d’EB. Lorsque les EB sont clairement formés, passez à l’étape suivante (figure supplémentaire 1B).
  15. Traiter une plaque de culture cellulaire à 24 puits avec un tampon de rinçage anti-adhérence (500 μL) pendant 15 min pour obtenir une plaque à faible fixation.
  16. Retirez complètement le tampon de rinçage et lavez les puits deux fois avec 1 mL de DPBS, puis ajoutez 1 mL de milieu E8 Flex dans les puits.
  17. Remettez les EB en suspension dans la plaque de culture à micropuits en les pipetant à l’aide d’une pointe de pipette à orifice de 1 mL de large pendant quelques fois.
  18. Pour chaque puits des plaques de 24 puits traitées à faible adhérence, prélever et ajouter 100 μL de milieu contenant des EB. Cela se traduira par 10 à 20 EB par puits. Ajoutez le support E8 Flex à l’ancien puits contenant les EB restants en tant que sauvegarde.
  19. Incuber la plaque dans un incubateur à cellules à 37 °C, 5 % de CO2 pendant 48 h.

3. 3D l’induction, la prolifération et la maturation des organoïdes neuronaux

  1. Le jour 2 après la formation de l’EB, décongeler les aliquotes de BMM sur la glace pendant au moins 30 min.
  2. Utilisez une pointe de 20 μL pré-refroidie et ajoutez judicieusement une goutte BMM glacée de 15 μL sur le milieu pour enrober les EB. Cela fait un film de BMM sur lequel les EB se fixeront et se développeront.
  3. Placez la plaque dans un incubateur à cellules à 37 °C, 5 % de CO2 .
  4. Le jour 4, après la formation de l’EB, retirez soigneusement 500 μL de milieu sans jeter les EB et répétez l’enrobage BMM en suivant l’étape 3.2.
  5. Démarrez immédiatement l’induction neurale en ajoutant 500 μL de milieu d’induction neurale PSC sur les cellules.
  6. Les jours 6 et 8, effectuez un demi-changement de milieu en retirant soigneusement 500 μL de milieu sans toucher les cellules et en ajoutant 500 μL de milieu à induction neurale.
  7. Les jours 10, 12 et 14, effectuez un demi-changement de milieu avec un milieu de cellules souches neurales (NSC) : Knockout DMEM/F12 + 1x supplément Glutamax + 1x supplément neural + bFGF + EGF.
  8. Le 15e jour, transférez l’ensemble du puits de sphères avec le milieu dans une nouvelle plaque à 12 puits traitée avec une solution de rinçage anti-adhérence comme décrit précédemment. Ajouter 500 μL de milieu de maturation neuronale (DMEM/F12 + 1x supplément N2 + 1x supplément B27 + 1x antibiotiques-antimycosiques) sur la culture.
  9. Effectuez un changement mi-moyen avec un milieu de maturation neuronale tous les deux jours.
  10. Au cours de la phase de maturation, s’il y a des signes d’épuisement nutritionnel, tels qu’un changement de couleur du milieu, déplacez l’organoïde vers des plaques à 6 puits, qui contiennent jusqu’à 3 ml de milieu par puits.
  11. En option, 17 jours après la formation de l’EB, compléter le milieu de maturation avec des cytokines (IL-34, M-CSF, TGF-β1, CD200, CX3CL1) pendant 6 jours pour faciliter la maturation microgliale.
  12. Le 23e jour, collectez les organoïdes neuronaux résultants pour la caractérisation ou d’autres expériences.

4. Clairance et immunocoloration des organoïdes neuronaux 3D

  1. Fixer jusqu’à 10 organoïdes par immersion dans 1 mL de paraformaldéhyde à 4 % (PFA) à 4 °C pendant 24 h.
  2. Transférez les organoïdes par puits dans une plaque inférieure transparente de 96 puits et lavez-les avec 200 μL de DPBS 2 fois pendant 1 h à chaque fois en secouant doucement.
  3. Perméabiliser les organoïdes en les lavant une fois dans du méthanol à 50 % dans du DPBS, du méthanol à 80 % dans de l’eau bidistillée (dd) et du méthanol sec à 100 % pendant 10 minutes chacun, à 4 °C avec une légère agitation.
  4. Laver les organoïdes en série dans 20 % de DMSO/méthanol, 80 % de méthanol dans de l’eau dd, 50 % de méthanol dans du DPBS, dans du DPBS à 100 %, puis dans du DPBS avec 0,2 % de Triton X-100, pendant 10 min chacun à 4 °C en secouant doucement. Faites un effort pour éliminer complètement le tampon résiduel après chaque lavage.
  5. Incuber dans un tampon de perméabilisation (DPBS avec 0,2 % de Triton X100, 0,3 M de glycine et 20 % de DMSO) en agitant doucement pendant 40 min à RT.
  6. Bloquer dans un tampon bloquant (DPBS avec 0,2 % de Triton X100, 6 % de sérum de chèvre et 10 % de DMSO) pendant 1 h à 37 °C avec agitation douce sur un agitateur à 80 tr/min.
  7. Incuber avec des anticorps dans un tampon de dilution d’anticorps (IBA1 1:100, TREM2 1:100, βIII-tubuline, 1:1000, 100 μL /puits dans du DPBS avec 0,2 % de Tween 20, 100 μg/mL d’héparine, 3 % de sérum de chèvre et 5 % de DMSO) à 37 °C pendant 2 h ou en chambre froide avec agitation douce à 80 tr/min pendant 3 jours.
  8. Laver avec du DPBS avec 0,2 % de Tween 20, 100 μg/mL d’héparine 5 fois, 10 min chacune à RT avec une légère secousse sur un shaker à 80 tr/min.
  9. Incuber avec l’anticorps secondaire (1:200 chèvre anti-souris Alexa488) à 37 °C pendant 1 h, suivi d’une RT pendant la nuit avec une légère agitation sur un agitateur à 80 tr/min.
  10. Pour la coloration de contraste nucléaire, effectuez la coloration DAPI en même temps que l’incubation d’anticorps ou dans un tampon de lavage.
  11. Laver les organoïdes 10 fois dans un tampon de lavage, 10 min à chaque fois à 37 °C, en secouant doucement.
  12. Observez au microscope. Si le fond est encore élevé, continuez à le laver 5 fois.
  13. Jetez le surnageant autant que possible. Ajouter 200 μL de solution de clarification des organoïdes et l’incuber pendant 5 minutes avant l’observation et prendre des images à l’aide d’un microscope confocal.

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Résultats

Notre protocole suit un schéma permettant de différencier les HPC des iPSC, puis de mélanger les HPC avec les iPSC pour produire des EB, suivis d’une induction neuronale, d’une différenciation et d’une maturation (Figure 1). Une différenciation HPC de haute qualité est essentielle pour le succès de la formation de l’EB et de la différenciation ultérieure des organoïdes. Une technique de culture par dilution en série est utilisée pour produire le nombre et la ...

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Discussion

Ici, un protocole détaillé pour la fabrication d’organoïdes neuronaux 3D contenant des microglies innées à partir d’EB dérivées d’iPSC mixtes et de HPC différenciés par iPSC est présenté. Il s’agit d’une approche relativement courte et facile qui ne fait appel qu’à des techniques et à des équipements de culture cellulaire généralement disponibles dans la plupart des laboratoires.

Le facteur le plus critique pour le succès de ce protocole est la qualité de la d...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Cette étude est financée par les fonds de recherche intra-muros du NINDS.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Plaques de culture cellulaire à 12 puitsCorning  ;#3512
Plaque de culture cellulaire à 24 puitsSARSTEDT#83.3922
Plaque AccutaseThermoA1110501
Aggrewell 400Technologies des cellules souches#34411Appelée plaque de culture à micropuits  ;
Alexa Fluor 488 chèvre anti-souris AnticorpsLife techniologiesA11001dilution 1:400
Alexa Fluor 594 chèvre anti-lapinLife techniologiesA11012dilution 1:400
Allegra X-30R Centrifugeuse avec rotor S6069Beckman Couler
Anti-adhérence  ; Solution de rinçageStem Cell Technologies#07010
anticorps anti-CD34Stem Cell Technologies#60013Dilution 1:100
anticorps anti-CD43 humainStem Cell Technologies#60085Dilution 1:100
anti-IBA1 rabbbit anticorpsFujifilm019-197412.5 µ ; g/mL
anti-TREM2  ; rat pAbRD Systemsmab172912.5   ; g/mL
Antibiotique-antimycosiqueGibco15240-0621x
supplément B27Life technologies17504-0441x
bFGFPeprotech100-18B20 ng/mL
CD200NovoproteinC311  ; Fioles CryoTube 100 ng/mL
Thermo#368632
CX3CL1Peprotech300-31  ; 100 ng/mL
DAPISigmaD95421 & micro ; g/mL
DMEM/F12Life technologies12400-0241x
DMSOSigmaD2650
DPBSGibco#41901361x
E8 Flex medium kitThermoA2858501
EDTAMediatech46-034-Cl  ;0,5 million d’euros
EGFPeprotechAF-100-1520 ng/mL
EVOS FL Auto MicroscopeThermoFluorescence microscope  ;
FastStart Universal SYBR Green PCR master mixRoche#4913850001
GlutamaxGibco#35050079
Sérum de chèvreSigmaG90234 %
IL-34Peprotech200-34  ; 100 ng/mL
ImageXpress Micro ConfocalMolecular Devices
Knockout DMEM/F12Gibco#10829018
M-CSFPeprotech300-25  ; 25 ng/mL
MatrigelCorning#354277Matrice de membrane basale (BMM)
Anti-&bêta de souris ; Anticorps III-tubulinePromegaG712Adilution 1:1000
Mr. Frosty containerThermo5100-0001
N2 supplementLife technologies17502-0481x
ParaformadehydeSigmaP61484 %
PSC Neural Induction MediumGibcoA1647801
Inhibiteur de roche Y27632Stemcell technologies#723041 mM stock
RT LTS 1000 ul pointesde pipette RAININ#30389218  ; pour le transfert d’organoïdes
STEMdiff Kit d’organoïdes cérébrauxStem Cell Technologies#08570
STEMdiff Kit hématopoïétiqueStemCell Technologies#5310Appelé kit hématopoïétique
StemPro Neural SupplementGibcoA1050801Appelé supplément neuronal
TGF-&beta ; 1Peprotech100-2150 ng/mL
Kit de purification de l’ARN total PlusNorgen#48400
TritonX-100SigmaT92840,10 %
Visikol Histo-Starter KitVisikolHSK-1Contient une solution de clarification des organoïdes HISTO-M, un tampon de lavage
Zeiss LSM 510-META Microscope confocalZeiss

Références

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