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Marquage par fluorescence pour visualiser les protéines faiblement exprimées chez le poisson-zèbre

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DOI :

10.3791/67616

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24 janvier 2025

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1State Key Laboratory of Cellular Stress Biology, School of Life Sciences, Faculty of Medicine and Life Sciences, Xiamen University, 2Technology Center, Shanxi Xinghuacun Fenjiu Distillery Co., Ltd., 3Research Unit of Cellular Stress of CAMS, Cancer Research Center of Xiamen University, Xiang'an Hospital of Xiamen University, School of Medicine, Xiamen University, 4Laboratory Animal Center, Xiamen University

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ici, nous présentons un protocole pour marquer les protéines avec une étiquette de protéine de fluorescence chez les larves de poisson-zèbre, un système in vivo nouvellement développé et modifié particulièrement utile pour visualiser les protéines de faible abondance chez le poisson zèbre.

Résumé

La technologie CRISPR/Cas9-mediated knock-in (KI) permet de marquer plus facilement les protéines fluorescentes chez le poisson-zèbre (Danio rerio), un organisme modèle privilégié pour l’imagerie in vivo en raison de sa transparence au cours des premiers stades de développement. Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour la réalisation du gène de fluorescence à haute efficacité KI, le dépistage rapide des fondateurs de KI et le traçage des protéines de faible abondance chez les larves de poisson-zèbre, qui jetteront une base essentielle pour les études physiopathologiques ultérieures chez le poisson zèbre. Le protocole actuel comprend des étapes complètes pour la conception de l’ARNsg pour le gène d’intérêt, la transcription in vitro de l’ARNg Cas9, la transcription in vivo de l’ARNg pour celui qui a la plus grande efficacité, la conception et la construction du plasmide du donneur, la micro-injection dans les larves de poisson-zèbre, le criblage du fondateur de KI et l’imagerie en direct du poisson-zèbre. Les étapes critiques, les conseils de dépannage, les méthodes de contrôle de la qualité, ainsi que les avantages et les applications de ce protocole sont inclus et discutés. Ce protocole garantit des résultats rapides et précis à faible coût et a été validé par de nombreux essais.

Introduction

En tant qu’organisme modèle bien accepté, le poisson-zèbre (Danio rerio) est largement utilisé dans la recherche scientifique sur le développement, la régénération, la tumorigenèse, l’infection et l’immunité, etc. 1,2,3,4,5. Les poissons-zèbres sont particulièrement adaptés à l’imagerie en direct in vivo lorsqu’ils sont traités avec du PTU (1-phényl 2-thiourea), un composé chimique toxique qui inhibe la mélanogénèse et rend les larves de poisson-zèbre transparentes pendant une période de temps relativementlongue6. Des souches de poisson-zèbre transparentes génétiquement modifiées, telles que le casper7 et le crystal8, sont également disponibles, permettant une visualisation en direct et un traçage de la lignée jusqu’à l’âge adulte. Outre ces efforts pour surmonter la pigmentation afin d’améliorer la visualisation en direct chez les poissons adultes, nos recherches se concentrent également sur le développement de stratégies d’édition de gènes puissantes pour rendre le marquage des protéines fluorescentes plus efficace et moins artificiel.

La technologie KI basée sur la microhomologie médiée par CRISPR/Cas9 (MMEJ) est maintenant largement appliquée dans les modifications génétiques de plusieurs organismes, y compris le poisson-zèbre, en raison de son efficacité KI relativement élevée 9,10,11,12. Pour réussir l’imagerie in vivo, deux défis doivent être relevés. L’une est les indels ou cicatrices introduites par le processus de recombinaison ; L’autre est que certains gènes cibles sont exprimés de manière endogène à un faible niveau, ce qui entraîne des signaux faibles de l’étiquette de fluorescence co-exprimée et l’échec de la détection in vivo. Dans le but d’obtenir un marquage efficace et précis des protéines et de minimiser l’interférence des niveaux d’expression des gènes endogènes, un travail récent a fait état d’une stratégie optimisée combinant une méthode de marquage « VH » amplifiant le signal de fluorescence et un flux de travail de dépistage germinal raffiné13, qui est plus adapté au marquage par fluorescence des gènes faiblement exprimés et plus efficace que les méthodes précédentes en optimisant le squelette du donneur et en combinant la réaction en chaîne par polymérase (PCR) et les vérifications de fluorescence Mettre en œuvre le dépistage germinal au moindre coût de temps et d’efforts. Ici, nous présentons un protocole détaillé étape par étape pour la méthode rapportée, y compris les étapes de préparation de l’embryon et d’élevage du poisson zèbre, la conception de l’ARNsg, la transcription in vitro des ARNsg, la transcription in vitro de l’ARNm Cas9, la micro-injection d’embryons de poisson-zèbre, le dépistage in vivo des ARNsg avec la plus grande efficacité, la conception et la construction du plasmide du donneur, le génotypage du poisson zèbre KI, le criblage germinal KI et l’imagerie et le phénotypage du poisson-zèbre KI. Ce protocole tout-en-un, fournissant une méthode de marquage par fluorescence de pointe, favoriserait sans aucun doute les études utilisant le poisson-zèbre dans divers domaines scientifiques et bénéficierait à des lecteurs de différents milieux universitaires.

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Protocole

Tous les élevages et expériences de poisson-zèbre ont été examinés et approuvés par le Comité de gestion et d’éthique des animaux de laboratoire de l’Université de Xiamen et étaient strictement conformes aux bonnes pratiques animales telles que définies par le Centre des animaux de laboratoire de l’Université de Xiamen. L’étude a respecté toutes les réglementations éthiques pertinentes pour l’utilisation des animaux.

REMARQUE : Tous les poissons zèbres adultes et larvaires ont été maintenus selon les protocoles standard à 28,5 °C avec un cycle lumière/obscurité de 13/11 h dans le système d’aquarium de poisson-zèbre de l’Université de Xiamen. Les embryons ont été conservés dans la zone tampon embryonnaire (tableau 1) dans un incubateur contrôlé (température de 28 ± 0,5 °C ; lumière, cycle 13 h lumière/11 h cycle d’obscurité). L’alimentation et la surveillance générale de tous les poissons-zèbres ont été effectuées deux fois par jour (9 h et 16 h). La souche de type sauvage (WT) utilisée dans cette recherche était Tübingen (Tü).

1. Choisir les gènes d’intérêt et concevoir l’ARN guide

  1. Connaître les informations du gène d’intérêt. Effectuez une recherche dans la base de données (https://zfin.org/) et assurez-vous que le nombre de variantes génétiques est connu. Décidez quelle variante manipuler et téléchargez les informations sur le gène cible à partir d’Ensembl (https://www.ensembl.org/), y compris la séquence du génome, la séquence d’ADNc et la séquence codante (CDS). Marquez les exons, les introns, les UTR, les codons de départ et les codons d’arrêt dans les séquences.
  2. Ne choisissez pas plus de 200 pb de CDS en amont du codon stop (TAA, TAG ou TGA) du gène cible comme région cible de l’ARNsg.
    REMARQUE : Il est préférable de s’assurer que cette région ne présente pas de polymorphismes nucléotidiques uniques (SNP) par séquençage de l’ADN.
  3. Utilisez le site Web CRISPRscan (https://www.crisprscan.org/) pour concevoir des ARNsg candidats dans la région cible choisie et prédire l’efficacité des ARNsg.
    1. Entrez la séquence d’ADN dans le cadre de conception.
    2. Sélectionnez les informations correspondantes, y compris l’espèce, le(s) décalage(s) maximal(s) dans les hors-cibles, l’endonucléase et le promoteur. Dans ce cas, choisissez Zebrafish-Danio rerio, No mismatch, Cas9-NGG et le promoteur T7 in vitro.
    3. Cliquez sur Obtenir des ARNsg pour obtenir des ARNsg. Sélectionnez 5 à 7 ARNsg avec un score CRISPRscan élevé et un score hors cible faible pour le dépistage in vivo .
  4. Concevoir des amorces PCR flanquant les sites cibles de l’ARNsg dont le produit est d’environ 500 pb pour l’amplification PCR ultérieure, le test de digestion enzymatique et le séquençage afin de vérifier l’efficacité de l’inactivation après micro-injection d’ARNsg/Cas9. Sélectionnez une séquence d’environ 20 pb dans les régions en amont et en aval et assurez-vous que sa teneur en GC est d’environ 50 % et que la valeur Tm varie de 50 à 55 °C.
    REMARQUE : Concevez deux amorces en amont et deux amorces en aval s’il est nécessaire de faire des combinaisons.

2. Préparation des ARNsg

REMARQUE : La séquence d’échafaudage commune de l’ARNsg (Figure 1) a été clonée dans un plasmide (Table des matériaux).

  1. La PCR amplifie la séquence conjuguée du promoteur T7-ARNsg à l’aide d’amorces et d’un mélange de PCR présentés dans le tableau 2 et le tableau 3, respectivement. Exécutez le programme PCR dans le Tableau 4. Électrophorèse sur gel (gel d’agarose, 1,2 % d’agarose dans un tampon TAE ; tampon TAE [Tableau 1] ; 200 V ; environ 5 min) avec 2 μL de produits PCR pour s’assurer que les produits sont corrects (le MW est d’environ 150 pb).
  2. Purifier les produits de PCR à l’aide d’un kit de purification (Table des matériaux) ou d’autres kits disponibles dans le commerce en suivant les instructions du fabricant.
    REMARQUE : À partir de maintenant, des réactifs et des matériaux exempts de RNase doivent être utilisés, et les procédures doivent être effectuées avec une prudence particulière pour éviter la contamination par la RNase (voir la discussion).
    1. Ajouter le tampon de liaison aux produits PCR à un rapport de volume de 5:1 et mélanger. Appliquer le mélange sur la colonne placée dans un tube de prélèvement de 2 mL. Centrifuger à 17 900 × g pendant 1 min à 25 °C. Jetez le flux continu et remettez la colonne dans le même tube de collecte.
    2. Ajouter 750 μL de tampon de lavage dans la colonne et centrifuger à 17 900 × g pendant 1 min à 25 °C. Jetez le flux continu et remettez la colonne dans le même tube de collecte. Centrifugeuse à 17 900 × g pendant 2 min à 25 °C. Placez la colonne dans un tube propre de 1,5 ml.
    3. Ajouter 20 μL d’eau exempte de nucléases dans la colonne, centrifuger à 17 900 × g pendant 2 min à 25 °C, pour éluer l’ADN et mesurer la concentration à l’aide d’un spectrophotomètre.
  3. Utilisez le système de production d’ARN T7 dans la table des matériaux ou des kits équivalents pour transcrire in vitro 250 ng de l’ADN purifié. Des opérations et des conditions sans RNase sont requises.
    1. Préparez la réaction dans des tubes PCR (sans RNase) conformément au tableau 3, et mélangez délicatement. Incuber à 37 °C dans un bain métallique pendant 2 h.
    2. Ajouter 0,5 μL de DNase I (sans RNase) et mélanger délicatement. Incuber à 37 °C dans un bain métallique pendant 15-20 min.
    3. Précipitation de l’éthanol
      1. Ajoutez de l’eau exempte de RNase à chaque réaction pour que le volume final atteigne 20 μL, puis transférez les échantillons dans des tubes de 1,5 mL.
      2. Ajoutez 50 μL d’éthanol à 100 % (2,5 V, sans RNase), mélangez bien, placez le mélange sur de la glace pendant 10 min et centrifugez à 21 000 × g pendant 15 min à 4 °C.
      3. Jetez le surnageant, lavez la pastille avec 500 μL d’éthanol à 75 % (sans RNase) et centrifugez-la à 21 000 × g pendant 5 min à 4 °C.
      4. Jetez le surnageant, séchez la pastille à 45 °C dans un bain métallique et dissolvez-la avec 40 μL d’eau sans RNase.
        REMARQUE : Pour le KI, les ARNsg doivent être précipités par LiCl (voir ci-dessous), mais pour le KO, ce n’est pas nécessaire.
    4. Exécutez des gels d’agarose (Gel d’agarose : 1,2 % d’agarose dans un tampon TAE ; tampon TAE [Tableau 1] ; 200 V ; environ 5 min) avec 1-2 μL d’ARN pour estimer la qualité puis mesurer la concentration à l’aide d’un spectrophotomètre.
      REMARQUE : Les ARNsg peuvent être stockés à -20 °Cor -80 °C pour une utilisation ultérieure.

3. Préparation de l’ARNm Cas9

  1. Effectuer la digestion enzymatique du plasmide Cas9 (Table des matériaux) pendant plus de 1,5 h à l’aide de XbaI conformément aux instructions du fabricant (pour le mélange réactionnel, voir Tableau 3). Test par électrophorèse sur gel (Gel d’agarose : 1,2 % d’agarose dans un tampon TAE ; tampon TAE [Tableau 1] ; 200 V ; environ 10 min) avec 1 μL pour vérifier que la digestion est bien faite.
  2. Purifier les produits de la même manière que les produits de PCR à ARNsg (étapes 2.2.1-2.2.3). À partir de là, des matériaux et des opérations sans RNase sont nécessaires.
  3. Utilisez le kit de transcription T3 (Table des matériaux) ou des kits équivalents pour la transcription in vitro de l’ARNm Cas9.
    1. Préparez la réaction dans des tubes PCR sans RNase conformément au tableau 3 et mélangez délicatement. Incuber à 37 °C pendant plus de 2,5 h.
    2. Ajouter 1 μL de Turbo DNase sans RNase et incuber à 37 °C pendant 15 à 20 min.
    3. Précipitations LiCl
      1. Transférez les échantillons dans des tubes de 1,5 ml, ajoutez 30 μL de LiCl (1,5 V) et mélangez délicatement.
      2. Mettez le mélange à -20 °C pendant environ 30 min puis centrifugez à 21 000 × g pendant 30 min à 4 °C.
      3. Jetez le surnageant, lavez les granulés avec 500 μL d’éthanol à 75 % (sans RNase) et centrifugez-les à 21 000 × g pendant 5 min à 4 °C.
      4. Jetez le surnageant, séchez la pastille à 45 °C et dissolvez-la dans 40 μL d’eau sans RNase.
  4. Mesurez la concentration de l’ARNm Cas9 à l’aide d’un spectrophotomètre. Exécutez des gels d’agarose (Gel d’agarose : 1,2 % d’agarose dans un tampon TAE ; tampon TAE [Tableau 1] ; 200 V ; environ 10 min) avec 1-2 μL d’ARN pour vérifier la concentration et la qualité.
    REMARQUE : Une DO 260/280 doit être supérieure à 2,0 et sa concentration doit être supérieure ou égale à 1000 ng/μL. L’ARNm Cas9 peut être stocké à -20 °Cor -80 °C pour une utilisation ultérieure.

4. Préparation à la micro-injection

  1. Préparez le poisson-zèbre : La nuit avant la micro-injection, placez un poisson-zèbre femelle en bonne santé et deux poissons-zèbres mâles en bonne santé dans un bassin d’accouplement, à l’aide d’un séparateur pour séparer les mâles et les femelles afin de les préparer à l’accouplement.
  2. Préparez de l’agarose à 4 %, un tampon de lyse et un tampon d’embryon (pH 8,0) (tableau 1).
  3. Préparez les aiguilles en verre capillaire pour la micro-injection (Tableau des matériaux).
  4. Préparez des plaques de micro-injection : Versez 35 ml d’agarose fondu à 4 % dans une boîte de Pétri de 10 cm et posez délicatement un moule en plastique pour créer des auges en forme de coin. Évitez les bulles d’air en tapotant doucement le moule. Une fois qu’il s’est solidifié, ajoutez-y de l’eau distillée double (ddw) et placez la plaque à 4 °C pour une utilisation ultérieure.

5. Test d’efficacité de l’ARNsg par micro-injection

  1. Le jour de la micro-injection, préparer le mélange de microinjection comme indiqué au tableau 5 sur de la glace dans un environnement exempt de RNase.
  2. Chargez la solution de microinjection dans l’aiguille à l’aide d’une pointe de pipette sans RNase (table des matériaux). Attention à ne pas faire de bulles.
  3. Placez l’aiguille chargée dans un micromanipulateur fixé à un micro-injecteur. Coupez la pointe de l’aiguille d’injection au microscope à l’aide de la pince pointue, en pinçant doucement la pointe de l’aiguille pour la casser. Ensuite, ajustez la pression d’injection jusqu’à ce que l’aiguille éjecte constamment une gouttelette de 1 nL, qui est quantifiée à l’aide d’un micromètre à étages et d’un capillaire.
  4. Retirez le séparateur et laissez le poisson se reproduire pendant environ 6 min. Prélever et transférer les embryons au stade 1 cellule dans une boîte de Pétri contenant un tampon d’embryons.
    1. Examinez la santé des embryons au microscope optique et retirez tous les œufs ou débris non fécondés. Réservez 20 embryons sains comme témoins non injectés dans une boîte de Pétri séparée et étiquetez-les.
  5. Transférez et alignez doucement les embryons sains au stade 1 cellule sur les rainures de la plaque de micro-injection réchauffées à température ambiante (RT) à l’aide d’une petite brosse. Retirez l’excédent de tampon.
  6. Effectuez toutes les opérations ultérieures sous un stéréomicroscope. À l’aide de la pointe de l’aiguille, ajustez doucement la position de l’embryon de manière à ce que le pôle de l’animal fasse face à l’aiguille. Injecter 1 nL de la solution mélangée dans le poteau de l’animal.
  7. Environ l’injection de 100 embryons est suffisante pour un ARNsg. Après l’injection, rincez doucement les embryons dans une plaque à six puits avec tampon pour embryons. Placez le plat dans un incubateur à température constante de 28,5 °C. Environ 10 h après la fécondation (hpf), examinez le développement embryonnaire au stéréomicroscope et retirez les embryons morts.
  8. À 24 hpf, prélever les embryons dans des tubes de 1,5 mL pour le génotypage (3 tubes par ARNsg et 5 embryons par tube). Jeter soigneusement l’eau supplémentaire à l’aide d’une pipette, ajouter 100 μL de tampon de lyse contenant de la protéinase K (à une concentration finale de 0,5 mg/mL) dans chaque tube, puis incuber à 56 °C pendant 1 h, puis à 95 °C pendant 15 min.
  9. Ajouter 200 μL d’éthanol (2V), bien mélanger et centrifuger à 19 000 × g pendant 10 min à RT.
  10. Jetez le surnageant, lavez la pastille avec 500 μL d’éthanol à 70 % et centrifugez-la à 19 000 × g pendant 3 min à RT.
  11. Jetez le surnageant, séchez la pastille à RT et dissolvez-la avec 50 μL de ddw. Ensuite, utilisez 1 μL des extraits pour préparer le mélange réactionnel pour la PCR (tableau 3) (pour les amorces de PCR, voir l’étape 1.4).
  12. Exécutez des gels d’agarose (Gel d’agarose : 1,2 % d’agarose dans un tampon TAE ; tampon TAE [Tableau 1] ; 200 V ; environ 10 min) avec 2 μL de produits de PCR pour confirmer que la PCR est réussie, puis effectuer des digestions enzymatiques (Tableau 3) pour déterminer l’efficacité des ARNsg. Mélangez délicatement le mélange de digestion enzymatique. Incuber à la température pendant la période de temps suggérée par le fabricant.
  13. Exécutez des gels d’agarose pour les produits digérés (Gel d’agarose : 1,2 % d’agarose dans un tampon TAE ; tampon TAE [Tableau 1] ; 200 V ; environ 10 min) avec les produits PCR non digérés comme témoins pour confirmer si la digestion a lieu.
    REMARQUE : Le site de clivage de Cas9 est à environ 3 pb en amont du PAM, donc le site de reconnaissance de l’enzyme de restriction est le meilleur pour couvrir 6 pb en amont du PAM. Si l’efficacité de l’ARNsg est élevée, la coupe et la mauvaise réparation entraîneront des indels, il est donc fort possible que l’enzyme de restriction ne puisse plus reconnaître le site de coupe. Si l’ARNsg est inefficace et que le site de reconnaissance de l’enzyme de restriction est intact, la digestion enzymatique peut se produire normalement. Grâce à l’électrophorèse sur gel d’agarose, on peut distinguer s’il y a eu digestion enzymatique.
  14. S’il n’y a pas de site de reconnaissance d’enzymes de restriction approprié, séquencez les produits de PCR et analysez l’efficacité de l’ARNsg par MARÉE (https://tide.nki.nl/). N’oubliez pas de faire de la PCR et de séquencer l’ADN génomique WT comme contrôle.
    1. Ouvrez le site Web et cliquez sur Démarrer la marée. Entrez la séquence guide de l’ARNsg dans le cadre sous Séquence guide.
    2. Cliquez sur Parcourir sous Chromatogramme d’échantillon de contrôle (.ab1 ou .scf) pour saisir le résultat de séquençage de la commande WT et cliquez sur Parcourir sous Chromatogramme d’échantillon de test (.ab1 ou .scf) pour saisir le résultat de séquençage de l’échantillon modifié.
    3. Cliquez sur Mettre à jour la vue. Le site Web donnera un pourcentage de la différence entre les deux séquences. Un pourcentage plus élevé indique une efficacité plus élevée de l’ARNsg. Un ARNsg avec une efficacité d’inactivation supérieure à 80 % convient aux procédures KI ultérieures.

6. Construction du plasmide donneur pour le marquage des protéines fluorescentes

  1. Concevez des séquences qui seraient d’abord clonées dans le plasmide, puis insérées dans le génome du poisson comme la figure 2 : une séquence de 25 pb en amont du site de clivage de Cas9 prédit est conçue comme le bras d’homologie gauche, et une séquence de 25 pb en aval du site de clivage de Cas9 prédit est le bras d’homologie droit. Introduire des CDS entre le site cible de l’ARNsg et le codon stop chez le donneur pour maintenir l’intégrité du gène endogène.
    REMARQUE : Le 5' du CDS complété (élément 4 de la figure 2) doit être muté de manière synonyme pour éviter le clivage secondaire du génome recombinant par le complexe sgRNA/Cas9.
  2. Utilisez le clonage indépendant de la ligature (LIC)14 à l’aide de l’exonucléase III (Table des matériaux) pour la construction du plasmide du donneur. D’autres méthodes, telles que l’assemblage Gibson, sont également réalisables. Les amorces de clonage sont illustrées à la figure 2. Les éléments « 1 », « 2 », « 3 » et « 4 » sont portés par les amorces :
    1. Design Primer F1, qui est composé d’une séquence superposée avec le vecteur, l’élément « 1 » et une partie de l’élément « 2 ».
    2. Design Primer R2, qui est composé d’une partie de l’élément « 1 », de l’élément « 2 » et de l’élément « 3 ».
    3. Concevez l’amorce F2, qui est composée des éléments « 3 », « 4 » et de la séquence 5' du CDS suivant le site cible de l’ARNsg.
    4. Concevez l’abécédaire R1, qui est composé de la séquence 3' du CDS du gène et d’une séquence chevauchant avec le vecteur.
    5. Utilisez l’ADNc du poisson-zèbre comme matrice et effectuez des PCR à l’aide des amorces.
      REMARQUE : Le chevauchement recommandé entre les amorces ou entre l’amorce et le vecteur est de 15-20 pb. Ces amorces sont spécifiques au gène cible, et un exemple des amorces pour cx39.9 et cx44.1 est donné dans le tableau 2. Cette conception a été appliquée avec succès comme décrit précédemment13. Des cartes détaillées des plasmides sont fournies dans le Fichier supplémentaire 1 et le Fichier supplémentaire 2. Les séquences d’ADN et de protéines conçues de cx39.9 et cx44.1 sont fournies dans le fichier supplémentaire 3.
    6. Purifier les produits PCR de la même manière que les produits PCR sgRNA (étapes 2.2.1-2.2.3).
  3. Digérer le vecteur donneur (figure 3 et tableau 6) à l’aide d’enzymes de restriction appropriées. Dans cet exemple, les enzymes sont PciI et Acc65I (Table of Materials). Effectuez le conformément aux instructions du fabricant (tableau 3). Purifier le vecteur donneur digéré de la même manière que les produits de PCR à ARNsg (étapes 2.2.1-2.2.3).
  4. Quantifier les fragments de PCR purifiés et le vecteur donneur digéré par électrophorèse sur gel d’ADN (gel d’ADN : 1,2 % d’agarose dans un tampon TAE ; tampon TAE [Tableau 1] ; 200 V ; environ 10 min). Préparez le mélange réactionnel pour le LIC conformément au tableau 3.
    REMARQUE : Tous les tubes et composants de la réaction doivent être placés sur de la glace, et la réaction et toutes les manipulations doivent être effectuées sur de la glace. Ajoutez 1 μL d’Exo III (20 unités) à la réaction en tant que dernier composant, puis pipetez immédiatement de haut en bas pour bien mélanger tous les composants. N’oubliez pas d’inclure un mélange réactionnel sans fragments de PCR comme contrôle pour montrer le potentiel d’auto-recuit du vecteur digéré.
  5. Placez immédiatement le mélange réactionnel sur de la glace et incubez pendant 60 min.
  6. Ajouter 1 μL d’EDTA 0,5 M (pH 8,0) pour arrêter la réaction, pipeter de haut en bas pour bien mélanger, puis incuber à 60 °C pendant 5 min, puis sur de la glace pendant 5 min.
  7. Transformez des cellules compétentes, telles que le DH5α, à l’aide des produits LIC et cultivez les bactéries sur des plaques LB (Table des matériaux et Tableau 1) avec des antibiotiques appropriés (Ampicilline dans ce cas) pendant 16 h.
  8. Assurez-vous qu’il y a des différences de plusieurs ordres de grandeur entre le nombre de colonies sur les plaques contenant des fragments de PCR et celui sur la plaque de contrôle. Choisissez des colonies uniques dans les plaques LIC pour l’analyse de la digestion enzymatique et le séquençage de l’ADN.
  9. Extrayez et purifiez les plasmides de donneurs corrects à l’aide d’un kit de purification de la même manière que les produits de PCR à ARNsg (étapes 2.2.1-2.2.3). Assurez-vous que la concentration finale est supérieure à 300 ng/μL.

7. Micro-injection d’embryons de poisson-zèbre pour le gène KI

  1. Effectuer toutes les manipulations de microinjection décrites ci-dessus, à l’exception de la préparation de la solution de microinjection conformément au tableau 7.

8. Criblage et identification de la descendance marquée par des protéines fluorescentes

  1. Observer la fluorescence au microscope à stéréofluorescence 12 à 48 h après la microinjection.
  2. Appliquer une méthode d’écran nouvellement établie13. Si une fluorescence évidente est observée, choisissez les larves fluorescentes et élevez-les. Si seule une trace de fluorescence ou même aucune fluorescence n’est observée, élevez toutes les larves injectées.
  3. À l’âge de 1 mois, anesthésier un poisson-zèbre micro-injecté avec 0,02 % de tricaïne (tableau 1). Pour chaque poisson-zèbre, prélevez un petit morceau de la nageoire caudale dans un tube PCR étiqueté et conservez le poisson-zèbre anesthésié correspondant dans un puits d’une plaque à six puits contenant de l’eau filtrée stérilisée aux UV (pH 7,2) avec la même étiquette.
  4. Utiliser la méthode de lyse alcaline (tampon de lyse dans le tableau 1)15 pour l’extraction de l’ADN génomique, suivie de la PCR à jonction 5'. Concevez l’amorce avant en amont du bras d’homologie gauche et l’amorce inverse sur l’insert (Figure 4). La taille du produit PCR est d’environ 500 pb. Pour des exemples d’amorces, voir le tableau 2.
    REMARQUE : Pour le poisson-zèbre fluorescent, cette PCR est utilisée pour vérifier l’exactitude du KI, de sorte que le produit PCR est ensuite soumis à un séquençage. Pour le poisson-zèbre sans fluorescence, cette PCR est utilisée pour vérifier la présence de KI. Choisissez les poissons positifs à la PCR et élevez-les jusqu’à l’âge adulte avec une valeur F0.
  5. Examiner les embryons F1 obtenus par accouplement du F0 criblé avec WT pour les profils d’expression de la GFP et génotypés par PCR de jonction.
    REMARQUE : Si l’insertion de la cible se produit dans F1 (qu’elle soit parfaite ou non), le F0 correspondant est défini comme F0 héréditaire, dont le produit PCR est ensuite séquencé. Si l’insertion est précise, le F0 correspondant est défini comme le F0 souhaité.
  6. Lorsque leF-0 souhaité est obtenu, utilisez la descendance pour l’imagerie afin d’observer et de suivre la protéine cible.

9. Imagerie et traitement des données

  1. Déterminer le stade de développement à imager. Préparez le poisson à l’avance. Ajouter de la 1-phényl-2-thiourée diluée (PTU ; 0,003 %, tableau des matières) au poisson pour éliminer les pigments si nécessaire.
    REMARQUE : Le PTU serait moins efficace s’il était appliqué après 24 hpf. Dans cet exemple, la PTU a été ajoutée au tampon embryonnaire avant 24 hpf et conservée dans le tampon jusqu’à 48 hpf lorsque les larves de poisson-zèbre ont été traitées pour l’imagerie.
  2. Ajouter 2 ml d’agarose fondu à 4 % (tableau 1) dans un plat de 35 mm et laisser reposer pour qu’il se solidifie. Transférez le poisson dans la zone tampon d’embryons contenant 0,02 % de tricaïne (tableau 1).
  3. Diluer 200 μL d’agarose fondue à 4 % dans 1 mL de ddw. Transférez le poisson anesthésié dans l’agarose diluée à l’aide d’une pipette de 1 mL lorsque l’agarose refroidit. Mélangez délicatement et transférez l’agarose montable dans le plat contenant du gel d’agarose solidifié à 4 % préparé à l’étape 9.2.
  4. Positionnez le poisson de manière à ce que la partie d’intérêt soit sur le dessus.
  5. Utilisez un microscope confocal à fluorescence droit pour l’imagerie et le traitement des données en suivant les instructions du fabricant (Tableau des matériaux).

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Résultats

Les jonctions lacunaires constituées de protéines polymères appelées connexines sont essentielles à l’échange de métabolites et d’ions de faible poids moléculaire entre les cellules en contact. La méthode de marquage des protéines par fluorescence décrite ci-dessus a été utilisée pour marquer la connexine 39.9 (figure 5A) et la connexine 44.1 (figure 5B), respectivement. Le KI correct a été vérifié par PCR de jonction (figu...

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Discussion

Pour mener à bien cette expérience sans heurts et avec succès, il faut accorder plus d’attention à certains aspects importants. Le stade de développement optimal du poisson-zèbre pour l’injection devrait être le stade unicellulaire. L’injection complète à ce stade peut garantir que toutes les cellules produites par division ultérieure contiennent les composants nécessaires au KI, augmentant ainsi la probabilité d’apparition simultanée du KI dans toutes les cellules et améliorant le taux ...

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Déclarations de divulgation

Tous les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent dans cet article.

Remerciements

Nous remercions Lu Zhou (Université de Xiamen) pour la relecture et l’édition de ce manuscrit. Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (subvention 82388201 à J.H. ; subvention 31801158 à Y.Z.), le National Key R&D Program of China (2020YFA0803500 à J.H.), le CAMS Innovation Fund for Medical Sciences (CIFMS) (2019-I2M-5-062 à J.H.), le Fujian Province Central to Local Science and Technology Development Special Program (2022L3079 à J.H.), et le Programme de coopération du district de FuXia-Quan Zi-Chuang (3502ZCQXT2022003 à J.H.). Les bailleurs de fonds n’ont joué aucun rôle dans la conception de l’étude, la collecte et l’analyse des données, les décisions de publication ou la préparation du manuscrit.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
1000 et micro ; L  ; conseilsN’importe quelle marqueN/APour toutes manipulations Tubes
1,5 mLToute marqueN/APour le stockage et la centrifugation de solutions diverses Tubes de
1,5 mL (sans RNase)Toute marqueN/APour le stockage et la centrifugation de solutions sans RNase
10 & micro ; L pointesN’importe quelle marqueN/APour toutes les manipulations
10 µ ; Embouts L (sans RNase)N’importe quelle marqueN/APour les manipulations sans RNase
1000 & micro ; L  ; pointes (sans RNase)Toute marqueN/APour les manipulations sans RNase
1-phényl 2-thiourée (PTU)SigmaP7629Pour inhiber la mélanogénèse et garder les larves transparentes
200 µ ; L pointesN’importe quelle marqueN/APour toutes manipulations
200 µ ; Embouts L (sans RNase)N’importe quelle marqueN/APour les manipulations sans RNase
2x Taq Plus Master Mix II (Dye Plus)VazymeP213-03PCR pour les tests d’efficacité de l’ARNg
Boîtes de 35 mmCorning430165Pour l’imagerie
Plaques à 6 puitsN’importe quelle marqueN/APour l’élevage individuel et temporaire du poisson-zèbre
Acc65INEBR0599SPour digestion enzymatique
Acide acétiqueSigma695092Pour la préparation de tampons TAE
AgarBiofroxx8211GR500Pour plaques LB
Ampicilline, sel de sodiumSangonA610028Pour les plaques LB
CaCl2SigmaC5080Pour la préparation de tampons embryonnaires
Tubes capillairesAppareilde Harvard30-0016Pour générer des aiguilles pour l’injection
Tubes capillairesN’importe quel(diamètre intérieur) = 0,1 mmPour quantifier une gouttelette de 1 nL
CRISPRscanCRISPRscan  ; http://www.crisprscan.org/Pour la conception d’ARNsg
DH5&alpha ;TIANGENCB101Pour la transformation
EDTASigmaE6758Pour la préparation du tampon de lyse et du tampon TAE
EnsemblEnsembl  ; https://asia.ensembl.org/Danio_rerio/Info/IndexPour trouver des informations génétiques
ÉthanolHUSHI64-17-5Pour la purification et l’extraction de l’ADN
Exonucléase IIITakara2170ALIC
Micro-injecteur à gazWarner InstrumentsPLI-100APour la micro-injection
Système d’électrophorèse sur gelWIXWIX-EP3000Pour gel Gants d’électrophorèse
N’importe quelle marqueN/APour toutes manipulations
Glucosesgdbio10010518Pour plaques LB
GlycérolSangonA501745Pour plaques LB
gRNA-pMD19-TChina Zebrafish Resource Center (CZRC)CZP3Plasmide sgRNA contenant sgRNA scaffold
KClSigmaP5405Pour embryon préparation du tampon
Solution de précipitation de chlorure de lithiumThermofisherAM9480Précipitation d’ARNsg, sans RNase
Agarose à bas point de fusionSangonA600015Pour la préparation de gels d’agarose à 4 %
Sulfate de magnésiumsgdbio20025118Pour plaques LB
Bain métalliqueN’importe quelle marqueN/APour l’incubation à température constante
Bleu de méthylèneSigmaM9140Pour la préparation du tampon d’embryons
Moule de micro-inectionMaisonN/APour générer des rainures pour maintenir les embryons pendant la micro-injection
Microloader, embout pour remplir Femtotips et autres microcapillaires en verre, stérile, 0,5 &ndash ; 20 & micro ; L, 100 mm, gris clair, 192 pièces (2 paniers & fois ; 96 pièces)Eppendorf5242956003Pour charger la solution de micro-injection dans l’aiguille d’injection, sans RNase
Extracteur de micropipettesSutter InstrumentP-97Pour générer des aiguilles pour l’injection
MicropipettesEppendorfN/APour toutes manipulations
Micro-ondesN/A N’importe quelle marqueN/APour couler des plaques d’injection et des gels d’agarose
MinElute PCR Kit de purification (50)QIAGEN28004Pour purifier les produits de PCR et les produits de digestion,
mMESSAGE sans RNase mMACHINE T3 TranscriptionKit InvitrogenAM1348Transcription in vitro de l’ARNm Cas9, sans RNase
N2Toute marqueN/APour la micro-injection
NaClSigmaS5886Pour la préparation du tampon embryon et du tampon de lyse
NaHCO3SigmaS5761Pour la préparation d’un tampon embryonnaire
NaOHSangonA100173Pour la préparation
d’un tampon TAE Eau sans nucléaseThermofisherR0581Manipulations liées à l’ARN, sans RNase
PciINEBR0655SPour la digestion enzymatique
Appareil PCRN’importe quelle marqueN/AAmplification PCR Tubes de bandelettes
PCRN’importe quelle marqueN/APour
tubes PCRFEITONGKANGblp-200Pour PCR
Boîte de PétriN’importe quelle marqueN/APour l’élevage de larves de poisson-zèbre, etc.
Rouge phénoliqueSigmaP0290Pour la micro-injection, sans RNase Porte-pipette
Warner InstrumentsPLI-PH1Pour la micro-injection
PrimeStar (Premix)TakaraDR040APour le clonage moléculaire
Protéinase KMerck539480Pour l’extraction de l’ADN génomique
pT3TS (T3 :zCas9-UTRglobin)Centre de ressources sur le poisson zèbre de Chine (CZRC)Modèle plasmidiqueCZP11
Centrifugeuse réfrigéréeN’importe quelle marqueN/APour la centrifugation liée à l’ARN
BalanceSartoriusBCE124-1CCNPour la coulée de plaques d’injection et de gels d’agarose
CiseauxN’importe quelle marqueN/APour couper
les queues de poissons adultes FDSSangonA600485Pour la préparation
du tampon de lysePetites brossesN’importe quelle marqueN/APour déplacer doucement les embryons sur des plaques de micro-injection
SpectrophotomètreThermofisherNanoDrop 2000Pour les mesures de concentration d’ADN/ARN
Micromètre de platineN’importe quelle marqueDIV (Division) = 0,01 mmPour quantifier une gouttelette de 1 nL
Microscope à stéréofluorescenceOlympusSZX16Pour l’observation de l’expression des gènes
StéréomicroscopeMoticSMZ-168Pour l’observation et la micro-injection
T7 RiboMAX Express Système de production d’ARN à grande échellePromegaP1320Transcription in vitro d’ARNsg, sans RNase
Incubateur à température contrôléeN’importe quelle marqueN/APour l’incubation d’embryons
TIDETIDEhttps://tide.nki.nl/Pour l’analyse de l’efficacité de l’ARNg  ;
Méthanesulfonate de tricaïneSigmaA5040Pour la préparation de la solution de tricaïne
TrisSangonA600194Pour la préparation de la solution de tricaïne, du tampon de lyse et du tampon TAE
TryptoneOXOIDLP0042Pour les plaques LB
Pince à épilerN’importe quelle marqueN/APour couper les aiguilles d’injection
XbaINEBR0145SPour enzymatique digestion
Extrait de levureOXOIDLP0021Pour plaques LB
Système d’aquarium pour poisson zèbreESENESEN-AW-S1Pour l’élevage de poissons adultes
Bassins d’accouplement de poissons-zèbres (avec séparateur)N’importe quelle marqueN/APour l’accouplement des poissons
Zeiss LSM 900+Airyscan2ZEISSZeiss LSM900Pour l’imagerie confocale des poissons marqués à la fluorescence et l’analyse des données
Site webZFINZFIN http://zfin.org/Pour trouver des informations sur les gènes
de identifiant de marque les Cas9

Références

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Mots-clés

Imagerie du poisson z breinsertion CRISPR Knock Inmarquage g niquemicroinjection du poisson z breconception d ARN guide sgRNAconstruction de plasmides donneursimagerie in vivo du poisson z bretra age prot ique

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