Etablissement et comparaison de méthodes de détection de l’activité T6SS basées sur la fluorescence chez Acinetobacter baumannii

Summary

Ici, nous proposons une méthode de détection quantitative basée sur le marquage fluorescent (en particulier la luciférase) pour évaluer efficacement et précisément l’activité de la T6SS bactérienne, qui convient à l’analyse à haut débit des souches cliniques.

Abstract

Le système de sécrétion de type VI (T6SS) est un mécanisme crucial qui médie les interactions intercellulaires chez les bactéries à Gram négatif, en particulier chez les espèces pathogènes telles que Acinetobacter baumannii. Des études antérieures ont montré que le grand plasmide pAB3 de la souche ATCC 17978 d’A. baumannii code pour une protéine de type TetR qui inhibe l’expression des gènes T6SS de base. En revanche, la souche WT^R- , qui n’a pas de pAB3, peut exprimer et sécréter de manière stable la protéine effectrice T6SS Hcp et présente la capacité de tuer E. coli. Le gène tssM , l’un des gènes centraux de T6SS, est essentiel à son activité ; sa suppression conduit directement à l’inactivation de T6SS. Cependant, les méthodes traditionnelles de détection de l’activité du T6SS, telles que les tests de destruction, souffrent d’un faible débit et d’une sensibilité insuffisante. Pour remédier à ces limitations, nous avons développé des méthodes de détection quantitatives basées sur le marquage fluorescent.

Pour améliorer la détection de l’activité T6SS, nous avons développé trois méthodes de marquage fluorescent : (1) Une méthode de détection quantitative basée sur le marquage à la luciférase, qui se caractérise par une spécificité, une sensibilité et une reproductibilité élevées, ce qui la rend adaptée à l’analyse à haut débit ; (2) Une méthode de détection basée sur le marquage de la protéine fluorescente verte (GFP), qui, bien qu’elle soit sensible aux interférences environnementales, offre l’avantage d’un débit élevé ; (3) La détection par cytométrie en flux, qui permet d’évaluer quantitativement la viabilité bactérienne, mais qui est complexe et coûteuse sur le plan opérationnel. Après une comparaison complète, la méthode d’étiquetage basée sur la luciférase s’est avérée être la plus précise, la plus sensible et la plus conviviale. Lorsqu’elle a été appliquée à 20 isolats cliniques d’A. baumannii, il a été confirmé que cette méthode permettait d’évaluer rapidement et précisément l’activité de T6SS.

Introduction

Le système de sécrétion de type VI (T6SS) est un système de sécrétion protéique important chez les bactéries à Gram négatif, largement impliqué dans la compétition bactérienne, l’antagonisme contre les hôtes eucaryotes et la régulation des réponses immunitaires de l’hôte ^1,2. En injectant des protéines effectrices toxiques dans les bactéries voisines ou les cellules eucaryotes, T6SS aide les bactéries à conserver un avantage concurrentiel dans des environnements complexes. Au cours des dernières années, le rôle important de T6SS dans l’adaptabilité bactérienne, la pathogénicité et les interactions microbiennes en a fait un point chaud de la recherche, en particulier chez les agents pathogènes multirésistants, où ses fonctions fournissent des cibles potentielles pour le développement de nouvelles stratégies antibactériennes ^3,4,5.

Acinetobacter baumannii (Ab) est un pathogène opportuniste à Gram négatif largement répandu en milieu hospitalier. En raison de sa résistance élevée aux médicaments et de sa forte capacité d’adaptation, il est devenu un agent pathogène nosocomial important dans le monde^{entier 6,7,8}. La survie d’A. baumannii dans des environnements microbiens complexes repose sur de multiples systèmes de sécrétion, parmi lesquels T6SS joue un rôle clé dans sa compétition avec d’autres microbes et ses interactions avec l’hôte. Avec son groupe de gènes T6SS hautement conservé et ses fonctions bien définies, A. baumannii est devenu un modèle idéal pour étudier les mécanismes T6SS. De plus, la structure unique du T6SS chez A. baumannii offre une perspective distincte pour révéler davantage la diversité et les fonctions du T6SS.

Le groupe de gènes T6SS d’A. baumannii contient 12 gènes protéiques de base (tels que tssA-tssM, manquant de tssJ) et plusieurs gènes aux fonctions inconnues (tels que tagX, tagN, tagF, etc.)^{2, 9, 10}. Parmi eux, la protéine corégulée par l’hémolysine (Hcp) est un composant important de la T6SS, et sa sécrétion est considérée comme une caractéristique de la T6SS fonctionnelle. Des études ont montré que le grand plasmide pAB3 d’A. baumannii inhibe l’expression de T6SS en codant pour une protéine régulatrice de type TetR. En revanche, les souches qui ont perdu pAB3 (comme WT^R-) peuvent exprimer et sécréter Hcp de manière stable, présentant une activité significative de T6SS¹¹. Le gène tssM est l’un des gènes centraux de T6SS, et sa délétion conduit directement à l’inactivation de T6SS.

Cependant, les méthodes traditionnelles de détection de l’activité du T6SS (telles que les tests de destruction) ont des limites telles qu’un faible débit, une faible reproductibilité et une sensibilité insuffisante, ce qui limite considérablement l’étude approfondie et l’application généralisée du T6SS⁵. Par conséquent, le développement de méthodes efficaces et précises de détection de l’activité T6SS est devenu un besoin urgent dans la recherche actuelle. Cette étude vise à établir et comparer des méthodes de détection de l’activité T6SS basées sur le marquage fluorescent afin de pallier les lacunes des méthodes traditionnelles. Grâce à la technologie de marquage fluorescent, nous avons réalisé un suivi quantitatif en temps réel de l’activité de T6SS, fournissant un outil plus précis et plus fiable pour l’étude des interactions bactériennes. Cette étude a permis de valider l’efficacité des méthodes de marquage fluorescent et, en comparant les avantages et les inconvénients de différentes stratégies de marquage fluorescent, a fourni de nouvelles perspectives et un soutien méthodologique pour les recherches futures. Il offre non seulement de nouveaux moyens techniques pour la recherche sur le T6SS, mais pose également une base scientifique pour comprendre les mécanismes complexes des interactions bactériennes et développer de nouvelles stratégies thérapeutiques antibactériennes.

Protocol

1. Sources de souches et de plasmides

1. Utilisez la souche étalon ATCC 17978 d’A. baumannii , E. coli (pZY01) et la souche clinique d’A. baumannii isolée du Département de médecine de laboratoire du Premier hôpital de l’Université de Jilin.
2. Utilisez le plasmide pZY01-GFP (porteur d’un gène de résistance à la kanamycine, capable d’une expression stable chez A. baumannii), qui a été modifié et conservé en laboratoire, et le plasmide pGEN-luxCDABE acheté dans le commerce (portant un gène de résistance à l’ampicilline).
3. Culture d’A. baumannii et d’E. coli dans un milieu Luria-Bertani (LB) ou un milieu minimal contenant : 50 mM de tampon de phosphate de potassium (pH 7,4), 15 mM (NH₄)₂SO₄, 2 mM de MgSO₄, 0,2 % (p/v) de succinate de sodium comme seule source de carbone et 0,01 % (p/v) d’extrait de levure¹². Ajouter des antibiotiques aux concentrations suivantes au besoin : E. coli : ampicilline (100 μg/mL) et kanamycine (50 μg/mL) ; A. baumannii : streptomycine (100 μg/mL).
   REMARQUE : E. coli (pZY01) et E. coli (pZY01-GFP) expriment une résistance à la kanamycine. E. coli (pZY01) n’a pas de marqueur fluorescent, il peut donc être appelé E. coli dans le texte suivant.

2. Préparation des souches bactériennes avant l’expérience

1. Récupérez les souches bactériennes du congélateur à -80 °C 2 jours avant l’expérience. Inoculer les souches bactériennes sur des plaques de gélose LB contenant les antibiotiques correspondants. Incuber les plaques toute la nuit à 37 °C.
   REMARQUE : Assurez-vous que toutes les cellules conservent les plasmides au début de l’expérience.
2. Choisissez deux colonies individuelles indépendantes de chaque souche bactérienne 1 jour avant l’expérience. Inoculer chaque colonie séparément dans deux tubes individuels contenant 5 mL de milieu liquide LB. Incuber les cultures pendant la nuit à 37 °C en secouant à 200 tr/min. Utilisez ces cultures pour des expériences ultérieures.
   REMARQUE : Optimisez le temps d’incubation en fonction du taux de croissance bactérienne pour assurer l’obtention d’une quantité adéquate de biomasse bactérienne.

3. Préparation des souches d’E. coli (GFP)/ E. coli (luciférase)

1. Transformation
   1. Ajouter 50 ng d’ADN plasmidique (pZY01-GFP ou pGEN-luxCDABE, quantifié via NanoDrop à A260/A280) dans 100 μL de cellules compétentes DH5α d’E. coli , respectivement, et mélanger doucement.
   2. Incuber sur glace pendant 30 min, subir un choc thermique à 42 °C pendant 60 s et placer immédiatement sur de la glace pendant 30 s.
   3. Ajouter 700 μL de bouillon LB sans antibiotique et incuber à 37 °C en agitant à 180 tr/min pendant 2 h.
2. Placage et culture
   1. Centrifuger à 420 × g pendant 2 min, jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 100 μL de bouillon LB sans antibiotique.
   2. Étaler le produit de transformation pZY01 (GFP) sur des plaques de gélose LB contenant 50 μg/mL de kanamycine.
   3. Étaler le produit de transformation pGEN-luxCDABE sur des plaques de gélose LB contenant 100 μg/mL d’ampicilline. Incuber à 37 °C pendant la nuit.
3. Vérification des clones positifs
   1. Choisissez des colonies uniques et extrayez l’ADN sous forme de modèles de réaction en chaîne par polymérase (PCR) le lendemain. Effectuer une amplification PCR et vérifier par électrophorèse sur gel d’agarose.
   2. Confirmez les souches positives et étiquetez-les comme E. coli (GFP) et E. coli (Luciférase).
      REMARQUE : Assurez-vous que la qualité des cellules compétentes est élevée pour une transformation efficace. Évitez l’excès de liquide bactérien pendant le placage pour éviter toute interférence avec l’isolement d’une seule colonie.

4. Transfert Western

1. Préparation des échantillons
   1. Prélever des cultures bactériennes et centrifuger (1500 × g, 10 min, 4 °C) pour séparer la pastille cellulaire et le surnageant.
   2. Ajoutez une quantité appropriée de tampon de charge à la fois à la pastille de cellule et au surnageant. Faire bouillir à 100 °C dans un bain métallique pendant 10 min. Centrifuger (1500 g, 10 min, 4 °C) et recueillir les surnageants sous forme d’échantillons de protéines.
   3. Mesurez la concentration en protéines à l’aide de l’acide bicinchoninique (BCA) ou de la méthode Bradford et ajustez-la à la même concentration.
2. Électrophorèse sur gel de dodécylsulfate-polyacrylamide de sodium (SDS-PAGE)
   1. Préparez des gels SDS-PAGE à des concentrations appropriées (p. ex., gel de séparation à 12 %, gel d’empilement à 5 %)¹³.
   2. Chargez des échantillons de protéines de 20 μg dans les puits de gel avec un marqueur de protéines pré-coloré de 1 à 2 μL. Effectuez une électrophorèse à 100-120 V jusqu’à ce que l’indicateur bleu de bromophénol atteigne le bas du gel.
      REMARQUE : Tampon courant : Tris 25 mM, Glycine 192 mM, SDS 0,1 % (p/v), eau distillée à 1 L.
3. Transfert (Western Blot)
   1. Retirez le gel des plaques de verre et trempez-le dans un tampon de transfert. Préparez une membrane de difluorure de polyvinylidène (PVDF) ou de nitrocellulose (NC), activez la membrane PVDF avec du méthanol, puis trempez-la dans un tampon de transfert.
      REMARQUE : Tampon de transfert : 25 mM de Tris, 192 mM de glycine, 20 % de méthanol
   2. Assembler l’appareil de transfert dans une structure « sandwich » (papier filtre-gel-membrane-papier filtre). Transfert à 100 V pendant 60 à 90 min (ajuster le temps en fonction du poids moléculaire de la protéine ; Les protéines de la cellule hôte (HCP) ont un poids moléculaire d’environ 17 kDa).
      REMARQUE : Placez le réservoir de transfert dans de l’eau glacée et ajoutez des blocs réfrigérants pour maintenir une température basse. Si le temps de transfert est long, remplacez les blocs réfrigérants à mi-chemin.
4. Bloquant
   1. Après le transfert, placez la membrane dans une solution de blocage du lait écrémé à 5 %. Bloquer à température ambiante (RT) sur un agitateur pendant 1 h ou toute une nuit à 4 °C.
5. Incubation primaire de l’anticorps
   1. Laver la membrane trois fois avec une solution saline tamponnée Tris (TBS) contenant 0,1 % de tampon Tween 20 (TBST), 5 min à chaque fois. Incuber la membrane avec des anticorps primaires dilués (anticorps anti-Hcp de souris, dilution 1:1000 ; anticorps anti-isocitrate déshydrogénase (ICDH) de souris, dilution 1:1000) à 4 °C pendant la nuit ou RT pendant 2 h.
6. Incubation secondaire d’anticorps
   1. Laver la membrane avec un tampon TBST 3 fois, 5 min chacune. Incuber la membrane avec un anticorps secondaire dilué (IgG anti-souris conjuguées à la peroxydase de raifort [HRP], dilution 1:3000) à RT pendant 2 h.
7. Détection
   1. Laver la membrane avec un tampon TBST 3 fois, 5 min chacune. Préparez le substrat chimiluminescent ECL et appliquez-le uniformément sur la membrane.
   2. Détecter des signaux à l’aide d’un système d’imagerie par chimiluminescence et capturer des images (la protéine HCP a un poids moléculaire d’environ 17 kDa, l’ICDH est une enzyme métabolique cytoplasmique dont le poids moléculaire attendu est d’environ 45 kDa chez A. baumannii).
      REMARQUE : L’ICDH est un marqueur de contrôle de la qualité important qui ne peut être détecté que dans la fraction de pastilles cellulaires (contenant des bactéries intactes) et non dans la fraction surnageante (contenant des protéines sécrétées), démontrant ainsi qu’aucune lyse cellulaire ne s’est produite pendant la préparation de l’échantillon. La sécrétion de Hcp (17 kDa) ne devrait être visible que dans les surnageants des souches actives T6SS.

5. Préparation de plaques à 96 puits avec un milieu gélosé LB

1. Ajouter rapidement un milieu gélosé LB autoclavé sans antibiotique, préchauffé, dans une plaque stérile de 96 puits, à raison de 50 μL par puits. Laissez la plaque reposer à RT pendant au moins 1 h pour assurer une solidification complète du fluide.
2. Utilisez des plaques à parois noires avec un fond transparent pour détecter la fluorescence GFP.
3. Utilisez des plaques à 96 puits étanches à la lumière pour détecter la fluorescence de la luciférase afin d’éviter les interférences de fluorescence entre puits.
   REMARQUE : Évitez de générer des bulles lors de l’ajout du milieu pour assurer une épaisseur de gel uniforme, ce qui favorise un contact et une croissance bactériennes optimaux.

6. Essai de mise à mort d’A. baumannii

1. Essai de destruction standard
   1. Cultiver des souches mutantes^{WT R-} et ΔtssM pendant une nuit à 37 °C en les secouant dans un milieu LB complété par 100 μg/mL de streptomycine, cultiver E. coli séparément dans un milieu LB contenant 50 μg/mL de kanamycine dans des conditions identiques.
   2. Lavez les cultures bactériennes deux fois avec du PBS stérile et mettez-les en suspension dans un milieu LB frais sans antibiotique. Réglez l’OD₆₀₀ sur 1.0 pour la standardisation.
   3. Mélangez des souches mutantes WT^R- et ΔtssM avec E. coli dans un rapport de 1:1.
   4. Placer 10 μL de la suspension bactérienne mixte sur des plaques de gélose LB sans antibiotiques et incuber à 37 °C pendant 6 h.
   5. Grattez les taches bactériennes et remettez-les en suspension dans 1 mL de PBS. Effectuez cinq dilutions en série de 10 fois.
   6. Placer 10 μL des suspensions bactériennes diluées sur des plaques LB contenant de la kanamycine et incuber toute la nuit à 37 °C.
   7. Analysez l’activité antibactérienne dépendante du T6SS des souches mutantes WT^R- et ΔtssM par comptage de colonies.
      REMARQUE : Assurez-vous de bien mélanger les suspensions bactériennes pour éviter les erreurs expérimentales. Effectuez au moins trois réplications indépendantes pour chaque échantillon afin de garantir la fiabilité des données.
2. Détection quantitative de l’activité T6SS à l’aide du marquage à la luciférase
   1. Normaliser la DO₆₀₀ des mutants E . coli (luciférase), WT^R-, ΔtssM et d’autres souches (par exemple, ATCC 17978, E. coli, Ab#40, Ab#170, Ab#180) à 1,0. Ajouter 5 μL de suspension bactérienne dans une plaque de 96 puits contenant de la gélose LB sans antibiotique. Après le séchage à l’air libre dans l’obscurité, mesurez la bioluminescence basée sur la luciférase pour vérifier la spécificité de la luminescence d’E. coli (luciférase).
   2. Effectuez une dilution en série de 5 fois d’E. coli (luciférase). Placer 10 μL de la suspension bactérienne diluée sur une plaque de 96 puits avec de la gélose LB et une plaque vide de 96 puits (toutes deux étanches à la lumière). Mesurer la bioluminescence basée sur la luciférase pour évaluer la sensibilité de la méthode de détection basée sur la luciférase et confirmer si la gélose LB interfère avec le signal de luminescence.
   3. Mélangez E. coli (luciférase) avec des mutants WT^R-, ΔtssM et 20 souches cliniques (OD₆₀₀ normalisé à 1,0) dans un rapport de 1:1. Diluer 10 fois, ajouter 5 μL à une plaque à 96 puits et mettre en place trois répétitions techniques.
   4. Après le séchage à l’air libre dans l’obscurité, mesurez la bioluminescence. Incuber à 37 °C dans l’obscurité pendant 4 à 6 h, puis mesurer à nouveau la bioluminescence (longueur d’onde d’émission : 562 nm).
   5. Évaluer quantitativement l’activité antibactérienne dépendante de T6SS en comparant les valeurs de bioluminescence avant et après la co-culture.
      REMARQUE : Assurez-vous de bien mélanger les suspensions bactériennes pour éviter les erreurs expérimentales. Effectuez au moins trois réplications indépendantes pour chaque échantillon afin de garantir la fiabilité des données. Utilisez le test t de Student pour l’analyse statistique.
3. Détection de l’activité T6SS à l’aide de l’étiquetage GFP
   1. Suivez la même procédure que pour l’expérience de marquage de la luciférase (longueur d’onde d’excitation : 480 nm, longueur d’onde d’émission : 509 nm).
   2. Mélanger E. coli (GFP) avec des mutants WT^R- et ΔtssM (OD₆₀₀ normalisé à 1,0) dans un rapport de 1:1. Placer 10 μL sur des plaques de gélose LB sans antibiotiques. Après séchage à l’air à RT, capturer des images à l’aide du canal de fluorescence GFP (programme Alex488, excitation : 488 nm, émission : 509 nm) d’un système d’imagerie multifonctionnel.
   3. Incuber à 37 °C dans l’obscurité pendant 4 à 6 h, puis capturer à nouveau des images. Évaluer l’activité de T6SS en fonction des changements dans l’intensité de fluorescence des taches bactériennes.
      REMARQUE : Effectuez toutes les étapes dans l’obscurité pour éviter les interférences avec les signaux de fluorescence. Assurez-vous d’un mélange complet des suspensions bactériennes pour éviter les erreurs expérimentales. Effectuez au moins trois réplications indépendantes pour chaque échantillon afin de garantir la fiabilité des données.
4. Détection par cytométrie en flux
   1. Mélangez les mutants WT^R- avec E. coli (GFP) et ΔtssM avec E. coli (GFP) dans un rapport de 1:1. Prenez une quantité appropriée de la suspension bactérienne mixte et diluez-la à une concentration appropriée (généralement DO₆₀₀ de 0,1 à 0,5) à l’aide de PBS stérile ou d’un tampon 1×.
      REMARQUE : 1× tampon fait référence au tampon de coloration par cytométrie en flux (1×), les ingrédients comprennent : 1× PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 1,8 mM KH₂PO₄, pH 7,4), complété par : 2-5 % (v/v) FBS inactivé à la chaleur (ou 1 % BSA comme alternative), 2 mM EDTA.
   2. Centrifuger la suspension bactérienne mixte diluée à 300 x g pendant 2 min et jeter le surnageant. Remettre la pastille en suspension dans 1 mL de PBS stérile ou 1× tampon et mélanger délicatement. Filtrer la solution remise en suspension à travers une crépine de 35 μm pour éliminer les agrégats et assurer une suspension à cellule unique.
   3. Allumez le cytomètre en flux, préchauffez le laser et calibrez l’instrument.
      1. Réglez les paramètres de détection : utilisez un laser de 488 nm pour exciter la GFP. Canal de détection : FL1 (généralement un filtre 530/30 nm pour la détection de fluorescence GFP). Définissez les paramètres de diffusion directe (FSC) et de diffusion latérale (SSC) pour distinguer les cellules bactériennes.
      2. Utilisez E. coli non marqué comme contrôle négatif, ajustez la tension et le gain, et assurez-vous que la population GFP négative est à la base du signal de fluorescence.
   4. Mélangez délicatement l’échantillon filtré et transférez 100 μL dans un tube de cytométrie en flux.
      1. Analysez les échantillons à l’aide des paramètres d’instrument suivants : Réglez le seuil FSC-H à 19 000 pour exclure les débris, avec des valeurs de gain de 100 (FSC), 110 (SSC) et 80 (FITC).
      2. Pour le gating, excluez d’abord les débris et les signaux non cibles dans le nuage de points FSC-A par rapport à SSC-A, puis analysez la population dans le canal FITC. Acquérir un minimum de 10 000 événements de la population cible (définie par les caractéristiques FSC/SSC) pour chaque échantillon.
   5. Analysez les données à l’aide d’un logiciel de cytométrie en flux (p. ex., FlowJo, BD FACSDiva).
      1. Tracez des diagrammes de dispersion FSC et SSC pour identifier la population bactérienne cible. Tracez des histogrammes de fluorescence FL1 pour distinguer les populations GFP positives et négatives.
      2. Calculez le pourcentage de cellules GFP positives et l’intensité moyenne de fluorescence (MFI).
   6. Centrifuger la suspension bactérienne mixte restante à 300 g pendant 2 min et jeter le surnageant. Remettez la pastille en suspension dans 10 μL d’eau stérile et placez-la sur des plaques de gélose LB sans antibiotique.
   7. Incuber à 37 °C dans l’obscurité pendant 5 h, puis gratter les taches bactériennes et les remettre en suspension dans 500 μL de 1× PBS. Prélever 100 μL de la solution remise en suspension, diluer de manière appropriée et effectuer la détection par cytométrie en flux, en répétant les étapes 6.4.4 à 6.4.5.
   8. Comparez le pourcentage de cellules GFP positives et l’intensité de la fluorescence avant et après la co-culture. Évaluer l’effet destructeur des mutants WT^R- et ΔtssM sur E. coli (GFP).
      REMARQUE : Assurez-vous d’utiliser une suspension à cellule unique pour éviter que l’agrégation de cellules n’affecte les résultats de détection. Calibrez l’instrument avant la détection pour garantir la précision et la reproductibilité des signaux de fluorescence. Évitez d’exposer les échantillons à une forte lumière pendant l’expérience pour éviter l’extinction de la fluorescence GFP. Effectuez au moins trois répétitions pour chaque échantillon afin de garantir la fiabilité des données.

Results

Les méthodes traditionnelles de détection de l’activité T6SS impliquent généralement la co-culture des souches prédatrices et cibles sur des plaques de gélose LB sans antibiotiques pendant 5 heures, puis le grattage des taches bactériennes, leur remise en suspension et l’exécution de dilutions en série. La suspension bactérienne diluée est ensuite repérée sur des plaques de gélose sélective. En comptant les colonies de la souche cible sur les plaques le lendemain, l’activité de T6SS peut être évaluée qualitativement. Cep...

Discussion

Le système de sécrétion de type VI (T6SS) est une machinerie multiprotéique complexe dont les fonctions sont principalement réalisées par la sécrétion de protéines effectrices. Ces protéines effectrices interviennent dans la compétition interbactérienne en tuant ou en inhibant d’autres espèces bactériennes, fournissant ainsi à la bactérie hôte un avantage concurrentiel dans les communautés microbiennes¹⁵. Au-delà de son rôle dans la compétition, des études ont mon...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 %, 15 % SDS-PAGE Kit de préparation de gel	Epizyme	PG112-20
° ; C Congélateur	Haier	HYCD-290
37 ° ; C Incubateur	Bluepard	181254254
4 ° ; C Réfrigérateur	Haier	HYC390-80
° ; C Congélateur	Haier	DW-86L726G(726L)
Plaque à 96 puits	JET	TCP010096
Agar	Biofrox	8211KG001
Persulfate d’ammonium (APS)	Thermo	7727-54-0
Armoire de sécurité biologique	ESCO	AC2-4S1  ;
Balance électronique	Sartorius AG	BSA124S-CW
Appareil d’électrophorèse	BIO-RAD	POWER
Machine à glace en écailles	GRANT	XB70
Cytomètre en flux	BECKMAN COULTER	AW38143
Tampon de coloration Proteintech		PF00018
Gel Imaging System	BIO-RAD	Gel Doc 2000
Glycine	Zike	ZK-L2577
Centrifugeuse à grande vitesse	Eppendorf	5405IN106358
HRP-conjugué Lapin/Souris Anticorps secondaire	Proteintech	SA00001-2
LB Bouillon	Solarbio	L8291
Centrifugeuse à basse température et à grande vitesse	Thermo	17R
Méthanol	Thermo	R40121
Micro Spectrophotomètre UV-Vis	Thermo	Nanodrop one
Microcentrifuge	allsheng	Mini-6k
Lecteur de microplaques	Bio-Tek	H1M
NuPAGE LDS Tampon d’échantillon	Thermo	NP0007
Solution tampon de phosphate (PBS)	Zike	ZK-L1649
Precision Plus Protein Double Color Standards	Bio-Rad	1610374
SDS Tampon de chargement d’échantillon	Beyotime	poo15L
Poudre de lait écrémé	Thermo	LP0033B
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)	Zike	zk6885
Bain-marie thermostatique	JingHong	DK-420S
Appareil de transfert	Bio-Rad	PowerPac HC
Tris(hydroxyméthyl)aminométhane (Tris)	Zike	ZK-L2557
Appareil d’électrophorèse verticale	Bio-Rad	Mii-PROTEAN Tetra