Article de méthode

Étude des interactions entre les cellules myéloïdes et les cellules CAR-T in vitro et in vivo

1.3K vues

⸱

DOI :

10.3791/68013

⸱

25 juillet 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1T Cell Engineering, Mayo Clinic, 2Department of Molecular Medicine, Mayo Clinic, 3Mayo Clinic Graduate School of Biomedical Sciences, 4Division of Hematology, Mayo Clinic, 5Department of Immunology, Mayo Clinic

Dans cet article

Résumé

Étant donné le nombre limité de modèles de xénogreffes disponibles pour étudier les interactions entre les cellules CART humaines et les cellules myéloïdes, nous avons établi des modèles in vitro et in vivo pour comprendre les impacts des macrophages humains sur les cellules CART. Les résultats peuvent potentiellement être généralisés pour évaluer les rôles des macrophages dans le microenvironnement tumoral et tester des immunothérapies ciblées sur les macrophages.

Résumé

La thérapie cellulaire à récepteur T antigénique chimérique (CART) a conduit à des succès cliniques remarquables dans le traitement des hémopathies malignes. Cependant, la plupart des patients rechutent dans les 1 à 2 ans. Plusieurs mécanismes conduisant à la résistance à la CART ont été identifiés, notamment l’inhibition des lymphocytes T par les cellules myéloïdes immunosuppressives. De plus en plus de preuves ont montré que les monocytes et les macrophages dans le microenvironnement tumoral (TME) contribuent à de mauvaises performances CART et à de mauvais résultats cliniques. Les modèles précliniques permettant d’étudier les interactions entre les macrophages humains et les cellules CART sont limités. Ici, nous discutons des approches pour comprendre les impacts des macrophages humains sur les cellules CART in vitro et in vivo. Nous décrivons des modèles de coculture in vitro pour montrer que les macrophages immunosuppresseurs inhibent les fonctions CART. De plus, nous rapportons un modèle de xénogreffe où des macrophages humains et des cellules tumorales sont greffés par voie sous-cutanée chez des souris NSG pour étudier les interactions des macrophages de type M2 avec les cellules CART et les cellules tumorales. Ces modèles peuvent être utilisés pour évaluer les rôles des macrophages dans l’EUT et tester des immunothérapies anticancéreuses ciblant les macrophages.

Introduction

La thérapie cellulaire autologue à récepteur de l’antigène chimérique T (CART) a remporté des succès cliniques dans le traitement des hémopathies malignes récidivantes ou réfractaires, ce qui a conduit à l’approbation par la FDA américaine de six produits CART ciblant CD19 ou l’antigène de maturation des cellules B (BCMA)1. Malgré l’activité initiale impressionnante de la thérapie cellulaire CART, la plupart des patients rechutent dans les 1 à 2 premières années suivant le traitement2. Plusieurs mécanismes de résistance au CART ont été identifiés, notamment la fitness sous-optimale des lymphocytes T, l’échappement de l’antigène et la faible persistance du CART, ainsi que l’inhibition médiée par le microenvironnement tumoral immunosuppresseur (TME)2,3. Les cellules myéloïdes, telles que les monocytes et les macrophages, constituent souvent une partie importante de l’EUT et se sont révélées être des inhibiteurs majeurs d’autres cellules immunitaires, y compris les lymphocytes T 4,5. Les effets néfastes des cellules myéloïdes dans le contexte de l’efficacité thérapeutique des cellules CART ont été rapportés dans des modèles précliniques et dans des essais cliniques de tumeurs hématologiques et solides 3,6. L’inhibition médiée par les myéloïdes peut se produire dès le début du processus de fabrication du CART - il a été démontré que les monocytes du produit d’aphérèse de départ inhibent l’expansion ex vivo du CART 7,8. Compte tenu de l’accumulation de preuves de l’inhibition de la CART médiée par les myéloïdes, de nombreuses études ont visé à modifier les cellules CART pour cibler et éliminer les macrophages immunosuppresseurs dans l’EUT afin d’améliorer les réponses immunitaires5. Cependant, les mécanismes à l’origine des interactions entre les cellules CART et les macrophages immunosuppresseurs ne sont pas encore entièrement élucidés. De plus, il existe peu de modèles de xénogreffes accessibles au public de ces interactions. Par conséquent, il est urgent de disposer de modèles étudiant les interactions entre les macrophages humains et les cellules CART, à la fois in vitro et dans des modèles murins.

Ici, nous décrivons une méthode où des cellules humaines CART ciblées par CD19 (CART19) sont co-cultivées avec des cellules tumorales CD19+ et des macrophages de type M2 polarisés ex vivo . De plus, nous rapportons un modèle murin de xénogreffe dans lequel des souris immunodéficientes sont greffées par voie sous-cutanée avec des cellules cibles et des macrophages humains, ce qui permet d’évaluer les immunothérapies d’intérêt dans un contexte avec des macrophages immunosuppresseurs. Plus précisément, nous avons analysé la prolifération spécifique de l’antigène CART en présence ou en l’absence de macrophages immunosuppresseurs in vitro, montrant une inhibition significative de l’expansion des lymphocytes T dans les plaques de co-culture transwell et directe. Dans notre modèle de xénogreffe, des souris NSG ont été greffées par voie sous-cutanée avec des cellules tumorales et des macrophages humains en suspension dans Matrigel pour le dépistage thérapeutique. Ce modèle animal a montré avec succès que les macrophages humains immunosuppresseurs différenciés ex vivo étaient capables de favoriser la progression tumorale chez les souris NSG. En suivant ce protocole, l’efficacité des traitements immunosuppresseurs ciblant les macrophages peut être testée, y compris celle des médicaments à petites molécules, des produits biologiques et d’autres thérapies cellulaires. Cependant, en raison des limites de l’utilisation de souris immunodéficientes pour étudier l’EUT humain, les modèles proposés sont les mieux adaptés aux études de validation de concept.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

Le protocole ci-dessous suit les directives du comité d’examen institutionnel (IRB), du comité de biosécurité institutionnel (IBC) et du département de médecine comparée du comité de soins et d’utilisation des animaux A00001767 de la Mayo Clinic.

1. Préparation de monocytes classiques humains pour l’étude in vitro

  1. Isoler les cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) à partir de donneurs de sang sains comme décrit précédemment9. Brièvement, diluer le sang total avec 2 % de FBS dans du PBS à un rapport de volume de 1:1, suivi d’une isolation PBMC dans un milieu à gradient de densité.
  2. Isoler les monocytes classiques humains (CD14+CD16-) des PBMC récoltés par sélection de billes magnétiques négatives selon les instructions du fabricant (Table des matériaux). Brièvement, lavez le nombre approprié de PBMC avec un tampon d’isolement et remettez les cellules en suspension dans le volume indiqué conformément aux instructions du fabricant. Marquer les cellules à l’exception des monocytes classiques avec un cocktail d’anticorps et des microbilles magnétiques. Recueillir les monocytes classiques du flux, tout en conservant les non-monocytes dans les colonnes.
    REMARQUE : Supposons que 5 % de l’ensemble des PBMC sont des monocytes classiques et ajustez le nombre de cellules de départ des PBMC en conséquence. Conservez les PBMC restants pour la confirmation de la pureté de la population de monocytes à l’étape 1.7. Les monocytes classiques doivent toujours être isolés des PBMC frais sans cryoconservation préalable.
  3. Comptez le nombre de monocytes isolés à l’aide d’un compteur de cellules (Table des matériaux) et faites tourner les cellules à 300 x g à 4 °C pendant 5 min. Remettre les cellules en suspension dans le tampon d’isolement cellulaire pour atteindre 1 x 106 cellules/mL comme concentration finale. Prélever 100 μL de suspension cellulaire et transférer dans une plaque à fond plat à 96 puits.
  4. Transférez 1 x 105 PBMC dans la même plaque en tant que contrôle de porte négative pour confirmer la pureté classique de la population de monocytes par cytométrie en flux. Faites tourner les cellules à 300 x g à 4 °C pendant 3 min. Conservez les monocytes isolés sur de la glace pendant les étapes 1.5 à 1.12.
  5. Laver en remettant les cellules en suspension avec 200 μL de tampon FACS et faire tourner les cellules à 300 x g à 4 °C pendant 3 min. Décantez soigneusement les surnageants.
  6. Pour chaque échantillon, préparer 50 μL de tampon FACS contenant 0,3 μL de réactif vivant/mort (excitation à 405 nm), 0,5 μL de CD14 10 (1 ng/μL) d’anti-humain CD1410 conjugué à l’APC et 0,5 μL de CD1611 (1 ng/μL d’anti-humain conjugué au PE ; Table des matériaux).
    REMARQUE : Pour garder une coloration constante, faites un mélange principal pour plusieurs échantillons en fonction du nombre total d’échantillons. Transvasez 50 μL de solution de coloration dans chaque puits.
  7. Ajoutez 50 μL de solution de coloration dans chaque puits et mélangez doucement les cellules pour éviter les bulles. Incuber les cellules dans l’obscurité à température ambiante pendant 15 min.
  8. Ajouter 200 μL de tampon FACS dans chaque puits et faire tourner les cellules à 300 x g à 4 °C pendant 3 min. Décantez soigneusement les surnageants.
  9. Laver en ajoutant 200 μL de tampon FACS dans chaque puits et faire tourner les cellules à 300 x g à 4 °C pendant 3 min. Décanter soigneusement les surnageants et remettre les cellules en suspension dans 200 μL de tampon FACS. Analysez les échantillons sur un cytomètre en flux (Tables des matériaux).
  10. Porte CD14+CD16- population. Assurez-vous que la population de CD14+CD16- est supérieure à 90 % des cellules vivantes pour une pureté idéale. Gate CD14+CD16- population de singulets vivants.
    REMARQUE : On suppose que les utilisateurs sont familiers avec l’analyse par cytométrie en flux.

2. Différenciation des macrophages M0 par rapport aux monocytes classiques humains

REMARQUE : La différenciation des macrophages de type M2 par rapport aux monocytes classiques humains est adaptée d’une publication précédente12.

  1. Faites tourner des monocytes isolés à 300 x g à 4 °C pendant 5 min et aspirez des surnageants. Remettre les cellules en suspension dans un milieu de culture cellulaire pour atteindre une concentration finale de 1 x 106 cellules/mL.
  2. Ajouter du GM-CSF recombinant humain pour atteindre une concentration finale de 10 ng/mL (Table des matériaux) et bien mélanger. Transférez 100 μL de cellules dans une plaque de 48 puits traitée pour la culture tissulaire et ajoutez 50 μL supplémentaires de milieu de culture cellulaire. Assurez-vous que chaque condition a 3 répétitions pour la lecture finale le 11e jour.
    REMARQUE : Les utilisateurs peuvent ajouter d’autres groupes d’expériences en conséquence. Ce protocole ne comprend que des cocultures expérimentales de cellules tumorales et de lymphocytes T avec ou sans macrophages de type M2 (Tableau 1).
  3. Transférez 100 μL de cellules dans une autre plaque de 48 puits et ajoutez 50 μL supplémentaires de milieu de culture cellulaire pour le phénotypage des macrophages. Assurez-vous d’inclure un puits pour le phénotypage des macrophages M0 et un pour le phénotypage des macrophages de type M2.
  4. Ajoutez 200 μL de PBS dans les puits environnants pour éviter l’évaporation de la culture cellulaire. Incuber les monocytes à 37 °C pendant 7 jours pour différencier les cellules en macrophages M0.
  5. Pour étudier les interactions entre les macrophages différenciés et les cellules CART19 appariées par donneur, isolez 1 x 107 lymphocytes T des PBMC du même donneur et générez des cellules CART19 en suivant une procédure de production CART de 8 jours comme décrit précédemment 9,13,14.
    REMARQUE : Les cellules CART costimulées avec le domaine de signalisation CD28 sont générées à partir de 5 x 106 cellules T comme décrit précédemment 9,13,14. En parallèle, des lymphocytes T non transduits (UTD) sont générés selon le même processus 9,13,14. Les lymphocytes T UTD seront utilisés comme contrôle négatif dans la prolifération des lymphocytes T pour contrôler la prolifération allogénique.

3. Différenciation des macrophages de type M2 des macrophages M0 par coculture avec des cellules cibles

  1. Le jour 7, prenez la plaque de 48 puits avec des macrophages M0 et incubez sur de la glace pendant au moins 30 min. Pipetez vigoureusement les cellules en permanence tout en gardant la plaque sur de la glace.
    REMARQUE : La durée de l’incubation dans la glace dépend de l’adhérence des macrophages, qui peut être différente en raison de la variance du donneur. Le premier mélange consiste à recueillir des macrophages faiblement adhérents, donc un pipetage de 5 minutes devrait suffire.
  2. Transférez les cellules détachées dans un tube conique frais de 15 mL (Table des matériaux) pré-refroidi sur de la glace. Ajoutez 200 μL de PBS glacé dans les puits de la plaque de 48 puits et pipetez vigoureusement les cellules restantes toutes les 10 minutes jusqu’à ce que la plupart des macrophages se détachent du fond. Après chaque pipetage, vérifiez les cellules au microscope et ajustez le temps d’incubation de la glace au besoin, avec des temps d’incubation plus longs pour les cellules plus adhérentes.
  3. Transférez les macrophages M0 détachés restants dans le tube conique de 15 mL sur de la glace. Mélangez soigneusement les cellules et comptez les cellules sur un compteur de cellules.
  4. Faire tourner les cellules à 300 x g à 4 °C pendant 5 min et aspirer les surnageants. Remettre en suspension dans du PBS glacé pour atteindre une concentration finale de 1 x 106 cellules/mL.
  5. Transférez 200 μL de cellules dans une plaque à fond plat de 96 puits (Tables des matériaux). Faites tourner les cellules à 300 x g à 4 °C pendant 3 min. Décantez soigneusement les surnageants. Comme contrôle négatif de la porte, ajoutez un extra bien coloré avec des marqueurs de la population parentale uniquement.
  6. Ajouter 100 μL de tampon FACS complété par 1 μL de solution bloquant le récepteur Fc à chaque échantillon. Incuber les cellules pendant 10 min à température ambiante. Faites tourner les cellules à 300 x g à 4 °C pendant 3 min. Décantez soigneusement les surnageants.
    REMARQUE : Il est important de pré-incuber les macrophages avec un tampon bloquant le récepteur Fc avant la coloration réelle du marqueur afin d’éviter les résultats faussement positifs.
  7. Pour le puits de l’échantillon, préparez 50 μL de tampon FACS contenant 0,3 μL de réactif vivant/mort (excitation à 405 nm), 0,5 μL d’anti-humain CD1410 conjugué à l’APC (1 ng/μL), 0,5 μL d’anti-humain CD20615 conjugué à l’APC/Cy7 (2 ng/μL) et 0,5 μL d’anti-humain conjugué à la PerCP CD16316 (2 ng/μL ; Table des matériaux). Pour le contrôle négatif, préparer 50 μL de tampon FACS contenant 0,3 μL de réactif vivant/mort et 0,5 μL de CD14 humain conjugué à l’APC.
  8. Ajoutez 50 μL de solution de coloration dans chaque puits et mélangez doucement les cellules pour éviter les bulles. Incuber les cellules dans l’obscurité à température ambiante pendant 15 min.
  9. Ajouter 200 μL de tampon FACS dans chaque puits. Faites tourner les cellules à 300 x g à 4 °C pendant 3 min. Décantez soigneusement les surnageants.
  10. Laver en ajoutant 200 μL de tampon FACS. Faites tourner les cellules à 300 x g à 4 °C pendant 3 min. Décanter soigneusement les surnageants et remettre les cellules en suspension dans 200 μL de tampon FACS.
  11. Analysez les échantillons sur un cytomètre en flux et examinez la population cellulaire CD14+CD206+CD163+ . Utiliser l’expression de CD163 et CD206 sur les macrophages M0 comme référence pour les phénotypes de type M2. Une migration de la population de CD163faibleCD206faible à CD163élevé ou CD206élevé est attendue dans les macrophages de type M2. L’ampleur du déplacement de population peut dépendre des donateurs.
  12. Préparez la lignée cellulaire tumorale d’intérêt et comptez sur un compteur de cellules.
    REMARQUE : Ce protocole utilise la lignée cellulaire de lymphome du manteau CD19+ non adhérente, JeKo-1, comme cible. D’autres lignées cellulaires tumorales et leur capacité à différencier les macrophages de type M0 à M2 peuvent être testées si nécessaire.
    1. Maintenir les cellules JeKo-1 avec le milieu de culture suggéré par le fournisseur (table des matériaux) à 1 x 106 cellules/mL dans une fiole de culture tissulaire. Mélangez les cellules tumorales dans le ballon et comptez-les avec un compteur de cellules.
  13. Faites tourner les cellules cibles à 300 x g à 4 °C pendant 3 min et aspirez les surnageants. Remettre en suspension les cellules cibles avec des milieux de culture cellulaire pour atteindre une concentration finale de 2 x 106 cellules/mL.
    REMARQUE : Préparez le nombre approprié de cellules tumorales en fonction du nombre de groupes expérimentaux. Assurez-vous qu’il y a 2 x 105 cellules cibles pour chaque groupe de coculture de macrophages de type M2, y compris la plaque de phénotypage M2.
  14. Transférez 100 μL de cellules tumorales dans des groupes de coculture de macrophages de type M2 dans la plaque à 48 puits préparée le jour 0 et pipetez doucement pour mélanger. Incuber les cellules à 37 °C pendant encore 24 h.
    REMARQUE : Un rapport de 2:1 des macrophages JeKo-1 :M0 a été testé pour la différenciation phénotypique de type M2. D’autres ratios peuvent être testés si nécessaire.
  15. Le 8e jour, placez une plaque de phénotypage de type M2 sur de la glace, détachez vigoureusement les cellules et préparez-vous au phénotypage comme décrit aux étapes 3.4 à 3.11.
    REMARQUE : Les macrophages de type M2 sont beaucoup plus adhérents que les macrophages M0, de sorte qu’il est prévu de prévoir une incubation plus longue dans la glace. Ce protocole n’utilise que de la glace et du PBS glacé pour détacher les macrophages afin de minimiser le stress sur les cellules.
  16. Combinez les fichiers de cytométrie en flux du phénotypage M0 du jour 7 avec le phénotypage de type M2. Contrôlez CD206 et CD163 de la population de cellules parentales CD14+ de l’échantillon de macrophages M0 et appliquez la même stratégie de contrôle à l’échantillon de macrophages de type M2 pour visualiser le changement de population.
  17. Pour introduire les lymphocytes T dans les cocultures, récoltez les lymphocytes T CART19 et UTD du jour 8 générés à l’étape 2.5 et transférez-les dans des tubes coniques de 50 ml. Bien mélanger à l’aide d’une pipette et compter à l’aide d’un compteur de cellules.
  18. Faites tourner les cellules à 300 x g à 4 °C pendant 5 min et aspirez soigneusement les surnageants. Remettre en suspension les lymphocytes T CART ou UTD dans des milieux de culture cellulaire pour atteindre une concentration finale de 2 x 106 cellules/mL.
  19. Préparez la lignée cellulaire tumorale et comptez sur le compteur de cellules. Faites tourner les cellules à 300 x g à 4 °C pendant 5 min et aspirez les surnageants.
  20. Remettre en suspension les cellules tumorales avec des milieux de culture cellulaire pour atteindre la concentration finale de 2 x 106 cellules/mL. Transférer 100 μL de cellules tumorales dans des puits de coculture sans macrophages de type M2 (Tableau 1).
  21. Transférez 100 μL de lymphocytes T CART ou UTD dans les puits de coculture appropriés (tableau 1). La coculture finale avec des macrophages de type M2 doit avoir des cellules tumorales, des lymphocytes T et des macrophages dans un rapport de 2:2:1. Utilisez des cocultures sans macrophages comme témoins.
  22. Pour maintenir le volume final constant entre les groupes, ajoutez 100 μL supplémentaires de milieu de culture cellulaire dans les puits sans macrophages. Incuber les cellules à 37 °C pendant 3 jours.
    REMARQUE : Si des cellules CART allogéniques sont utilisées, les utilisateurs doivent inclure des cellules T UTD appariées par donneur dans les cocultures comme contrôle approprié pour détecter toute expansion des cellules T induite par l’allogénéité. Dans ce cas, les cellules T CART et UTD cryoconservées précédemment générées doivent être décongelées et récupérées correctement, suivies d’au moins 3 à 4 heures de repos avant d’être ajoutées aux cocultures.

4. Analyse de la prolifération des cocultures spécifiques à l’antigène

  1. Le 11e jour, placez la plaque de coculture sur de la glace et pipetez vigoureusement les cellules. Mélangez bien les cellules et transférez-les dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 ml.
    REMARQUE : La lecture principale des cocultures est de quantifier l’expansion des lymphocytes T, de sorte que le détachement des macrophages n’est pas nécessaire à moins que les utilisateurs ne prévoient d’analyser d’autres marqueurs sur les macrophages dans le même panel.
  2. Ajouter 200 μL de PBS glacé dans les puits d’échantillon et pipeter vigoureusement. Transférez le reste de la solution dans les mêmes tubes de microcentrifugation.
  3. Vérifiez les puits au microscope (10x) pour vous assurer que les cellules en suspension sont complètement récoltées. Faire tourner les cellules à 300 x g à 4 °C pendant 5 min et aspirer les surnageants.
  4. Remettez les cellules en suspension de toutes les conditions avec 200 μL de tampon FACS et transférez-les sur une plaque à fond plat à 96 puits. Faites tourner les cellules à 300 x g à 4 °C pendant 3 min. Décantez soigneusement les surnageants.
  5. Préparez 50 μL de tampon FACS contenant 0,3 μL de réactif vivant/mort (excitation à 405 nm) et 0,5 μL de CD317 humain conjugué à l’APC (1 ng/μL ; Table des matériaux) pour chaque puits d’échantillon. Ajoutez 50 μL de solution de coloration dans chaque puits et mélangez soigneusement les cellules à l’aide d’une pipette pour éviter les bulles.
    REMARQUE : Dans cette étape, il y aura des granulés de grosses cellules. Pour vous assurer que tous les lymphocytes T sont colorés, vérifiez le fond de la plaque pour confirmer qu’il ne reste pas de pastilles de cellules après avoir bien mélangé.
  6. Incuber les cellules dans l’obscurité à température ambiante pendant 15 min. Ajouter 200 μL de tampon FACS dans chaque puits. Faites tourner les cellules à 300 x g à 4 °C pendant 3 min. Décantez soigneusement les surnageants.
  7. Laver en ajoutant 200 μL de tampon FACS. Faites tourner les cellules à 300 x g à 4 °C pendant 3 min. Décanter soigneusement les surnageants et remettre les cellules en suspension dans 200 μL de tampon FACS.
  8. Analysez les échantillons sur un cytomètre en flux. Contrôlez les cellules CD3+ et quantifiez le nombre absolu de cellules CD3+ en direct comme ci-dessous :
    figure-protocol-1
  9. Tracez sous forme de graphique le nombre absolu de cellules CD3+ dans chaque condition à l’aide de GraphPad Prism.
    REMARQUE : On s’attend à ce que les cocultures avec des macrophages de type M2 aient un nombre absolu de lymphocytes T CD3 beaucoup plus faible que dans les conditions en l’absence de macrophages de type M2.

5. Impact des macrophages de type M2 sur les cellules CART dans un système de transpuits

REMARQUE : Les plaques Transwell séparent physiquement les macrophages de type M2 des cellules CART stimulées et ne permettent aux molécules solubles de circuler qu’entre les types de cellules, ce qui permet aux utilisateurs d’étudier la dynamique des interactions indépendantes du contact entre les macrophages et les cellules CART (Figure 1).

  1. Isolez 1 x 106 monocytes classiques humains et confirmez la pureté de la population par cytométrie en flux, comme décrit aux étapes 1.1 à 1.10. Faites tourner 1 x 106 monocytes à 300 x g à 4 °C pendant 5 min et aspirez les surnageants.
    REMARQUE : Les utilisateurs peuvent vouloir générer des cellules CART autologues et UTD appariées par donneur, comme décrit à l’étape 2.5.
  2. Remettre les cellules en suspension dans un milieu de culture cellulaire pour atteindre une concentration finale de 1 x 106 cellules/mL. Ajouter du GM-CSF recombinant humain pour atteindre une concentration finale de 10 ng/mL et bien mélanger.
  3. Transfert de 200 μL de cellules remises en suspension dans le puits de fond d’une plaque de transpuits à 24 puits (0,4 μm) avec 3 réplicats techniques. Ajoutez 100 μL supplémentaires de milieu de culture cellulaire dans chaque puits et assurez-vous que le fond du puits est entièrement couvert. Ajouter 300 μL de milieu de culture cellulaire dans 3 autres puits pour les conditions sans macrophages (contrôle positif).
  4. Ajoutez 200 μL de PBS dans les puits environnants pour éviter l’évaporation de la culture cellulaire. Incuber les cellules à 37 °C pendant 7 jours.
  5. Le jour 7, préparez 1,4 x 10 cellules tumorales6 JeKo-1 et transférez-les dans un tube conique de 15 ml. Faites tourner les cellules à 300 x g à 4 °C pendant 5 min et aspirez les surnageants.
  6. Remettre en suspension les cellules tumorales avec des milieux de culture cellulaire pour atteindre une concentration finale de 2 x 106 cellules/mL. Ajoutez 200 μL de cellules tumorales dans les puits inférieurs de toutes les conditions de l’échantillon et mélangez bien. Incuber les cellules à 37 °C pendant encore 24 h. Utilisez des puits de fond avec uniquement JeKo-1 comme témoin positif.
  7. Le jour 8, récoltez les cellules T CART et UTD générées à l’étape 5.1. et remettre en suspension les lymphocytes T dans des milieux de culture cellulaire pour atteindre une concentration finale de 1 x 106 cellules/mL.
    REMARQUE : Si des cellules CART allogéniques sont utilisées, les utilisateurs doivent inclure des cellules T UTD compatibles avec un donneur dans les cocultures, comme décrit à l’étape 3.22.
  8. Comptez et préparez 1,4 x 106 cellules JeKo-1. Transférez les cellules tumorales dans un tube de centrifugation de 15 mL et faites tourner les cellules à 300 x g à 4 °C pendant 5 min.
  9. Aspirer des surnageants et remettre en suspension des cellules dans des milieux de culture cellulaire pour atteindre une concentration finale de 1 x 106 cellules/mL. Transférez 100 μL de cellules T préparées et 100 μL de cellules tumorales dans chaque puits supérieur pour toutes les conditions de l’échantillon.
  10. Bien mélanger les cellules dans le puits supérieur et incuber à 37 °C pendant 3 jours.
  11. Le 11e jour, mélangez les cellules dans la chambre supérieure et transférez-les dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 ml. Lavez les puits supérieurs avec 200 μL de PBS et transférez les cellules restantes dans les tubes de la microcentrifugeuse.
  12. Faire tourner les cellules à 300 x g à 4 °C pendant 5 min et aspirer les surnageants. Effectuer un test de prolifération des lymphocytes T comme décrit aux étapes 4.4 à 4.9.
    REMARQUE : Les macrophages de type M2 polarisés par JeKo-1 peuvent supprimer la prolifération des lymphocytes T spécifiques de l’antigène d’une manière indépendante du contact. D’autres modèles de tumeurs peuvent être testés si nécessaire.

6. Etablissement d’un modèle de xénogreffe avec des macrophages humains et une tumeur chez des souris NSG

  1. Isolez 1 x 107 monocytes classiques humains et confirmez la pureté par cytométrie en flux comme décrit aux étapes 1.1 à 1.10. Utilisez des souris NSG greffées avec JeKo-1 seul comme contrôle pour confirmer les effets pro-tumoraux des macrophages de type M2, comme illustré à la figure 2.
    REMARQUE : Ce protocole greffe des souris NSG avec 5 x 105 macrophages humains par voie sous-cutanée. La récupération des macrophages après détachement le jour 7 est d’environ 50 %. Les utilisateurs peuvent ajuster les numéros de cellule en conséquence et s’assurer de préparer des cellules supplémentaires.
  2. Faites tourner des monocytes isolés à 300 x g à 4 °C pendant 5 min et aspirez des surnageants. Remettre les cellules en suspension dans un milieu de culture cellulaire pour atteindre une concentration finale de 1 x 106 cellules/mL.
  3. Ajouter du GM-CSF recombinant humain pour atteindre une concentration finale de 10 ng/mL et bien mélanger. Transférez les monocytes dans un flacon de culture tissulaire T25 et incubez les cellules à 37 °C pendant 7 jours.
  4. Le 7e jour, pipetez vigoureusement les cellules sur de la glace toutes les 10 minutes et vérifiez les cellules au microscope jusqu’à ce que la plupart des macrophages soient détachés. Transférez les cellules dans un tube conique de 15 ml sur de la glace, lavez le ballon avec du PBS glacé pour détacher les cellules restantes et combinez les cellules dans le tube conique.
  5. Comptez les cellules sur le compteur de cellules. Faire tourner les cellules à 300 x g à 4 °C pendant 5 min et aspirer les surnageants.
  6. Lavez et remettez en suspension les cellules avec 5 ml de PBS glacé. Faire tourner les cellules à 300 x g à 4 °C pendant 5 min et aspirer les surnageants.
  7. Remettre en suspension les cellules dans du PBS glacé pour atteindre une concentration finale de 2 x 107 cellules/mL. Transférez la solution cellulaire dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL et conservez-la sur de la glace.
  8. Préparez 1,5 x 107 cellules de luciférase+ JeKo-1 et transférez les cellules dans un tube conique de 15 ml.
    REMARQUE : En raison du faible nombre de cellules injectées, l’imagerie par bioluminescence (BLI) est nécessaire pour surveiller la charge tumorale. Le nombre de macrophages et de cellules tumorales pour les injections sous-cutanées peut être augmenté selon les besoins. Si les tumeurs sont visibles et accessibles par un pied à coulisse après l’injection, des cellules tumorales de type sauvage peuvent être utilisées à la place.
  9. Faites tourner les cellules à 300 x g à 4 °C pendant 5 minutes et aspirez les surnageants. Remettre en suspension les cellules dans du PBS glacé pour atteindre une concentration finale de 4 x 107/mL.
  10. Transférez le même volume de macrophages et de cellules tumorales dans un autre tube de microcentrifugation frais de 1,5 ml et mélangez bien. Ajouter le même volume de matrice de membrane basale solubilisée dans la solution de cellules mixtes et bien mélanger sur de la glace.
    REMARQUE : La matrice de la membrane basale doit être décongelée sur de la glace pendant la nuit pour éviter la solidification. À ce stade, chaque 100 μL de solution cellulaire a 5 x 105 macrophages et 1 x 106 JeKo-1 en suspension dans la matrice de la membrane basale, qui utilise le même rapport de nombre de cellules que celui utilisé dans le protocole de différenciation des macrophages in vitro de type M2.
  11. À titre de contrôle, transférez les cellules JeKo-1 préparées restantes avec le même volume de PBS glacé dans un tube de microcentrifugation frais de 1,5 ml, en ajoutant le même volume de matrice de membrane basale à la solution cellulaire et en mélangeant bien sur de la glace.
  12. Préparez 10 souris femelles et mâles de 6 à 8 semaines NOD-SCID-γ-/- (NSG) (~20 g) pour une anesthésie par inhalation avec 2,5 % d’isoflurane. Introduire l’anesthésie à l’isoflurane à l’aide d’un appareil d’anesthésie par inhalation de rongeurs. L’isoflurane vaporisé est livré dans une chambre et une platine chauffée avec des cônes nasaux.
  13. Placez les souris dans la chambre d’anesthésie pendant 1 à 2 minutes. Transférez les souris vers les cônes du nez sur la scène chauffée une fois que les réflexes posturaux et droits sont perdus18. Gardez les souris sur l’étape de chauffage tout au long de la procédure. Appliquez une pommade oculaire sur les deux yeux des souris pour prévenir les lésions cornéennes dues à la perte du réflexe de clignement pendant l’anesthésie.
  14. Rasez soigneusement le flanc droit de chaque souris pour exposer la peau après l’anesthésie des souris. Chargez une seringue de 0,5 mL avec 100 μL de mélange de cellules de macrophages JeKo-1 et retirez soigneusement les bulles dans la solution.
  15. Soulevez délicatement la peau exposée à la main et insérez l’aiguille dans la région soulevée. Continuez à soulever la peau avec l’aiguille et appuyez un doigt sur le site d’injection. Essayez de ne pas bouger l’aiguille une fois insérée pour éviter les perforations accidentelles et les fuites cellulaires.
  16. Libérez lentement les cellules dans la couche sous-cutanée et retirez soigneusement l’aiguille. Répétez les injections sous-cutanées pour les 10 souris NSG, 5 souris recevant à la fois JeKo-1 et des macrophages et 5 souris recevant JeKo-1 seul.
  17. Préparez la D-luciférine (tableau des matériaux) à une concentration de 15 mg/mL. Chargez une seringue de 0,5 mL avec 200 μL de D-luciférine et injectez-la dans chaque souris par voie intrapéritonéale.
  18. Placez les souris anesthésiées sur la scène pour BLI 10 min après l’injection de D-luciférine. Effectuez l’inspection complète complète de l’infection bactérienne pour chaque souris et enregistrez-la comme charge tumorale de base (jour 0). Remettez les souris dans leurs cages.
    REMARQUE : Les utilisateurs doivent s’assurer que les souris anesthésiées ne sont pas laissées sans surveillance jusqu’à ce qu’elles reprennent conscience pour maintenir la déposition sternale après la procédure d’imagerie.
  19. Surveiller la charge tumorale par BLI 2 fois par semaine jusqu’à ce que des critères expérimentaux ou humains soient atteints. Le critère de survie globale est atteint lorsque le volume tumoral est égal ou supérieur à 2000mm3, calculé par la formule ci-dessous :
    figure-protocol-2
    REMARQUE : La durée de la surveillance de la tumeur peut être ajustée en fonction de l’objectif des expériences et des lectures souhaitées. En raison de la taille extrêmement petite de la tumeur au cours des 2-3 premières semaines, BLI est recommandé pour l’indication de la charge tumorale. Une fois que les tumeurs deviennent visibles et accessibles par un pied à coulisse, les mesures BLI et de l’étrier sont recommandées pour une analyse précise des tumeurs.
  20. Pour étudier les interactions entre les macrophages humains greffés et les cellules CART19 autologues chez les souris NSG, générer et greffer des macrophages humains différenciés ex vivo comme décrit dans les étapes 6.1 à 6.16. Isolez les lymphocytes T autologues du même donneur de sang à l’étape 6.1 en suivant le protocole de fabrication CART de 8 jours, comme décrit précédemment 9,13,14.
    REMARQUE : Chaque souris NSG est traitée avec 2 x 106 cellules CART19. Les utilisateurs doivent générer au moins 2 x 10cellules CART 7 pour traiter 10 souris. Les cellules CART sont cryoconservées au jour 8 et stockées jusqu’à ce que JeKo-1/macrophages soient greffés chez la souris, 5 jours après les injections sous-cutanées.
  21. Après 5 jours d’injections de tumeurs/macrophages, randomisez les souris en fonction du BLI comme décrit aux étapes 6.17-6.18. Décongelez et préparez les cellules CART comme décrit à l’étape 3.22. Laver les cellules CART avec du PBS et les faire tourner à 300 x g à 4 °C pendant 5 min.
  22. Remettre en suspension les cellules CART dans le PBS pour atteindre une concentration finale de 2 x 107 cellules/mL. Chargez une seringue de 0,5 mL avec 100 μL de cellules CART préparées et injectez dans chaque souris greffée de tumeur par voie intraveineuse par la veine de la queue.
  23. Surveillez la charge tumorale par BLI une fois par semaine pendant 4 semaines.
    REMARQUE : En raison des fonctions immunosuppressives des macrophages humains greffés, des activités antitumorales CART altérées et une charge tumorale plus élevée sont attendues chez les souris injectées avec JeKo-1/macrophages.

7. Confirmation du phénotype de type M2 dans les macrophages humains greffés par coloration par immunofluorescence

  1. Pour confirmer le phénotype de type M2 induit par JeKo-1 dans les macrophages humains greffés décrits à l’étape 6 par coloration par immunofluorescence, suivez les étapes 6.1 à 6.19 et augmentez le nombre de macrophages injectés et de luciférase+ JeKo-1 à 5 x 106 cellules et 1 x 107 cellules par souris NSG, respectivement.
    REMARQUE : Les utilisateurs doivent s’assurer que le volume final d’injection pour chaque souris est de 100 μL.
  2. Le jour 7, euthanasier les souris NSG par du CO2, effectuer une luxation cervicale et confirmer la perte des réflexes cornéens comme décrit précédemment19. Placez les souris sur le banc de travail avec les tumeurs tournées vers le haut. Vaporisez de l’éthanol à 70 % sur les sites tumoraux et récoltez soigneusement les tumeurs greffées avec des ciseaux et des pinces.
  3. Transférez les tissus tumoraux dans des tubes coniques de 50 ml remplis de 20 à 30 ml de paraformaldéhyde à 4 % pour la fixation comme décrit précédemment20. Cryoconservation et cryosection des tissus tumoraux pour la coloration par immunofluorescence selon un protocole précédemment publié20.
  4. Lamelles de tissu tumoral tachant avec un anticorps CD206 anti-humain de souris conjugué à AF546 (1:50) et un anticorps iNOS anti-humain de lapin conjugué à AF647 (1:100) dilué dans un tampon de coloration par immunofluorescence, suivi d’une coloration et d’une préservation du noyau comme décrit précédemment21.
    REMARQUE : Pour des résultats de coloration optimaux, les utilisateurs doivent effectuer un titrage d’anticorps en conséquence, en particulier lorsque différentes lignées cellulaires tumorales sont utilisées.
  5. Acquérez des images d’immunofluorescence avec la microscopie confocale à 40x. Pour confirmer que les macrophages humains greffés développent un phénotype de type M2, attendez-vous à voir une expression de CD206 humain et une expression minimale d’iNOS humain.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

L’objectif de ce protocole est d’établir des modèles in vitro et in vivo pour étudier les interactions entre les macrophages immunosuppresseurs humains et les cellules CART en raison de la nature complexe et de la dynamique des interactions et des modèles de xénogreffes existants limités. Selon le protocole, des monocytes classiques humains isolés sont différenciés pour acquérir des phénotypes de type M2 et deviennent fonctionnellement immunosuppresseurs.

Pour confirmer la pu...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

La thérapie cellulaire CART a montré de nombreux succès cliniques dans le traitement de sous-ensembles de patients atteints d’hémopathies malignes, mais la plupart des patients rechutent dans les 1 à 2 ans suivant la perfusionde CART 1,2. Divers mécanismes potentiels de résistance au CART ont été identifiés, et les cellules myéloïdes immunosuppressives jouent un rôle important dans l’immunosuppression du TME et l’échec ultérieur ...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

SSK est l’inventeur de brevets dans le domaine de l’immunothérapie CAR qui sont concédés sous licence à Novartis (par le biais d’un accord entre la Mayo Clinic, l’Université de Pennsylvanie et Novartis), MustangBio (par l’intermédiaire de la Mayo Clinic) et Sendero (par l’intermédiaire de la Mayo Clinic). RLS et SSK sont les inventeurs de brevets dans le domaine de l’immunothérapie CAR qui sont concédés sous licence à Humanigen (par l’intermédiaire de la Mayo Clinic). KY, RLS, TH, BK, ES et SSK sont les inventeurs de brevets dans le domaine de l’immunothérapie CAR qui sont concédés sous licence à Immix. SSK reçoit des fonds de recherche de Kite, Gilead, Juno, BMS, Novartis, Humanigen, MorphoSys, Tolero, Sunesis/Viracta, LifEngine Animal Health Laboratories Inc., Incyte et Lentigen. SSK a participé à des réunions consultatives avec Kite/Gilead, Humanigen, Juno/BMS, Capstan Bio et Novartis. SSK a siégé au conseil de sécurité et de surveillance des données avec Humanigen et Carisma. SSK a été consultant pour Torque, Calibr, Novartis, Capstan Bio, Carisma et Humanigen.

Remerciements

Cette étude a été en partie financée par le Mayo Clinic Comprehensive Cancer Center (SSK), le Mayo Clinic Center for Individualized Medicine (SSK), le Mayo Clinic Center for Regenerative Biotherapeutics (SSK), la subvention R37CA266344-01 des National Institutes of Health (SSK) et la subvention CA201127 du ministère de la Défense (SSK).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Seringue de 0,5 mLFisher Scientific329461
Tube de microcentrifugation de 1,5 mLEppendorf1415-2508  ;
Tube conique de 15 mLCorning Sciences de la vie352097
Plaque transpuits à 24 puits (0,4 &mu ; m)Corning Sciences de la vie3397
Tube conique de 50 mLCorning Sciences de la vie352098
CD206 anti-humain conjugué APC/Cy7Biolégende321119Anticorps de flux
CD14 humain conjugué à l’APCBiolégende325607Anticorps de flux
CD3 anti-humain conjugué à l’APCBiolégende344811Anticorps de flux
Solution de rinçage autoMACSMiltenyi Biotec130-091-222Tampon d’isolement de monocytes classiques  ;
Matrice de membrane basaleCorning Sciences de la vieCLS356237Matrice de membrane basale solubilisée
Milieux de culture cellulaire10 % de sérum AB humain 1 % de pénicilline-streptomycine-glutamine dans un milieu cellulaire hématopoïétique sans sérum X-VIVO 15
Kit d’isolement de monocytes classique, humainMiltenyi Biotec130-117-337
Système CytoFLEX  ; B5-R3-V5Beckman CoulterRéf. C04652Cytomètre en flux
D-luciférineBiotechnologie de l’orCHANCE-1G
D-PBS (solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco)Gibco14190250  ;
Pommade oculaireThermoFisher19-090-832
Tampon FACS2 % FBS 1 % azoture de sodium dans PBS
Sérum fœtal bovinCorning Sciences de la vie35-011-CV
Plaque à fond plat de 96 puitsCorning Sciences de la vieCLS3997
Sérum AB humain inactivé inactivé  ;Recherche innovante4931
Human TruStain FcX (solution de blocage des récepteurs Fc)Biolégende422301
Isoflurane liquide  ;   ;Piramal Pharma Limited66794-017-10
Système d’imagerie in vivo IVIS SpectrumPerkinElmer124262
Milieu de culture de lignées cellulaires JeKo-110 % FBS 1 % de pénicilline-streptomycine-glutamine dans le milieu RPMI-1640
Kit de coloration Aqua Dead Cell fixable en direct/mort, pour une excitation de 405 nmInvitrogenN° L34966
Colonne LSMiltenyi Biotec130-042-401Sélection de billes négatives
LymphoprepTechnologies des cellules souches07811Gradient de densité moyen
Solution mère MACS BSAMiltenyi Biotec130-091-376Tampon d’isolement de monocytes classiques  ;
Anticorps CD206 anti-humain de souris conjugué à AF546  ;Biotechnologie de Santa CruzSC-376232
HOCHER. Cg-Prkdcscid  ; souris Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG)Laboratoire Jackson  ;5557
CD16 humain conjugué au PEBiolégende302007Anticorps de flux
Pénicilline-Streptomycine-Glutamine (100x), LiquideGibco10378-016
CD163 anti-humain conjugué à PerCPBiolégende333625Anticorps de flux
Anticorps iNOS anti-humain de lapin conjugué à AF647ProteintechRéférence : CL647-18985
GM-CSF humain recombinantTechnologies des cellules souches78015
RPMI-1640 moyenGibco11875093
SepMate-50 IVDTechnologies des cellules souches85450Isolation PBMC par centrifigation par gradient de densité  ;
Azoture de sodium, 5 % (p/v)Ricca Chemical7144.8-16
Plaque 48 puits traitée par culture tissulaireCorning Sciences de la vie3548
Analyseur de viabilité cellulaire Vi-cell XRBeckman CoulterCompteur de cellules
X-VIVO 15 Milieu cellulaire hématopoïétique sans sérumLonza04-418Q

Références

  1. Yun, K., Siegler, E. L., Kenderian, S. S. Who wins the combat, CAR or TCR. Leukemia. 37 (10), 1953-1962 (2023).
  2. Neelapu, S. S., et al. Axicabtagene Ciloleucel CAR T-Cell Therapy in Refractory Large B-Cell Lymphoma. New England J Med. 377 (26), 2531-2544 (2017).
  3. Shah, N. N., Fry, T. J. Mechanisms of resistance to CAR T cell therapy. Nat Rev Clin Oncol. 16 (6), 372-385 (2019).
  4. Kiss, M., Caro, A. A., Raes, G., Laoui, D. Systemic Reprogramming of Monocytes in Cancer. Fronti Oncol. 10, (2020).
  5. Rodriguez-Garcia, A., et al. cell-mediated depletion of immunosuppressive tumor-associated macrophages promotes endogenous antitumor immunity and augments adoptive immunotherapy. Nat Commun. 12 (1), (2021).
  6. Kankeu Fonkoua, L. A., Sirpilla, O., Sakemura, R., Siegler, E. L., Kenderian, S. S. CAR T cell therapy and the tumor microenvironment: Current challenges and opportunities. Mol Ther Oncolyt. 25, 69-77 (2022).
  7. Stroncek, D. F., et al. Elutriated lymphocytes for manufacturing chimeric antigen receptor T cells. J Trans Med. 15 (1), (2017).
  8. Stroncek, D. F., et al. Myeloid cells in peripheral blood mononuclear cell concentrates inhibit the expansion of chimeric antigen receptor T cells. Cytotherapy. 18 (7), 893-901 (2016).
  9. Sterner, R. M., Cox, M. J., Sakemura, R., Kenderian, S. S. Using crispr/cas9 to knock out gm-csf in car-t cells. J Vis Exp. (149), e59629(2019).
  10. Ali, L. R., et al. PD-1 blockade and CDK4/6 inhibition augment nonoverlapping features of T cell activation in cancer. J Exp Med. 220 (4), e20220729(2023).
  11. Wang, T., et al. Proteomic and Metabolomic Characterization of SARS-CoV-2-Infected Cynomolgus Macaque at Early Stage. Front Immunol. 13, 954121(2022).
  12. Ruella, M., et al. Overcoming the immunosuppressive tumor microenvironment of Hodgkin lymphoma using chimeric antigen receptor T cells. Cancer Dis. 7 (10), 1154-1167 (2017).
  13. Sakemura, R., et al. Development of a Clinically Relevant Reporter for Chimeric Antigen Receptor T-cell Expansion Trafficking, and Toxicity. Cancer Immunol Res. 9 (9), 1035-1046 (2021).
  14. Sterner, R. M., et al. GM-CSF inhibition reduces cytokine release syndrome and neuroinflammation but enhances CAR-T cell function in xenografts. Blood. 133 (7), 697-709 (2019).
  15. Smith, A., et al. A Novel Three-Dimensional Skin Disease Model to Assess Macrophage Function in Diabetes. Tissue Eng Meth. 27 (2), 49-58 (2021).
  16. Nowak, W., et al. Pro-inflammatory monocyte profile in patients with major depressive disorder and suicide behaviour and how ketamine induces anti-inflammatory M2 macrophages by NMDAR and mTOR. EBioMedicine. 50, 290-305 (2019).
  17. Ajith, A., et al. Humanized Mouse Model as a Novel Approach in the Assessment of Human Allogeneic Responses in Organ Transplantation. Front Immunol. 12, 687715(2021).
  18. Tsukamoto, A., Serizawa, K., Sato, R., Yamazaki, J., Inomata, T. Vital signs monitoring during injectable and inhalant anesthesia in mice. Exp Animals. 64 (1), 57-64 (2015).
  19. Hickman, D. L. Minimal Exposure Times for Irreversible Euthanasia with Carbon Dioxide in Mice and Rats. J Am Assoc Lab Animal Sci. 61 (3), 283-286 (2022).
  20. Zhou, R., Mei, L. Neural Development: Methods and Protocols. , Humana Press. Totowa, NJ. (2013).
  21. Gutierrez-Ruiz, O. L., et al. Ectopic expression of DOCK8 regulates lysosome-mediated pancreatic tumor cell invasion. Cell Rep. 42 (9), 113042(2023).
  22. Kirkiles-Smith, N. C., et al. Development of a Humanized Mouse Model to Study the Role of Macrophages in Allograft Injury. Transplantation. 87 (2), 189-197 (2009).
  23. Chuprin, J., et al. Humanized mouse models for immuno-oncology research. Nat Rev Clin Oncol. 20 (3), 192-206 (2023).
  24. Yun, K., et al. Intrinsic immunosuppressive features of monocytes suppress CAR-T19 through IL-1 pathway modulation in mantle cell lymphoma. Mol Ther Oncol. 33 (2), 200985(2025).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Demander l’autorisation de réutiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demander une autorisation

Mots-clés

Interactions des cellules my lo desmacrophages immunosuppresseursmicroenvironnement tumoralcoculture in vitrox nogreffe in vivocellules souches h matopo tiquesprise de greffe des macrophagesimagerie par bioluminescenceimmunoth rapie ciblant les macrophages

Articles connexes