Ce protocole montre que le battage des billes combiné à la purification des billes de capture d’ADN fournit une méthode rapide et cohérente pour extraire l’ADN des échantillons de Mycobacterium tuberculosis , ce qui en fait un choix efficace pour les applications de séquençage de nouvelle génération.
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Article de méthode
Extraction d’ADN mycobactérien à l’aide d’un battage de billes dans un tampon personnalisé suivi d’un flux de travail NGS
* These authors contributed equally
Dans cet article
Résumé
Résumé
La tuberculose est une maladie mortelle, et l’émergence d’une résistance aux antibiotiques chez la bactérie responsable de l’agent pathogène, Mycobacterium tuberculosis, aggrave les résultats du traitement. L’identification précise et rapide de la résistance aux médicaments grâce aux technologies de séquençage est nécessaire pour améliorer les résultats des patients atteints de tuberculose grâce à des schémas thérapeutiques adaptés. La méthode d’extraction de l’ADN est essentielle pour les tests moléculaires en aval et est compliquée par la paroi cellulaire dure de Mycobacterium, la faible charge bacillaire de nombreux échantillons cliniques et la complexité de la matrice des expectorations. Il existe de nombreuses méthodes d’extraction de l’ADN de M. tuberculosis , mais il n’existe actuellement aucun étalon-or. De plus, peu de ces méthodes se sont avérées efficaces de manière constante, et beaucoup ne conviennent pas aux milieux de lutte contre la tuberculose à faibles ressources et à forte charge. Par conséquent, les laboratoires introduisent fréquemment leurs propres modifications de procédures, ce qui entraîne une variabilité importante des méthodes. Ici, nous présentons un protocole rentable, rapide et standardisé pour l’extraction d’ADN mycobactérien à partir d’expectorations cliniques et de cultures qui produit de l’ADN adapté à la qPCR, et qui devrait être envisagé pour une utilisation dans les laboratoires de diagnostic clinique.
Introduction
L’extraction d’ADN de haute qualité de M. tuberculosis est nécessaire à la détection de la tuberculose résistante aux médicaments (TB) à l’aide du séquençage ciblé de nouvelle génération (NGS) et du séquençage du génome entier (WGS), mais elle est souvent négligée. Nous avons développé un protocole standardisé pour fournir un ADN cohérent et de haute qualité pour les applications cliniques NGS, y compris des approches NGS ciblées comme Deeplex-MycTB (GenoScreen) et le séquençage du génome entier, qui sont maintenant recommandées par l’Organisation mondiale de la santé (OMS) pour le diagnostic de la tuberculose résistante aux ....
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Protocole
Cette étude a été menée à l’Université de Californie à San Francisco (UCSF) sous l’approbation du Comité institutionnel de biosécurité (BUA #BU198320-01GBUA/BABB) et suit les directives d’éthique de la recherche de l’UCSF. Nous avons obtenu des échantillons d’expectorations restants prélevés par Discovery Life Sciences dans le cadre d’un protocole de renonciation au consentement approuvé par l’IRB auprès de personnes atteintes d’affections respiratoires non liées à la tuberculose.
1. Préparation des tampons
- Tampon Triton personnalisé (tableau 1) : Pour préparer 100 mL de tampon Triton personnali....
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Résultats
Nous avons testé le protocole d’extraction d’ADN sur des échantillons d’expectorations cultivées de M. tuberculosis et de M. tuberculosis (n = 3 pour chaque condition). À l’aide de M. tuberculosis H37Rv mc² 7901 en culture, nous avons normalisé l’entrée à 8,4 x 106 cellules par 50 μL, ce qui équivaut à 1 mL d’une culture MGIT à 200 UG. Pour les expériences sur les expectorations, nous avons utilisé 1 mL d’expectorations provenant d’individus atteints d’affections respiratoires non TB.......
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Discussion
Dans ce travail, nous présentons un protocole robuste et validé pour l’extraction d’ADN de M. tuberculosis de haute qualité en utilisant le battage de billes avec nettoyage par billes magnétiques pour les applications moléculaires et NGS en aval.
La méthode offre plusieurs avantages par rapport aux protocoles existants d’extraction de l’ADN de M. tuberculosis . Alors que l’extraction traditionnelle au phénol-chloroforme prend généralement plu.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
R01AI153213 Institut national des allergies et des maladies infectieuses (NIAID).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Perles de zircone-silicate de 0,1 mm | Produits Biospec | Référence 11079101z | Perles utilisées pour l’étape de battement des billes pour lyser les cellules mycobactériennes |
| Perles AMPure XP | Beckman Coulter | Réf. A63880 | Perles magnétiques pour le nettoyage de l’ADN après la lyse |
| EDTA (0,5 M, pH 8,0) ; | Thermo Fisher Scientific | AM9260G | Composants tampons Triton/Low EDTA personnalisés |
| Fastprep 24 | MPbio, États-Unis | 116004500 | Équipement pour le battage des talons à 6,5 m/s |
| Introduction à l’avant | Thermo Fisher Scientific | Synthèse sur mesure | Séquence d’amorce : AATTCCTGGTGTAGCGGTGG |
| H2O (Eau, grade biologie moléculaire) | Thermo Fisher Scientific | Réf. BP2819-1 | Composants tampons Triton/Low EDTA personnalisés |
| Sonde universelle Luna | Biolabs de la Nouvelle-Angleterre | Référence M3004 | Réactif qPCR pour le dénombrement de l’ADN mycobactérien |
| MycoPrep Kit | BD | UGS/RÉF 240863 | Digestion d’échantillons BD MycoPrep pour le traitement des expectorations NALC-NaOH |
| NaCl (chlorure de sodium, solution 5M) | Thermo Fisher Scientific | AM9759 | Composants tampons Triton/Low EDTA personnalisés |
| PBS | Millipore Sigma | Réf. P2272 | Traitement des expectorations |
| Apprêt inversé | Thermo Fisher Scientific | Synthèse sur mesure | Séquence d’amorce : GTTTACGGCGTGGACTACCA |
| Sonde TaqMan | Thermo Fisher Scientific | Synthèse sur mesure | Séquence de sonde : AGGAGGAACACCGGTGGCGA |
| Tris-HCl (1 m, pH 8,0) | Thermo Fisher Scientific | AM9855G | Composants tampons Triton/Low EDTA personnalisés |
| Triton X-100 | Thermo Fisher Scientific | 28314 | Composants tampons Triton/Low EDTA personnalisés |
Références
- Jouet, A., et al. Deep amplicon sequencing for culture-free prediction of susceptibility or resistance to 13 anti-tuberculous drugs. Eur Respir J. 57 (3), 2002338(2021).
- George, S., et al. DNA Thermo-Protection Facilitates Whole Genome Sequencing of Mycobacteria Direct from Clinical Samples by the Nanopore Platform.
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Réimpressions et autorisations
