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Développement d’un modèle de lésion pulmonaire aiguë chez le porcelet néonatal pour recréer l’environnement précoce des poumons des nourrissons prématurés

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DOI :

10.3791/68058

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31 octobre 2025

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1Sinclair Centre for Regenerative Medicine, Ottawa Hospital Research Institute, 2Division of Neonatology, Karolinska University Hospital, 3Division of Neonatology, Children's Hospital of Eastern Ontario, 4Department of Obstetrics, Gynecology and Newborn Care, University of Ottawa, 5Faculty of Medicine, University of Ottawa

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit le développement d’un modèle néonatal de porcelet de lésion pulmonaire aiguë qui modélise les événements pathogènes précoces survenant dans le poumon prématuré, y compris la quantité insuffisante de tensioactifs, l’hyperoxie, la ventilation à haute pression et l’inflammation, afin de faciliter la compréhension des déclencheurs moléculaires de la dysplasie bronchopulmonaire et d’améliorer l’application thérapeutique.

Résumé

La naissance prématurée est une cause majeure de morbidité et de mortalité pédiatriques. La dysplasie bronchopulmonaire (DBP) est une conséquence grave de l’extrême prématurité, entraînant des altérations de la croissance pulmonaire et des effets durables sur le développement. La pathogenèse du TPL est multifactorielle, y compris la ventilation mécanique, l’hyperoxie et l’inflammation comme principaux moteurs de son développement. Actuellement, il n’existe aucun traitement pour le TPL. Dans cette étude, un nouveau modèle réalisable et reproductible de lésions pulmonaires aiguës (LAI) chez un porcelet nouveau-né, imitant les stimuli cliniques auxquels est confronté le poumon prématuré humain, est présenté. Le modèle de porcelet nouveau-né ALI à plusieurs reprises, combinant l’épuisement en surfactant, l’hyperoxie, la ventilation à haute pression et l’administration de lipopolysaccharides intratrachéaux (LPS), entraîne une oxygénation altérée, une fonction pulmonaire perturbée, une inflammation avec infiltration de neutrophiles et des lésions pulmonaires histologiques. Ses principaux avantages sont l’utilisation des stimuli nocifs connus pour conduire à la pathogenèse du TPL et son faible entretien. Il génère un ALI haute-fidélité, répondant aux critères ALI de l’American Thoracic Society. Les grands modèles animaux, tels que ce modèle de porcelet, sont essentiels pour comprendre les facteurs pathogènes précoces, identifier les cibles thérapeutiques et faciliter l’application clinique aux patients.

Introduction

L’extrême prématurité est l’une des principales causes de décès chez les enfants de moins decinq ans 1. La complication grave la plus courante de la prématurité est la dysplasie bronchopulmonaire (DBP), une maladie pulmonaire chronique, avec des facteurs multifactoriels, notamment l’inflammation, le stress oxydatif dû à l’hyperoxie et le traumatisme induit par la ventilationassistée 2. Ce micro-environnement entraîne une altération de la croissance pulmonaire, ce qui peut avoir un impact durable sur la croissance et le développement des prématurés3. Actuellement, il n’existe aucun traitement pour le TPL.

Une récente revue systématique sur l’utilisation des cellules stromales mésenchymateuses comme traitement potentiel du TPL a révélé que les données précliniques ne concernaient que des rongeurs4. Ce phénomène est courant compte tenu de la grande disponibilité, de la facilité d’utilisation et de l’entretien des modèles de rongeurs. Cependant, la reproduction des études dans de grands modèles animaux est essentielle pour assurer le succès des efforts translationnels pour les thérapies nouvelles et à venir pour les nourrissons prématurés. De nombreux essais cliniques échouent en raison d’études précliniquesinadéquates5, ce qui ralentit le développement du traitement pour les patients. Bien que l’utilisation d’un modèle de primate non humain soit un modèle préclinique privilégié pour jeter les bases des essais cliniques sur l’homme, elle est laborieuse, coûteuse et difficilement accessible. Le modèle néonatal du porcelet est avantageux, avec l’utilisation de médicaments et d’équipements similaires aux soins néonatals, imitant l’environnement clinique des soins intensifs néonatals, ce qui améliore la faisabilité de l’application clinique. De plus, le système immunitaire des poumons porcins ressemble beaucoup à celui de l’homme 6,7,8,9, partageant plus de 80 % de la variance génétique du récepteur toll-like 4 10, les macrophages réagissant aux lipopolysaccharides (LPS)11,12 et la production d’oxyde nitrique13 - contributeurs potentiels de l’inflammation dans le poumon humain14. De plus, le surfactant pulmonaire d’origine porcine est un traitement cliniquement établi utilisé pour les maladies pulmonaires aiguës chez les nouveau-nés prématurés15.

Ce protocole présente la génération d’un nouveau modèle d’une lésion pulmonaire aiguë (ALI) d’un jour chez les porcelets nouveau-nés, avec des résultats cohérents, standardisés et traduisibles, conformément aux critères ALI 16,17,18 de l’American Thoracic Society. Des lavages pulmonaires salins répétés pour l’épuisement du surfactant avec ventilation à haute pression et une exposition ultérieure au LPS ou à d’autres substances toxiques ont été utilisés chez des porcs adultes pour induire des lésions pulmonaires18. Cependant, les modèles similaires disponibles chez les porcelets nouveau-nés sont rares19,20. Ce protocole décrit comment induire une lésion pulmonaire à l’aide d’un protocole adapté de lavages pulmonairesde déplétion en surfactant 21,22,23 sous ventilation hyperoxique et à haute pression, suivis d’un déclencheur inflammatoire utilisant le LPS instillé directement dans le poumon. Ce modèle est prêt pour l’administration d’un traitement de choix soit localement (intratrachéal - IT) soit systémiquement (intraveineux - IV) après la lésion pulmonaire induite, avec un suivi de son effet sur 5 h. Le cadre général imite étroitement l’état des poumons des prématurés. L’épuisement en surfactant recrée le syndrome de détresse respiratoire, marqué par un manque de surfactant à la naissance. Cette affection peut être associée à un barotraumatisme, à un atélectotraumatisme et à des problèmes d’oxygénation nécessitant des niveaux élevés d’oxygène et une ventilation mécanique. Enfin, la plupart des prématurés naissent dans un environnement inflammatoire en raison d’une chorioamnionite ou d’une infection, caractéristiques qui ont été tentées d’être reproduites par l’administration de LPS dans ce modèle de porcelet. Ce modèle à plusieurs succès de l’ALI crée des stimuli cliniques similaires auxquels le poumon prématuré humain est confronté, ce qui offrira des informations inestimables sur les processus pathogènes précoces du TPL et l’optimisation potentielle de l’administration du traitement pour une traduction clinique efficace24.

Protocole

Toutes les expériences sont réalisées par du personnel certifié en accord avec les réglementations nationales et institutionnelles (https://ccac.ca/en/guidelines-and-policies/) après approbation par le Comité régional de protection des animaux et le Service vétérinaire et de protection des animaux (protocole OHRIe-3731). Des porcelets nouveau-nés des deux sexes, âgés de 0 à 3 jours, avec un mélange de Yorkshire, de Landrace et de Duroc, ont été utilisés pour ce modèle. Une description détaillée des étapes (numéro d’étape identifié entre parenthèses) pour la préparation, l’anesthésie, la gestion des fluides et des médicaments et la surveillance utilisée pendant toute la durée de l’expérience (1-3), des interventions chirurgicales (4) y compris une période de stabilisation (5) avant d’induire la lésion pulmonaire à coups multiples (7), avec observation post-blessure et ventilation d’entretien (6, 8) se terminant par l’euthanasie et la fin de l’expérience (10) est fournie. Une procédure standardisée facultative pour le traitement intratrachéal (9) est également présentée. Le temps total entre la ferme et la fin de l’expérience et la collecte des échantillons est d’environ 12 à 15 h. Les réactifs et l’équipement utilisés dans cette étude sont énumérés dans la table des matériaux.

1. Préparation expérimentale

  1. Allumez et calibrez les moniteurs et le ventilateur avant l’arrivée du porcelet. Assurez-vous que les cartes mémoire sont insérées dans le moniteur pour l’enregistrement continu des données pendant l’expérience.
  2. Réglez le ventilateur avec une pression inspiratoire maximale (PIP) de 15 cmH2O, une pression expiratoire positive (PEP) de 6 cmH2O, un débit inspiratoire de 8 L/min, une fréquence respiratoire (RR) de 30/min, un temps inspiratoire (Tinsp) de 0,4 s, une fraction d’oxygène inspiré (FiO2) de 1,0 et fixez un nouveau circuit de ventilation et un humidificateur.
  3. Préparez des trousses chirurgicales stériles, des champs opératoires, des consommables (y compris des médicaments - voir la table des matériaux), des cathéters et le FRC imprimé. Augmenter la température de la salle d’opération à 25 °C ou plus, si l’équipe de recherche le juge nécessaire. Allumez la couverture chauffante/le matelas d’eau à 39 °C. Préparez un système de réchauffement à air pulsé prêt à l’emploi si une régulation supplémentaire de la température est nécessaire.
  4. Placez 1 l de sachet de solution saline normale dans un bain d’eau tiède (39 °C) pour préparer les lavages pulmonaires.
  5. Installez des pompes à perfusion de médicaments (kétamine et propofol) et ajoutez de nouveaux sacs de sonneries lactées à température ambiante et de dextrose aux pompes à fluide.
  6. Le porcelet reste avec la truie à la ferme locale et y a accès gratuitement jusqu’à ce qu’il soit ramassé par un membre de l’équipe de recherche. Notez le sexe, l’âge, la taille de la portée et l’heure de naissance.
    REMARQUE : Dans un véhicule de transport universitaire homologué avec un chauffeur qualifié, un membre expérimenté de l’équipe est présent tout au long du transport. Le porcelet est placé dans un grand transporteur souple fermé, qui lui permet de se déplacer en toute sécurité, librement et de s’allonger sans restriction (avec un coussin chauffant en caoutchouc d’eau chaude enveloppé dans des couvertures si nécessaire). Cela permet au porcelet de rester calme (il s’endort souvent) dans cet environnement apaisant. Le transporteur contenant le porcelet est fixé en place à l’aide de la ceinture de sécurité. Le membre de l’équipe a pour rôle d’apaiser doucement le porcelet et d’éviter les bruits forts pour maintenir le niveau de stress du porcelet au minimum.
  7. À votre arrivée à l’établissement de recherche, réduisez le bruit au minimum et tenez doucement le porcelet tout en plaçant le cône nasal d’anesthésie sur son visage.

2. Préparation des animaux

REMARQUE : Cette section comprend l’induction et le maintien de l’anesthésie (selon les protocoles approuvés par l’établissement).

  1. Initier l’écoulement O2 sans isoflurane lors de la mise en place du cône de nez. Lorsque le porcelet est calme, commencer l’isoflurane et augmenter jusqu’à ce que 3 % d’isoflurane soit administré (environ 60 s). Surveillez attentivement la respiration et ajustez l’isoflurane en conséquence.
  2. Vérifiez l’absence de réponse du porcelet en pinçant fortement l’orteil.
  3. Une fois que le porcelet ne répond plus, pesez-le et mesurez-le pour s’assurer qu’il est bon pour obtenir le dosage du médicament.
  4. Injecter la buprénorphine HCL (0,04 mg/kg) par voie intramusculaire (IM) avec une aiguille de 25 G dans la patte arrière pour l’analgésie.
  5. Fixez l’oxymètre de pouls sur le sabot supérieur droit (pré-ductal), le brassard de tensiomètre non invasif (jusqu’à ce que l’artère fémorale soit canulée) et les dérivations ECG.
  6. Insérez des angiocathes de 24 G dans les deux oreilles. Fixez des ensembles d’extension de 6 po avec rinçage salin avec robinets d’arrêt à 4 voies. Soutenez l’oreille avec un abaisse-langue pour éviter l’obstruction positionnelle.
  7. Prélevez du sang à partir du cathéter auriculaire inséré pour la mesure de la glycémie à l’aide d’un glucomètre calibré conformément aux instructions du fabricant.
  8. Amorcer la perfusion de D5W par voie intraveineuse (IV) à 5 mL/kg/h et ajuster en fonction de la glycémie pour cibler une glycémie de 4 à 5 mmol/L.
  9. Administrer des injections en bolus d’analgésie/anesthésie dans la veine de la deuxième oreille.
    REMARQUE : Une compréhension critique des propriétés et des effets secondaires de ces médicaments est nécessaire pour leur utilisation optimale et sûre.
    1. Administrer un bolus de 2 mg/kg IV de kétamine diluée (10 mg/mL) et un bolus de 5 mg/kg IV de propofol (10 mg/mL, 1 %) administrés en plusieurs bolus de plus petit volume. Méfiez-vous de la possibilité qu’une apnée survienne après un bolus de propofol. Continuer l’administration soigneuse de bolus de propofol (pour un total de 5 mg/kg) jusqu’à ce que le porcelet ne réponde plus au test de pincement des orteils durs et que la perfusion continue de propofol soit établie.
    2. Interrompre l’isoflurane (une fois la perfusion IV de propofol initiée) et poursuivre l’anesthésie IV continue pendant le reste de l’expérience.
  10. Commencer la perfusion continue du régime anesthésique suivant avec un titrage minutieux basé sur la fréquence cardiaque et la pression artérielle, y compris le réflexe de retrait pour atteindre la profondeur chirurgicale stable de l’anesthésie :
    1. Propofol (10 mg/mL) à raison de 10-30 mg/kg/h (équivalent à 1-3 mL/kg/h) IV.
    2. Kétamine (100 mg/mL) à raison de 5-10 mg/kg/h (équivalant à 0,05-0,1 mL/kg/h) IV.
      REMARQUE : Les lignes de perfusion d’analgésie/anesthésie sont fixées au cathéter auriculaire controlatéral de la perfusion D5W. Un ajustement à l’apport hydrique total et à la température ambiante peut être nécessaire pour assurer un soutien et une homéostasie appropriés.

3. Liquides, médicaments et surveillance

REMARQUE : Cette section fournit des informations sur la façon de maintenir l’hydratation, l’apport en glucose, l’analgésie/anesthésie, et d’assurer un examen approprié des données expérimentales, des préoccupations ou des problèmes.

  1. S’assurer que le débit de perfusion IV combiné total (LRS et D5W) pour l’homéostasie est généralement de 5 à 8 mL/kg/h.
    1. Administrer D5W dans le cathéter veineux auriculaire à une dose de 5 à 10 mL/h (ajustée toutes les heures en fonction de la glycémie artérielle (BG) - cible de 4 à 5 mmol/L).
    2. Administrer le LRS par le cathéter veineux fémoral à un débit de 1 à 6 mL/kg/h pour maintenir l’homéostasie liquidienne. Pour empêcher la coagulation de l’accès artériel et veineux, fixez une poche de perfusion NS héparinée à pression sur le transducteur et maintenez la pression entre 250 et 300 psi.
    3. Assurez-vous d’une profondeur d’anesthésie générale et d’une analgésie appropriées tout au long de la chirurgie et avant de commencer la période de stabilisation (étape 5.1) et d’induire une relaxation musculaire.
  2. Suivi des différents paramètres (emploi à temps plein pour une personne tout au long de l’expérience).
    REMARQUE : La surveillance et la documentation des signes vitaux, des réglages du ventilateur, des interventions, des échantillons prélevés, des médicaments, avec les doses et les heures, dans un CFR imprimé pré-fait (voir Dossier supplémentaire 1) pendant toute la durée de l’expérience. Les données continues enregistrées par le manomètre et le ventilateur sont enregistrées à la fin de l’expérience pour une analyse ultérieure.
    1. Surveiller la saturation en oxygène (SpO2) - s’assurer du signal de l’oxymètre de pouls préductal (sabot supérieur droit).
    2. Surveillez la fréquence cardiaque (FC) - fixez les fils ECG au porcelet.
    3. Pour surveiller la température, insérez le thermomètre rectal lubrifié à 3-4 cm de profondeur et fixez-le à la queue avec du ruban adhésif. Maintenez la température rectale du porcelet à 38-39 °C en ajustant le coussin chauffant et la température ambiante de la pièce (25 °C). Si vous utilisez une source de chauffage électrique, assurez-vous qu’une couverture supplémentaire est placée entre le porcelet et le tapis chauffant pour éviter les brûlures.
      REMARQUE : Utilisez une source de réchauffement supplémentaire telle qu’un système de réchauffement à air pulsé (comme une couverture recouverte au-dessus du porcelet) si l’homéostasie de la température n’est pas correctement atteinte.
    4. Pour la pression artérielle, effectuez une surveillance non invasive avec un brassard de taille appropriée jusqu’après la chirurgie, puis déterminez la pression artérielle invasive, y compris la pression artérielle moyenne (MAP) et la pression veineuse centrale (CVP), et documentez sur le CRF.
      REMARQUE : Assurez-vous que les dômes des transducteurs artériels et veineux sont placés et mis à zéro au niveau du cœur pour des lectures précises.
    5. Effectuez des prélèvements sanguins à des moments prédéfinis via un cathéter artériel ou veineux central. Effectuer une analyse des gaz du sang hépariné de 0,1 mL de sang artériel hépariné à l’aide d’un analyseur de sang portable (un appareil qui peut évaluer au minimum le pH, le PCO2, le PO2, le HCO3, le BE, le BG, le lactate, la créatinine, le Na, K, Cl - à noter sur le CRF) pour gérer la ventilation et le contrôle métabolique tout au long de l’expérience.
    6. Effectuer des prélèvements biologiques pour des expériences et des analyses futures : recueillir du sang total, du plasma et de l’urine en cours à des moments pertinents au cours du protocole expérimental, conformément aux objectifs de l’étude. Prélevez également des échantillons de paramètres d’évaluation, y compris le liquide de lavage broncho-alvéolaire (BALF), les tissus pulmonaires et d’autres tissus16,17, selon les objectifs de l’étude.
      1. Limiter l’anémie et l’hypovolémie iatrogènes :
        1. Prélevez lentement (l’équivalent de trois fois le volume de l’espace mort) du sang dans une seringue, mettez de côté et prélevez un volume suffisant pour des analyses expérimentales futures (0,4 à 1,5 ml)25 telles que les marqueurs de stress inflammatoire et oxydatif. Adaptez les volumes d’échantillons au poids corporel, au taux d’hémoglobine et à la stabilité du porcelet.
          REMARQUE : Le sang de l’espace mort est renvoyé à l’animal, et la ligne est rincée avec une solution saline avec au moins le volume équivalent qui a été prélevé pour l’échantillonnage du sang (gaz du sang ± sang pour les expériences futures) afin d’éliminer la ligne de sang, limitant ainsi l’occlusion possible due à un caillot sanguin.
    7. Enregistrez tous les signes vitaux et les paramètres ventilatoires dans la CRF à intervalles réguliers toutes les 15 à 30 minutes, plus fréquemment lors de l’induction de l’anesthésie et de la chirurgie, ou si le porcelet est instable.
    8. Notez les changements de médicaments depuis le début de l’anesthésie tout au long de l’expérience en notant l’heure de début et de fin ainsi que les modifications de dose.
    9. Évaluez la profondeur de l’anesthésie en évaluant le pincement des orteils/de la bande coronaire pour le réflexe de retrait, initialement à une fréquence régulière. Une fois que la relaxation musculaire complète est atteinte, surveillez la fréquence cardiaque et la pression artérielle pour une évaluation continue de la profondeur de l’anesthésie.
    10. Visez les éléments suivants, si rien d’autre, tout au long de l’expérience : FC : 120-180 bpm, MAP : 50-80 mmHg, CVP : 3-10 cmH2O, Température corporelle : 38-39 °C, BG : 4-5 mmol/L, PaCO2 : 35-45 mmHg, ajustez RR (max 60 respiration/min), Volume courant (VT) : 7 mL/kg, ajustez le PIP.

4. Intervention chirurgicale (temps : ~30-40 min)

  1. Maintenez la ventilation pendant la chirurgie.
    1. Maintenir RR de 30 respirations/min, viser la VT expiratoire à 10 mL/kg ajustée par PIP, PEP constante de 6 cmH2O, Tinsp de 0,4 s et FiO2 à 1,0.
  2. Établissez un champ stérile en effectuant un gommage cutané aseptique préféré au niveau du cou pour la trachéotomie et de l’aine pour l’accès aux vaisseaux fémoraux à l’aide de techniques de gommage standard.
    1. Effectuez l’incision du cou.
      1. Effectuez une incision cutanée au niveau du cou avec un scalpel entre le cartilage cricoïde et l’encoche sternale (taille approximative de 10 cm). Utilisez une dissection émoussée pour isoler la trachée.
      2. Enfilez deux attaches ombilicales de 12 pouces sous la trachée.
      3. Faites une incision de 5 mm entre les anneaux trachéaux et la partie la plus antérieure de la trachée, juste en dessous du cartilage cricoïde. Insérez la sonde endotrachéale (ETT). Faites le premier nœud sur le dessus de la trachée la plus proche de l’incision.
      4. Gonflez le poignet ETT, rétractez doucement le poignet ETT jusqu’à ce que le poignet soit arrêté par l’attache. Serrez la première attache et fixez une deuxième attache à l’ETT. Cette méthode permet de s’assurer que la pointe est au-dessus de la carène, ce qui est confirmé par l’auscultation des bruits respiratoires symétriques et bilatéraux.
        REMARQUE : La bronche du lobe droit crânien se développe à proximité de la bifurcation de la trachée. Attention au blocage de cette bronche si l’ETT est placé trop profondément. En cas de problèmes de ventilation ou de changements soudains, envisagez d’ajuster le tube. Le tronc vagosympathique et les nerfs laryngés se trouvent dans cette zone du cou. Des précautions doivent être prises pour éviter de stimuler ou de blesser ces nerfs.
    2. Effectuez l’incision de l’aine.
      1. Palper l’artère fémorale, effectuer une incision cutanée superficielle au niveau de l’aine droite à l’aide d’un scalpel (environ 8-10 cm).
      2. Utilisez la dissection contondante pour isoler l’artère et la veine fémorales.
      3. Enfilez deux sutures (3.0 soie) sous chacune des artères et veines fémorales pour les isoler26. Préparez les cathéters à insérer.
        1. Pour le cathétérisme de la veine fémorale droit, soulevez les deux sutures pour obstruer tout flux sanguin. Attachez la veine fémorale distale au site d’insertion proposé.
          1. Insérez complètement le cathéter, en tirant légèrement le stylet vers l’arrière et en attachant l’attache distale pour maintenir le cathéter en place. Retirez le stylet et fixez le kit d’extension de 6 pouces avec un robinet d’arrêt à trois voies qui a été amorcé avec une solution saline.
          2. Avant de fixer le cathéter, prélevez une petite quantité de sang pour assurer la perméabilité. Fixez le cathéter dans le vaisseau à l’aide de l’attache de suture proximale, empêchant le cathéter de glisser.
          3. Fixez l’orifice secondaire pour l’administration du liquide d’entretien et la perfusion de médicaments. Fixez l’orifice primaire pour la pression veineuse centrale.
        2. Pour le cathétérisme artériel fémoral droit, utilisez les mêmes étapes sur l’artère fémorale que pour la veine décrite aux étapes 4.2.2.3.1.1 à 4.2.2.3.1.3.
          1. Fixez le premier port du robinet d’arrêt à 3 voies pour la surveillance invasive de la pression artérielle et perdez les incisions de l’aine et du cou avec des agrafes chirurgicales.
    3. Effectuez l’insertion du cathéter de la vessie sus-pubienne pour l’accès urinaire.
      1. La vessie est superficiellement située dans le bas-ventre, légèrement à gauche de la ligne médiane sagittale. Nettoyez l’abdomen à l’aide d’une technique aseptique.
      2. Insérez un angio-cathéter stérile de 18 G (2 po) parallèle à la paroi abdominale, crânien à la paire de mamelons la plus basse (5-6 cm sous l’ombilic), pointé vers l’ombilic tandis que d’une main, exercez une légère pression de chaque côté de la vessie pour stabiliser et agrandir légèrement (le protocole facultatif pour l’aspiration sus-pubienne peut être trouvé ailleurs27).
      3. Une fois que l’écoulement d’urine est confirmé, collez le cathéter à l’abdomen pour sécuriser sa position. Fixez un kit d’extension de grand diamètre au cathéter. Placez l’extrémité distale dans un tube de 50 mL placé sous l’animal.

5. Stabilisation et recrutement pulmonaire post-opératoire standardisé (Temps : ~30-60 min)

REMARQUE : La stabilisation commence lorsque toutes les procédures chirurgicales sont terminées. Une profondeur d’analgésie/anesthésie suffisante est essentielle avant la relaxation musculaire, car elle garantit que les signes vitaux, tels que le MAP et la FC, sont dans la plage normale et l’absence de réflexes de retrait. La MAP et la FC seront surveillées en permanence tout au long du protocole pour s’assurer que la profondeur de l’anesthésie est appropriée.

  1. Administrer du rocuronium (0,3 mg/kg) en bolus IV (via l’accès D5W de la veine de l’oreille) et initier une perfusion continue de rocuronium (5,5 mg/kg/h) pour la relaxation musculaire avant la manœuvre de recrutement pulmonaire. Cette perfusion se poursuivra pendant toute la durée de l’expérience afin d’uniformiser la procédure de lavage et d’éviter l’asynchronie avec le ventilateur.
  2. Effectuer une manœuvre standardisée de recrutement pulmonaire.
    1. Augmentation progressive de la PEP : commencer à PEP 6 cmH2O, en augmentant de 1 cmH2O toutes les minutes jusqu’à ce que la PEP 10 cmH2O soit atteinte. Ajuster le PIP pour maintenir VT 10 mL/kg.
    2. Maintenir à une PEP de 10 cmH2O pendant 2 min avant de revenir à une PEP de 6 cmH2O en sens inverse (comme à l’étape 5.2.1) tout en maintenant une tension de 10 mL/kg.
    3. Lorsqu’il est stable à VT 10 mL/kg sur une PEP 6 cmH2O, enregistrer les paramètres respiratoires, les paramètres physiologiques et prélever une gazométrie artérielle (point temporel VT 10 mL/kg sur CRF).
      1. S’assurer que la PaO2 est de >400 mmHg (réponse attendue à l’hyperoxie chez un animal dont les poumons sont sains). FiO2 1.0 est utilisé pendant les phases initiales de l’expérience pour assurer une réponse appropriée à l’hyperoxie comme critère d’inclusion.
      2. Si ce n’est pas le cas :
        1. Vérifiez la position de la sonde endotrachéale, les réglages du ventilateur, l’administration d’oxygène et la bonne technique de prélèvement sanguin. Répétez la manœuvre de recrutement pulmonaire une fois pour assurer un bon recrutement.
        2. S’il n’y a toujours pas d’amélioration, exclure l’animal et l’euthanasier immédiatement (conformément aux protocoles approuvés par l’établissement) en raison du problème intrinsèque potentiel du poumon (poumon malsain résultant d’une exposition antérieure non expérimentale - c.-à-d. à la ferme).
      3. Ajustez le RR pour maintenir la PaCO2 entre 35 et 45 mmHg.
      4. Abaisser le PIP pour atteindre VT 7 mL/kg, en gardant FiO2 1.0 et PEP 6 cmH2O.
      5. Après la stabilisation, enregistrer les lectures de référence temporelles pour VT 7 mL/kg sur la feuille CRF avec les paramètres physiologiques et les échantillons, y compris les gaz du sang artériel et veineux. La stabilisation comprend les signes vitaux, comme à l’étape 3.2.10, et les valeurs de gaz sanguins suivantes : PaO2 : 400-500 mmHg, PaCO2 : 35-45 mmHg, pH : 7,35-7,45, BG : 4-5 mmol/L.

6. Ventilation pour les animaux témoins

  1. Utilisez une ventilation à volume contrôlé avec un volume courant de 7 mL/kg, une PEP de 6 cmH2O et une FiO2 de 1,0. Ne pas induire de lésions pulmonaires chez les animaux témoins (c.-à-d. ne pas effectuer d’appauvrissement en surfactant ou d’instillation d’endotoxines).
  2. Poursuivre la ventilation pendant environ 90 minutes pour correspondre à la durée moyenne nécessaire pour induire des lésions pulmonaires chez les animaux de laboratoire (voir l’étape 7 et la figure 1). Après cette période, passez directement à l’étape 10.

7. Induction d’une lésion pulmonaire aiguë (modèle à coups multiples)

  1. Effectuer l’épuisement du tensioactif (temps : 1-2 h)
    1. Avant de commencer le lavage des poumons, allumez l’appareil d’aspiration et assurez-vous qu’il est prêt à l’emploi. Placez le seau de récupération de lavage en position. Placez des coussinets absorbants sous la tête de l’animal et sous la table chirurgicale pour recueillir tout le liquide qui s’est échappé et récupéré pendant le lavage.
      1. Pesez les coussinets avant et après le lavage. Réglez le ventilateur sur PEP 5 cmH2O, PIP 25 cmH2O, RR 25/min et FiO2 1.0. Maintenez ces réglages de ventilation à pression contrôlée tout au long de la procédure de lavage. Attendez-vous à ce que la VT diminue d’environ 35 % à 45 % pendant le lavage complet.
    2. Débranchez le circuit ventilatoire de l’ETT et fixez l’entonnoir de lavage (voir Fichier supplémentaire 1).
    3. Instillez 30 mL/kg de solution saline isotonique chaude (NS) dans les poumons en versant doucement du NS dans l’entonnoir tenu à environ 30 cm au-dessus du porcelet.
    4. Massez la cage thoracique en appuyant bilatéralement sur la face latérale pour fournir une « pression » mécanique. Aidez à déplacer la solution saline dans les poumons et à la faire circuler dans l’appareil de lavage. Comptez 2-3 s entre les massages.
      REMARQUE : Évitez de masser trop rapidement ou trop lentement pour éviter une élimination inadéquate du surfactant ou un retour veineux altéré. Ne pas dépasser 30 s par cycle de lavage.
      1. Retirez le liquide de lavage en abaissant l’entonnoir sous le porcelet. Déconnectez légèrement l’entonnoir de l’ETT pour permettre au liquide de s’écouler dans le seau de collecte au sol.
      2. Effectuez une aspiration active pendant 10 s maximum. Insérez le cathéter d’aspiration dans l’ETT tout en continuant le massage de la cage thoracique pour faciliter le drainage du fluide. Surveillez le MAP et la FC, et rétablissez la ventilation tôt si l’un ou l’autre des paramètres baisse considérablement.
      3. Rebranchez le circuit ventilatoire. S’il reste un excès de liquide dans l’ETT, effectuez une deuxième aspiration.
    5. Laissez le porcelet récupérer pendant au moins 3 minutes entre les cycles de lavage pour réduire le stress et le risque d’intolérance.
    6. Démarrez le prochain cycle de lavage une fois que SpO2 revient à 100 %. Si la SpO2 ne revient pas à 100 %, vérifiez la PaO2via les gaz du sang une fois que la SpO2 s’est stabilisée
      1. Si PaO2 >100 mmHg, répéter les lavages pulmonaires (étapes 7.1.2 à 7.1.6).
      2. Si PaO2 <100 mmHg - attendre 15 min tout en maintenant les paramètres de ventilation de lavage, puis répéter l’analyse des gaz du sang.
      3. Si la PaOest de 2 >100 mmHg, continuer le lavage et passer à l’étape 7.1.6 pour réévaluer l’étendue des blessures.
    7. Confirmer que la lésion de l’appauvrissement du surfactant est obtenue lorsque la PaO2 reste <100 mmHg pendant 15 min. Arrêtez le lavage et passez à l’étape suivante.
  2. Instiller une endotoxine intratrachéale (Temps : 15 min)
    1. Préparer le lipopolysaccharide (LPS) d’Escherichia coli (1,5 mg/kg) en le diluant dans du NS jusqu’à un volume total de 2 mL dans une seringue de 3 mL.
      REMARQUE : Choisir la souche et la dose appropriées, en tenant compte des variations potentielles des effets en fonction de la souche.
    2. Attendez 15 minutes après le dernier lavage pulmonaire, puis instillez le LPS par voie intratrachéale (IT) avec le porcelet en position couchée.
    3. Améliorez la distribution homogène du LPS dans le poumon atélectique en suivant les étapes suivantes :
      1. Remplacez l’extrémité ETT standard par un adaptateur d’orifice en Y pour permettre la ventilation et l’administration simultanées de LPS via un cathéter à travers l’orifice latéral de la valve.
      2. Appliquer du PEP de 10 cmH2O pendant 1 min. Ajustez la PIP pour maintenir la VT à 7 mL/kg et réglez la RR à 40 respirations/min.
      3. Insérez un cathéter à travers l’orifice latéral dans l’ETT à une profondeur prémesurée de sorte que l’embout dépasse de 1 à 2 mm l’ETT.
      4. Injectez le LPS à travers le cathéter. Rincer le cathéter avec 1 mL de NS suivi d’un bolus d’air de 9 mL pour assurer une administration complète.
      5. Retirez le cathéter et fermez l’orifice latéral.
      6. Poursuivre la ventilation avec PEP 10 cmH2O (ajuster le PIP pour maintenir VT 7 mL/kg) pendant 3 min après l’administration du LPS.
      7. Débranchez le circuit du ventilateur de l’ETT pendant 30 s pour inverser tout recrutement involontaire de tissu pulmonaire.
      8. Lors de la déconnexion, ajustez les réglages du ventilateur sur FiO2 0,5, PEP 6 cmH2O, PIP pour maintenir VT 7 mL/kg, et augmentez RR à 40-60 respirations/min pour atteindre PaCO2 de 35-45 mmHg.
      9. Une fois que le VT est stabilisé à 7 mL/kg, consignez les mesures physiologiques de Timepoint 0 heure et remplissez la feuille CRF. Ajustez le RR en fonction de la PaCO2 à partir de l’analyse des gaz du sang.

8. Ventilation pendant la période d’observation (Temps : ~6 h)

  1. Passez à la ventilation à volume contrôlé avec FiO2 à 0,5 et PEP à 6 cmH2O. Ajustez le PIP au besoin pour maintenir le VT à 7 mL/kg (ne réglez pas de PIP maximum). Ajustez le RR, jusqu’à un maximum de 60 respirations/min, pour maintenir une PaCO2 normale.
  2. Utilisez des mesures horaires des gaz du sang pour guider les ajustements de RR tout au long du reste de l’expérience. Ajuster continuellement le PIP pour maintenir le VT à 7 mL/kg.
  3. Appliquer ces paramètres de ventilation uniformément aux animaux témoins et aux animaux à impacts multiples pendant toute la période d’observation de 6 heures (voir la figure 1).

9. Procédure de traitement - facultative (Durée : ~10-20 min)

  1. Pour les études d’intervention potentielles, administrez l’agent thérapeutique par une voie cliniquement pertinente, telle qu’intratrachéale (IT), intraveineuse (IV), sous-cutanée, intramusculaire ou intranasale. Sélectionnez le moment du traitement en fonction de la conception expérimentale. Si aucun traitement n’est administré, passez à l’étape 10. Un exemple d’administration informatique est fourni ci-dessous :
    1. Positionnez le porcelet en position couchée latérale droite.
    2. Maintenir la PEP à 6 cm H2O. Ajuster la PEP pour obtenir une VT de 7 mL/kg.
    3. Insérez le cathéter dans l’orifice latéral de la valve à la longueur prédéterminée (comme décrit à l’étape 7.2.3.3). Instiller la moitié de la dose ou du volume prévu de l’intervention. Appliquez ensuite un bolus de 1 mL NS et 9 mL d’air. Limitez le volume total à 2,5 mL/kg afin de minimiser le risque d’occlusion de la ventilation après l’injection en bolus.
    4. Scellez l’orifice latéral de la vanne avec le capuchon pour éviter les fuites de ventilation.
    5. Repositionnez le porcelet en position couchée latérale gauche et répétez les étapes 9.1.3 à 9.1.4.
    6. Remettez le porcelet en position couchée. Ajuster le PIP pour maintenir la VT à 7 mL/kg.
    7. Poursuivez la ventilation comme décrit à l’étape 8.

10. Euthanasie et réalisation de l’expérience

  1. Effectuer les derniers enregistrements physiologiques et les prélèvements d’échantillons après 6 h de ventilation pendant la période d’observation (étape 8).
  2. Euthanasier l’animal avec 120 mg/kg de pentobarbital sodique IV (240 mg/mL) administré en bolus (conformément aux protocoles approuvés par l’établissement).
  3. Assurer la mort d’un animal en l’absence de signes vitaux (rythme cardiaque, pression artérielle et respiration). Auscultez pour l’absence de fréquence cardiaque et de bruits respiratoires avec un stéthoscope pour la confirmation du décès. La mort est confirmée par une collection terminale de tissus du cœur et des poumons.
  4. Prélever les échantillons de tissus et les fluides corporels pour des analyses biochimiques, moléculaires et/ou histologiques plus poussées14,17 en vue d’expériences futures.
  5. Enregistrez toutes les données dans l’équipement de surveillance et le ventilateur, assurez-vous que les copies de sauvegarde sont téléchargées sur le disque local et le disque partagé, et éteignez tous les équipements.
  6. Éliminez tous les objets tranchants et les matières biologiques dangereuses conformément aux directives des politiques locales.
  7. Nettoyez toutes les surfaces avec le produit antiseptique de votre choix.
  8. Lavez tous les instruments et laissez-les sécher toute la nuit.

Résultats

Les paramètres de ce modèle sont alignés sur les critères de l’American Thoracic Society pour l’ALI (minimum 3 sur 4), qui comprennent les altérations physiologiques, histologiques, inflammatoires et de la barrière alvéolaire-capillaire16,17. D’autres critères d’évaluation peuvent être inclus en fonction de l’étude et à la discrétion de chaque groupe de recherche souhaitant mettre en œuvre ce modèle. Les lésions pulmonaires modérées sont définies comme un rapport entre la fraction partielle d’oxygène dans le sang artériel et la fraction d’oxygène inspiré (PaO2/FiO2, également connue sous le nom de rapport P/F) < 200 mmHg, et les lésions graves < 100 mmHg17. L’indice d’oxygène (OI) est calculé à l’aide de la formule suivante : OI = (pression moyenne des voies respiratoires (mAWP) * %O2)/PaO2, et les valeurs comprises entre 8 et 16 sont classées comme lésions modérées28. Comparativement aux animaux témoins, les animaux à impacts multiples ont présenté des lésions pulmonaires graves à modérées en raison de leur indice d’oxygénation altéré, de leur rapport P/F et de leur diminution de la compliance du système respiratoire (figure 2). Des signes clairs de lésions histologiques étaient présents à l’aide d’un score de lésions pulmonaires histologiques à 5 modalitésde 16,17 (Figure 3), avec un afflux de neutrophiles dans l’espace alvéolaire et interstitiel, des débris protéiques remplissant les espaces aériens et un épaississement de la cloison alvéolaire. L’afflux de neutrophiles dans le BALF fournit une indication des processus inflammatoires parallèlement à l’augmentation de la cytokine IL-6 dans le tissu pulmonaire (Figure 4).

figure-results-1
Figure 1 : Organigramme des lésions pulmonaires aiguës chez les porcelets nouveau-nés. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-2
Figure 2 : Un IPL modéré à sévère est observé à la suite de la lésion à coups multiples présentée dans ce protocole. (A,B) Une augmentation de l’indice d’oxygénation (entre 8 et 12) et un faible rapport PaO2/FiO2 (P/F) sont obtenus dans le modèle à coups multiples présenté ici (ligne rouge) par rapport au témoin (ligne bleue), conformément aux lésions pulmonaires modérées à graves. (C) La fonction pulmonaire est altérée chez les animaux à coups multiples, représentée ici par une diminution de >50 % de la compliance du système respiratoire. Nombre d’animaux (N) : témoin (N = 5) et multi-hit (souche LPS O55 :B5, 1,5 mg/kg) (N = 3). Toutes les valeurs utilisées signifient ± écart-type. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-3
Figure 3 : Le modèle d’ALI à coups multiples montre une lésion histologique hétérogène. (A,B) Des signes macroscopiques de lésions pulmonaires inégales affectant préférentiellement la face centrale postérieure du poumon à coups multiples sont observés. (C, D) Images représentatives (100x) de coupes pulmonaires colorées à l’hématoxyline et à l’éosine (H&E) montrant un afflux de neutrophiles dans l’espace alvéolaire et interstitiel, avec un épaississement alvéolaire et septal dans le poumon à coups multiples. (E, F) Des images représentatives (400x) de coupes pulmonaires colorées à l’H&E mettent en évidence une altération de l’intégrité structurelle, une infiltration neutrophile et un dépôt de débris dans l’espace alvéolaire du poumon à coups multiples. Les carrés bleus représentent la zone agrandie (E,F). La barre d’échelle noire représente 100 mm (C,D) et 50 mm (E,F). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-4
Figure 4 : Le modèle multi-hit montre une réponse inflammatoire après ALI. (A) Afflux de neutrophiles avec des neutrophiles atteignant plus de 75 % de la fraction des cellules totales dans le liquide de lavage broncho-alvéolaire (BALF) 6 h après une lésion pulmonaire induite (multi-hit) par rapport aux animaux témoins. (B) La cytokine pro-inflammatoire IL-6 est élevée dans le liquide de lavage broncho-alvéolaire (BALF) et (C) dans le tissu pulmonaire 6 heures après l’ALI induite. Le nombre d’animaux (N) varie en fonction du matériel disponible au moment de l’analyse. Pour BALF (B), un test immuno-enzymatique a été utilisé, tandis que pour le tissu pulmonaire (C), la technologie des billes laser multiplex a été réalisée. Toutes les valeurs sont indiquées en moyenne ± écart-type. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Dossier supplémentaire 1 : Formulaire de suivi de cas pour le modèle de lésion pulmonaire aiguë du porcelet néonatal. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fle.

Discussion

Le modèle ALI du porcelet néonatal se compose d’un modèle à plusieurs coups comprenant un lavage pulmonaire pour l’élimination du surfactant (imitant le syndrome de détresse respiratoire conduisant à un atélectotraumatisme), une exposition élevée à l’oxygène (conduisant à des espèces réactives de l’oxygène), une ventilation mécanique (baro/volu-traumatisme), ainsi que l’administration informatique de LPS en tant que stimulus inflammatoire, reflétant les divers composants que l’on pense être impliqués dans la pathogenèse du TPL chez les nouveau-nés prématurés2. Au cours du processus d’appauvrissement du tensioactif, il y a une augmentation délibérée de la pression et de l’oxygène pour contribuer aux blessures. L’exposition à l’hyperoxie avec FiO2 1.0 est d’environ 3 h, et une pression élevée est ajoutée pendant environ 90 minutes pendant la phase de lésion pulmonaire induite (lavage par appauvrissement en tensioactif et installation d’endotoxines). Des niveaux élevés d’oxygène inspiré pendant la réanimation (FiO2 0,9 élevé vs FiO2 0,3 faible) chez les nouveau-nés extrêmement prématurés ont entraîné un stress oxydatif et une inflammation plus élevés, l’exposition à l’hyperoxie étant inférieure à 1 h29. Lors de l’épuisement du tensioactif dans le modèle de porcelet, les poumons s’effondrent, ce qui entraîne une atélectasie, et la capacité de maintenir la perméabilité alvéolaire sera réduite pour une ventilation et une oxygénation appropriées. Ainsi, même si les réglages sont réduits pendant la période d’observation, l’élimination du tensioactif entraînera la nécessité d’une pression plus élevée afin d’atteindre un volume courant de 7 mL/kg. Les poumons seront capables de produire du surfactant au fil du temps, et l’ampleur du processus nocif en cours pourrait diminuer avec le temps. Cependant, ce nouveau modèle néonatal de porcelet ALI montre une faible récupération (Figure 2) de la fonction pulmonaire (compliance) et de l’oxygénation (rapport PF) pendant la période d’observation pendant 6 h suivant la lésion pulmonaire induite. Ce modèle ressemble beaucoup aux circonstances postnatales initiales les plus courantes auxquelles sont confrontés les nourrissons extrêmement prématurés, ce qui le rend très pertinent pour les efforts translationnels. Le modèle crée une lésion pulmonaire aiguë modérée (100-200 mmHg) à sévère (<100 mmHg) définie par le rapport P/F28. L’effet LPS avec inflammation atteint son apogée une à 2 heures après la blessure30. Ce modèle peut être utilisé comme un échafaudage qui peut être manipulé par d’autres groupes en modifiant la durée de l’observation ou du traitement utilisé pour l’adapter à leur programme de recherche.

Étapes critiques du protocole

Malgré la priorité accordée à l’accessibilité, ce grand modèle animal reste complexe, nécessitant la collaboration d’une équipe hautement qualifiée pour mener à bien cette expérience. Il y a des étapes critiques dans le protocole qui nécessitent une prudence supplémentaire. Ces considérations sont essentielles pour assurer le succès de ce cadre expérimental complexe.

Transport de l’animal

On s’attend à ce que le détachement précoce de la mère soit une période extrêmement stressante pour l’animal, ce qui peut entraîner l’incapacité de maintenir la stabilité cardiovasculaire et peut-être la mort pendant le transport. Cependant, le protocole de transport (voir étape 3) présenté ici a permis des animaux très calmes (certains s’endorment même), permettant une expérimentation complète. Bien qu’il soit difficile de faire des recommandations claires concernant la durée maximale du transport, les porcelets ont pu supporter confortablement un transport d’environ 60 minutes selon notre expérience.

Optimisation de la ventilation

Le ventilateur doit être réglé pour compenser la conformité du circuit afin de s’assurer que le volume courant complet est délivré aux poumons. Ceci est particulièrement important lors de l’épuisement du tensioactif, car le porcelet peut devenir hémodynamiquement instable si le volume courant est perdu dans le circuit. Les chercheurs doivent confirmer que le ventilateur disponible permettra une distribution appropriée du volume courant pour un nouveau-né. Les ventilateurs adultes ne seront souvent pas en mesure d’atteindre des volumes courants néonatals appropriés. La PIP est utilisée pour maintenir les valeurs de volume courant expiratoire (7 mL/kg utilisé dans ce protocole comme décrit précédemment par d’autres 14,19,20,21,31,32, sauf pendant le lavage des poumons - voir la section suivante). L’utilisation standardisée de l’adaptateur de tube endotrachéal avec un port latéral valvulaire lors de l’administration de LPS, ou pour tout traitement informatique, permet de maintenir la pression des voies respiratoires en évitant la déconnexion du circuit ventilatoire.

Stratégie standardisée de recrutement pulmonaire après la chirurgie

L’atélectasie peut se développer dans les poumons des porcelets au cours des phases préparatoires et chirurgicales. Une manœuvre de « recrutement pulmonaire » après relaxation musculaire a été administrée33 pour assurer une bonne aération des poumons. Après la manœuvre de recrutement, la pression partielle de l’oxygène dans le sang artériel devrait être supérieure à 400 mmHg, compte tenu de la réponse hyperoxique normale dans les poumons ouverts sains. Si ce n’est pas le cas, le chercheur doit déterminer si les poumons n’ont pas été correctement recrutés en raison de conditions expérimentales non optimisées ou si le porcelet peut avoir une condition préexistante (par exemple, si le porcelet provient d’une ferme où des expositions inconnues peuvent se produire). Le protocole permet de tester la première explication avec la relance de la manœuvre de recrutement une fois pour voir si cet objectif peut être atteint. Si l’on n’atteint pas 400 mmHg de PaO2 une deuxième fois, il faut considérer l’exclusion de l’animal comme une condition préexistante qui pourrait exister et qui influencerait de manière inappropriée les résultats de l’expérience.

Une homéostasie liquidienne et métabolique suffisante est de la plus haute importance

Cela limitera les effets confondants importants liés à une mauvaise hydratation et à un contrôle métabolique insuffisant. Ces porcelets nés à terme, généralement nés dans une grande portée, n’auront pas tous la même opportunité d’être allaités. En tant que tels, ils peuvent être exposés à un certain niveau de déshydratation postnatale avant d’être utilisés dans l’expérience. Fournir un apport hydrique total de 5 à 8 mL/kg/h est suffisant pour maintenir un bon volume intravasculaire14,34. Le contrôle métabolique est maintenu avec le maintien d’une glycémie entre 4 et 5 mmol/L (plage physiologique normale pour les porcelets nouveau-nés35,36). Un taux élevé de lactate dans le sang est une autre référence utilisée pour refléter un mauvais apport en oxygène et peut éventuellement refléter un faible état du liquide intravasculaire avant l’hypoxie. Un régime liquidien suffisant et un animal bien hydraté résistent aux lavages d’épuisement du tensioactif avec une stabilité cardiovasculaire et ne génèrent pas d’acidose sévère. Les valeurs de référence de l’hémoglobine et d’autres paramètres biochimiques varient en fonction de l’âge et de l’espèce37,38. Une hémoglobine plus faible peut avoir un impact sur l’oxygénation, ce qui nécessite un prélèvement sanguin optimisé et conservateur39,40. Chaque prise de sang est compensée par un volume égal de NS. Les taux d’électrolytes sanguins, d’urée et de créatinine ont été utilisés pour suivre un régime liquidien suffisant.

Prévoir un temps de récupération suffisant pendant la procédure de lavage des poumons

Pendant le lavage pulmonaire, une fenêtre de récupération importante d’au moins 3 à 5 minutes est nécessaire entre chaque lavage pour permettre un retour veineux correct afin d’éviter une congestion hépatique dangereuse41, une hémorragie hépatique et une insuffisance cardiaque droite. Ce phénomène a été observé chez quelques animaux de la cohorte expérimentale. Une gestion appropriée et proactive des fluides est impérative pour le maintien de la stabilité clinique. En recréant un petit milieu de soins intensifs pour ce modèle de porcelets, il est essentiel d’avoir un clinicien, un néonatologiste ou un technicien vétérinaire principal qui peut faciliter l’application des connaissances entre les membres de l’équipe afin de reconnaître les situations importantes et leurs plans d’urgence associés.

Dépannage recommandé

Le porcelet sera sous anesthésie générale et analgésie pendant toute la durée chirurgicale et expérimentale. Une personne est dédiée à la surveillance du porcelet pendant toute la durée de l’expérience. Chaque animal est différent dans sa sensibilité et sa réponse aux anesthésiques. Il est essentiel de surveiller l’état de l’animal immédiatement après l’induction de l’anesthésie avec des signes vitaux et des gaz sanguins toutes les heures. Il fournira des informations sur le niveau d’anesthésie et la stabilité métabolique, en plus de l’évaluation physique si nécessaire. Il existe une variabilité dans le nombre de lavages pulmonaires (de 6 à 20) et donc dans le temps (de 28 à 115 min) nécessaire pour atteindre la déplétion en tensioactif.

Problèmes potentiels et solutions lors de l’initiation, de la stabilisation et de la chirurgie de l’anesthésie : (1) Si l’apnée se développe, le gaz anesthésique doit être coupé et la respiration doit être soutenue par une ventilation par ballon-masque jusqu’à ce que la respiration spontanée reprenne. (2) Si des signes d’hypovolémie par une FC élevée, une PMA faible ou une faible CVP sont présents, un bolus liquidien de 10 mL/kg de NS doit être administré et un taux accru de liquide d’entretien doit être envisagé. (3) En cas d’hypotension avec diminution de la MAP à 30-40 mmHg, qui n’est pas résolue avec le bolus de liquide, les pompes d’anesthésie doivent être diminuées/arrêtées, et les signes de perfusion et d’hypotension sont réévalués après 10-15 min. Analyse des gaz sanguins pour les taux d’hémoglobine afin d’évaluer une éventuelle hémorragie interne. (4) Si les symptômes respiratoires indiquent un pneumothorax (désaturation aiguë ou bradycardie >20 %), le porcelet est euthanasié immédiatement.

Limitations

Le modèle ci-dessous représente une IAL néonatale à court terme (6 h) dans un modèle animal de grande taille. La chronicité des blessures menant à un TPL est un facteur important à prendre en compte. Ce modèle pourrait ne pas saisir pleinement cet aspect de la pathogenèse, et les données informant de l’évolution de la lésion pulmonaire au-delà de 6 heures restent indéterminées. Néanmoins, la cohérence de ce modèle constitue une base solide sur laquelle s’appuyer (extension de la longueur/modification du protocole), permettant une polyvalence aux groupes de recherche qui le mettront en œuvre. Malgré l’accent mis sur l’accessibilité et la faisabilité de ce grand modèle animal lors de sa conception, des compétences spécifiques sont justifiées pour le bon déroulement de l’expérience. Une expertise clinique avec une base solide en physiologie et des connaissances pour gérer les changements/détériorations rapides via des médicaments/perfusion/etc. est nécessaire pour la mise en œuvre et la réussite dans les premières phases. Cet ensemble de compétences peut ensuite être transféré aux membres de l’équipe pour la maintenance continue du modèle au fil du temps. De plus, une équipe composée d’un technicien vétérinaire, de techniciens de laboratoire et d’étudiants diplômés chevronnés avec lesquels une communication et une collaboration solides ont été établies peut assurer une couverture appropriée de tous les composants de chaque expérience. Il est prévu qu’au moins trois membres de l’équipe soient nécessaires pour réaliser l’expérience du début à la fin lorsque le flux de travail sera optimisé.

Importance et application potentielle

L’application clinique s’appuie sur des études fondamentales solides au niveau préclinique. Cependant, de nombreux essais cliniques échouent en raison de l’inadéquation entre le modèle préclinique et la physiologie humaine, ce qui souligne l’importance de grands modèles animaux étroitement apparentés pour renforcer le potentiel de traduction. La mise au point d’un nouveau modèle néonatal de lésions pulmonaires chez les porcelets est essentielle pour mieux comprendre les événements pathogènes précoces, favorisant ainsi un environnement propice au développement de la DBP chez les prématurés humains. Le modèle présenté ici recrée des aspects importants d’un cadre de soins intensifs (hyperoxie, ventilation à haute pression et manque de surfactant) pour les bébés prématurés pendant les premiers jours de la vie, qui est étroitement modélisé. Ce nouveau modèle polyvalent de porcelet néonatal à succès multiples offrira des informations inestimables sur les processus pathogènes précoces du TPL, fera progresser les connaissances sur les candidats thérapeutiques, ainsi que l’optimisation de leur administration thérapeutique pour une application clinique efficace. Il agira comme un excellent vecteur de collaborations, favorisant un cadre de test d’hypothèses pour les études de preuve de concept variant de l’innocuité à l’efficacité, et la production de connaissances. Servant de base à de futurs essais, ce modèle fera progresser considérablement les efforts d’application clinique des lésions pulmonaires aiguës observées chez les nouveau-nés prématurés.

Déclarations de divulgation

Tous les autres auteurs n’ont aucun intérêt concurrent à déclarer.

Remerciements

Nous sommes reconnaissants envers le Dr Martin Post, de l’Hôpital pour enfants malades de Toronto, qui nous a généreusement prêté un respirateur néonatal qui a été utilisé tout au long de ce projet. Nous remercions également Dan DeVette et son équipe du Service vétérinaire et de soins aux animaux de l’Institut de cardiologie de l’Université d’Ottawa pour toute l’aide qu’ils nous ont apportée lors de l’élaboration de ce modèle. Ce travail a été soutenu par le Fonds d’innovation CHAMO du CHEO, le Réseau de cellules souches, l’association de la princesse Lovisa [HKH Kronprinsessan Lovisas förening], la Fondation David et Astrid Hagelén et la Swedish Heart Lung Foundation.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Lame de scalpel #10Incision cutanée
1 ml de seringueBectonDicksonBD309659Slip Tip  ;
Seringues de 10 mlBectonDicksonBD302995Rinçez les seringues pour les lignes artérielles et veineuses
18 g d’angiocathéter   ;InsyteCanulation de la vessie
Seringues de 20 mlBectonDicksonBD302830Bolus fluide si nécessaire
Aiguilles hypodermiques de 22 GBectonDicksonSeringue de recharge
24 g d’angiocathétersInsyte160465Accès intraveineux de l’oreille et artère et veine fémorales
Aiguilles hypodermiques de 25 gBectonDicksoninjection intramusculaire (IM) de bupénorphine
Seringues de 3 mlBectonDicksoninjection de médicaments et surveillance de l’élimination des espaces morts de lignes
Cravates en soie 3-0EthiconA304HUtilisé pour fixer des cathéters artériels et veineux
Robinets d’arrêt à 4 voiesDiscofix, BraunD500456020fixé à un fluide et des lignes de surveillance pour le rinçage et l’échantillonnage
Ensemble d’extensions de 6"Technologies d’infusion SAIPoste 6attaché à la perfusion/lignes artérielles   ;
Ensemble d’extension 60"BBV6223Lignes d’infusion de médicaments
Adaptateur d’accès AirLife Neo-Verso Y pour tubes endotrachéauxVyaireCSC300utilisé pour administrer le matériel intratrachéalement
Bupénorphine, 0,3 mg/mLCDMV128140Bolus IM comme antidouleur
Dextrose, 5 %BaxterJB0063Maintien de la glycémie
Rideaux jetables3M3M1050Rideaux de champ stériles
Électrodes ECG3M220790électrodes à usage unique pour l’ECG
Sonde d’administration par tube endotrachéal (ETT)
Tube endotrachéal 3,5  ;Teleflex5-10107Utilisé pour la trachéotomie
Épinéphrine, 1 mg/mLHospira07541L01Dilué avec du sérum physiologique normal stérile à 0,1 mg/mL pour la réanimation si nécessaire
Analyseur de gaz sanguins EPOC   ;Siemens10736398Système d’analyse sanguine EPOC avec hôte NXS
Cartes d’échantillons EpocSiemensBD309659Cartouches de gaz sanguin
Formol, 10 % tamponnéFisher ScientificSF100-4Fixation pulmonaire
BouillotteKent ScientificTPZ-814EACouverture circulante d’eau
Pompes de perfusion intraveineuses (IV) x 3Sigma AldrichZ401358Perfusion de kétamine/propofol et rocuronium
Kétamine, 10 mg/mLVetoquinol112170Perfusion continue (diluée avec du sérum physiologique stérile) dans une pompe à seringue pour l’entretien anesthésique   ;
Kétamine, 100 mg/mLVetoquinol112170Utilisé comme bolus pour l’induction de l’anesthésie générale et pompe à seringue pour l’entretien de l’anesthésie   ;
Ringers lactésBaxterJB2323Entretien du volume sanguin
Équipement de lavage : cheminée, connecteur à trois voies, connecteur ETT, tuyau de 4 piedsn/an/aTubes faits maison pour le lavage
Lipopolysaccharide, LPS (O55 :B5), 100 mgSigma-AldrichL2880-100mg2e blessure pulmonaire touchée
Humidificateur respiratoire MR850Fisher et PaykelMR850JXX*
Pentobarbital Sodium (Euthanyl), 240 mg/mLVetoquinol381Bolus IV pour l’euthanasie humaine
Transducteur de pressionFournitures vétérinaires McCarthyV6402pour les pressions artérielles/veineuses sur Surgivet
Propofol, 10 mg/mLUtilisé comme bolus pour l’induction de l’anesthésie générale et pompe à seringue pour l’entretien de l’anesthésie   ;
Oxymètre de poulsMaismoNEOPT-500
Rocuronium, 10 mg/mLAuropharma2498820Utilisé après l’opération et avant le début de l’induction de la lésion pulmonaire, suivi d’une perfusion continue
Solution saline, 0,9 %BaxterJB1324Rinçage des lignes sanguines et réanimation du volume sanguin
Eau stérilen/an/apour humidificateur à ventilateur
Cathéter d’aspiration 10 CH/25 cmMediplast608810251Utilisé pour le lavage bronchéo-alvéolaire du lobe pulmonaire
Cathéter d’aspiration 6 CH/40 cmMediplast60880640Enlever l’excès de solution saline pendant le lavage
Instruments chirurgicaux : poignée de scalpel, pinces anti-moustiques, pinces du pouce, ciseaux metzenbaum, agrafes, ciseaux chirurgicaux, écarteurs, gaze, bol en acier inoxydableN/AN/APack chirurgical autoclavé
Surgivet : Coiffe NIBP, sonde de température,   ; Deux fois la tension artérielle invasive, l’ECG, le pouls-oxymètreFournitures vétérinaires McCarthyv9203comprend : brassard non invasif de tension artérielle (NIBP), thermomètre, pression artérielle (BP) 2x invasive, électrocardiographie (ECG) et oxymètre de pouls
Pompes à seringue x 3Pompes d’anesthésie
Bandesécurisation des lignes IV auriculaires
Bande omble-cordonEthiconsécurise le tube endotrachéal à l’intérieur de la trachée
Ventilateur (Servo-I)Getingedoit avoir des réglages néonataux pour un volume de marée adéquat
Circuit ventilatoireFisher et PaykelRT265avec humidificateur
Pince d’occllusion à tube de Vorsen/an/aocculte le tubage pendant le lavage

Références

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Réimpressions et autorisations

Mots-clés

Mod le de porcelet n onataldysplasie bronchopulmonaired pl tion en surfactantexposition l hyperoxieventilation haute pressionadministration de lipopolysaccharideinflammation pulmonaireanalyse des gaz du sanginfiltration neutrophile
Développement d’un modèle de lésion pulmonaire aiguë chez le porcelet néonatal pour recréer l’environnement précoce des poumons des nourrissons prématurés
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