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Article de méthode

Un modèle murin unique pour l’évaluation quantitative de la formation de biofilm sur les implants chirurgicaux dans l’abcès sous-cutané

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DOI :

10.3791/68067

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6 juin 2025

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1Department of Orthopaedic Surgery, Orthopaedic Trauma Institute (OTI), University of California, San Francisco (UCSF), 2Rosies Base, LLC, 3Department of Neurological Surgery, Weill Institute for Neurosciences, Brain and Spinal Injury Center (BASIC), University of California, San Francisco (UCSF)

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit un modèle expérimental unique d’infections liées aux implants qui permet l’incubation simultanée de deux implants avec des bactéries dans des conditions identiques au sein d’une même souris. Il permet également une évaluation précise de la formation de biofilms sur les surfaces des implants à l’aide de méthodes analytiques comparatives optimisées, démontrant ainsi des techniques avancées d’évaluation des propriétés antimicrobiennes des biomatériaux.

Résumé

Pour développer un nouveau biomatériau aux propriétés antibactériennes pour les procédures chirurgicales orthopédiques, il est crucial d’établir un modèle animal expérimental d’infections liées aux implants qui imite étroitement l’état pathologique. De plus, une comparaison quantitative avec des échantillons de contrôle est nécessaire pour évaluer la formation de biofilm sur les matériaux. Cependant, les modèles animaux actuels, qui impliquent l’implantation d’un seul matériau chez chaque individu, peuvent donner des résultats incohérents en raison de l’hétérogénéité du statut d’infection entre les sujets. De plus, il reste difficile de quantifier avec précision la formation de biofilms sur les matériaux in vivo , et les résultats peuvent manquer de fiabilité. Pour résoudre ces problèmes, cette étude a mis en évidence un modèle murin unique d’infection liée à l’implant qui permet l’incubation simultanée de deux implants avec des bactéries dans un environnement clos au sein d’une seule souris, formant un abcès sous-cutané encapsulé. Une poche d’air mature a d’abord été créée sous la peau du dos. Deux fils d’acier inoxydable ont été connectés et placés dans le sac, suivis de l’inoculation de Xen 36, une souche bioluminescente de Staphylococcus aureus. 14 jours après l’inoculation, un abcès sous-cutané s’était formé autour des fils. Le biofilm a été complètement retiré de la surface de chaque fil, et les suspensions bactériennes dissoutes ont été mesurées avec précision à l’aide de méthodes optimisées pour évaluer la formation de biofilm sur l’implant, déterminer les unités formant colonies et effectuer une analyse quantitative de la réaction en chaîne par polymérase. En exploitant l’opéron lux des bactéries bioluminescentes, les niveaux d’expression relatifs de l’ARNr luxA et 16S ont été utilisés pour déterminer la charge bactérienne dans le biofilm sur chaque fil. Cette approche analytique comparative optimisée permet d’évaluer précisément la formation de biofilms sur deux fils dans des conditions d’infection uniformes au sein d’un seul modèle de souris et peut faciliter l’avancement de biomatériaux ayant des propriétés antibactériennes.

Introduction

Les infections liées aux implants restent un défi important en milieu clinique, car elles peuvent entraîner des taux élevés de morbidité et de mortalité en chirurgie orthopédique, malgré les progrès de la technique chirurgicale et de la conception des implants1. Bien que l’incidence des infections associées aux implants chirurgicaux ait considérablement diminué en raison des normes modernes de contrôle aseptique dans l’environnement de la salle d’opération et des protocoles appropriés pour l’antibioprophylaxie périopératoire, l’incidence des infections liées aux implants en chirurgie primaire reste de 2 % à 5 %2.

Le principal mécanisme sous-jacent des infections liées aux implants est la formation d’un biofilm sur les surfaces de l’implant, qui protège les micro-organismes des antibiotiques et du système immunitaire, ce qui rend l’infection difficile à éradiquer 3,4. Comme l’adhérence bactérienne sur la surface de l’implant est cruciale au cours de la première étape de la formation du biofilm, la minimisation de l’adhérence bactérienne et de la formation ultérieure du biofilm est une stratégie essentielle pour réduire le risque d’infections liées à l’implant. Malgré les propriétés antibactériennes de diverses technologies d’implants, celles-ci n’ont pas été largement utilisées cliniquement en raison d’événements indésirables, tels que la toxicité cellulaire et les allergies 5,6,7,8. Par conséquent, il existe encore un besoin clinique non satisfait d’implants antibactériens qui harmonisent l’innocuité, l’efficacité, la stabilité et la durabilité afin de réduire le risque d’infections liées aux implants. La recherche et le développement d’implants aux propriétés antibactériennes pourraient faire progresser la technologie chirurgicale pour surmonter ces problèmes.

Il est essentiel d’évaluer les propriétés antibactériennes de divers biomatériaux à l’aide de petits modèles animaux avant de passer à des modèles animaux plus grands et à des essais cliniques9. De nombreuses études ont montré des modèles murins applicables d’infections liées aux implants à l’aide d’une bactérie bioluminescente, qui contient l’opéron luxABCDE 10,11,12,13,14,15. Bien que ces modèles accélèrent la recherche sur le développement d’implants ou de technologies antibactériennes, ils ont certaines limites. Tout d’abord, une expertise de pointe et des équipements spécialisés, tels que des rayons X ou des systèmes d’imagerie dédiés, sont souvent nécessaires pour évaluer directement et avec précision la charge bactérienne sur les implants placés dans des modèles murins. Deuxièmement, alors que les implants collectés évaluent généralement un implant solitaire à un seul site d’infection par animal, les conditions d’infection et les réponses immunologiques peuvent varier d’un individu à l’autre, ce qui peut entraîner une variabilité des résultats des évaluations comparatives. Par conséquent, lorsque l’on compare les effets antibactériens de divers biomatériaux in vivo, il est plus avantageux de les implanter et de les inoculer avec des bactéries dans des environnements uniformes pour résoudre ces problèmes. De plus, il est essentiel d’optimiser la méthodologie actuelle et de réaliser des évaluations quantitatives avec reproductibilité et précision en exploitant les caractéristiques du modèle animal et des bactéries utilisées.

Cette étude présente une nouvelle approche expérimentale pour les infections liées aux implants in vivo qui permet des mesures précises pour évaluer la formation du biofilm sur les surfaces de deux implants au sein d’un seul modèle de souris grâce à des méthodes analytiques comparatives inter- et intra-individuelles. Le biofilm sur chaque implant peut être quantifié à l’aide de méthodes optimisées de visualisation du biofilm sur l’implant, de détermination des unités formant colonies (UFC) et d’analyse quantitative de la réaction en chaîne par polymérase (qPCR) d’une souche bioluminescente de Staphylococcus aureus, Xen 36. L’étude précédente a montré qu’un nouvel implant métallique possède une efficacité antibactérienne in vivo prometteuse contre Staphylococcus aureus en utilisant cette approche globale16. Cette méthodologie peut être facilement mise en œuvre dans un cadre de laboratoire standard et peut accélérer la recherche sur le développement de biomatériaux antibactériens.

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Protocole

Toutes les procédures sur les animaux sont approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Université de Californie à San Francisco (UCSF) et sont effectuées dans une installation BSL2 après consultation et approbation du programme de risque de biosécurité de l’UCSF, administré par l’UCSF Environmental Health and Safety. Des souris C57BL/6 mâles et femelles (âgées de 12 à 16 semaines, 25 à 50 mg) ont été utilisées. Les détails des réactifs et de l’équipement utilisé sont répertoriés dans la table des matériaux.

1. Préparation des bactéries

  1. Utilisez le bioluminescent Staphylococcus aureus Xen36 (ATCC49525) comme agent pathogène.
    REMARQUE : Cette souche est obtenue à partir de l’American Type Culture Collection (Manassas, VA) et utilise de manière unique un opéron luxABCDE , qui est optimisé et intégré dans le plasmide natif de l’hôte. Xen36 utilise également le gène de résistance à la kanamycine lié à l’opéron lux .
  2. Ajouter une petite quantité de bouillon de glycérol congelé de Xen 36 et ajouter les morceaux à 5 mL de bouillon de soja tryptique (TSB) contenant 200 μg/mL de kanamycine.
  3. Incuber la culture pendant la nuit à 37 °C dans un incubateur à agitation (200 tr/min).
  4. Laisser traîner Xen36 sur des plaques de gélose TSB (TSB dans la gélose 1,5 %) contenant 200 μg/mL de kanamycine et incuber pendant une nuit à 37 °C.
  5. Isoler des colonies individuelles de Xen36 et les mettre en culture dans 5 mL de BST contenant 200 μg/mL de kanamycine pendant une nuit à 37 °C dans un incubateur à agitation (200 tr/min).
  6. Mesurer l’absorbance de la culture résultante à 630 nm.
  7. Diluer la culture et faire une culture Xen36 de 1,0 x 108 UFC/mL basée sur l’absorbance à 630 nm.
    REMARQUE : Une mesure de l’absorbance à 630 nm (contre un blanc TSB) de 0,5 est à peu près équivalente à 1,0 x 108 UFC/ml de Xen36.
  8. Diluez la culture et faites une culture Xen36 de 1,0 x 105 UFC/mL.

2. Préparation des implants connectés

  1. Utilisez deux fils en forme de tige composés d’acier inoxydable de qualité chirurgicale (SUS316L, chacun mesurant 8 mm de long et 0,5 mm de diamètre.
  2. Connectez les deux fils verticalement en les insérant aux deux extrémités d’une pointe de pipette de 20 μL coupée à une longueur d’environ 3 mm.
    REMARQUE : insérez les fils connectés verticalement dans la pointe de l’aiguille 18 G (Figure 1). Assurez-vous que les fils sont solidement fixés par la pointe de la pipette pour éviter toute déconnexion.
  3. Autoclavez les fils avant de les implanter chirurgicalement dans les souris.

3. Création d’un sac sous-cutané mature

REMARQUE : 7 jours avant l’inoculation bactérienne, créez la poche d’air comme suit :

  1. Anesthésier la souris (C57BL/6) avec de l’isoflurane à 2 % par inhalation (en suivant les protocoles approuvés par l’établissement).
    REMARQUE : Évaluez le niveau d’anesthésie approprié en observant la fréquence respiratoire, le tonus musculaire, le pincement des orteils, le réflexe cornéen et la couleur des muqueuses. Utilisez une pommade ophtalmique sur les yeux pour prévenir la sécheresse sous anesthésie.
  2. Transférez la souris anesthésiée sur le lit chirurgical et rasez la région cervicale/thoracique dorsale de la souris.
  3. Écouvillonnez et stérilisez toute la région avec de l’éthanol à 70 % et de la povidone iodée.
  4. Remplissez une seringue de 10 ml d’air stérile et fixez une aiguille de 27 G à la sortie.
  5. Pincez et élevez doucement la base du cou de la souris pour créer un espace entre le tissu sous-cutané et le fascia.
  6. Placez l’aiguille dans la ligne médiane entre les omoplates de la souris et injectez 3 ml d’air stérile par voie sous-cutanée pour créer la poche d’air (figure 2).
    REMARQUE : Tout en injectant de l’air, maintenez les deux côtés du dos avec la main opposée pour vous assurer que l’air se propage au centre du dos, créant une poche au milieu.
  7. Remettez la souris dans une cage chauffée avec un tampon thermique et surveillez-la de près jusqu’à ce qu’elle se remette de l’anesthésie.
  8. Injectez 3 mL d’air stérile comme décrit ci-dessus pour maintenir le gonflage de la cavité et créer un sac mature tous les 2 jours.
    REMARQUE : Avant chaque gonflage, aspirez l’air du sachet pour confirmer le bon placement de la pointe de l’aiguille. Retirez délicatement la seringue de l’aiguille, en laissant la pointe de l’aiguille dans le sachet. Regonflez le sachet avec 3 ml d’air stérile.

4. Implantation de fils connectés et inoculation bactérienne

  1. 7 jours après la première injection d’air, anesthésie la souris comme décrit à l’étape 3.1.
    REMARQUE : Pendant l’intervention chirurgicale, vérifiez constamment que la souris respire et est anesthésiée. L’ensemble de l’intervention chirurgicale prend généralement 10 à 15 minutes lorsqu’elle est effectuée par un chirurgien qualifié. L’anesthésie est maintenue en plaçant un tube délivrant 2 % d’isoflurane mélangé à de l’oxygène à côté du museau de la souris.
  2. Écouvillonnez et stérilisez toute la région avec de l’éthanol à 70 % et de la povidone iodée.
  3. Injectez la bupivacaïne par voie sous-cutanée juste avant la chirurgie.
  4. Faites une incision longitudinale médiane de 3 mm en haut du sac.
  5. Insérez une aiguille de 18 G contenant les fils connectés dans le sac par le trou et poussez les fils à l’aide d’une seringue intérieure d’une aiguille spinale de 25 G (Figure 3A,B).
  6. En laissant la pointe de l’aiguille de 18 G à l’intérieur du sac, retirer délicatement le cylindre intérieur et injecter 3 mL de culture de Xen36 1,0 x 105 UFC/mL à l’aide de la seringue (figures 3C,D).
  7. Retirez soigneusement toutes les aiguilles, fermez la peau à l’aide d’une pince à plaie et scellez-la avec un adhésif cutané topique (figures 3E, F).
  8. Assurez-vous qu’il n’y a pas de fuite, remettez la souris dans la cage individuelle chauffée avec un tampon thermique et surveillez comme auparavant.

5. Extraction des implants de l’abcès sous-cutané

  1. Après l’euthanasie par surdosage d’isofluorane, rasez la région dorsale cervicale, thoracique et lombaire de la souris, puis frottez et stérilisez toute la région avec de l’éthanol à 70 % et de la povidone iodée (Figure 4A).
    REMARQUE : L’euthanasie a été menée conformément aux lignes directrices de l’American Veterinary Medical Association (AVMA) pour l’euthanasie des animaux.
  2. Faites une incision médiane de 2 cm dans la région lombaire et exfoliez soigneusement le tissu sous-cutané à l’aide de ciseaux.
  3. Étendez l’incision et la dissection sous-cutanée vers la partie proximale et séparez le tissu adhérent entourant l’abcès (Figure 4B - D).
  4. Excise tout l’abcès sous-cutané (Figure 4E).
  5. Coupez l’abcès et extrayez soigneusement le fil de l’intérieur de l’abcès (Figure 4F).

6. Quantification du biofilm formé sur les surfaces de l’implant

  1. Dosage du violet cristallin
    1. Placez les fils extraits de l’abcès dans les puits individuels d’une plaque de 24 puits contenant 1 mL d’eau désionisée (DI).
    2. Transférez les fils dans de nouveaux puits contenant 1 ml d’eau DI pour éliminer les bactéries qui adhèrent peu à la surface des fils.
    3. Fixez le biofilm sur les fils avec de l’éthanol à 100 % pendant 1 min et laissez-les sécher.
    4. Transférez les fils dans de nouveaux puits contenant 1 mL de réactif violet cristallin à 0,1 %.
    5. Après 15 min de coloration, lavez délicatement les fils deux fois avec de l’eau DI pour éliminer tout excès de colorant.
    6. Placez l’implant dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL contenant 250 μL d’acide acétique à 33 % pendant 15 min ; Solubiliser le violet cristallin adhérent au biofilm sur l’implant, puis vortex pendant 1 min.
    7. Transférez 200 μL de la suspension sur une plaque à 96 puits et mesurez l’absorbance àOD 630 nm à l’aide d’un lecteur de microplaques. Toutes les mesures sont effectuées en trois exemplaires.
  2. Comptage des unités formant colonies (UFC)
    1. Retirez toutes les bactéries faiblement adhérentes de la surface des fils comme décrit à l’étape 6.1.2.
    2. Placez l’implant dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL contenant 200 μL de trypsine 10x et incubez à 37 °C pendant 1 h.
    3. Vortex pendant 1 min et sonicate dans un bain-marie à 100 W pendant 5 min, suivi d’un vortex supplémentaire pendant 30 s pour détacher le biofilm dans la suspension.
    4. Inoculer 10 μL de la suspension diluée en série sur les plaques de gélose TSB (TSB dans la gélose 1,5 %) avec 200 μg/mL de kanamycine.
      REMARQUE : Effectuez cette procédure en trois exemplaires pour chaque solution.
    5. Après avoir incubé les plaques à 37 °C pendant 24 h, comptez les colonies sur les plaques et calculez le nombre de cellules bactériennes dans la culture d’origine en utilisant le nombre moyen de colonies17.
      REMARQUE : Pour vous assurer que toutes les bactéries sont éliminées des fils, ce qui est crucial pour une mesure précise, colorez les fils avec du violet cristallin et observez-les après avoir appliqué la suspension sur les plaques. Dans les expériences préliminaires, la combinaison de la dissociation mécanique et chimique ci-dessus a permis d’éliminer tous les biofilms Xen36 des surfaces du fil d’acier inoxydable conventionnel (Figure 5).
  3. Analyse quantitative de l’amplification en chaîne par polymérase (qPCR)
    1. Retirez toutes les bactéries faiblement adhérentes de la surface des fils comme décrit à l’étape 6.1.2.
    2. Placez l’implant dans un microtube de 1,5 mL contenant 600 μL de TSB.
    3. Extraire l’ADN à l’aide du système de lyse alcaline modifiée sans pastilles16.
      REMARQUE : Le volume final d’ADN élué est de 20 μL.
    4. Diluez l’ADN 1:10 et stockez-le à -20 °C.
    5. Effectuer une qPCR pour les gènes de l’ARNr luxA et 16S 16.
      REMARQUE : Toutes les réactions qPCR sont effectuées en trois exemplaires. Le volume total du mélange réactionnel est de 10 μL, contenant 3 μL de matrice d’ADN, 5 μL de SYBR Green, 1 μL d’eau sans nucléases et 0,5 μL de chaque amorce. Les amorces du gène luxA sont 5'- GAGCATCATTTCACGGAGTTTG -3' et 5'- ATAGCGGCAGTTCCTACATTC -3'. Les amorces du gène de l’ARNr 16S sont 5'- GTGGAGGGTCATTGGAAACT - 3' et 5'- CACTGGTGTTCCTCCATATCTC - 3'. Les conditions de la PCR sont les suivantes : dénaturation initiale pendant 2 min à 94 °C suivie de 40 cycles de 15 s à 94 °C, 30 s à 60 °C et 30 s à 72 °C, et une extension finale à 72 °C pendant 5 min.
    6. La moyenne des valeurs seuils à trois cycles (Ct) est comparée à une courbe d’étalonnage générée avec de l’ADN purifié directement à partir de cultures Xen36 pures diluées en série pour estimer la charge bactérienne sur l’implant (Figure 6).

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Résultats

Cette étude a évalué la fiabilité d’une approche globale utilisant un nouveau modèle murin d’infection liée à l’implant avec des évaluations quantitatives optimisées de la formation de biofilm sur les surfaces de l’implant, qui a été utilisé dans l’étude précédente16. Les deux implants identiques ont été utilisés pour examiner le biofilm formé à leur surface, dans le but de vérifier que les deux implants pouvaient être incubés simultanément dans des conditions d’in...

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Discussion

Cette étude a démontré une approche complète pour des évaluations quantitatives précises de la formation de biofilms sur plusieurs implants en exploitant un nouveau modèle de souris et des techniques d’analyse optimisées pour les infections liées aux implants. Pour s’assurer que deux implants ont été incubés dans des conditions d’infection identiques chez le même sujet, une poche sous-cutanée mature a été créée au sein d’une seule souris par des injections d’air répétées. Ce modèle a fou...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Remerciements

Cette recherche a été partiellement financée par un programme de recherche coopérative industrie-université de la NSF appelé Center for Disruptive Musculoskeletal Innovations (IIP-1916629), Komatsuseiki Kosakusho Co., Ltd. et Rosies Base, LLC.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Acide acétiqueTHOMAS SCIENTIFIC12-16-15-00
Agilent BioTek 800 TS Lecteur d’absorbanceAgilentBT800TS
Aiguilles hypodermiques stériles Air-Tite, calibre de l’aiguille : 18 gFISHER SCIENTIFIQUE14817151 (CS)
Aiguilles vertébrales BD : 25 gFISHER SCIENTIFIQUE22043805
Agitateur d’incubateur de paillasseFISHER SCIENTIFIQUE
Bain à ultrasons Branson, 115 Vac, 60 HzFISHER SCIENTIFIQUE2489500
Branson Ultrasonics 2510R-MTH (Sonicateur)RPI-T48500-500.0
Centrifugeuse sorvall picoFISHER SCIENTIFIQUE
CFX96 Module d’optique en temps réel Système qPCRBIO-RAD
Stérilisateur compact, 30LTHOMAS SCIENTIFIC LLC22A00N096 (EA/1)
Violet cristallin, 1 %, solution SCI_EDFISHER SCIENTIFIQUE10114-58-6
Plaque de culture cellulaire Falcon 24 puitsFISHER SCIENTIFIQUE877125
Plaque de culture cellulaire Falcon 96 puitsFISHER SCIENTIFIQUE8771001
Fisherbrand Mélangeur numérique à vortexFISHER SCIENTIFICS
KanamycineTHOMAS SCIENTIFIC LLC  ;15160054
Gélose au sel de mannitol  ;
FISHER SCIENTIFIC  ;
Incubateur micirobiologiqueThermo ScientificRéférence 51028063H
PBS, solution saline tamponnée au phosphate
Staphylococcus aureus ATCC 49525 (Xen36)Perkin Elmer119243
SYBR Green I Teinture en gel d’acide nucléiqueFISHER SCIENTIFIQUE
Trypsine 10x (2,5 %)FISHER SCIENTIFIQUE15090046
Bouillon de soja tryptique  ;NETA SCIENTIFIC INC  ;
Zyppy Plasmid Miniprep KiFISHER SCIENTIFIQUE501977785Système de lyse alcaline modifiée sans granulés

Références

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Réimpressions et autorisations

Mots-clés

Mod le d infection murineinfection li e aux implantsbiomat riaux antibact riensbact ries bioluminescentescoloration au cristal violetunit s formant coloniePCR quantitative
Un modèle murin unique pour l’évaluation quantitative de la formation de biofilm sur les implants chirurgicaux dans l’abcès sous-cutané
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