L’imagerie in vivo des articulations est une technique précieuse pour découvrir le comportement migratoire des leucocytes et la dynamique moléculaire des articulations enflammées. Nous présentons ici un protocole détaillé pour l’imagerie in vivo des articulations à l’aide d’un modèle murin de l’arthrite induite par le collagène de type II (ACI).
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Article de méthode
In vivo L’imagerie révèle le comportement migratoire des leucocytes à l’intérieur des articulations
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les leucocytes sont des cellules transmises par le sang issues de la moelle osseuse qui doivent migrer dans les tissus pour médiatiser l’inflammation. Le contrôle de cette migration représente donc un point crucial pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques visant à atténuer l’inflammation. Les études traditionnelles sur les points d’arrivée ne nous ont pas permis de disséquer pleinement le comportement migratoire des leucocytes in vivo. Les avancées récentes en technologie d’imagerie ont cependant permis des connaissances sans précédent sur la migration des cellules immunitaires chez les animaux vivants, enrichissant considérablement notre compréhension de la régulation moléculaire du trafic cellulaire immunitaire.
Ici, nous présentons un protocole détaillé pour l’imagerie in vivo des articulations en utilisant un modèle murien d’arthrite induite par le collagène de type II (CIA). Les souris sont immunisées avec du collagène de type II émulsionné dans un adjuvant complet de Freund, et la progression de l’arthrite est surveillée par des scores cliniques et des mesures de l’épaisseur des pattes. Au pic de l’arthrite, les leucocytes sont visualisés in vivo par microscopie confocale chez des souris transgéniques exprimant des protéines fluorescentes ou chez des souris de type sauvage après injection intraveineuse d’anticorps marqués fluorescentement et de Dextran de poids moléculaire élevé pour la coloration des vaisseaux. Une exposition chirurgicale soigneuse de l’articulation, l’application d’agarose et un positionnement correct de la jambe permettent une imagerie stable à long terme, généralement durant plusieurs heures. Cette approche permet une analyse en temps réel de l’arrêt leucocytivale, du rampement et de la migration transendothéliale au sein des articulations enflammées.
Ce protocole sera précieux pour les groupes de recherche investiguant le trafic leucocytaire dans l’arthrite et d’autres maladies inflammatoires. Il peut également servir de plateforme pour l’évaluation préclinique des thérapies ciblant la migration des cellules immunitaires.
Introduction
Puisque les leucocytes sont des cellules transmises par le sang dérivées de la moelle osseuse, ils doivent pénétrer dans les tissus pour provoquer une inflammation1. Le contrôle de ce processus représente un point clé où de nouveaux traitements pourraient être développés pour atténuer l’inflammation2. En général, le trafic leucocytaire vers les tissus enflammés se produit dans les venules postcapillaires et suit la cascade d’adhésion, débutant par la capture des leucocytes en flux libre par la paroi du vaisseau. De plus, le processus est suivi par des leucocytes roulant le long de la paroi du vaisseau dans la direction du flux, un arrêt leucocytaire sur l’endothélium, une libération de l’adhésion, et un déplacement dans toutes les directions à la surface du vaisseau pour localiser un site réceptif de migration transendothéliale (TEM) vers un emplacement spécifique dutissu 1,3.
Ces étapes distinctes sont régulées par une combinaison de signaux moléculaires, incluant les sélectines (pour le roulement), les intégrines (pour l’arrêt, le rampement) et les chimioattractifs (CA) (pour l’arrêt, éventuellement le rampement, et le TEM)3. Les CA activent les leucocytes via sept récepteurs chimioattractifs (CAR) couplés à la protéine G couvrant la transmembrane, et jouent un rôle crucial dans la cascade d’adhérences en augmentant l’affinité de l’intégrine (conduisant à l’arrêt) et en induisant le TEM. Cependant, les mécanismes exacts des TEM ne sont pas entièrement compris. Les études traditionnelles sur les points d’arrivée et les expériences in vitro n’ont pas apporté d’éclairage sur la manière dont la signalisation CA-CAR régule dynamiquement le comportement migratoire des leucocytes in vivo.
Les avancées récentes en technologie d’imagerie ont permis de voir sans précédent la migration des cellules immunitaires chez les animaux vivants, enrichissant considérablement notre compréhension de la régulation moléculaire du trafic cellulaire immunitaire in vivo 4,5,6. Par exemple, cette technologie a permis d’élucider le contrôle moléculaire du trafic des neutrophiles vers des sites d’inflammation tissulaire, tels que la lésion hépatiquethermique 7 et la lésion cutanéeau laser 8. Par conséquent, nous avons sollicité l’étude des mécanismes moléculaires contrôlant le trafic des neutrophiles vers les sites d’inflammationarticulaire 9. L’imagerie articulaire in vivo décrite ici a révélé que le récepteur C5a du composant du complément 1 (C5aR1) est crucial pour initier l’adhésion des neutrophiles à l’endothélium articulaire, déclenchant ainsi une inflammation au sein des articulations. C5aR1 a facilité l’arrêt et la propagation des neutrophiles dépendants de l’intégrine, suivis par un MET médié par le récepteur leucotriène B4, et un rampement entraîné par le récepteur CC de la chimicine 1 (CCR1). Le récepteur de la chimiokine CXC 2 (CXCR2) a joué un rôle dans les stades avancés du TEM des neutrophiles dans les articulationsenflammées 10. De plus, l’imagerie articulaire in vivo a révélé un nouveau paradigme des réactions d’hypersensibilité de type III à l’intérieur de l’articulation, où le C5a agit comme initiateur de l’inflammation, tandis que les cellules résidentes dans les tissus jouent un rôle plus significatif dans l’inflammation dans le paradigme actuel des réactions d’hypersensibilité de typeIII 10,11.
De plus, nous avons appliqué l’imagerie in vivo de l’articulation pour étudier la dynamique moléculaire de C5a à l’intérieur de l’articulation. Le C5a chargé sur le tissu articulaire chez les souris sauvages était rapidement transporté dans la lumière vasculaire, tandis que chez les souris déficientes en C5aR2, C5a restait entièrement dans le tissusynovial 12. Ces données démontrent que C5aR2, exprimé sur l’endothélium articulaire, transporte C5a dans la lumière du vaisseau, un processus nécessaire à l’adhésion neutrophile dépendante de C5aR1 dans lesarticulations 13.
L’imagerie in vivo des articulations est applicable à tous les modèles d’arthrite inflammatoire et permet une observation à long terme (généralement quelques heures), bien que la visualisation des tissus profonds (>1 mm) puisse être limitée selon le microscope utilisé. Pris ensemble, cette technique fournit un outil puissant pour étudier le comportement migratoire des leucocytes et la dynamique moléculaire au sein des articulations enflammées. Nous partageons ce protocole pour l’imagerie articulaire in vivo afin de soutenir les groupes de recherche étudiant ce processus dans les articulations enflammées.
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Protocole
Toutes les expériences animales ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de la faculté de médecine de l’Université St. Marianna (Approbation n° TG240926-2 et TG250801-2) et se déroulent conformément aux directives institutionnelles et nationales.
1. Préparation d’un modèle murin de l’arthrite
REMARQUE : Les modèles animaux d’arthrite ont fourni des outils précieux pour comprendre la pathogenèse de la maladie et développer de nouvelles thérapies14. Bien que plusieurs modèles murins d’arthrite présentent des avantages et des limites uniques, l’arthrite induite par le collagène de type II (ACI) a été largement utilisée dans des études sur la pathogenèse de la polyarthrite rhumatoïde (PR)14. Dans cette section, nous décrivons le protocole des modèles de la CIA pour l’arthrite (les fournitures et instruments sont présentés à la Figure 1).
- Préparez une dilution de collagène bovin de type II dans 0,05 M acide acétique (concentration finale 4 mg/mL) en secouant toute la nuit à 4 °C.
- Pour créer l’émulsion, mélangez la dilution de collagène (4 mg/mL dans 0,05 acide acétique M) avec l’adjuvant complet de Freund (CFA) dans un ratio 1:1 dans une seringue en verre. Cela donne une concentration finale de collagène de 2 mg/mL dans l’émulsion. Mélangez vigoureusement à la main pendant environ 20 minutes. Ce procédé génère de la chaleur, donc refroidissez la seringue en verre contenant l’émulsion sur de la glace. Utilisez un bécher pour vérifier la consistance de l’émulsion pendant la préparation.
NOTE. Conservez toute dilution restante de collagène à -80 °C. Cela peut être utilisé pour la deuxième immunisation. - Transférez l’émulsion dans une seringue en verre de 1 mL équipée d’une aiguille de 26 x 1/2 G, et laissez-la sur la glace jusqu’à l’immunisation.
- Anesthésiez des souris DBA1/J de 8 semaines (mâles ou femelles) avec des injections intrapéritonéales de médétomidine (0,3 mg/kg), midazolam (4 mg/kg) et vetorphale (5 mg/kg).
NOTE. Les souris transgéniques ont souvent un fond C57BL6. Le collagène de poulet est généralement utilisé pour l’ACI chez les souris C57BL6 ; cependant, l’incidence et la gravité de l’ACI chez les souris C57BL6 sont plus faibles que chez les souris DBA/1J. Si vous utilisez des souris transgéniques sur un fond C57BL6, envisagez de mener une étude pilote pour évaluer l’incidence et la gravité de la CIA. - Rase les poils autour de la queue à l’aide d’une tondeuse pour préparer la vaccination.
- Injectez lentement un volume de 100 μL de l’émulsion (contenant 200 μg de collagène) dans l’espace sous-cutané le long du dos caudal (près de la base de la queue) (Figure 2).
- Répétez les étapes 1,2 à 1,6 au jour 21 pour la deuxième vaccination (Figure 2).
2. Évaluation du score clinique de l’arthrite et mesure de l’épaisseur des pattes
REMARQUE : Le score clinique de l’arthrite et la mesure de l’épaisseur des pattes sont essentiels pour évaluer l’activité de la maladie. En général, les scores cliniques de l’arthrite et les mesures de l’épaisseur des pattes sont effectués tous les 1 à 3 jours après la première immunisation.
- Score clinique de l’arthrite : Notez la somme des scores pour les quatre pattes de chaque souris. Utilisez le système de notation suivant :
0 = Normal
1 = Érythème et gonflement d’un doigt
2 = Érythème et gonflement de deux doigts ou érythème et gonflement de l’articulation de la cheville
3 = Érythème et gonflement de plus de trois doigts ou gonflement de deux doigts et articulations de la cheville
4 = Érythème et gonflement sévère de la cheville, du pied et des doigts avec déformation.
NOTE. Une articulation de la cheville enflée est définie comme une épaisseur de patte supérieure à 4 mm. - Mesure de l’épaisseur de la patte : Mesurez l’épaisseur de chaque patte à l’aide d’un étrier à coulisse numérique. Utilisez l’épaisseur moyenne des pattes sur les quatre pattes de chaque souris.
3. Imagerie in vivo des articulations
REMARQUE : L’imagerie in vivo des articulations nous permet d’observer la migration des leucocytes vers l’intérieur des articulations et d’analyser leur comportement dans le tissu chez des souris vivantes. Pour visualiser les cellules, on utilise des souris transgéniques génétiquement modifiées pour exprimer des protéines fluorescentes dans des cellules spécifiques, ainsi que des souris injectées par voie intraveineuse avec des anticorps marqueurs anticellulaires. Les fournitures utilisées sont représentées à la Figure 3.
- Anesthésier les souris arthrotogènes par voie intrapéritonéale avec de la médétomidine (0,3 mg/kg), du midazolam (4 mg/kg) et du vétorphale (5 mg/kg).
- Rase la jambe de souris avec une tondeuse et utilise une crème dépilatoire (<60 s) pour enlever les poils restants. Évitez les applications prolongées pour éviter les irritations cutanées.
- Retirez la crème avec une gaze humide (Figure 4A). Assurez-vous que tous les poils sont enlevés afin d’éviter une autofluorescence indésirable dans la zone d’imagerie. Répétez si nécessaire.
- Un lubrifiant cornéen stérile est appliqué sur les deux yeux pendant l’anesthésie pour prévenir la dessiccation ou les ulcères cornéens.
- Sous une endoscopie chirurgicale, réalisez une incision de 1 cm le long de la peau à l’aide de microciseaux (Figure 4B).
NOTE. Cette étape est cruciale. La chirurgie peut déclencher un recrutement leucocytaire (en particulier neutrophile). Évitez tout dommage pouvant causer des artefacts. En raison de l’angiogenèse dans les articulations arthritiques, ces articulations sont sujettes à des saignements. Plusieurs séances d’entraînement peuvent être nécessaires pour réussir la chirurgie. - Positionnez les articulations arthritiques sur la plaque en plastique (Figure 4C).
NOTE. Un adhésif de tissu peut être utilisé pour aider à fixer la patte de la souris en place. Cette étude utilise de l’argile pour fixer une lame en verre sur une plaque en plastique. - Couvrez la zone d’imagerie avec environ 1 mL d’agarose à 1,5 % avec une solution phosphatée tamponnée (PBS) (Figure 4D).
NOTE. Assurez-vous que l’agarose a refroidi pour éviter les lésions tissulaires, ce qui pourrait favoriser le recrutement des leucocytes dans la zone d’imagerie. - Prépare le décor au microscope.
NOTE. Utilisez un coussin chauffant pour maintenir la température corporelle de la souris lors de longues séances d’imagerie. - Ajustez les réglages du microscope confocal (puissance du laser, gain, décalage, emplacement, etc.). Ici, réalisez des images avec un microscope confocal avec un objectif à immersion dans l’eau 25, NA 1.1. Réglez l’excitation laser à 488 nm, 561 nm et 640 nm, et collectez l’émission à 488,0 nm, 561,6 nm et 638,5 nm.
- Vérifiez la fréquence de balayage du microscope. Utilisez une résolution en pixels de 512 x 512, avec 5 sections optiques, une pile Z de 4 μm, et un temps de cycle de 15 s pour permettre l’analyse des cellules mobiles individuelles sur un temps suffisant afin d’obtenir des données significatives.
- Une fois un emplacement approprié identifié, commencez l’acquisition de l’image.
NOTE. Si vous utilisez des anticorps marqueurs anticellulaires pour marquer les leucocytes, injectez les anticorps par voie intraveineuse 3 minutes avant le début de l’imagerie. Pour la visualisation des vaisseaux sanguins, injectez simultanément Qdots, l’anticorps CD31 ou Dextran. Par exemple, injecter environ 2 μg d’anticorps par souris de Ly6G pour les neutrophiles et de CD4 pour les lymphocytes T, ainsi qu’environ 80 μg de 680-250k Dextran par souris pour la coloration des vaisseaux sanguins. Les anticorps et le Dextran sont généralement dissous dans 100 μL de PBS stérile. Sachez que certains anticorps peuvent épuiser les leucocytes, alors vérifiez que les anticorps sélectionnés ne réduisent pas le nombre de leucocytes. - Traiter les images de fichiers ND2 acquises avec le microscope confocal à l’aide du module General Analysis 3 (GA3) du logiciel d’analyse d’images NIS-Elements (version 6.20.00). Effectuer l’extraction des régions vasculaires et la soustraction de fond. Après le traitement de toutes les périodes, exportez les images en vidéo.
NOTE. Dans le cadre de l’analyse, comptez le nombre de cellules collantes et extravasées. - Après l’examen d’imagerie, il faut soit laisser l’animal se rétablir comme procédure de survie, soit l’euthanasier humainement, selon le plan expérimental. Si la survie est souhaitée, fermez doucement le site chirurgical et fournissez des soins postopératoires appropriés conformément aux directives institutionnelles de soins aux animaux.
REMARQUE : Dans cette étude, tous les animaux ont été euthanasiés de manière humaine immédiatement après l’imagerie, conformément aux directives institutionnelles et nationales.
4. Analyse statistique
- Présentez les données comme moyenne ± erreur standard de la moyenne (SEM). Effectuer une analyse statistique en utilisant le test t de Student pour des comparaisons en deux groupes ou une ANOVA unidirectionnelle pour plusieurs groupes, suivie du test post hoc de Tukey. Considérons une valeur p < 0,05 comme statistiquement significative.
REMARQUE : Toutes les analyses ont été effectuées avec la version 10 de GraphPad Prism.
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Résultats
Ici, des souris DBA/1J mâles de 8 semaines sont immunisées avec une émulsion contenant du collagène bovin de type II et de CFA dans un ratio 1:1 au jour 0 et au jour 21. Le score clinique de l’arthrite et la mesure de l’épaisseur des pattes sont effectués tous les 1 à 3 jours entre le jour 0 et le 42. En général, l’apparition de l’arthrite est observée vers le jour 28, avec le score clinique de l’arthrite et l’épaisseur des pattes atteignant un pic vers le jour 35 (F...
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Discussion
L’imagerie in vivo des articulations, contrairement aux études traditionnelles sur les points d’extrémité, offre des perspectives sans précédent sur les processus biologiques dynamiques chez la souris vivante. Par exemple, cette technique nous permet de comprendre comment quatre récepteurs chimioattractifs différents - C5aR1, BLT1, CCR1 et CXCR2 - collaborent pour initier le recrutement de neutrophiles dans les articulations enflammées dans l’arthrite10,11
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Déclarations de divulgation
Y.M. a reçu des subventions/soutiens de recherche de Chugai Pharmaceutical Co., Ltd.
Remerciements
Le travail de Y.M. est soutenu par la Société japonaise pour la promotion de la science (JSPS) KAKENHI [subvention numéro JP22K08531, JP25K02574] ; Agence japonaise pour la recherche et le développement médicaux (AMED) [Numéro de subvention 25bm1423033] ; la Fondation commémorative Mochida pour la recherche médicale et pharmaceutique ; La subvention JCR pour la promotion de la recherche pour FRONTIER et la Fondation Mitsubishi.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 29 G x 1/2" | Terumo | SS-10M2913 | |
| 0,1 M acide acétique | Fujifilm | 016-18835 | |
| Seringue plastique de 1 mL | Retour au début | 19531 | |
| Seringue de 1 mm pour la graisse | Terumo | SS-01T | |
| 18 G x 1 1/2" | Terumo | NN-1838R | |
| 26 G x 1/2" | Terumo | NN-2613S | |
| 680-250 kDa dextrane | Biotium | 80135 | |
| Agarose | invitrogen | 16520-100 | |
| Collagène bovin de type II | Centre de recherche sur le collagène | K42 | |
| Argile | debika | 93186 | |
| Complètement freund' s adjuvant (CFA) | Chondrex | 7001 | |
| Microscope confocal | Nikon | A1 | |
| Verre de couverture | Matsunami Glass IND., Ltd | C024401 | |
| Étrier de culasse numérique | Mitsutoyo | 500-180-30 | |
| Tube Falcon (15 mL) | Corning | NA | |
| Tube Falcon (50 mL) | Corning | NA | |
| Anticorps anti-souris conjugué à FITC | Biolégende | 127606 | |
| Pinces | Roboz | RS-5070 | |
| Pinces | NAPOX | MA-48-2 | |
| Seringue en verre et connecteur | Tsubasa Industry Co., Ltd ; | S7P | |
| Graisse | Toray Dow Corning Silicone | NA | |
| Tondeuse à cheveux | Wahl | WA5109 | |
| Tondeuse à cheveux | Wahl | 9966 | |
| Épilation crè ; Moi | Kracie | N/A | |
| Médétomidine | Meiji | N/A | |
| Micro-ciseaux | Roboz | RS-5610 | |
| Micro-ciseaux | Roboz | RS-5630 | |
| Midazolam | Sandoz | N/A | |
| Gaze humide | Nippon Paper Crecia Co., Ltd | S-200 | |
| Analyse d’image NIS-Elements 6.20.00 | Nikon | NA | |
| PBS dans un tube Falcon (50 mL) | Shimadzu Diagnostics Corporation | 5913 | |
| Anticorps anti-souris conjugué PE CD4 | Biolégende | 100408 | |
| Plaque en plastique | Corning | 351029 | |
| Prism 10.3.1 | GraphPad | NA | |
| Verre à coulisse | Muto Pure Chemicals Co., Ltd | 5115 | |
| Portée chirurgicale | Olympe | VMZ | |
| Liaison tissulaire | 3M | 1469SB | |
| Vetorphale ; | Meiji | N/A |
Références
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- Miyabe, Y., Lian, J., Miyabe, C., Luster, A. D. Chemokines in rheumatic diseases: pathogenic role and therapeutic implications. Nat Rev Rheumatol. 15 (12), 731-746 (2019).
- Griffith, J. W., Sokol, C. L., Luster, A. D. Chemokines and chemokine receptors: positioning cells for host defense and immunity. Annu Rev Immunol. 32, 659-702 (2014).
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Réimpressions et autorisations
