Un test de préférence olfactive pour mesurer les biais hédoniques olfactifs dans des modèles murins de dépression

Résumé

Ici, nous présentons un protocole de test de préférence olfactive qui permet d’évaluer les biais olfactifs négatifs envers les stimuli olfactifs appétitifs et aversifs dans des modèles murins de dépression.

Résumé

La dépression est le principal facteur d’invalidité dans le monde, affectant 280 millions de personnes chaque année. Au-delà de la réduction de l’activité et de la motivation, il a été démontré que la dépression est associée à un biais de valence négatif : les patients trouvent les stimuli sensoriels neutres et positifs moins agréables et les négatifs plus désagréables par rapport aux individus en bonne santé. En particulier, le biais hédonique olfactif peut représenter un marqueur d’état de la maladie chez les patients et peut être facilement mesuré dans des modèles murins. Cependant, il existe très peu de tests chez l’animal pour mesurer les biais émotionnels de manière translationnelle. Nous proposons ici un protocole pour une évaluation fiable de l’attribution de la valence olfactive des souris témoins et dépressives par l’exploration des odorants associés à diverses valeurs hédoniques. À l’aide de ce test de préférence olfactive et de plusieurs lectures comportementales, nous confirmons un biais olfactif négatif envers les stimuli appétitifs et aversifs dans deux modèles murins distincts de dépression. Il est important de noter que cette méthode s’applique aux hommes et aux femmes. Enfin, ce protocole permet de multiples adaptations pour améliorer l’évaluation de la réponse émotionnelle et peut être facilement combiné avec des outils classiques de suivi en direct de l’activité neuronale.

Introduction

La dépression est un trouble de l’humeur grave et l’une des principales causes d’invalidité dans le monde. Selon l’Organisation mondiale de la santé, environ 280 millions de personnes, soit 4 % de la population, souffrent de dépression. Il est 50 % plus fréquent chez les femmes que chez les hommes, et l’épidémie de COVID-19 a augmenté de 25 % la prévalence des troubles dépressifs au cours de la première année de la pandémie (Organisation mondiale de la santé, 2022). De plus, environ un tiers des patients ne répondent pas aux traitements antidépresseurs classiques, il faut des semaines pour observer les effets antidépresseurs, et la physiopathologie des troubles de l’humeur reste largement méconnue.

Selon le DSM-5¹, un diagnostic de dépression repose sur plusieurs symptômes, notamment une humeur dépressive, une perte d’intérêt ou de plaisir, une variation de poids importante, un ralentissement physique et psychologique, de la fatigue, un sentiment d’inutilité, des difficultés à se concentrer et des pensées récurrentes de mort. Des études cliniques ont également démontré que les troubles de l’humeur s’accompagnent d’altérations sensorielles : les patients déprimés trouvent les stimuli sensoriels moins agréables que les sujets témoins ^2,3,4.

La « valence » hédonique fait référence au degré auquel quelque chose est agréable (valence positive) ou aversif (valence négative). L’attribution de la valence à un stimulus peut déclencher un comportement adapté, y compris l’approche ou l’évitement⁵. Il est intéressant de noter que ce processus est très conservé entre les espèces, des insectes aux humains⁶. La dépression est donc associée à un biais négatif de valence. Cependant, le diagnostic clinique repose encore peu sur l’évaluation des biais sensoriels.

Parmi les modalités sensorielles, l’olfaction est particulièrement intéressante car les entrées olfactives contournent largement les relais thalamiques et se projettent vers le système limbique chez les mammifères, y compris les humains. D’un point de vue évolutif, il a été démontré que ce système est essentiel pour coder un ensemble de réponses primaires aux stimuli environnementaux 7,8,9,10,11,12. En plus de ces circuits neuronaux partagés, des études cliniques révèlent une relation bilatérale entre l’olfaction et la dépression, les patients déprimés présentant des altérations olfactives ainsi que des troubles olfactifs provoquant des symptômes dépressifs¹³. De plus, la fonction olfactive est récupérée chez les patients déprimés après un médicament ou une thérapie 14,15,16,17. Ces résultats suggèrent que les déficits olfactifs pourraient être un biomarqueur de l’état (état des manifestations cliniques chez les patients) plutôt qu’un trait (propriétés qui jouent un rôle antécédent, éventuellement causal, dans la physiopathologie du trouble psychiatrique et peuvent donc être utilisées pour un diagnostic précoce et pré-symptomatique) de la maladie¹⁸. En conséquence, une meilleure compréhension de la façon dont la modalité olfactive est altérée dans la dépression pourrait ouvrir la voie à de nouveaux outils thérapeutiques pour le diagnostic et la détection de la réactivité au traitement.

Par conséquent, l’évaluation du biais hédonique olfactif dans des modèles de dépression serait particulièrement intéressante, à la fois pour évaluer le phénotype dépressif induit et comme outil pour étudier les mécanismes neuronaux à l’origine de ces changements dans l’attribution de la valence. Des études antérieures ont déjà utilisé des approches comportementales pour évaluer l’attribution de la valence des odeurs chez la souris. Cependant, ces tests présentent plusieurs mises en garde : ils nécessitent des dispositifs sophistiqués¹⁹ qui impliquent principalement des boîtes fermées par un couvercle 19,20,21, impliquent un contact physique constant avec une solution olfactive 20,21,22 et/ou entraînent des temps d’exploration des odeurs très courts 21,22,23. Cela rend ces tests incompatibles avec les outils classiques de surveillance en direct de l’activité neuronale qui nécessitent des durées d’échantillonnage plus longues chez les souris attachées.

De plus, Malkesman et al. ont déjà développé le test de reniflement d’urine femelle (FUST) pour surveiller l’activité de recherche de récompense chez les rongeurs en mesurant l’investigation olfactive de souris mâles exposées à l’urine de souris femelles²⁴. Cependant, ce test n’évalue que la réponse comportementale à un stimulus positif particulier de nature sociale, et avec des temps d’interaction courts. De plus, ce test a été conçu exclusivement pour les rongeurs mâles, bien que la dépression soit deux fois plus fréquente chez les femmes que chez les hommes.

Pour pallier toutes ces limitations, nous avons développé ici un test de préférence olfactive (OPT) adapté de Bigot et ^al.14, où les souris mâles et femelles peuvent être exposées à une grande variété d’odeurs neutres, positives et négatives afin d’évaluer précisément la réponse hédonique dans le contexte de la dépression. Le choix des odeurs peut être basé sur des publications antérieures ^14,25, mais ce test permet également d’explorer de nouveaux stimuli sociaux, nutritionnels et liés aux infections, en utilisant à la fois des composants naturels et des mélanges chimiques monomoléculaires ou spécifiquement conçus.

Protocole

Tous les soins aux animaux et les procédures expérimentales ont suivi les directives nationales et européennes (2010/63/UE) et ont été approuvés par le Ministère français de la Recherche (APAFiS : #16380-2018080217358599_v1 ; APAFIS #51636-2024101718013761_v4). Les souris mâles et femelles C57BL/6JRj (modèle UCMS) et les souris mâles C57BL/6NTac (modèle CORT) (âgées de 8 semaines) ont été logées socialement (4 à 5 souris par cage) et maintenues dans des conditions standard (23 ± 1 °C ; humidité 40 %) selon un cycle lumière/obscurité de 14/10 h (lumières allumées à 7 h) avec de la nourriture et de l’eau à volonté.

1. Le dispositif expérimental

1. Installation de l’arène
   1. Préparez le dispositif expérimental, qui se compose d’une arène à deux compartiments (45 cm × 50 cm × 25 cm) composée de murs en plexiglas gris et d’un sol blanc. Séparez les deux compartiments (25 cm × 45 cm) par une paroi en plexiglas gris (37 cm × 25 cm).
   2. Placez une boîte de Pétri perforée (60 mm × 15 mm avec 7 trous de 5 mm de diamètre) au bas de la paroi de chaque compartiment.
   3. Fixez verticalement les boîtes de Pétri au mur à l’aide d’un adhésif double face ou d’un adhésif sensible à la pression (par exemple, Blu-tack).
   4. Placez une caméra sur le toit de l’arène pour enregistrer le comportement des animaux (à 2 m au-dessus de l’arène) et suivre automatiquement leurs mouvements tout au long de l’expérience.
2. Choix des odeurs
   1. Avant l’expérience, choisissez une liste d’odeurs de valence neutre, positive et négative qui seront testées (voir le tableau 1 pour des exemples).
   2. Vérifiez que toutes les odeurs choisies ont une pression de vapeur similaire. De plus, évaluez la diffusion de certaines odeurs dans l’arène à l’aide d’un détecteur à photoionisation (PID)²⁶.
   3. Testez chaque odeur un jour distinct.
      REMARQUE : Il est recommandé de planifier l’utilisation des odeurs neutres d’abord, puis des odeurs appétitives, et de terminer par les odeurs aversives pour minimiser les effets d’exploration d’un jour à l’autre. Cet ordre minimise les effets de transfert d’un jour de test à l’autre. Alternativement, une présentation aléatoire pourrait être utilisée, mais tous les groupes expérimentaux doivent être testés avec la même séquence d’odeurs.
3. Conception de groupes expérimentaux
   1. Divisez les souris en au moins deux groupes expérimentaux : les souris témoins et les souris qui subiront le modèle de dépression. Hébergez les animaux d’un même groupe dans les mêmes cages.
      ATTENTION : Chaque groupe expérimental doit contenir au moins environ 7 à 8 individus pour obtenir une signification statistique. Les cages doivent être localisées à proximité dans la maison des animaux pour minimiser l’effet de cage.
   2. Induire un phénotype de type dépressif dans des groupes de souris pertinents en utilisant le modèle de dépression de choix.
      REMARQUE : Décrire des protocoles pour induire des comportements de type dépression chez les souris dépasse le cadre de cet article. Cependant, cette étude présente des expériences utilisant deux modèles différents (l’Unpredictable Chronic Mild Stress [UCMS] et la corticostérone [CORT])^27,28 comme résultats représentatifs de ce test de préférence olfactive. En bref, le modèle UCMS repose sur l’exposition à une variété de facteurs de stress environnementaux différents pendant plusieurs semaines, tandis que le modèle CORT consiste à administrer de manière chronique de la corticostérone dissoute dans l’eau de boisson de souris (environ 5 mg/kg/jour selon la quantité de boisson que les souris boivent).

2. Phase d’accoutumance

1. Habituation générale et manipulation
   1. À votre arrivée, laissez les souris tranquilles pendant 1 semaine sans aucun changement de litière. Ajoutez un matériau en coton supplémentaire et un igloo dans la cage pour réduire le stress.
   2. Après 1 semaine, manipulez doucement toutes les souris tous les jours pendant 3-4 jours et habituez-les à la manipulation des tasses, de préférence dans la salle d’expérience.
2. Conditions expérimentales de l’essai
   1. Transférez la souris dans la salle de test comportemental 30 minutes avant le début de l’expérience.
      REMARQUE : Idéalement, la salle comportementale devrait comprendre deux parties distinctes permettant aux animaux d’être dans une partie pendant que la souris testée effectue dans l’autre.
   2. Veillez à ce que les conditions normales du logement soient maintenues (23 ± 1 °C ; humidité 40 %), et qu’il n’y ait pas de bruit, d’éclairage ou d’odeur gênants dans la pièce.
   3. À l’aide d’un luxmètre, réglez l’éclairage à environ 40 lux dans l’aréna. Assurez-vous que l’éclairage est homogène dans l’arène.
3. Accoutumance à l’arène
   1. Ajoutez un papier filtre propre (42,5 mm) dans les deux boîtes de Pétri (60 mm × 15 mm).
   2. Utilisez du ruban adhésif transparent pour fixer le couvercle de la boîte de Pétri à son fond (car il sera placé verticalement).
   3. Le premier jour, placez doucement toutes les souris de la même cage dans l’arène pendant 10 minutes pour réduire la néophobie.
      ATTENTION : Placez toujours les souris dans l’arène en les manipulant à la tasse pour éviter le stress dû au ramassage par la queue.
   4. Le lendemain, introduisez chaque souris individuellement dans l’arène, juste entre les deux compartiments, et enregistrez le comportement pendant 10 min.
   5. Répétez l’opération pendant 2 à 3 jours d’affilée.
4. Critère d’exploration
   1. Définissez les deux zones (25 cm, 15 cm) dans lesquelles les boîtes de Pétri ont été placées et mesurez le temps que chaque animal passe dans chaque zone.
   2. Faites la moyenne de ces mesures à travers toutes les étapes individuelles d’habituation.
   3. Si le temps moyen passé dans chacune des zones est supérieur à 50 s, le critère est rempli. Si ce n’est pas le cas, répéter les séances d’habituation jusqu’à ce que le critère soit atteint, ou exclure l’animal de l’analyse.
      REMARQUE : Un maximum de deux séances d’habituation peut être effectué par jour (matin et après-midi).

3. Phase de test

1. Préparation de l’odeur
   1. Le jour du test, préparez l’odeur avec la bonne dilution sous une hotte chimique. Diluez l’odeur dans de l’huile minérale ou de l’eau distillée, selon la structure chimique. Pour éviter toute contamination, stockez l’huile minérale dans une pièce séparée et ventilée, à l’abri des odeurs.
      REMARQUE : L’utilisation d’une nouvelle bouteille d’huile minérale est recommandée au début d’une nouvelle expérience.
   2. Conservez la solution odorante dans un flacon en verre. Évitez les contenants en plastique qui pourraient ajouter une contamination par les odeurs.
   3. Juste avant que chaque souris ne soit testée, prélevez 200 μL de la solution odorante à l’aide d’une micropipette à l’aide d’embouts filtrants et placez-le sur le papier filtre dans l’une des deux boîtes de Pétri.
   4. Laissez l’autre papier filtre de la deuxième boîte de Pétri intact.
   5. Transférez les boîtes de Pétri dans la salle d’essai et fixez-les verticalement sur le mur de l’arène.
      ATTENTION : Ne préparez pas et ne jetez pas les solutions odorantes dans la salle d’expérimentation pour éviter la contamination par les odeurs. Changez régulièrement de gants pendant l’expérience. Si l’on soupçonne que les gants pourraient être contaminés lors de la manipulation des odeurs, changez-les avant de saisir les souris pour les tester.
2. Test comportemental
   1. Placez chaque souris individuellement dans l’arène, juste entre les deux compartiments.
   2. Enregistrez pendant 10 min.
   3. Retirez la souris de l’arène.
   4. Retirez l’odeur de la boîte de Pétri.
   5. Nettoyez l’aréna avec une solution désinfectante (p. ex., éthanol 70 %) et séchez-le.
   6. Jetez le papier filtre et répétez la préparation des odeurs pour la souris suivante.
   7. Idéalement, ne testez qu’une seule odeur par jour. Utilisez de préférence les odeurs neutres d’abord, puis les odeurs positives et enfin les odeurs négatives (voir Figure 1).
      ATTENTION : Effectuez les étapes d’habituation et de test à peu près au même moment de la journée pendant les jours de l’expérience (idéalement entre 9 h et 15 h). Si le nombre d’animaux nécessite une période plus longue, soyez attentif à tester différents groupes expérimentaux de manière alternée pour éviter tout biais diurne. S’il est nécessaire de tester des mâles et des femelles dans la même expérience, préférez tester un sexe après l’autre.
      REMARQUE : Utilisez des boîtes de Pétri propres tous les jours du test pour éviter la contamination par les odeurs. Il convient de noter que les boîtes de Pétri perforées peuvent être réutilisées pour plusieurs expériences après un nettoyage approprié et une décontamination des odeurs.

4. Analyse des données

1. Suivi du comportement
   1. Utilisez un programme de suivi automatique pour enregistrer la position de la souris tout au long des tests.
   2. Définir des zones distinctes dans l’arène pour l’analyse (voir Figure 1) :
      1. Définissez une « zone d’odeur » (25 cm × 15 cm), la zone où la boîte de Pétri est placée avec le papier filtre imbibé de l’odeur (c’est-à-dire la zone la plus proche de l’odeur représentant environ un tiers du compartiment de surface).
      2. Définissez une « zone de contrôle » (25 cm × 15 cm), symétrique à la « zone d’odeur », mais sans aucune odeur ajoutée dans la boîte de Pétri.
      3. Définissez une « zone d’odeur derrière » (25 cm × 30 cm), c’est-à-dire que le reste du compartiment est l’endroit où la boîte de Pétri d’odeur est placée.
      4. Définir une « zone de contrôle arrière » (25 cm × 30 cm), symétrique à la « zone de contrôle arrière », constituée du reste du compartiment non olfactif.
         REMARQUE : Le suivi du point central du corps de la souris est suffisant pour analyser la préférence olfactive de l’animal. Cependant, le suivi spécifique du nez de chaque souris permet d’illustrer plus précisément l’investigation olfactive de l’animal.
2. Lectures de la réponse hédoniste
   1. À l’aide du suivi automatique, collectez les informations suivantes pour chaque souris et chaque jour du test, y compris les étapes d’habituation :
      1. Enregistrez la distance totale parcourue dans l’arène (m).
      2. Notez le temps passé dans chaque zone de l’arène (s).
      3. Enregistrez le nombre d’entrées dans chaque zone de l’aréna.
   2. Utilisez la distance totale parcourue pour évaluer les principaux effets locomoteurs.
   3. Pour évaluer les différences de préférence olfactive envers diverses odeurs, utilisez les principales lectures :
      1. Utilisez le temps passé dans la zone d’odeur.
      2. Utilisez le nombre d’entrées dans la zone d’odeur.
      3. Utilisez un indice de préférence, calculé comme le temps passé dans la zone d’odeur normalisé par rapport au temps passé dans cette zone pendant l’accoutumance (la normalisation est effectuée sur les souris de tous les groupes). La moyenne fait référence à la moyenne arithmétique du temps passé dans la zone d’odeur, et sd fait référence à son écart-type.
         
      4. Utilisez un indice d’exploration des odeurs, calculé comme la moyenne des valeurs normalisées de la distance parcourue, du temps passé dans la zone d’odeur et du nombre d’entrées dans la zone d’odeur, comme suit :
         
         
         REMARQUE : Cet indice de préférence peut être adapté si nécessaire, par exemple, en comparant le temps passé dans la zone d’odeur par rapport à la zone de contrôle. Si les groupes montrent des différences significatives dans leur exploration de la « zone olfactive » pendant l’habituation, la normalisation peut être effectuée par rapport au groupe témoin seulement, plutôt qu’à tous les groupes combinés.
   4. Représentez visuellement ces lectures pour les souris témoins et dépressives sous forme de moyenne ± d’erreur type de la moyenne (SEM).
   5. Utilisez l’analyse de variance bidirectionnelle (ANOVA) à mesures répétées suivie de tests post-hoc (ici le test de différence la moins significative de Fisher non corrigée) pour tenir compte à la fois des groupes expérimentaux, des odeurs (facteur de mesure répétée) et des facteurs d’effet d’interaction. Le facteur d’interaction indique si les différences entre les groupes sont constantes pour toutes les odeurs présentées.
   6. Vérifier la normalité et l’homoscédasticité à l’aide de tests adaptés (test de Shapiro-Wilk, test de Bartlett). La signification statistique a été fixée à *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001.

Résultats

Pour vérifier que les souris de type dépressif présentent un biais olfactif négatif^14,29 et qu’il peut être mesuré de manière fiable à l’aide du protocole du test de préférence olfactive que nous décrivons ici, nous avons évalué la réponse hédonique à différentes odeurs dans deux modèles murins distincts de dépression.

Tout d’abord, nous avons utilisé un modèle murin de stress chronique léger imprévisible (UCMS) d’une durée de 4 semaines adapté de²⁸ (voir le fichier supplémentaire 1 pour le protocole détaillé) pour induire un phénotype dépressif chez de jeunes souris femelles C57BL/6JRj (Figure 2A,B). Ces souris femelles ont été testées dans le test de préférence olfactive avec de l’urine de souris mâle (MU, pure) comme une odeur appétitive, et du 2,4,5-triméthylthiazole (TMT, 5 % dans l’huile minérale) comme une odeur aversive. En moyenne, chaque souris a passé au moins 50 secondes dans la zone « contrôle » et dans la zone « odorante » pendant l’habituation, remplissant ainsi le critère (Figure 2C). Cependant, par accoutumance, les souris UCMS ont passé beaucoup plus de temps dans la « zone de contrôle » par rapport aux témoins, mais comme il n’y a pas de différence significative concernant la zone où l’odeur sera ajoutée, cette différence peut être écartée. En ce qui concerne la distance, les souris témoins se déplaçaient significativement plus que les UCMS lorsqu’elles étaient exposées à l’UM, mais pas pendant l’accoutumance ou en présence de TMT (Figure 2D). Enfin, toutes les lectures de la réponse hédonique (temps passé dans la zone d’odeur, nombre d’entrées dans la zone d’odeur et indice de préférence) montrent des différences significatives ou une tendance statistique entre les femelles témoins et UCMS (figure 2E-G). Cet effet est également visible à travers l’indice global d’exploration des odeurs, qui est une mesure combinée de la réponse hédonique et locomotrice (Figure 2H). De manière constante, chaque lecture démontre donc un biais hédonique négatif en réponse à des stimuli olfactifs appétitifs et aversifs. Il est intéressant de noter que le score d’émotion, qui est calculé comme une valeur normalisée du phénotype anxiogène et dépressif sur la base d’une grande batterie de tests comportementaux¹⁴, est positivement corrélé avec l’indice d’exploration olfactive de l’UM et du TMT (Figure 2I), montrant une relation entre la réponse comportementale aux odeurs positives et négatives et le phénotype anxiogène et dépressif.

Deuxièmement, nous avons utilisé le même protocole UCMS pour induire un phénotype dépressif chez les souris mâles cette fois-ci. Au cours du test de préférence olfactive, ces souris ont été exposées à de l’urine de souris femelle (FU, pure), qui est appétitive, et au TMT comme précédemment, sous forme d’odeur négative (Figure 3A,B). Il n’y a pas de différence dans le temps passé dans les quatre zones lors de l’habituation, ni dans la distance parcourue au cours de l’essai (Figure 3C,D). Le temps passé dans la zone olfactive montre une réduction significative de l’exploration FU et TMT dans l’UCMS par rapport aux Témoins (Figure 3E). De plus, les souris UCMS pénètrent significativement moins dans la zone olfactive, ou ont tendance à le faire, et présentent un indice de préférence significativement réduit pour le FU et le TMT (Figure 3F,G), confirmant un biais olfactif négatif dans un état de type dépressif. De même, l’indice d’exploration des odeurs montre une réponse comportementale négativement décalée aux souris FU et TMT des souris UCMS par rapport aux témoins (Figure 3H), qui ont tendance à être positivement corrélés avec le score d’émotivité des animaux (Figure 3I).

Dans une troisième expérience, nous avons eu recours à un autre modèle de dépression qui repose sur l’administration chronique de corticostérone (CORT) dans l’eau de boisson de souris mâles C57BL/6NTac alors que les souris témoins ne reçoivent que la solution de véhicule (Veh) (10 % de 2-hydroxypropyl-bêta-cyclodextrine) ²⁷. Après quatre semaines de traitement CORT ou Veh, les souris ont été habituées pendant quatre jours, puis exposées à une odeur neutre (OCT : 2-trans octenal, 1 % dans l’eau), une odeur positive (PO : huile d’arachide) et une odeur négative (TMT : 2,4,5-triméthylthiazole, 5 % dans l’huile minérale) (Figure 4A,B). Grâce à l’accoutumance, il n’y avait pas de différences entre Veh et CORT (Figure 4C). Cependant, les deux groupes ont passé beaucoup plus de temps dans la « zone d’odeurs » que dans la « zone de contrôle ». Il n’y a pas de différence pour la distance parcourue, à l’exception de l’odeur positive (PO) pour laquelle les souris Veh se déplaçaient plus que CORT (Figure 4D). Il est important de noter, comme pour les souris UCMS, que le temps passé dans la zone d’odeur était significativement réduit pour les souris CORT lorsqu’elles étaient exposées à une odeur neutre et appétitive (Figure 4E). Une exploration réduite des odeurs est également visible par une réduction significative ou une tendance à un nombre inférieur d’entrées dans la zone d’odeur (Figure 4F). Dans ce cas, des différences entre les groupes sont mises en évidence en fonction de la lecture analysée, probablement en raison des limitations liées au nombre d’animaux utilisés ainsi que d’un potentiel effet de plancher causé par le faible temps d’exploration observé après l’exposition aux TMT. Dans l’ensemble, l’indice de préférence est significativement plus faible chez les souris CORT pour tous les stimuli olfactifs par rapport à Veh (Figure 4H). Enfin, l’indice d’exploration olfactive de toutes les odeurs est significativement corrélé avec le score d’émotivité des animaux (Figure 4I), démontrant une fois de plus que ce test de préférence olfactive est un outil approprié pour évaluer les biais émotionnels négatifs dans plusieurs modèles murins de dépression.

Enfin, nous pouvons exclure la possibilité que les différences observées puissent être causées par une réduction de l’activité locomotrice, plutôt que par des biais émotionnels. En effet, la locomotion ne diffère pas entre les groupes lors de l’évaluation de la distance totale parcourue (Figure 2D, Figure 3D, Figure 4D). De plus, sur la base de l’analyse statistique, une réduction générale de l’engagement dans une tâche ou un effet de nouveauté ne peuvent pas non plus expliquer ces biais. En fait, nous avons trouvé un effet significatif du facteur odeur dans l’analyse de l’indice de préférence, sans interaction significative entre les groupes expérimentaux et les odeurs. Ces résultats démontrent que les souris de type dépressif effectuent effectivement la tâche, et que leur exploration réduite est spécifique à chaque signal olfactif.

Figure 1 : Schéma général de la chronologie et de la configuration du test de préférence olfactive. Les souris sont d’abord habituées à l’arène. Le premier jour de l’accoutumance, les souris de la même cage d’habitation sont placées ensemble pour réduire la néophobie. Le lendemain, ils sont placés individuellement dans l’arène. Après l’accoutumance, une odeur est ajoutée à l’une des chambres. Les odeurs neutres sont d’abord testées préférentiellement, suivies des odeurs positives et enfin des odeurs négatives. À des fins d’analyse, l’arène peut être divisée en quatre zones différentes. Créé avec Biorender. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Biais olfactif négatif dans un modèle de dépression chez une souris femelle UCMS. (A,B) Chronologie et groupes expérimentaux de l’étude : Des souris femelles témoins et UCMS (Unpredictable Chronic Mild Stress) sont testées dans le test de préférence olfactive avec une odeur positive (MU : urine de souris mâle, pure) et négative (TMT : 2,4,5-triméthylthiazole, 5 % dans de l’huile minérale). Créé avec Biorender. (C) Les souris UCMS ont passé en moyenne beaucoup plus de temps dans la « zone de contrôle » et moins de temps dans la « zone d’odeur arrière » par rapport aux témoins pendant l’accoutumance (Groupe : F(1, 12) = 74,03, p < 0,0001 ; Zone : F(2,434, 29,21) = 7,688, p = 0,0012 ; Interaction : F(3, 36) = 5,148, p = 0,0046). (D) La distance totale parcourue a été considérablement réduite dans l’UCMS lorsqu’il est exposé à l’UM, mais pas pour l’habituation (Hab) et le TMT (Groupe : F(1, 12) = 4,664, p = 0,0518 ; Odeur : F(1,871, 22,45) = 4,846, p = 0,0195 ; Interaction : F(2, 24) = 4,797, p = 0,0177). (E) Les souris UCMS ont passé beaucoup moins de temps à explorer l’UM et le TMT (Groupe : F(1, 12) = 24,39, p = 0,0003 ; Odeur : F(1, 12) = 59,69, p < 0,0001 ; Interaction : F(1, 12) = 2,267, p = 0,1580). (F) Les souris UCMS entraient moins que la zone d’odeur ou s’occupaient de (Groupe : F(1, 12) = 9,279, p = 0,0102 ; Odeur : F(1, 12) = 5,100, p = 0,0433 ; Interaction : F(1, 12) = 1,649, p = 0,2233). (G) L’indice de préférence pour l’UM et le TMT est significativement réduit chez les souris UCMS (Groupe : F(1, 12) = 24,39, p = 0,0003 ; Odeur : F(1, 12) = 59,69, p < 0,0001 ; Interaction : F(1, 12) = 2,267, p = 0,1580). (H) L’indice d’exploration des odeurs pour MU et TMT est significativement réduit chez les souris UCMS (F(1, 12) = 14,71, p = 0,0024 ; Odeur : F(1, 12) = 0, p > 0,9999 ; Interaction : F(1, 12) = 0,02630, p = 0,8739). (I) L’indice d’exploration olfactive pour MU et TMT est tous deux positivement corrélé avec le score d’émotivité des animaux (MU : Pearson R² = 0,4837, F(1,12) = 11,24, **p = 0,0058 ; TMT : Pearson R² = 0,5340, F(1,12) = 13,75, **p = 0,0030). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Biais olfactif négatif dans un modèle de dépression chez une souris mâle UCMS. (A,B) Chronologie et groupes expérimentaux de l’étude : Des souris mâles témoins et UCMS sont testées dans le test de préférence olfactive avec une odeur positive (FU : urine de souris femelle, pure) et négative (TMT : 2,4,5-triméthylthiazole, 5 % dans de l’huile minérale). Créé avec Biorender. (C) Il n’y a pas de différence en moyenne dans le temps passé dans les différentes zones de l’arène par accoutumance (Groupe : F(1, 13) = 3,921, p = 0,0693 ; Zoner = F(1,688, 21,94) = 34,57, p < 0,0001 ; Interaction : F(3, 39) = 0,7385, p = 0,5355). (D) Il n’y a pas de différence dans la distance totale parcourue entre les commandes et l’UCMS (Groupe : F(1, 13) = 2,313, p = 0,1522 ; Odeur : F(1,722, 22,38) = 1,746, p = 0,1998 ; Interaction : F(2, 26) = 0,8806, p = 0,4266). (E) Le temps passé à explorer la zone odorante avec FU et TMT est significativement réduit chez les souris UCMS (Groupe : F(1, 13) = 6,808, p = 0,0216 ; Odeur : F(1, 13) = 16,21, p = 0,0014 ; Interaction : F(1, 13) = 0,3304, p = 0,5753). (F) Les souris UCMS entraient significativement moins de fois dans la zone d’odeur pour le TMT et avaient tendance à le faire pour le FU (Groupe : F(1, 13) = 6,572, p = 0,0236 ; Odeur : F(1, 13) = 3,784, p = 0,0737 ; Interaction : F(1, 13) = 0,2145, p = 0,6509). (G) L’indice de préférence des souris UCMS est significativement réduit pour FU et TMT (Groupe : F(1,13 ) = 6,808, p = 0,0216 ; Odeur : F(1, 13) = 16,21, p = 0,0014 ; Interaction : F(1, 13) = 0,3304, p = 0,5753) ; (H) L’indice d’exploration des odeurs de l’UCMS est significativement réduit pour les deux odeurs (Groupe : F(1, 13) = 12,42, p = 0,0037 ; Odeur : F(1, 13) = 0,002580, p = 0,9603 ; Interaction : F(1, 13) = 0,5804, p = 0,4598). (I) L’indice d’exploration des odeurs pour le FU et le TMT tend à être positivement corrélé avec le score d’émotivité des animaux (FU : Pearson R² = 0,2573, F(1, 13) = 4,504, p = 0,0536 ; TMT : Pearson R² = 0,2266, F(1, 13) = 3,809, p = 0,0729). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Biais olfactif négatif dans un modèle murin mâle CORT de dépression. (A,B) Chronologie et groupes expérimentaux de l’étude : Les souris mâles Veh et CORT sont testées dans le test de préférence olfactive avec une odeur neutre (OCT : trans-2-octenal, 1 % dans l’eau), positive (PO : huile d’arachide, pure) et négative (TMT : 2,4,5-triméthylthiazole, 5 % dans de l’huile minérale). Les souris Veh et CORT sont administrées avec la solution Vehicle et Vehicle + Corticosteroone, respectivement, pendant toute la durée de l’expérience. Créé avec Biorender. (C) Temps moyen passé dans les différentes zones de l’arène lors de l’accoutumance (Groupe : F(1, 10) = 0,07588, p = 0,7886 ; Zone : F(2,224, 22,24) = 6,939, p = 0,0036 ; Interaction : F(3, 30) = 0,7033, p = 0,5575). (D) Distance totale parcourue pendant l’essai d’accoutumance (Hab) et les différentes odeurs (Groupe : F(1, 10) = 4,193, p = 0,0678 ; Odeur : F(3, 30) = 11,80, p < 0,0001 ; Interaction : F(3, 30) = 1,489, p = 0,2375). (E) Les souris CORT passent moins de temps dans la zone olfactive que Veh pour l’OCT et le PO (Groupe : F(1, 10) = 5,094, p = 0,0476 ; Odeur : F(2, 20) = 28,87, p < 0,0001 ; Interaction : F(2, 20) = 3,841, p = 0,0388). (F) Les souris CORT entrent moins souvent dans la zone d’odeur ou sont soignées par rapport à Veh (Groupe : F(1, 10) = 6,832, p = 0,0259 ; Odeur : F(2, 20) = 2,738, p = 0,0889 ; Interaction : F(2, 20) = 0,2902, p = 0,7512). (G) Les souris CORT affichent un indice de préférence plus faible pour l’OCT et le PO (Groupe : F(1, 10) = 5,895, p = 0,0356 ; Odeur : F(2, 20) = 20,83, p < 0,0001 ; Interaction : F(2, 20) = 1,437, p = 0,2611). (H) L’indice d’exploration des odeurs est significativement réduit chez les souris UCMS pour toutes les odeurs (Groupe : F(1, 10) = 12,35, p = 0,0056 ; Odeur : F(2, 20) = 0,04381, p = 0,9572 ; Interaction : F(2, 20) = 0,3622, p = 0,7006). (I) L’indice d’exploration des odeurs pour chaque odeur est positivement corrélé avec le score d’émotivité des animaux (OCT : Pearson R² = 0,5601, F(1, 10) = 12,73, **p = 0,0051 ; PO : Pearson R² = 0,4495, F(1, 10) = 8,165, *p = 0,0170 ; TMT : Pearson R² = 0,5061, F(1, 10) = 10,25, **p = 0,0095). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Nom	Abréviation	Dilution	Valence
2,4,5-triméthylthiazole	TMT	5 % dans l’huile minérale	Négatif
2-trans-octénal	OPO	1 % dans l’eau	Neutre
Urine de souris femelle	FU	Pur	Positif
Urine de souris mâle	MU	Pur	Positif
Huile d’arachide	PO	Pur	Positif

Tableau 1 : Exemples d’odeurs avec une valence neutre, positive et négative.

Fichier supplémentaire 1 : Protocole pour le stress chronique léger imprévisible de 4 semaines. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Les biais émotionnels négatifs sont une caractéristique majeure des troubles dépressifs et présentent un intérêt particulier pour mieux comprendre la physiopathologie de la maladie. Il est donc crucial d’inclure à la fois l’évaluation des biais sensoriels dans les modèles précliniques afin d’améliorer la caractérisation du phénotype de type dépressif et d’étudier quels mécanismes biologiques sous-tendent le traitement émotionnel et ses altérations dans des conditions pathologiques. De plus, l’olfaction est un sens de choix pour étudier les biais émotionnels. D’un point de vue translationnel, il est éthologiquement pertinent d’évaluer le traitement émotionnel à la fois chez la souris et chez l’homme. De plus, les systèmes olfactif et émotionnel sont fortement entrelacés et partagent des structures neuronales communes tout au long de l’évolution. Il existe une relation forte et réciproque entre l’olfaction altérée et la dépression¹⁰, ce qui fait de l’olfaction un outil prometteur et puissant à utiliser pour le diagnostic et la réponse au traitement, ainsi que dans la recherche fondamentale.

Ici, nous avons développé un protocole pour un test de préférence olfactive afin d’évaluer les biais émotionnels olfactifs dans deux modèles murins de dépression. Il est important de noter que cette méthode permet d’évaluer la réponse à une grande variété de stimuli à valence variable, à la fois positifs et négatifs, ainsi qu’à des stimuli neutres dont la valeur pourrait changer dans des conditions pathologiques. Ces stimuli ultérieurs ne sont pas obligatoires pour la validité du test, mais ils peuvent apporter des informations supplémentaires intéressantes à l’expérience. Ce test permet également d’évaluer l’évolutivité de la réponse en utilisant différentes concentrations d’odeurs. Il est crucial d’évaluer la réponse à des stimuli ayant des valeurs hédoniques différentes et de séparer le traitement émotionnel positif du traitement émotionnel négatif dans le contexte de la dépression. En effet, les résultats précliniques indiquent que le traitement antidépresseur peut ne pas restaurer uniformément le traitement olfactif positif et négatif¹⁴. L’exploration spontanée des stimuli olfactifs appétitifs ou aversifs intrinsèquement saillants prévient également les facteurs confondants des déficits cognitifs ou motivationnels associés aux états dépressifs ^30,31. Par conséquent, ce protocole ne nécessite pas de longues phases d’apprentissage, ce qui présente des avantages techniques. Il est important de noter que les deux modèles utilisés dans cette étude reposent sur des interventions effectuées à l’âge adulte, de sorte que des expériences futures seront nécessaires pour évaluer si ce protocole est également sensible à l’évaluation d’autres facteurs de risque de dépression, y compris l’adversité au début de la vie.

Il est important de noter que ce protocole s’applique aux hommes et aux femmes, ce qui est essentiel car les femmes sont deux fois plus susceptibles d’être touchées par la dépression que les hommes. Cependant, les hommes sont susceptibles d’être sous-diagnostiqués de la dépression en raison des attentes sociales, de la honte ou de la stigmatisation, comme l’ont examiné Shi et ^coll.32. Néanmoins, la dépression semble différer entre les hommes et les femmes, en termes de symptomatologie (manifestations cliniques), d’étiologie (causes biologiques) et de prédictivité du traitement 33,34,35, mais de nombreux modèles et tests de dépression sont encore principalement conçus pour des sujets masculins uniquement. Par exemple, le test standard de reniflage d’urine féminine²⁴ utilise un protocole similaire, mais repose sur un signal d’odeur sociale unique. Bien que très informatif, ce test permet un temps d’exploration court (30 s chez les témoins) et est principalement adapté aux souris mâles car l’urine femelle n’a pas la même signification éthologique et hédonique pour les deux sexes. Enfin, il semble que la réponse hédonique olfactive soit sensible au traitement antidépresseur¹⁴, faisant de notre test un outil de choix pour caractériser de manière fiable les états de type dépressif, remplaçant d’autres tests controversés comme le test de nage forcée 36,37,38.

Il est important de noter que le test entraîne des temps d’exploration des stimuli plus longs (100-200 s) par rapport aux tests décrits précédemment 21,22,23. L’augmentation de la durée de l’exploration est particulièrement importante lorsque ce test est combiné à des techniques de surveillance en direct de l’activité neuronale, par exemple. De plus, ce test ne nécessite pas de privation de nourriture/eau, évitant ainsi les facteurs de confusion métaboliques. Enfin, ce test peut être réalisé pendant la période de lumière, réduisant ainsi les contraintes expérimentales (cycle inverse, enregistrements infrarouges).

Cependant, pour mener à bien ce protocole, certaines étapes techniques sont essentielles. Tout d’abord, il est essentiel que les expériences soient réalisées dans un environnement très contrôlé et non stressant : l’éclairage doit être homogène et ne pas être trop lumineux, et il ne doit pas y avoir de bruit ou d’odeur gênante dans la pièce. Les souris peuvent être testées dans l’arène une fois par jour, et le test doit être effectué à peu près à la même heure chaque jour. De plus, il est recommandé de faire appel à un expérimentateur unique lors de la réalisation de ces expériences afin de réduire le stress chez les animaux.

Deuxièmement, une exploration suffisante de l’arène par le biais de journées d’accoutumance doit être assurée. Si une souris passe moins de 50 s en moyenne dans l’une des zones où des boîtes de Pétri sont placées pendant l’habituation, un ou deux jours supplémentaires d’habituation peuvent être ajoutés avant de tester les odeurs. Si la souris n’explore toujours pas l’arène assez longtemps, elle doit être exclue de l’analyse. En cas d’exploration dissymétrique initiale de la « zone odorante » lors de l’habituation entre groupes expérimentaux, le calcul de l’indice de préférence peut être adapté pour corriger les biais de préférence spontanée différentielle, par exemple en normalisant par le temps passé lors de l’habituation par rapport à chaque groupe, ou même par rapport à leur propre exploration lors de l’habituation. En effet, une autre difficulté peut être une grande variabilité entre les groupes expérimentaux. Si le problème se pose, pour limiter la variabilité intra-individuelle, les souris peuvent être testées sur deux jours consécutifs avec la même odeur. Les résultats peuvent ensuite être moyennés entre les deux jours. Il est important de noter que les tests consécutifs de la réponse olfactive ne sont pas censés affecter de manière significative le comportement exploratoire¹⁴.

En ce qui concerne la préparation des odeurs, les solutions doivent être préparées dans une pièce différente de celle des tests, et les expérimentateurs doivent être conscients que la solution ne se diffuse pas excessivement dans la salle comportementale. Enfin, les solutions doivent de préférence être préparées peu de temps avant le test et stockées dans un flacon en verre inodore afin que l’odeur ne s’estompe pas ou ne soit pas contaminée. Pour certaines odeurs comme l’urine de souris mâle et femelle qui sont censées être très appétitives, si les souris témoins ne présentent pas de lectures d’exploration associées à une valence hautement positive, la solution doit être vérifiée. En particulier, l’urine de souris doit être fraîchement recueillie sur de jeunes souris (âgées de 5 mois maximum) peu de temps avant le test (maximum 2-3 jours avant) et conservée à 4 °C pour préserver les propriétés olfactives. Il convient de noter que le prélèvement pendant plusieurs jours consécutifs devrait prévenir les effets dus aux stades du cycle œstral chez les souris femelles. Si nécessaire, l’urine peut être conservée à -20 °C pour un stockage à plus long terme, bien que cette procédure ne soit pas recommandée car elle réduit sensiblement l’intensité des odeurs. De même, le plaisir perçu de l’huile d’arachide peut également être variable, selon le lot ou la marque, par exemple. Il est important de noter que deux odeurs distinctes ou des odeurs avec des concentrations différentes peuvent être ajoutées dans les compartiments, au lieu de la « zone de contrôle » non odorante, pour mesurer la préférence entre deux solutions odorantes.

Enfin, le test de préférence olfactive peut être adapté de différentes manières pour améliorer sa conception et élargir ses applications potentielles. En effet, en dehors de la lecture motrice, l’évaluation de la réponse émotionnelle à travers ce test pourrait être améliorée en combinant différentes techniques pour mesurer diverses composantes des émotions⁶. Par exemple, un microphone à ultrasons peut être placé à côté de l’arène pour enregistrer les vocalisations ultrasonores, qui peuvent être émises en réponse à certains stimuli positifs et négatifs^24,39. La température corporelle peut également être surveillée à l’aide d’une caméra infrarouge ou d’un émetteur de télémétrie en temps réel implantable 40,41,42. Certains de ces transmetteurs sont même capables d’accéder aux fréquences cardiaques et respiratoires 43,44,45. La combinaison de ces outils aiderait à établir une évaluation comportementale plus fine de la réponse émotionnelle. Le test de préférence olfactive peut également être facilement couplé à d’autres techniques pour élucider davantage les mécanismes neuronaux à l’origine de la dysrégulation émotionnelle, comme l’optogénétique, la photométrie par fibre ou les enregistrements d’imagerie en direct mini-scope ou d’électrophysiologie in vivo. Enfin, ce protocole peut être facilement transposable en clinique en intégrant l’évaluation des biais sensoriels et de la réponse olfactive hédonique dans la recherche humaine et même comme outil de diagnostic ou de réponse thérapeutique.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
2,4,5-triméthylthiazole	Sigma-Aldrich	W332518-100G-K
2-trans octenal	Sigma-Aldrich	Référence 52464-1ML
Blu-tack	UHU	N/A
Papier filtre	Fisher Scientific	11710125	42,5 millimètre
Flacon en verre	DUTSCHER DOMINIQUE	958983
Huile minérale	Sigma-Aldrich	M5904-500ML
Noldus Ethovision	Noldus Ethovision	Version 17.5	Alternativement, Single Mouse Tracker dans le logiciel open source ICY ou Deeplabcut pourrait être utilisé
Pétri	Faucon	351007	Boîte de Pétri de 60 mm x 15 mm avec 7 trous sur mesure de 5 mm de diamètre
Arène en plexiglas	Sur mesure  ;	N/A	Arène en plexiglas de 45 cm x 50 cm x 25 cm divisée en deux chambres par un mur de 37 cm x 25 cm au milieu.