Génération de co-cultures de sphéroïdes épithéliaux-fibroblastes humains normaux flottants

Résumé

Ici, nous présentons un protocole simple et très pratique mais fiable pour la co-culture sphéroïdale directe de cellules épithéliales pulmonaires humaines et de fibroblastes sans s’appuyer sur une matrice.

Résumé

Les systèmes de culture tridimensionnels (3D) sont devenus de plus en plus populaires en raison de leur capacité à reproduire les propriétés et les architectures cellulaires naturelles, imitant ainsi les structures tissulaires in vitro. Parmi ces modèles, la culture d’agrégats cellulaires sphériques (appelés sphéroïdes) intégrés dans une matrice extracellulaire semi-solide (MEC) représente un modèle de culture cellulaire quasi in vivo avancé, car elle permet différents états cellulaires fonctionnels à la suite d’interactions cellule-cellule et cellule-ECM, ainsi que des gradients d’oxygène et de nutriments. Parce que les sphéroïdes sont techniquement moins exigeants et relativement peu coûteux à obtenir, ils sont fréquemment utilisés dans le criblage de médicaments et les tests de toxicité, ce qui permet un criblage à haut contenu pour tester de nouveaux médicaments en phase préclinique. À cette fin, les structures 3D de diverses tumeurs sont principalement recréées. Dans le même temps, Matrigel est actuellement l’un des ECM les plus largement utilisés et est considéré comme la référence dans la culture de sphéroïdes et d’organoïdes, bien qu’il s’agisse d’une matrice 3D basée sur des expériences sur des souris, dont l’extraction - comme les tests sur les animaux en général - est associée à des préoccupations éthiques majeures. Ici, nous présentons un protocole sans matrice pour la co-culture sphéroïdale directe de cellules épithéliales bronchiques humaines et de fibroblastes, qui peut être considéré comme une méthode de co-culture optimisée, en particulier en ce qui concerne la communication épithéliale-fibroblaste et les interactions au sein des sphéroïdes respectifs, sans s’appuyer sur une matrice porteuse (basée sur l’animal). En établissant ces co-cultures de sphéroïdes épithéliaux-fibroblastoïdes flottants en tant que plate-forme in vitro orientée vers le patient pour modéliser les toxicités tissulaires normales (pulmonaires) des approches thérapeutiques anticancéreuses, non seulement une réduction du nombre d’animaux de laboratoire, mais aussi un remplacement adéquat et significatif des expériences animales correspondantes peut être obtenu.

Introduction

Les cultures cellulaires bidimensionnelles (2D), dans lesquelles des cellules monocouches plates sont cultivées, expansées, puis plaquées pour des tests de recherche cellulaires, restent une méthode facile, pratique, rentable et largement utilisée pour les procédures de dépistage préclinique standard ^1,2. Pour étudier la diaphonie interactive (paracrine) entre différents types de cellules in vitro, on peut utiliser un milieu conditionné d’un type de cellule pour la stimulation d’un autre type de cellule. De plus, diverses méthodes de co-culture ont émergé, par exemple des méthodes indirectes, lorsque les cellules co-cultivées sont physiquement séparées à l’aide d’une membrane microporeuse. Ces « systèmes Transwell » comprennent un insert (la membrane microporeuse) qui est placé dans une plaque de culture cellulaire 2D traditionnelle. Un type de cellule est ensuite ensemencé et cultivé sur la membrane, partageant le même milieu que l’autre type poussant sur le puits compagnon, permettant ainsi des communications paracrines bidirectionnelles². Les deux types de cellules pourraient même être ensemencés des deux côtés de la membrane, formant davantage une co-culture de contact direct de cellule à cellule, ce qui convient à l’étude des tissus structurés par barrière ^3,4.

Cependant, les réponses cellulaires de ces systèmes de culture cellulaire 2D, même avancés, ne reflètent pas toujours les résultats des expériences animales correspondantes et même des études cliniques, ce qui est dû, entre autres, à l’absence de signalisation directe entre les différents types de cellules et donc à l’absence d’organisations cellulaires de type in vivo. Par conséquent, les systèmes de culture tridimensionnels (3D) sont devenus de plus en plus populaires en raison des capacités des caractéristiques cellulaires naturelles et des architectures imitant les structures tissulaires in vitro ^5,6. Parmi ces modèles, la culture d’agrégats cellulaires sphériques, appelés sphéroïdes, intégrés dans des matrices extracellulaires semi-solides, fournit un modèle de co-culture cellulaire plus avancé où différents états cellulaires fonctionnels suivant les interactions cellule-cellule et cellule-ECM ainsi que les gradients d’oxygène et de nutrition peuvent être obtenus⁷. Ces cultures in vitro in vitro plus complexes doivent être générées et maintenues homogènes en ce qui concerne la taille de l’assemblage cellulaire tout en favorisant le développement et la différenciation cellulaires, tout en étant efficaces, rapides, cohérentes et pratiques ^7,8.

En utilisant les caractéristiques naturelles d’auto-agrégation et d’adhésion, les sphéroïdes (principalement les sphéroïdes tumoraux) sont généralement générés à l’aide de la technique de la goutte suspendue ^9,10. En tant que l’une des premières techniques utilisées pour générer des corps embryonnaires, le test de la goutte suspendue est devenu une méthode largement utilisée pour générer de nombreux sphéroïdes homogènes basés sur les principes de la gravité et de la tension superficielle avant l’intégration de l’ECM à l’aide de Matrigel, l’étalon-or des matrices extracellulaires, bien qu’il soit basé sur la souris. Des efforts considérables ont été déployés pour générer des sphéroïdes dans des approches sans échafaudage ^8,11. Par exemple, les sphéroïdes peuvent être générés à l’aide d’une bouteille de culture cellulaire avec un agitateur, empêchant ainsi l’ensemencement cellulaire, la méthode la plus simple pour produire des sphéroïdes à grande échelle¹².

Le plus difficile dans la complexation de cultures cellulaires et donc dans l’établissement d’un système physiologiquement précieux comme les alternatives in vivo in vitro dans son laboratoire sont des protocoles complexes avec de nombreuses étapes différentes (qui doivent encore être établies). Par exemple, générer d’abord des structures cellulaires à l’aide d’une méthode, les récolter, puis les intégrer dans une matrice, en particulier l’utilisation de matrices qui ne sont pas faciles à manipuler, sont des étapes critiques qui nécessitent plus de conviction avant qu’une méthode puisse être utilisée en routine et en série. Ici, nous avons utilisé une plaque de fixation ultra-faible dans un format de 96 puits, qui ne permet pratiquement aucune fixation cellulaire au récipient de culture pour établir des sphéroïdes 3D complexes de cellules épithéliales pulmonaires et de fibroblastes. Les sphéroïdes qui en résultent se forment de manière très uniforme et assez rapide en 24 heures, ce qui raccourcit la durée de l’expérience. Une culture prolongée et, par conséquent, une croissance cellulaire et une différenciation fiables sont effectuées dans le même puits pendant toute la période, de sorte qu’après le placage initial, seul le milieu doit être remplacé pendant toute la période de culture. Par conséquent, nous présentons un protocole très simple, rapide et donc très pratique pour générer des sphéroïdes pulmonaires humains qui répliquent morphologiquement et fonctionnellement l’épithélium des voies respiratoires à des niveaux quasi physiologiques. Un autre avantage est que ce protocole peut être facilement adapté à d’autres cellules.

Protocole

Toutes les étapes sont effectuées dans des conditions stériles (enceinte de biosécurité). Pour les compositions de milieux utilisées dans cette étude, voir le tableau 1.

1. Préparation du matériel expérimental

1. Cultiver et développer des cellules épithéliales pulmonaires normales humaines (HBEC3-KT) sur des boîtes de culture de cellules en plastique standard (flacons T75) dans un milieu de croissance épithéliale normal à l’aide d’un incubateur standard¹³ (voir tableau 1).
   REMARQUE : Pour une meilleure croissance, le milieu peut être complété en outre avec 10 % de sérum de veau fœtal (FCS).
2. Cultiver des fibroblastes humains (HS-5) dans un milieu RPMI complété par 10 % de sérum de veau fœtal et de la pénicilline/streptomycine^10,14 (voir tableau 1).
3. Préparez un milieu organoïde pulmonaire ramifié (BLO-Medium) en complétant le DMEM/F12 avec du N-2, du B27, de la pénicilline-streptomycine, de l’albumine sérique bovine, du monothioglycérol, de l’acide ascorbique, du KGF/FGF7, du FGF10, de l’ATRA et du CHIR99021. (voir le tableau 1 et le tableau des matériaux).
   REMARQUE : Il est recommandé de préparer le milieu frais, au moins avec l’ajout de KGF / FGF7, FGF10, ATRA et CHIR99021. Si plus de fluide est nécessaire dans un court laps de temps, seule une courte période de stockage de quelques jours (jusqu’à 1 semaine) à 4 °C est recommandée. Alternativement, le milieu de différenciation organoïde des voies respiratoires PneumaCult disponible dans le commerce peut être utilisé.

2. Préparation des cellules épithéliales et des fibroblastes

REMARQUE : Utilisez les deux types de cellules lorsque les cellules atteignent environ 80 % de confluence. Préparez chaque type de cellule séparément.

1. Retirer et jeter le milieu de culture.
2. Lavez les cellules en rinçant brièvement la couche cellulaire avec 5 ml de PBS.
3. Trypsiniser les cellules épithéliales en ajoutant 2 mL de trypsine-EDTA à 0,5 %, suivi d’une courte incubation à 37 °C pendant 4 à 8 min.
4. Prélever des cellules arrondies et presque détachées en ajoutant un milieu de croissance normal ou du PBS complété par 10 % de FCS à l’aide d’une pipette sérologique de 5 ml.
5. Piquez le volume approprié de haut en bas plusieurs fois dans la fiole T75 (le long de la surface de croissance) pour séparer davantage les amas de cellules et transférer la suspension cellulaire dans un tube de 15 ml.
6. Récoltez les fibroblastes HS5 respectivement en utilisant la trypsinisation TE à 37 °C pendant 3 à 5 min.
7. Granuler chaque type de cellule (et donc exempt de trypsine) par centrifugation (p. ex., 300 à 400 × g pendant 5 minutes à température ambiante [RT]) et remettre en suspension (cellules épithéliales et fibroblastes) dans 1 à 2 ml de milieu de croissance épithéliale normale avant le comptage.
8. Déterminer le nombre de cellules viables à l’aide d’un volume approprié de cellules remises en suspension ; chacun dilué 1/5 à l’aide de colorant bleu de trypan à 0,4 % dans une chambre de comptage Neubauer au microscope.

3. Génération de cultures de sphéroïdes 3D épithéliaux-fibroblastes

1. Diluer le nombre désiré de cellules dans un milieu de croissance épithéliale normal à l’aide d’un tube de 15 ml. Calculez 2000 cellules épithéliales avec 50 fibroblastes dans 100 μL de milieu pour chaque puits des 96 plaques de puits. Le nombre de cellules résultant, adéquat pour une plaque de 96 puits, est de 200 000 cellules HBEC et de 5 000 fibroblastes HS5 dans 10 mL de milieu de croissance épithéliale normal.
2. Mélanger délicatement à l’aide de pipettes sérologiques stériles de 10 ml.
3. Transférez la suspension cellulaire dans un réservoir de réactif stérile pour une micropipette multicanaux.
4. Ensemencez les cellules dans une plaque de fixation à très faible teneur en transférant 100 μL de la suspension cellulaire dans chaque puits à l’aide d’une pipette multicanaux (12 canaux).
5. Incuber dans des conditions de culture cellulaire standard à 37 °C et 5 % de CO₂ dans une atmosphère humidifiée.
   REMARQUE : La formation des sphéroïdes est évaluée par un examen microscopique régulier à l’aide d’un microscope inversé et en photographiant des sphéroïdes pour chaque point temporel souhaité.
6. Après 4 jours, ajoutez 100 μL de BLO-Medium par puits aux sphéroïdes générés.
7. Incuber davantage dans des conditions de culture cellulaire standard à 37 °C et 5 % de CO₂ dans une atmosphère humidifiée.

4. Effectuer un changement régulier de support

1. Après 7 à 8 jours, effectuez un changement de support régulier. Par conséquent, positionnez la plaque légèrement inclinée de sorte que les sphéroïdes s’enfoncent dans le sens de l’inclinaison en fonction de la gravité.
2. Aspirez le surnageant avec précaution et du mieux possible à l’aide d’une pointe de pipette de 100 à 200 μL.
3. Repositionnez la plaque horizontalement et remplissez-la de 100 à 150 μL de milieu BLO par puits (à l’aide d’une pipette multicanaux)
4. Incuber davantage dans des conditions de culture cellulaire standard à 37 °C et 5 % de CO₂ dans une atmosphère humidifiée ou commencer une expérience/un traitement.
   REMARQUE : Les sphéroïdes peuvent être cultivés pendant de plus longues périodes (jusqu’à 21 jours). Ensuite, un changement complet de support doit être effectué au moins deux fois par semaine.

5. Analyses en aval (récolte des sphéroïdes)

1. Effectuez régulièrement des examens microscopiques et de la documentation en prenant des photos en combinaison avec des mesures de taille de sphéroïde et des calculs de volume, permettant enfin de quantifier la croissance des sphéroïdes et les altérations potentielles de la croissance après les traitements.
2. Pour l’imagerie de cellules vivantes aux points temporels souhaités, incubez les sphéroïdes pendant 15 minutes supplémentaires avec 1 μg/mL de Hoechst 33342 (ou DAPI) pour la coloration des noyaux et analysez-les par microscopie à fluorescence.
3. Récoltez les sphéroïdes générés au moment souhaité à l’aide d’une pipette de 200 μL avec la sortie coupée (maintenir stérile) pour augmenter le diamètre. Par conséquent, aspirez également le support contenant le sphéroïde. Mélangez et recueillez les sphéroïdes dans un tube de 2 à 5 ml. Après 2 à 5 minutes, lorsque les sphéroïdes ont coulé sous l’effet de la gravité, retirer le surnageant et procéder à l’analyse en aval.
4. Pour la production de lysats de protéines sphéroïdes entières, ajoutez directement un tampon de lyse glacé (150 mmol/L de NaCl, 1 % de NP40, 0,5 % de désoxycholate de sodium, 0,1 % de dodécylsulfate de sodium, 50 mmol/L de Tris/HCl, pH 8, complété par un cocktail d’inhibiteurs de protéase) dans le tube contenant les sphéroïdes récoltés. Après deux ou trois cycles de congélation et de décongélation, déterminer la teneur en protéines des lysats et passer à l’analyse en aval, p. ex., analyse par transfert Western¹⁵.
5. Pour la génération de lysats d’ARN sphéroïde entiers, ajoutez directement le tampon de lyse de l’ARN dans le tube contenant les sphéroïdes récoltés et effectuez l’isolement de l’ARN conformément aux instructions du fabricant du kit d’isolement d’ARN respectif utilisé.
6. Pour l’immunohistochimie (IHC) et la coloration par immunofluorescence, suivez les étapes 5.6.1 à 5.6.3.
   1. Traiter les sphéroïdes récoltés avec 1 à 2 mL de solution saline tamponnée au paraformaldéhyde/phosphate (PBS) à 4 % pendant 30 min, puis les soumettre à un enrobage de paraffine et à une section (3-5 μm).
   2. Avant la coloration immunofluorescente, préparer les échantillons en utilisant une série décroissante d’alcool et l’incubation avec une solution de récupération cible. Ensuite, bloquez les lames avec une solution bloquante (2 % de sérum de chèvre normal/PBS) pour réduire les interactions non spécifiques et incubez les anticorps primaires pendant la nuit à 4 °C.
   3. Détecter les antigènes à l’aide d’anticorps secondaires marqués par fluorescence. Contre-coloration des noyaux avec DAPI. Effectuer une coloration supplémentaire (p. ex., trousse de coloration PAS) selon les protocoles d’évaluation histologique du fabricant.
7. Pour les suspensions à cellule unique, suivez les étapes 5.7.1 et 5.7.2.
   1. Réintroduire les sphéroïdes récoltés dans 1 à 2 mL de TrypLE contenant 100 U/mL de DNase I, puis les incuber pendant 15 minutes à 37 °C. Arrêtez la digestion en ajoutant du PBS contenant 2 à 5 % de FCS, 2 mM d’EDTA et de DNAse I.
   2. Passer la solution cellulaire à travers une crépine cellulaire de 70 μm dans un tube conique frais avant l’analyse en aval (p. ex., cytométrie en flux ou analyse de cellule unique).
8. Pour l’analyse du séquençage de l’ARN sur cellule unique, suivez les étapes 5.8.1 à 5.8.3.
   1. Étiquetez les différentes suspensions unicellulaires d’intérêt représentant différents points temporels ou traitements à l’aide d’un kit de multiplexage unicellulaire (humain) selon les instructions du fabricant.
   2. Combinez ensuite les échantillons et chargez-les sur une voie sur une cartouche à cellule unique, en visant 10 000 à 40 000 cellules.
   3. Récupérez des cellules uniques, effectuez la transcription inverse et la préparation de la banque selon les instructions du fabricant, et séquencez l’ARN isolé.

Résultats

Ce protocole simple permet la co-culture sphéroïdale sans matrice de cellules épithéliales bronchiques humaines et de fibroblastes en combinaison avec des plaques d’attache ultra-faibles (Figure 1A). Au cours du processus de culture, des sphéroïdes pulmonaires plus complexes se forment progressivement à partir des sphéroïdes initialement générés, avec la génération efficace de différentes structures épithéliales et fibroblastiques représentant des interactions cellulaires directes, comme le ...

Discussion

Des modèles de culture cellulaire 3D ont été proposés pour combler le fossé entre les cultures 2D et les études in vivo, car ce type de (co-)culture imite mieux les propriétés physiologiques, morphologiques et pathologiques présentes in vivo, car davantage d’interactions cellule-cellule, d’interactions cellule-ECM, de réponses aux stimuli, d’expression génique, d’expression protéique et de différenciation sont présentes^17,

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Pipettes sérologiques stériles de 10 mL	ThermoFischer	170356N	Pipettes sérologiques stériles Nunc, ou
tube conique équivalent de 15 mL	Corning	430052	ou équivalent
37 ° ; C/ 5 % CO2 humidifié  ; incubateur
5 mL pipettes sérologiques stériles  ;	ThermoFischer	170355N	Nunc pipettes sérologiques stériles, ou
tube conique équivalent de 50 mL	Corning	CLS430829	ou équivalent
ATRA (All-Trans Retinoic Acid)	StemCell Technologies	Cat#72262	50 nM
B-27 Supplement (50x),  ;	ThermoFischer/Gibco	Cat#17504044	1x
BD Rhapsody WTA Amplification Kit	BD Bioscience	Cat#633801	utiliser selon les instructions du fabricant
Enceinte
Albumine sérique bovine	Roche	Cat#BSAVHS-RO	0.4 % (v/v)
Cell Strainer	Corning	352350	Faucon 70 et micro ; m Filtre à cellules, blanc, stérile, Centrifugeuse emballée individuellement
	Eppendorf	https://www.fishersci.com/shop/products/eppendorf-5804-series-centrifuge-rotor-packages-9/p-4119001	par exemple, Eppendorf Centrifuge 5804 - Centrifugeuse de paillasse
DMEM/F12	Invitrogen	Cat#11330-032	500 mL
DNase I, sans RNase (1  ; U/&mu ; L)	ThermoFischer	Cat#EN0521	100 U/mL  ;
EDTA (0,5 M), pH 8,0,	ThermoFischer	AM9260G	2 mM
Eppendorf Research plus Pipette multicanaux 12 canaux  ;	Eppendorf		par exemple, #3125000044 (10&ndash ; 100 et micro ; L) ou #3125000060 (30&ndash ; 300 et micro ; L)
Sérum de veau fœtal	ThermoFischer/Gibco	Cat#A5256701	10 % (v/v)
HBEC3-KT  ;	ATCC	CRL-4051	lignée de cellules épithéliales pulmonaires normales humaines  ;
Solution d’héparine (0,2 %)	StemCell Technologies	Cat#7980	0,8 mL
Hoechst 33342  ;	ThermoFischer	Cat#H1399	1 & micro ; g/mL
HS-5  ;	ATCC	CRL-3611	fibroblastes stromaux humains
Hu Recom FGF-10 (KGF-2) ACF	StemCell Technologies	Cat#78173.1	10 ng/mL
Hu Recom FGF-7 (KGF) ACF  ;	StemCell Technologies	Cat#78186.1	10 ng/mL
Human Single-Cell Multiplexing Kit	BD Bioscience	Cat#633781	selon les instructions du fabricant
Solution mère d’hydrocortisine  ;	StemCell Technologies	Cat#7926	0.5 mL par 500 mL
Laduviglusib (CHIR-99021)	Biozol/Selleckchem	Cat#S1263	3 µ ;
M Acide L-ascorbique	Sigma-Aldrich	Cat#A92902	50 µ ; g/mL
Microscope	ZEISS
Monothioglycérol	Sigma-Aldrich	Cat#M6145	0.4 µ ; M
N-2 Supplément (100x)	ThermoFischer/Gibco	Cat#17502048	1x
chambre de comptage Neubauer	Merck	BR718605	par ex., BRAND  ; chambre de comptage BLAUBRAND  ; Motif Neubauer Sérum
de chèvre normal	ThermoFischer	Cat#31873	2 % (v/v) en PBS
NP-40	Merck/Millipore	Cat#492016	NP-40-Alternative, 1 %
PAS Staining Kit	Sigma Aldrich	Cat#1016460001	selon les instructions du fabricant
PBS	ThermoFischer	Cat#10010023	1x
Pénicilline-Streptomycine (10.000  ; U/mL), 100x	ThermoFischer/Gibco	Cat#15140122	1x
PFA	ThermoFischer	Cat#J61899. AK	Paraformaldéhyde, 4 % dans le
milieu de différenciation organoïde des voies respiratoires PBS PneumaCult (ODM)	StemCell Technologies	Cat#05060	Milieu basal organoïde des voies respiratoires PneumaCult (#05061, 360 mL) et supplément de différenciation organoïde des voies respiratoires PneumaCult* (#05063, 40 mL)
PneumaCult Ex Plus Medium	StemCell Technologies	Cat#5040	Kit composé de PneumaCult-Ex Plus Basal Medium (#05041, 490 mL ) et PneumaCult-Ex Plus 50X Supplement*(#05042, 10 mL)
Cocktail d’inhibiteurs de protéase	Merck/Roche	Cat#4693132001	1 tab/10 mL
Rhapsody cDNA Kit	BD Bioscience	Cat#633773	selon les instructions du fabricant
RPMI 1640 Medium	ThermoFischer/Gibco	Cat#11875093	500 mL
Chlorure de sodium	Merck/Sigma-Aldrich	S9625	150 mmol/L
Citrate de sodium	Merck/Sigma-Aldrich	Cat#1613859-1G	0.10 %
Désoxycholate de sodium	Merck/Sigma-Aldrich	Cat#30970	0.50 %
Dodécylsulfate de sodium  ;	Merck/Sigma-Aldrich	Cat#11667289001	0,10
Réservoir de réactif stérile pour micropipette multicanaux (par exemple, 60 ml)	ThermoFischer	9510037	ou équivalent
TC-Platte 96well BIOFLOAT a 4 Stü ; ck	Sarstedt (ou facellitate)	83.3925.400 (ou F202003)	plaque de fixation ultra-basse
Tris/HCl	ThermoFischer	Cat#AM9855G	50 mmol/L , pH 8
Triton  ; X-100	Sigma-Aldrich	Cat#X100-5ML	0.05 %  ;
Trypan Blue Stain (0,4 %)	ThermoFischer	Cat#15250061	1/5 (v/v) avec NGM
TrypLE	ThermoFischer	Cat#12604013	1x
Trypsine-EDTA (0,5  ;%)	ThermoFischer	Cat#15400054	0,05 % Solution de trypsine-EDTA (TE) diluée aseptiquement à 1X à l’aide d’une solution saline tamponnée au phosphate (sans calcium ni magnésium)
Réactif WST-1	CELLPRO-RO, Roche	Cat#5015944001	réactif de prolifération cellulaire  ;