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Article de méthode

Établissement de modèles in vitro de culture de ganglions de la racine dorsale : approches complémentaires pour l’étude de la diaphonie cancéreux-nerf

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DOI :

10.3791/68552

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11 juillet 2025

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1Division of Cancer Biology and Genetics, Sinclair Cancer Research Institute, and Department of Pathology and Molecular Medicine, Queen's University, 2Laboratory of Mutagenesis and Oncogenetics, Department of General Biology - Center for Biological Science, State University of Londrina

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit les méthodes d’établissement de cultures entières et dissociées de ganglions de la racine dorsale (DRG) de souris et leur utilisation pour évaluer les interactions tumeur-nerf.

Résumé

La contribution du système nerveux au microenvironnement tumoral et l’importance de l’invasion neuronale comme voie de dissémination du cancer sont de plus en plus reconnues. Les interactions des cellules cancéreuses avec les neurones peuvent favoriser leur invasion autour et dans les nerfs, une caractéristique de nombreux cancers dont les résultats cliniques sont médiocres. Les modèles in vitro d’étude des interactions réciproques entre les neurones et les cellules cancéreuses fournissent des outils précieux pour comprendre la propagation du cancer et identifier des approches pour l’atténuer.

Ici, nous décrivons un protocole pour l’isolement des ganglions de la racine dorsale murine (DRG) et l’établissement de cultures monocouches entières et dissociées qui peuvent être utilisées pour visualiser la morphologie des neurones et la croissance des neurites au fil du temps. Les DRG entiers montés dans Matrigel préservent l’architecture nerveuse et les réponses aux stimuli dans un environnement hétérogène plus similaire au nerf in vivo , tandis que les cultures nerveuses dissociées permettent d’évaluer de plus près les interactions directes cellule-cellule. Une fois les cultures DRG établies, les cellules cancéreuses peuvent être ajoutées pour générer des co-cultures qui peuvent être utilisées pour visualiser les changements dans la croissance des neurites et la morphologie nerveuse en réponse aux cellules cancéreuses. La croissance ou la motilité des cellules cancéreuses en réponse à des signaux dérivés des nerfs au fil du temps ou dans des conditions de stimulation ou d’inhibition de la croissance peut être évaluée, ainsi que la visualisation des effets du contact direct entre les cellules cancéreuses et les extensions nerveuses.

Comme les deux modèles de co-culture peuvent être générés simultanément, ce protocole fournit une vue plus complète de l’impact des interactions cancer-neurones et facilite les comparaisons des conditions de traitement et l’intégration des informations provenant du niveau cellulaire et des ganglions entiers. Ce protocole facilitera l’étude des interactions nerf-tumeur et pourra être utilisé pour un large éventail d’applications, y compris les études de signalisation cellulaire, le criblage de médicaments ou l’étude de l’hétérogénéité de l’environnement tumeur-nerf et des mécanismes de dissémination tumorale le long des nerfs.

Introduction

La dissémination tumorale, par invasion locale et métastases régionales ou à distance, est la principale cause de décès lié au cancer. Bien que la recherche se soit concentrée sur les voies vasculaires ou lymphatiques de propagation, l’invasion neurale des cellules tumorales est fréquemment observée dans de nombreuses tumeurs solides, y compris les cancers du pancréas 1,2, de la prostate 3, de la tête et du cou4, du sein5 et colorectal6. Au cours des dernières années, de nombreuses études ont mis en évidence le rôle émergent des nerfs dans la promotion de la croissance et de la progression tumorales, et en tant que voies de dissémination, favorisant le développement de métastases 7,8. Dans ce contexte, les neurosciences du cancer sont devenues un domaine de recherche de premier plan, offrant de nouvelles perspectives en oncologie en élucidant les interactions entre les cellules tumorales et les composants fondamentaux du système nerveux périphérique (SNP) qui peuvent contribuer à ces processus 8,9.

Le SNP se compose à la fois de nerfs périphériques et de ganglions, qui sont des structures hétérogènes composées de divers types de cellules, y compris des neurones de tailles et de fonctions variables, des cellules de Schwann et d’autres cellules gliales, des fibroblastes, des macrophages, des mastocytes, des mélanocytes et des cellules endothéliales vasculaires qui forment le système vasculairelocal 10. Le SNP est un composant essentiel du microenvironnement tumoral (TME), et la communication réciproque entre les cellules cancéreuses et les nerfs, soit directement par contact physique, soit indirectement par la libération de facteurs neurotrophiques, de neurotransmetteurs, de facteurs de croissance et d’autres signaux, peut faciliter l’invasion neuronale et favoriser des phénotypes plus agressifs8.

Les modèles in vitro peuvent être utilisés pour caractériser les processus qui contribuent à l’entretien et à la réparation des nerfs et sont de plus en plus utilisés pour examiner les interactions cellulaires entre les nerfs et les cellules cancéreuses11,12. Un modèle in vitro fréquemment utilisé implique des ganglions de la racine dorsale de souris (DRG) extraits co-cultivés avec des cellules tumorales11. Ces modèles utilisent souvent la culture monocouche bidimensionnelle (2D) de cellules DRG dissociées pour étudier la biologie neuronale in vitro et ont été utilisés pour modéliser les interactions cellulaires dans le PNS13,14. Cependant, les cultures 2D n’ont pas la complexité du microenvironnement nerveux et représentent mal son architecture in vivo. Des montures entières tridimensionnelles (3D) de neurones périphériques ou de ganglions offrent une alternative qui récapitule plus efficacement la physiologie des nerfs périphériques pour représenter les interactions nerf-environnement de manière plus holistique 15,16,17,18. Cependant, l’hétérogénéité de ce modèle limite la capacité de visualiser ou de quantifier les interactions cellule-cellule, et ces modèles sont plus efficaces pour observer les réponses nerveuses périphériques globales que pour explorer des interactions cellulaires spécifiques et des réponses mécanistes aux stimuli. Ainsi, il est clair que les cultures neuronales dissociées et entières sont complémentaires et que l’évaluation des modèles 2D et 3D en parallèle est optimale pour évaluer à la fois les effets globaux et les réponses cellulaires individuelles aux stimuli.

Ce protocole décrit des méthodes de génération de cultures nerveuses dissociées complémentaires (2D) et entières (3D) qui peuvent être utilisées pour évaluer les interactions nerveuses et cellulaires cancéreuses aux niveaux cellulaire et tissulaire, fournissant une vue plus complète de ces interactions que les méthodes utilisant un seul type de culture 1,13. Ces modèles peuvent être utilisés pour visualiser et évaluer les processus cellulaires, y compris la morphologie des cellules nerveuses et la croissance des neurites, ainsi que les réponses des cellules tumorales aux agents chimiotactiques sécrétés par les nerfs, tels que les facteurs neurotrophiques, et la diaphonie entre les neurones sensoriels et les cellules tumorales. Il permet également d’explorer les interactions potentielles entre les cellules tumorales et d’autres composants du microenvironnement neural, tels que les cellules immunitaires, les fibroblastes et les cellules gliales. Nous soulignons l’application de ces modèles pour étudier les interactions nerveuses-cellules cancéreuses au fil du temps, visualisées par coloration de cellules vivantes ou immunofluorescence, comme exemples d’approches pour évaluer ou quantifier les interactions et les réponses cellulaires. Ensemble, les résultats générés par l’utilisation de ces méthodes peuvent approfondir notre compréhension de la façon dont le système nerveux favorise la croissance et la propagation du cancer, ce qui nous aide à développer des stratégies pour cibler ces mécanismes.

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Protocole

Tous les travaux sur les souris ont été examinés et approuvés par le Bureau du Comité universitaire de protection des animaux de l’Université Queen’s (numéro de protocole 2524). Les animaux ont été conservés et euthanasiés pour le prélèvement de tissus conformément aux lignes directrices éthiques du Conseil canadien de protection des animaux et du National Centre for the Replacement, Refinement & Reduction on Animals in Research (Royaume-Uni). Dans ce protocole, nous avons utilisé des tissus isolés d’animaux C57BL/6, mais nous avons également utilisé avec succès d’autres génotypes, y compris des animaux Rag2IL2Rγc KO. Les sections 1 à 6 peuvent être effectuées dans un environnement propre sur une paillasse de laboratoire stérilisée en surface (voir la figure 1), tandis que les sections 7 à 9 doivent être effectuées dans une enceinte de sécurité biologique. Pour une meilleure compréhension, des représentations schématiques des étapes mentionnées ont été créées (Figure 1).

1. Préparation des solutions mères

  1. Préparez la solution de papaïne et la solution de collagénase IV/Dispase II. Dissoudre la papaïne dans du PBS stérile (solution saline tamponnée au phosphate) à une concentration de 30 U/mL ; conserver dans des aliquotes de 1 mL à -20 °C. Dissoudre la collagénase de type IV à 1,25 mg/mL et la dispase II à 2,5 mg/mL dans du PBS. Conserver dans 1 mL d’aliquotes à -20 °C.
  2. Préparez un milieu de culture neurobasale (F12) complété par un supplément de B27 à 2 % (solution mère 50 fois), un sérum de veau fœtal à 10 % et une pénicilline-streptomycine à 1 % (Pen-Streptocoque) (solution mère 100 fois).
  3. Préparez la solution saline équilibrée de Hank (HBSS) avec 1 % de pénicilline-streptomycine (solution mère 100x).
    REMARQUE : Pour favoriser la survie et la fixation initiales des cellules, un milieu F12 complété par 10 % de FBS est utilisé pour améliorer l’établissement des cultures. Cependant, le FBS favorise également la prolifération de cellules non neuronales, y compris les fibroblastes. Des conditions de milieu réduit ou sans sérum (par exemple, F12 supplémenté en B27 uniquement) peuvent être utilisées pour minimiser la croissance cellulaire non neuronale dans la culture DRG et la co-culture de cancer, mais peuvent affecter la survie, en particulier des cultures de neurones dissociés. Les milieux sans sérum doivent également être pris en compte lors de la collecte de milieux conditionnés par DRG pour évaluer leurs effets sur le comportement des cellules cancéreuses.

2. Préparation des réactifs et des matériaux pour la dissection des DRG (Figure 1A)

  1. Instruments chirurgicaux en autoclave. Stérilisez la surface du microscope de dissection avec de l’éthanol à 70 % et installez-le sur un banc propre.
  2. Ajouter 6 à 8 ml de HBSS-Pen-Strep (étape 1.3) dans deux plaques de culture de 10 cm et déposer sur de la glace.
    REMARQUE : Ces plaques seront utilisées pour collecter les colonnes vertébrales après la dissection. Selon le nombre de moelles épinières disséquées, des plaques supplémentaires peuvent être nécessaires.
  3. Ajouter 8 à 10 ml de HBSS-Pen-Strep dans un tube conique de 15 ml et placer sur de la glace.
  4. Ajouter 3 ml de HBSS-Pen-Strep dans une plaque de culture de 3 cm et placer sur de la glace.
    REMARQUE : Le tube de 15 mL préparé à l’étape 2.3 sera utilisé pour recueillir les DRG pour la dissociation, tandis que la plaque de culture de 3 cm (étape 2.4) sera utilisée pour recueillir les DRG pour le modèle à montage entier.

3. Préparation des réactifs et du matériel pour la culture de DRG en monture entière

REMARQUE : Certaines étapes de cette section peuvent nécessiter une préparation de nuit. Bien que tout type de plaque de culture tissulaire puisse être utilisé pour les cultures DRG, les volumes et les instructions de ce protocole ont été optimisés pour les lames à fond de verre à 8 puits, ce qui a fourni une qualité d’imagerie optimale pour nos analyses. Gardez la lame à fond en verre à 8 puits, les pointes de pipette et le Matrigel sur la glace en tout temps.

  1. Décongeler la solution de Matrigel à 4 °C pendant la nuit (ou au moins 3 h) avant utilisation. Assurez-vous de garder Matrigel recouvert de glace en tout temps.
  2. Réfrigérez les pointes de pipette et la lame à fond en verre à 8 puits à -20 °C pendant la nuit pour minimiser l’adhérence du Matrigel aux pointes et éviter la polymérisation prématurée du Matrigel dans la plaque.
  3. Chauffer le milieu supplémenté (étape 1.2) à 37 °C au bain-marie.

4. Préparation des réactifs et des matériaux pour la culture de DRG dissociée

  1. Décongeler la solution de papaïne et la solution de collagénase IV/Dispase II (étape 1.1) dans un bain-marie à 37 °C jusqu’à ce qu’elles soient prêtes à l’emploi.
    REMARQUE : Pour chaque souris disséquée, utilisez 1 aliquote (1 ml) de papaïne et 1 aliquote de solution de collagénase IV/dispase II.
  2. Milieux de culture chauds complétés (étape 1.2).

5. Prélèvement de la colonne vertébrale (Figure 1B) et dissection des DRG (Figure 1C)

  1. Euthanasier des souris âgées de 4 à 8 semaines par surdose d’isoflurane suivie d’une luxation cervicale. Allongez l’animal euthanasié sur son abdomen et rasez sa fourrure en vous concentrant sur la zone située au-dessus de la colonne vertébrale (Figure 1B, étapes 1 et 2).
  2. Vaporisez le dos de l’animal avec de l’éthanol à 70 % et retirez toute fourrure lâche, en l’essuyant avec des serviettes en papier de la queue au crâne pour éviter que la fourrure ne contamine la dissection.
  3. À l’aide de ciseaux stérilisés, faites une incision droite le long de la surface dorsale rasée, de la queue au crâne. Rétractez la peau des deux côtés de l’incision à l’aide d’une pince émoussée pour exposer la colonne vertébrale (Figure 1B, étape 3).
  4. À l’aide d’une nouvelle paire de pinces et de ciseaux, pour éviter la contamination par la fourrure, faites une incision horizontale à la base (extrémité de la queue) de la colonne vertébrale (figure 1B, étape 4).
  5. Faites deux incisions longitudinales parallèles de chaque côté de la colonne vertébrale pour la libérer. À l’aide d’une pince, soulevez doucement la colonne vertébrale afin d’enlever le tissu conjonctif environnant (Figure 1B, étape 5).
  6. Pour libérer complètement la colonne vertébrale, faites une incision en haut de la colonne vertébrale (proximale au crâne). Transférez la colonne vertébrale dans les plaques pré-réfrigérées de 10 cm contenant HBSS-Pen-Strep sur de la glace (étape 2.2) (Figure 1C, étape 6).
    REMARQUE : Il est pratique de rassembler toutes les colonnes vertébrales dans la même plaque de 10 cm et de déplacer les colonnes individuelles une par une vers une plaque séparée pour d’autres étapes de dissection.

6. Dissection des ganglions de la racine dorsale (DRG)

  1. À l’aide de ciseaux à ressort, retirez tout tissu conjonctif résiduel autour de la colonne vertébrale, exposant les vertèbres (Figure 1C, étape 7). Cela permet une visualisation plus claire de la vertèbre et facilite la coupe le long de la ligne médiane. Récupérez les colonnes coupées dans une plaque fraîche de 10 cm pré-refroidie (étape 2.2).
  2. Une à la fois, transférez la moelle épinière coupée dans la platine du microscope pour la dissection. Fendez soigneusement la colonne vertébrale dans le plan sagittal à l’aide de ciseaux à ressort (Figure 1D, étape 8).
  3. À l’aide d’une pince à pointe fine, retirez la moelle épinière de la colonne vertébrale, en exposant les DRG bilatéralement le long des racines des nerfs rachidiens (Figure 1D, étape 9).
    REMARQUE : Des précautions supplémentaires doivent être prises lors de cette étape car les DRG peuvent être retirés avec la moelle épinière s’ils sont manipulés trop brutalement.
  4. Coupez les nerfs spinaux avec des ciseaux à ressort et retirez tout tissu conjonctif autour des DRG (Figure 1D, étape 10).
    REMARQUE : L’élimination du tissu conjonctif dans cette étape minimise les débris dans les cultures DRG.
  5. À l’aide d’une pince à pointe fine, tirez doucement sur le DRG pour l’extraire de la racine dorsale. Pour une culture en monture entière, placez les DRG dans la plaque de 3 cm (préparée à l’étape 2.4) (Figure 1D, étape 11). Regroupez les DRG restants dans un tube conique de 15 mL (préparé à l’étape 2.3) à utiliser pour la dissociation.
    REMARQUE : Gardez les plaques et les tubes sur la glace tout au long du processus de dissection.
  6. Répétez les étapes 6.4 à 6.5 jusqu’à ce que toutes les DRG soient extraites. Répétez toutes les étapes ci-dessus pour toute colonne vertébrale supplémentaire.
    REMARQUE : Les souris ont 30-31 paires de DRG selon la souche, ce qui permettra de collecter jusqu’à 60 DRG de chaque animal. Si vous collectez uniquement des DRG à partir de la partie lombaire de la moelle épinière, 10 DRG peuvent être extraits. L’utilisation de DRG provenant du même animal pour établir les deux modèles de culture réduit la variabilité intra-expérimentale et garantit des résultats cohérents et comparables entre des expériences complémentaires.
    REMARQUE : Toutes les étapes suivant l’extraction des DRG doivent être effectuées dans une enceinte de sécurité biologique.

7. Culture de DRG en monture entière (figure 2)

  1. À l’aide d’embouts pré-refroidis (étape 3.2), pipeter 2 μL de Matrigel réfrigéré pour former une gouttelette dans chaque puits d’une lame à fond de verre à 8 puits placée sur de la glace (figure 2A, étape 1). Pour éviter que Matrigel ne polymérise prématurément avant d’ajouter le DRG, pipetez une seule gouttelette à la fois. Pour éviter de rayer la surface du toboggan, placez le toboggan dans une plaque de 10 cm avant de le placer sur de la glace.
  2. À l’aide d’une pince à pointe fine, transférez un DRG sur une plaque sèche et déplacez-le doucement pour éliminer tout excès de HBSS, empêchant ainsi une dilution supplémentaire du Matrigel lors de l’ajout du DRG à la gouttelette de Matrigel. Transférez le DRG vers la goutte Matrigel (Figure 2A, étape 2).
    REMARQUE : Utilisez une pince à pointe fine pour pousser doucement le DRG dans la gouttelette Matrigel, en vous assurant que le DRG est complètement immergé et positionné au centre de la gouttelette.
  3. Répétez les étapes 7.1 à 7.2 pour chaque DRG ajouté à une gouttelette Matrigel.
  4. Incuber la lame à fond de verre à 8 puits à 37 °C pendant 5 min dans un incubateur humidifié pour permettre au Matrigel de polymériser (figure 2A, étape 3).
  5. Ajouter délicatement 200 μL de milieu de culture chaud complété dans chaque puits et incuber à 37 °C avec 5 % de CO2 (figure 2B, étape 4). Remplacer le milieu par un milieu de culture frais complété toutes les 72 h.
  6. Surveillez le DRG à l’aide de la microscopie à fond clair pour évaluer sa viabilité et sa croissance neuronale toutes les 24 h (figure 2C et figure 3).
    REMARQUE : La viabilité peut être indiquée par une augmentation de la longueur et de la densité des neurites. Des images peuvent être capturées au fil du temps pour démontrer le développement des extensions de cellules DRG (Figure 3).

8. Culture DRG dissociée (Figure 4)

REMARQUE : N’importe quelle plaque multipuits peut être utilisée pour ensemencer les neurones DRG dissociés. Cependant, dans ce protocole, des lames à fond de verre à 8 puits ont été utilisées car elles offraient une meilleure confluence cellulaire et une meilleure qualité d’imagerie pour les analyses d’immunofluorescence.

  1. Enrobage de plaques de culture avec du collagène
    1. Préparez une solution de travail de 50 μg/mL de collagène I acidifié dans du HCl stérile de 0,01 M dans une enceinte de sécurité biologique.
    2. Pipeter 100 μL de solution de collagène I dans chaque puits de la lame à fond de verre à 8 puits. Inclinez et tournez doucement la lame pour vous assurer que la solution de collagène couvre uniformément toute la surface inférieure de chaque puits. Incuber la lame à 37 °C dans un incubateur humidifié pendant 1 h pour assurer la polymérisation du collagène I.
      REMARQUE : Pendant la période d’incubation, passez aux étapes 8.2 et 8.3.
    3. Après l’incubation, pipetez doucement toute solution résiduelle de collagène I non polymérisé de chaque puits. Rincez bien chaque balise avec 100 μL de PBS. Pipetez l’excès de PBS, en laissant une fine couche résiduelle pour éviter que le collagène ne se dessèche.
      REMARQUE : La lame à fond en verre à 8 puits peut rester dans l’enceinte de sécurité biologique jusqu’à ce que les DRG dissociés soient prêts pour l’étape d’ensemencement.
  2. Digestion enzymatique
    1. Centrifugez doucement le tube de 15 mL contenant les DRG extraits (étape 6.5) pendant 5 min à 200 × g à température ambiante pour granuler les DRG. Retirez délicatement le HBSS à l’aide d’une pipette.
    2. Rincez les DRG dans un milieu supplémenté préchauffé, en tapotant doucement le tube pour vous assurer que tout le contenu est lavé et centrifugez pendant 5 minutes à 200 × g pour granuler les DRG.
    3. Retirer le support à la pipette et ajouter 1 mL de solution de papaïne (figure 4A, étape 1). Mélanger délicatement et incuber pendant 20 min à 37 °C dans un incubateur de culture tissulaire. Secouez doucement le tube pour l’agiter toutes les 5 min.
    4. Après 20 min, ajoutez 4,5 ml de média supplémenté et mélangez doucement pour neutraliser la papaïne. Tube de centrifugation pendant 5 min à 400 × g pour granuler les DRG. Retirez délicatement le surnageant à l’aide d’une pipette.
    5. Ajouter 1 mL de solution de Collagenase IV/Dispase II et incuber pendant 20 min à 37 °C dans l’incubateur. Secouez doucement le tube toutes les 5 minutes (Figure 4A, étape 1).
    6. Après 20 min, ajoutez 4,5 ml de milieu supplémenté et mélangez doucement pour neutraliser la solution de collagénase IV/Dispase II. Tube de centrifugation pendant 5 min à 400 × g pour granuler les DRG. Retirez délicatement le surnageant à l’aide d’une pipette.
    7. Ajouter 2 mL de milieu supplémenté et ajouter de la DNase I à une concentration finale de 0,2 mg/mL. À ce stade, les DRG sont complètement digérés et peuvent apparaître sous la forme d’une touffe lâche (Figure 4A, étape 2).
  3. Dissociation mécanique
    1. Triturez doucement le DRG, en le pipetant de haut en bas 4 à 5 fois à l’aide d’une pointe de pipette filtrante de 1000 μL (Figure 4A, étape 2).
    2. Effectuez une deuxième étape de trituration à l’aide d’une pointe de pipette de 200 μL 4-5x. Après cette étape, l’échantillon apparaît trouble et il reste quelques amas visibles de tissu (figure 4A, étape 2).
    3. Filtrer la suspension cellulaire à travers une crépine de 70 μm dans un tube conique de 50 mL. Rincer graduellement la crépine avec 10 mL de média pour assurer une filtration complète des cellules à travers la crépine (figure 4A, étape 3).
    4. Tube de centrifugation pendant 5 min à 1 000 × g sur les cellules à granulés. Retirer le milieu de la pastille et le remettre en suspension dans 500 μL de milieu supplémenté (figure 4A, étape 4).
    5. Retirez tout PBS résiduel des puits de la lame à fond de verre à 8 puits. Répartissez la suspension DRG dissociée entre les puits enrobés de collagène. Incuber les lames à 37 °C dans un incubateur humidifié avec 5 % de CO2. Ajouter plus de milieu au besoin et remplacer le milieu par du milieu de culture frais complété toutes les 48 h (figure 4B, étape 5).
      REMARQUE : Les cellules dissociées de DRG peuvent être comptées à l’aide d’un hémocytomètre ou d’une chambre de comptage de cellules et d’une coloration au bleu trypan pour assurer un nombre constant de cellules par puits. Pour ce protocole, environ 1 × 105 cellules ont été ensemencées dans chaque puits.
    6. Surveiller les cellules dérivées de DRG à l’aide de la microscopie à fond clair pour évaluer la viabilité et la croissance neuronale (Figure 4C et Figure 5).
      REMARQUE : Les neurones apparaissent comme des corps cellulaires arrondis avec des bords définis et peuvent prendre 24 heures ou plus pour adhérer, tandis que les cellules non neuronales se stabilisent généralement avant les neurones. Une certaine excroissance de neurites peut être observée après 24 h et augmente avec le temps jusqu’à 7 jours en culture. Les cellules dérivées de DRG dissociées et les DRG entiers sont préincubées pendant 72 h avant d’ajouter des cellules cancéreuses et d’établir des co-cultures.

9. Préparation des suspensions de cellules cancéreuses et établissement de co-cultures

REMARQUE : Des cellules cancéreuses adhérentes de plusieurs types peuvent être utilisées. Les milieux de croissance et le nombre de cellules pour les cocultures dépendront de la lignée cellulaire. Nous recommandons des tests préliminaires avant l’expérience afin de déterminer le moment de la collecte des cellules et le nombre optimal d’ensemencements de cellules. Le protocole décrit ici était basé sur l’utilisation des lignées cellulaires de cancer du pancréas humain PanC1 et MiaPaCa2, et de la lignée cellulaire de cancer de la prostate DU-145.

  1. Laver les cellules avec un milieu sans sérum et les trypsiniser pendant environ 3 minutes avec 2 ml de trypsine/plaque de 10 cm.
  2. Neutralisez la trypsine en ajoutant 6 mL de milieu supplémenté et pipetez doucement de haut en bas pour obtenir une suspension unicellulaire. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et d’une coloration au bleu trypan.
  3. Mettre en suspension les cellules cancéreuses à une concentration de 2 × 10 à5 cellules/mL dans un milieu supplémenté (étape 1.2).
    REMARQUE : La densité cellulaire optimale peut varier en fonction de la taille des cellules, du temps de doublement et de la durée de la co-culture et peut être ajustée au besoin.
  4. GRD entier et co-culture de cellules cancéreuses (figure 6B)
    1. Aspirez le support de l’ensemble des cultures DRG du support dans la diapositive à fond en verre à 8 puits.
    2. Pipetez doucement 200 μL de la suspension de cellules cancéreuses (étape 9.3) sur la gouttelette de Matrigel contenant l’ensemble du support DRG.
      REMARQUE : Cela assure une répartition uniforme des cellules cancéreuses autour de la gouttelette. Veillez à ne pas déranger la gouttelette de Matrigel avec la pointe de la pipette.
    3. Incuber la lame de co-culture dans un incubateur humidifié à 37 °C avec 5 % de CO2. Rafraîchissez le milieu tous les jours en le lavant une fois avec 200 μL de média supplémenté chaud, puis en ajoutant 300 μL de média supplémenté dans chaque puits.
      REMARQUE : Aspirez doucement le milieu à l’aide d’une pipette pour éviter de perturber la co-culture DRG-cellules cancéreuses. Au fil du temps, à mesure que les cocultures deviennent plus complexes et organisées, elles deviennent également plus sensibles aux perturbations qui peuvent avoir un impact sur les interactions cellulaires et l’intégrité de la co-culture.
    4. Surveiller la co-culture à l’aide d’un microscope à fond clair ou à fluorescence à 24 heures d’intervalle pour évaluer le comportement des cellules cancéreuses et les interactions neuronales (figure 6B).
      REMARQUE : La fréquence d’observation peut être ajustée en fonction de la chronologie expérimentale et des interactions cellulaires d’intérêt.
  5. Drg dissocié et co-culture de cellules cancéreuses (Figure 6C)
    1. Aspirez les médias des cultures dissociées dans la diapositive à fond de verre à 8 puits.
    2. Répartissez doucement 200 μL de la suspension de cellules cancéreuses (étape 9.3) dans chaque puits. Suivez les mêmes étapes d’incubation, de rafraîchissement du milieu et de surveillance que celles décrites pour les cocultures de montures entières (étapes 9.4.3 et 9.4.4).
      REMARQUE : Pour une meilleure visualisation des processus cellulaires et des interactions cellule-neurone cancéreux, des traqueurs de cellules fluorescents peuvent être ajoutés à la culture, en suivant le protocole du fabricant.

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Résultats

Notre protocole décrit l’isolement de cellules primaires dérivées de DRG de souris et l’établissement de deux modèles de culture complémentaires : les cultures DRG dissociées et les cultures DRG entières, qui nous permettent d’étudier les interactions nerf-cellule cancéreuse à différents niveaux de complexité. L’un des principaux avantages de ce protocole est que les deux types de culture peuvent être générés à l’aide de DRG isolés du même animal, ce qui minimise la variabilité inter-anim...

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Discussion

Le protocole présenté ici décrit des méthodes améliorées pour établir des cultures de nerfs primaires DRG 2D et 3D et leur application en co-culture avec des cellules cancéreuses. Ce protocole progresse sur les méthodes précédentes en établissant les deux modèles en parallèle. Comme les modèles 2D et 3D sont établis en même temps, en utilisant des nerfs primaires isolés des mêmes animaux, les variations interanimales et interexpérimentales sont minimisées, et les données des deux modèles...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par des subventions de fonctionnement des Instituts de recherche en santé du Canada (PJT-178274) (LMM), par une bourse d’études supérieures de l’Ontario (LCBO) et par une bourse de la Coordination pour l’amélioration du personnel de l’enseignement supérieur - Brésil (CAPES) - Code des finances 001 (ERP). LMM est titulaire de la chaire Bracken en génétique et médecine moléculaire à l’Université Queen’s. Certaines images ont été générées en partie à l’aide de Biorender.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Outils
70 et micro ; m Crépine de celluleProgène71-229483-ULTUtilisé pour la suspension de cellules filtrantes
Glissières à fond en verre à 8 puitsIBidi, Munich, Allemagne80807
Dumont #5 - Pince fineFine Science Tools, Foster City, États-Unis11254-20
Pince Dumont #5Fine Science Tools, Foster City, États-Unis11252-20
Ciseaux finsFine Science Tools, Foster City, États-Unis91460-11
Pince à motifFine Science Tools, Foster City, États-Unis91121-12
Ciseaux à ressortFine Science Tools, Foster City, États-Unis91500-09
réactifs
1x solution saline tamponnée au phosphateSigma, St. Louis, États-UnisD8662-500MLUtilisé pour dissoudre les enzymes
Supplément B-27 (50x)Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, États-Unis17504044Utilisé à une concentration de 2 % dans les milieux F12
Collagène bovin de type ICorning Incorporated, New York, États-Unis354231Utilisé pour le revêtement des plaques, solution de travail 50 & micro ; g/mL dans 0,01 M HCl
Collagénase de type IVSigma-Aldrich, Saint-Louis, États-UnisC4-BIOCDissoudre dans le PBS à 1,25 mg/mL, aliquoter, conserver à -20 ° ; C
Dispase IIRoche, Bâle, Suisse4942078001Dissoudre dans le PBS à 2,5 mg/mL, aliquoter, conserver à -20 ° ; C
DNase IRoche, Bâle, Suisse.11284932001Ajouté à la concentration finale de  ; 0,2 mg/mL lors de la dissociation
Sérum fœtal bovin (FBS)Sigma-Aldrich, Saint-Louis, États-UnisF1051Utilisé à une concentration de 10 % dans les milieux F12
HBSS (solution saline équilibrée de Hank)Sigma, St. Louis, États-UnisH6648-500MLPréparé avec 1 % de pénicilline-streptomycine
Facteur de croissance du matrigel réduitCorning Incorporated, New York, États-Unis356231Décongeler à 4 ° ; C toute la nuit, garder sur la glace
Mélange nutritif F-12 JambonSigma-Aldrich, Saint-Louis, États-UnisN6658-500MLMilieu de base pour la préparation de milieux de culture supplémentés
PapaïneRoche, Bâle, Suisse.10108014001Dissoudre dans du PBS à 30 U/mL, aliquote, stocker à -20 ° ; C
Pénicilline-streptomycine (100x)Sigma-Aldrich, Saint-Louis, États-UnisP4333-100MLUtilisé à une concentration de 1 % dans les milieux
Trypan Blue SolutionSigma-Aldrich, Saint-Louis, États-UnisRéf. T8154-100MLÉvaluer la viabilité cellulaire
TrypLE ExpressThermo Fisher Scientific, Massachusetts, États-Unis12605-028Pour la récolte de cellules cancéreuses
Anticorps
Anticorps anti-tubuline IIIAbcam (Cambridge, Royaume-Uni)AB15568Dilution 1:200
Alexa Fluor 488Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, États-UnisA-11008Dilution 1:2000
Alexa Fluor 594Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, États-UnisA-21442Dilution 1:2000
Alexa Fluor 647Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, États-UnisA-21245Dilution 1:2000
Anticorps NeuNSigma-Aldrich, Saint-Louis, États-UnisMAB377Dilution 1:100
Colorants fluorescents & Sondes
Réactif ActinGreen 488 ReadyProbes (Phalloïdine)Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, États-UnisRéf. R37110Dilution 1:40
CellTrace Calcein Rouge-OrangeThermo Fisher Scientific, Massachusetts, États-UnisRéf. C34851Traqueur cellulaire utilisé pour visualiser les neurones au microscope à fluorescence
Hoechst 33342Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, États-UnisN° H3570Dilution 1:5000

Références

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